JPS6240290A - ヒト表皮細胞増殖因子生産用形質転換体 - Google Patents
ヒト表皮細胞増殖因子生産用形質転換体Info
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- JPS6240290A JPS6240290A JP60176976A JP17697685A JPS6240290A JP S6240290 A JPS6240290 A JP S6240290A JP 60176976 A JP60176976 A JP 60176976A JP 17697685 A JP17697685 A JP 17697685A JP S6240290 A JPS6240290 A JP S6240290A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
配粟上例訓皿九」
本発明は、ヒト表皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦと略記）製
造のための組換えＤＮＡ技術に関する。
造のための組換えＤＮＡ技術に関する。
より具体的にはｈＥＧＦに対応する合成遺伝子およびそ
れを含むＤＮＡ、該ＤＮＡＩ形質転換した宿主およびこ
れらを用いるｈＥＧＦの製造法に関する。
れを含むＤＮＡ、該ＤＮＡＩ形質転換した宿主およびこ
れらを用いるｈＥＧＦの製造法に関する。
従】聾髪皮迷−
ｋｔ Ｅ Ｇ Ｆは主として一二脂腸や顎下線力鬼ら分
泌される５３個のアミノ酸から成るポリペプチド。
泌される５３個のアミノ酸から成るポリペプチド。
ホルモンであり、胃酸分泌抑制ならびに表皮細胞増殖促
進作用を有する。ｈＥＧＦの胃酸抑制作用は十二指腸潰
瘍の治療薬としての可能性を示すものである。さらにｈ
ＥＧＦは細胞の膜表面に存在するＥＧＦ受容体に結合し
て、多方面的な生体反応を惹起せしめることが知られて
いる（Ｄ、Ｇ、。
進作用を有する。ｈＥＧＦの胃酸抑制作用は十二指腸潰
瘍の治療薬としての可能性を示すものである。さらにｈ
ＥＧＦは細胞の膜表面に存在するＥＧＦ受容体に結合し
て、多方面的な生体反応を惹起せしめることが知られて
いる（Ｄ、Ｇ、。
ｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、ｒアニュアル レビューオブ
フィジオロジー（Ａ ｎ ｎ 、 Ｒｅ ｖ 、 Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ、）Ｊ ４３ ２５１ （１９８１）
）。
フィジオロジー（Ａ ｎ ｎ 、 Ｒｅ ｖ 、 Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ、）Ｊ ４３ ２５１ （１９８１）
）。
！□
ＥＧＦによって誘起される反応は腫瘍ウィルスの゛発癌
遺伝子産物によって誘発される反応と同一で、ＥＧＦの
生体内での役割や細胞増殖調節機構を解明することは発
癌機構を探る上からも興味あることと考えられている。
遺伝子産物によって誘発される反応と同一で、ＥＧＦの
生体内での役割や細胞増殖調節機構を解明することは発
癌機構を探る上からも興味あることと考えられている。
しかし、天然に存在するｈＥＧＦは極めて微量であるた
め１組換えＤＮＡ技術による生産が注目されるようにな
った。ｈＥＧＦ遺伝子をヒトの組織から得る試みは種々
の制約によって極めて困難なため、未だにｈＥＧＦのＤ
ＮＡ配列は決定されていない。
め１組換えＤＮＡ技術による生産が注目されるようにな
った。ｈＥＧＦ遺伝子をヒトの組織から得る試みは種々
の制約によって極めて困難なため、未だにｈＥＧＦのＤ
ＮＡ配列は決定されていない。
一方、既に決定されているｈＥＧＦのアミノ酸配列（Ｈ
，Ｇｒｅｇｏｒｙ、ｒネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ、
２５７，３２５ （’７５））を基にして、化学的に合
成した構造遺伝子を微生物において発現させる例は知ら
れている。しかし、ＥＧＦは比較的低分子のペプチドで
あり、菌体内で異物として認識され、酵素分解され易い
点を考慮して、融合ペプチドとして発現させている（Ｊ
、Ｓｍ ｉ ｔ ｈら、［ヌクレイツク アシッズ リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ）Ｊ １０ ４４６７ （’８２）］−また融合
２□ ペプチドから不要部分を除去する方法も提示されている
が、極めて不確実なものにすぎない（スチーブン・ジェ
ームス・ブルウアーら、特開昭５８−２１６６９７）、
ｈＥＧＦそのものを発現させた例は酵母の系において知
られているが（Ｍ、Ｓ。
，Ｇｒｅｇｏｒｙ、ｒネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ、
２５７，３２５ （’７５））を基にして、化学的に合
成した構造遺伝子を微生物において発現させる例は知ら
れている。しかし、ＥＧＦは比較的低分子のペプチドで
あり、菌体内で異物として認識され、酵素分解され易い
点を考慮して、融合ペプチドとして発現させている（Ｊ
、Ｓｍ ｉ ｔ ｈら、［ヌクレイツク アシッズ リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ）Ｊ １０ ４４６７ （’８２）］−また融合
２□ ペプチドから不要部分を除去する方法も提示されている
が、極めて不確実なものにすぎない（スチーブン・ジェ
ームス・ブルウアーら、特開昭５８−２１６６９７）、
ｈＥＧＦそのものを発現させた例は酵母の系において知
られているが（Ｍ、Ｓ。
Ｕｒｄｅａら、「プロシージング オブ ナショナル
アカデミ−オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ。
アカデミ−オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、ｓｃｉ、 ＵＳＡ）Ｊｓ８１・
“４６１ （’８３） ３ 、１７）！１ｉｆｔ“″”
′°［低く、酵母の増殖速度が遅いことと相まって大量
生産には適していない。
“４６１ （’８３） ３ 、１７）！１ｉｆｔ“″”
′°［低く、酵母の増殖速度が遅いことと相まって大量
生産には適していない。
目が しようとする０ −
上記のようにｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列は未だ解１１
３６ず・＊ｆ：ｈＥＧＦ（１）７Ａ）酸配
）列を基にして合成した対応遺伝子を種々の系で発
）現させる試みもあるが、融合ペプチドとして
発現 サさせる方法ではその操作上の煩雑さ
、不要部分の除去の困難さ等があるし、また融合ペプチ
ドとせず直接、上記合成遺伝子を発現させた例では、そ
の生産量は極めて低く、実用的なものではなかった。
：“ ゛′″“°−′１ 本発明者らはｈＥＧＦを効率よく生産させる方法を提供
すべく鋭意研究を重ねた結果、この目的に適したｈＥＧ
ＦのＤＮＡ配列を見出し、更に該遺伝子の製法、該遺伝
子を含む組換えＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換した宿主、
それらによるｈＥＧＦの製造法を確立し１本発明を完成
したものである。
３６ず・＊ｆ：ｈＥＧＦ（１）７Ａ）酸配
）列を基にして合成した対応遺伝子を種々の系で発
）現させる試みもあるが、融合ペプチドとして
発現 サさせる方法ではその操作上の煩雑さ
、不要部分の除去の困難さ等があるし、また融合ペプチ
ドとせず直接、上記合成遺伝子を発現させた例では、そ
の生産量は極めて低く、実用的なものではなかった。
：“ ゛′″“°−′１ 本発明者らはｈＥＧＦを効率よく生産させる方法を提供
すべく鋭意研究を重ねた結果、この目的に適したｈＥＧ
ＦのＤＮＡ配列を見出し、更に該遺伝子の製法、該遺伝
子を含む組換えＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換した宿主、
それらによるｈＥＧＦの製造法を確立し１本発明を完成
したものである。
ｈＥＧＦのＤＮＡ配列として従来採用されていたものは
、大腸菌、酵母等の発現系に適したコドンからなるもの
であったが、このたび本発明者等はこのような人間とは
かなりかけ離れている発現系に適したコドンとは全く異
なった、人間により近いネズミのＥＧＦ （ｍＥＧＦ）
の遺伝子に注目して本発明を完成したものである。
、大腸菌、酵母等の発現系に適したコドンからなるもの
であったが、このたび本発明者等はこのような人間とは
かなりかけ離れている発現系に適したコドンとは全く異
なった、人間により近いネズミのＥＧＦ （ｍＥＧＦ）
の遺伝子に注目して本発明を完成したものである。
ｈＥＧＦはネズミのそれ（Ｊ、５ｃｏｔｔら、「サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｊ、２２１ ２３６（’８３）
）と比較すると、アミノ酸配列において７０％の相同性
があり、アミノ酸の異なっている部分も、その大部分は
コドンのｏｎｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎに
よって導びかれるものである。すなわち、ｈＥＧＦ遺伝
子のＤＮＡ配列はネズミのそれと極めて良く似ているも
のと推定される。一般にアミノ酸配列からＤＮＡ配列を
導くと、コドンの縮重によって多数のＤＮＡ配列が可能
となる。そこで合成遺伝子の配列を決定する基準として
１発現系の細胞において最も容認されたコドンを採用す
るのが通例となっている（Ｉｔａｋｕｒａら［サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｊ １９８，１０５６ （１９
７７））。
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｊ、２２１ ２３６（’８３）
）と比較すると、アミノ酸配列において７０％の相同性
があり、アミノ酸の異なっている部分も、その大部分は
コドンのｏｎｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎに
よって導びかれるものである。すなわち、ｈＥＧＦ遺伝
子のＤＮＡ配列はネズミのそれと極めて良く似ているも
のと推定される。一般にアミノ酸配列からＤＮＡ配列を
導くと、コドンの縮重によって多数のＤＮＡ配列が可能
となる。そこで合成遺伝子の配列を決定する基準として
１発現系の細胞において最も容認されたコドンを採用す
るのが通例となっている（Ｉｔａｋｕｒａら［サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｊ １９８，１０５６ （１９
７７））。
ノ□
しかし最近の知見によると、原核生物において真核生物
の遺伝子を発現させても何ら支障はなく、ある場合には
発現系に適合させた遺伝子より効率がよい（Ｍ、Ｉ（、
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、ｒヌクレイツク アシッズ リサ
ーチ、シンポジウム シリーズ（Ｎｕｅｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
５ａｒｉｅｓ）Ｊ↓１，１９７ （’８２））、遺伝
子の発現を高めるための因子としては多くのものが挙げ
られるが、構造遺伝子に対応するｍＲＮＡの安定性なら
びに翻訳効率も重視される。この場合ｍＲＮＡの塩基配
列が決定する高次構造が重要な意味を持つと推定される
。これらの点を考慮するとｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列
をアミノ酸配列を変えない範囲でネズミのＥＧＦ遺伝子
に類似させるべきであろう。
の遺伝子を発現させても何ら支障はなく、ある場合には
発現系に適合させた遺伝子より効率がよい（Ｍ、Ｉ（、
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、ｒヌクレイツク アシッズ リサ
ーチ、シンポジウム シリーズ（Ｎｕｅｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
５ａｒｉｅｓ）Ｊ↓１，１９７ （’８２））、遺伝
子の発現を高めるための因子としては多くのものが挙げ
られるが、構造遺伝子に対応するｍＲＮＡの安定性なら
びに翻訳効率も重視される。この場合ｍＲＮＡの塩基配
列が決定する高次構造が重要な意味を持つと推定される
。これらの点を考慮するとｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列
をアミノ酸配列を変えない範囲でネズミのＥＧＦ遺伝子
に類似させるべきであろう。
実際にこの考え方でｈＥＧＦ遺伝子をデザインしたとこ
ろ、ネズミのそれに対して９０％近い相同性を持たせる
ことが可能であった。しかし、目的とする遺伝子を正確
に構築するためには、さらにＤＮＡＮ玉鎖上ける比較的
長い自己相補性の存在あるいは二重鎖ＤＮＡ間での正常
でない相補性を最小限にすべきである。これらの条件を
満足させるためにコンピューターを利用して若干の修正
を施し、第１図に示すような、ｈ Ｅ Ｇ Ｆの製造に
最も適した新規なりＮＡ配列を見出した。第１図にはＤ
ＮＡ配列に加えてアミノ酸配列を示す。
ろ、ネズミのそれに対して９０％近い相同性を持たせる
ことが可能であった。しかし、目的とする遺伝子を正確
に構築するためには、さらにＤＮＡＮ玉鎖上ける比較的
長い自己相補性の存在あるいは二重鎖ＤＮＡ間での正常
でない相補性を最小限にすべきである。これらの条件を
満足させるためにコンピューターを利用して若干の修正
を施し、第１図に示すような、ｈ Ｅ Ｇ Ｆの製造に
最も適した新規なりＮＡ配列を見出した。第１図にはＤ
ＮＡ配列に加えてアミノ酸配列を示す。
該遺伝子は融合ペプチドとして発現させることもできる
し、融合ペプチドとせず、直接ｈＥＧＦとして発現する
こともできる。
し、融合ペプチドとせず、直接ｈＥＧＦとして発現する
こともできる。
前者の場合は、ｈＥＧＦの合成遺伝子の５′末端側に開
始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ以外の蛋白質をコー
ドするＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終
るか、または開始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ合成
遺伝子の３′末端側にｈＥＧＦ以外の蛋白質をコードす
るＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終って
もよい。
始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ以外の蛋白質をコー
ドするＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終
るか、または開始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ合成
遺伝子の３′末端側にｈＥＧＦ以外の蛋白質をコードす
るＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終って
もよい。
後者の直接発現に用いるには第２図に示すように、ｈＥ
ＧＦのポリペプチドをコードする配列に加えて開始コド
ンＡＴＧ、停止コドン例えばＴＡＧを各々５′側と３′
側に直接配し、また５′末端側と３′末端側はベクター
への挿入のために各々Ｅｃｏ ＲＩ、Ｂａｍ ＨＩ付
着末端とし、それ構造遺伝子の後半部にＢｇｌＩＩの認
識部位を設ける。１外にも遺伝子操作上の多様性を持た
せるために構また３′末端の下流にはＰｓｔ Ｉの認
識部位を設けることもできる。以上の修正を施すと、ネ
ズミのＥＧＦ （ｍＥＧＦ）遺伝子に対して８０％の相
同性となる。
ＧＦのポリペプチドをコードする配列に加えて開始コド
ンＡＴＧ、停止コドン例えばＴＡＧを各々５′側と３′
側に直接配し、また５′末端側と３′末端側はベクター
への挿入のために各々Ｅｃｏ ＲＩ、Ｂａｍ ＨＩ付
着末端とし、それ構造遺伝子の後半部にＢｇｌＩＩの認
識部位を設ける。１外にも遺伝子操作上の多様性を持た
せるために構また３′末端の下流にはＰｓｔ Ｉの認
識部位を設けることもできる。以上の修正を施すと、ネ
ズミのＥＧＦ （ｍＥＧＦ）遺伝子に対して８０％の相
同性となる。
本発明のｈＥＧＦ遺伝子の合成に肖っては、例えば第２
図に示すように最終的にはｈＥＧＦ遺伝子を２２個のフ
ラグメントに分割したが、ここでフラグメントの自己会
合を避けるために、５′あるいは３′末端に自己相補的
配列が出現しないよう注意した。第３図に各ＤＮＡフラ
グメントを示す。このフラグメントへの分割の仕方は上
記自己会合を避ける等の注意をすれば、上記のものに限
定される必要はなく１種々の分は方が可能である。
図に示すように最終的にはｈＥＧＦ遺伝子を２２個のフ
ラグメントに分割したが、ここでフラグメントの自己会
合を避けるために、５′あるいは３′末端に自己相補的
配列が出現しないよう注意した。第３図に各ＤＮＡフラ
グメントを示す。このフラグメントへの分割の仕方は上
記自己会合を避ける等の注意をすれば、上記のものに限
定される必要はなく１種々の分は方が可能である。
各ＤＮＡフラグメント（＃１〜＃２２）は既知の合成法
に従って製造し得る。各フラグメントは必要に応じて５
′末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、２乃
至３群に分けてパイプリダイズさせＤＮＡリガーゼによ
って二重鎖ＤＮＡとする。さらに各群を再びＤＮＡリガ
ーゼで連結させることによって完全なｈＥＧＦ遺伝子が
得られた（第４図参照）。
に従って製造し得る。各フラグメントは必要に応じて５
′末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、２乃
至３群に分けてパイプリダイズさせＤＮＡリガーゼによ
って二重鎖ＤＮＡとする。さらに各群を再びＤＮＡリガ
ーゼで連結させることによって完全なｈＥＧＦ遺伝子が
得られた（第４図参照）。
これをｐ ｒ（Ｒ３２２のＥ ｃ ｏ ＲＩおよびＢａ
ｎＨＴによる消化物と結合させ、新規プラスミドＰＴＢ
３６＋を得、大腸菌１）Ｈｌを形質転換する。
ｎＨＴによる消化物と結合させ、新規プラスミドＰＴＢ
３６＋を得、大腸菌１）Ｈｌを形質転換する。
単能したプラスミドについてＤＮＡフラグメントの一部
をプライマーとしてＳａｎｇｅｒ法によって塊法配列を
決定し、目的とするｈＥＧＦ遺伝子の存在を確認する。
をプライマーとしてＳａｎｇｅｒ法によって塊法配列を
決定し、目的とするｈＥＧＦ遺伝子の存在を確認する。
本発明の合成遺伝子を発現するに際しては、プラスミド
、バクテリオファージなどのベクターにｔ、Ｉｉ人した
組換えＤＮＡとして用いることが好ましい。
、バクテリオファージなどのベクターにｔ、Ｉｉ人した
組換えＤＮＡとして用いることが好ましい。
上記組換えＤＮＡは前記した開始コドンＡＴＧの上流に
プロモーターを有しているのが好ましく、該プロモータ
ーは、形質転換体の製造に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであればいかなるものでもよい。
プロモーターを有しているのが好ましく、該プロモータ
ーは、形質転換体の製造に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであればいかなるものでもよい。
たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；
例、２９４．ＷＳ２１０．ＤＨＩ、Ｎ４８３０など）で
はｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃ
Ａプロモーター、入Ｐプロモーター＋ｌＰＰプロモー
ター、など、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ；例、Ｍｌ １１４など）ではｓｐｏ ｔプロ
モーター。
例、２９４．ＷＳ２１０．ＤＨＩ、Ｎ４８３０など）で
はｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃ
Ａプロモーター、入Ｐプロモーター＋ｌＰＰプロモー
ター、など、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ；例、Ｍｌ １１４など）ではｓｐｏ ｔプロ
モーター。
５ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰ プロモーターなど
、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅＨ例、Ａ３２２など）ではＰ Ｈ０５プロモーター
、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプ
ロモーターなど、動物細胞（例、サル細胞ＣＯ５−７，
チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯなど）ではＳＶ４０
由来のプロモーターやマウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ
）由来のＬ Ｔ Ｒ領域のプロモーターなどが挙げられ
る。とりわけ宿主が大腸菌の場合はプロモーターがｔｒ
ｐプロモーターまたは入ＰＬプロモーターであることが
好ましく、宿主が動物細胞の場合は、上記プロモーター
に加え、エンハンサ−を有することが好ましい。
、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅＨ例、Ａ３２２など）ではＰ Ｈ０５プロモーター
、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプ
ロモーターなど、動物細胞（例、サル細胞ＣＯ５−７，
チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯなど）ではＳＶ４０
由来のプロモーターやマウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ
）由来のＬ Ｔ Ｒ領域のプロモーターなどが挙げられ
る。とりわけ宿主が大腸菌の場合はプロモーターがｔｒ
ｐプロモーターまたは入ＰＬプロモーターであることが
好ましく、宿主が動物細胞の場合は、上記プロモーター
に加え、エンハンサ−を有することが好ましい。
ｈＥＧＦ合成遺伝子の発現の一例を次に述べる（第５図
参照）。
参照）。
ｐ Ｔ Ｂ ３６１からＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩで切り出
される１７２塩基対のＤＮＡを発現用ベクターｐＬｒｐ
７８１のＥｒ、ｏＲｒ、Ｐｓ ｔ Ｔ部位に組込み、Ｐ
ｔｒｐ支配下の発現用ベクターｐＴＢ ３７０を得た。
される１７２塩基対のＤＮＡを発現用ベクターｐＬｒｐ
７８１のＥｒ、ｏＲｒ、Ｐｓ ｔ Ｔ部位に組込み、Ｐ
ｔｒｐ支配下の発現用ベクターｐＴＢ ３７０を得た。
一方、ＰＴＢ３６１のＥ ｃ ｏ ＲＩ −Ｂ ａ ｍ
ＨＩ消化によって得られる１７９塩基対のＤＮＡを発
現用ベクターｐＴＢ２８１のＥ ｃ ｏ ＲＩ −Ｂ
ａ ｍＨ１部位に組込みＰＬ支配下の発現用ベクターｐ
ＴＢ３７２とした。
ＨＩ消化によって得られる１７９塩基対のＤＮＡを発
現用ベクターｐＴＢ２８１のＥ ｃ ｏ ＲＩ −Ｂ
ａ ｍＨ１部位に組込みＰＬ支配下の発現用ベクターｐ
ＴＢ３７２とした。
ｐＴＢ ３７０を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換し、生
育するコロニーをアンピシリン感受性を指標にして選別
し、目的に＋ Ｅ Ｇ Ｆ遺伝子を含む株を得た。
育するコロニーをアンピシリン感受性を指標にして選別
し、目的に＋ Ｅ Ｇ Ｆ遺伝子を含む株を得た。
ｐＴＢ３７２の場合には、温度感受性大腸菌Ｎ４８３０
を用いて形質転換し、テトラサイクリン感受性を指標と
して選別し、クローニングしたＰＴＲ３７２で大腸菌Ｄ
ＨＩを形質転換して合成遺伝子の発現を行った。
を用いて形質転換し、テトラサイクリン感受性を指標と
して選別し、クローニングしたＰＴＲ３７２で大腸菌Ｄ
ＨＩを形質転換して合成遺伝子の発現を行った。
また、ｐＴＢ３６１からＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで切り
出されるＥＧＦ遺伝子を、動物細胞発現用ベクターｐＴ
Ｂ ３９６に組込み、さらにその５ｖ−４０プロモータ
ーの上流に、マウス白血病ウィルス由来のＬＴＲ（ＸＪ
Ｉ域（ＭｕＬＶ ＬＴＲ）を含むＤＮＡ断片をＣ１ａ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩで切り出して挿入し、動物細胞発現
用ベクターｐＴＢ５０６とした。
出されるＥＧＦ遺伝子を、動物細胞発現用ベクターｐＴ
Ｂ ３９６に組込み、さらにその５ｖ−４０プロモータ
ーの上流に、マウス白血病ウィルス由来のＬＴＲ（ＸＪ
Ｉ域（ＭｕＬＶ ＬＴＲ）を含むＤＮＡ断片をＣ１ａ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩで切り出して挿入し、動物細胞発現
用ベクターｐＴＢ５０６とした。
ｐＴＢ５０６で、マウスＬＡ９細胞を共形質転換し、ク
ローニングを行い形質転換体マウスＬＡ９−ＥＧＦ−３
細胞とした。
ローニングを行い形質転換体マウスＬＡ９−ＥＧＦ−３
細胞とした。
これら形質転換株を培養し、菌体を７Ｍグアニジン処理
した液中に含まれるｈＥＧＦを（１）で標識されたｍＥ
ＧＦとの競合反応によるヒト胎児包皮細胞ＥＧＦ受容体
結合アッセイにより定量したところ、大腸菌ＤＨＩ／ｐ
ＴＢ３７０によって約２ｍｇ／１以上の産生量を示した
（第１表参照）。この発現量は大腸菌におけるｈＥＧＦ
の直接発現としては注目すべきものである。
した液中に含まれるｈＥＧＦを（１）で標識されたｍＥ
ＧＦとの競合反応によるヒト胎児包皮細胞ＥＧＦ受容体
結合アッセイにより定量したところ、大腸菌ＤＨＩ／ｐ
ＴＢ３７０によって約２ｍｇ／１以上の産生量を示した
（第１表参照）。この発現量は大腸菌におけるｈＥＧＦ
の直接発現としては注目すべきものである。
止皿
本発明ではｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列として。
発現系の細胞において最も容認されたコドンを採用する
のでなく、むしろｈＥＧＦとそのアミノ酸配列において
順位したｍ Ｅ Ｇ Ｆの遺伝子のＤＮＡ配列と高い相
同性を有するＤＮＡ配列とすることによって、ｍ ＲＮ
Ａの安定性、翻訳効率、ｍ ＲＮＡの塩基配列が決定
する高次構造の影響が良好なものとなって、ｈＥＧＦが
効率よく生産される。
のでなく、むしろｈＥＧＦとそのアミノ酸配列において
順位したｍ Ｅ Ｇ Ｆの遺伝子のＤＮＡ配列と高い相
同性を有するＤＮＡ配列とすることによって、ｍ ＲＮ
Ａの安定性、翻訳効率、ｍ ＲＮＡの塩基配列が決定
する高次構造の影響が良好なものとなって、ｈＥＧＦが
効率よく生産される。
また本発明では構造遺伝子の後半部にＢｇｌＩＩ。
３′末端近くにＰｓｔ Ｉの認識部位を有することに
よって、遺伝子挿入の成否、挿入方向の確認を容易にし
たり、数種類のベクターに乗せることができる等、遺伝
子操作上の有利さ、多様性を発揮し得るものである。
よって、遺伝子挿入の成否、挿入方向の確認を容易にし
たり、数種類のベクターに乗せることができる等、遺伝
子操作上の有利さ、多様性を発揮し得るものである。
そして本発明で提供するｈＥＧＦ遺伝子は新規なりＮＡ
配列を有し、しかも微生物より大巾に人間に近いネズミ
のＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列と高い相同性を有するもの
で、ｈＥＧＦの高い発現率が期待され、また本発明によ
り初めてｈＥＧＦを大腸菌を宿主とした系で直接発現さ
せることが可能となった。更に本発明のｈＥＧＦに対応
する合成遺伝子を用いた組換えＤＮＡ技術により、ｈ−
ＥＧＦをより効率よく製造することができ、治療薬とし
てのｈＥＧＦの生産や、ｈＥＧＦの生体内での役割や細
胞増殖調節機構の解明、ひいては発癌機構の解明に役立
つものである。
配列を有し、しかも微生物より大巾に人間に近いネズミ
のＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列と高い相同性を有するもの
で、ｈＥＧＦの高い発現率が期待され、また本発明によ
り初めてｈＥＧＦを大腸菌を宿主とした系で直接発現さ
せることが可能となった。更に本発明のｈＥＧＦに対応
する合成遺伝子を用いた組換えＤＮＡ技術により、ｈ−
ＥＧＦをより効率よく製造することができ、治療薬とし
てのｈＥＧＦの生産や、ｈＥＧＦの生体内での役割や細
胞増殖調節機構の解明、ひいては発癌機構の解明に役立
つものである。
太庭廻１主ぜ徴求
次に本発明を実施例により説明する。
なお以下に開示する形質転換体 エシェリヒアコリ （
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ＰＴＢ
３７０およびエシェリヒアコリ（’Ｅ ５ｃｂｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨＩ／ｐＴＢ３７２、ｐＲＫ２
４８ｃＩｔｓは、財団法人発酵研究所（Ｉ Ｆ Ｏ）
ニそれぞれＩＦＯ−１４３７９オヨびＩＦＯ−１４３８
０とシテ、また昭和５９年１０月５日から通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にそれぞれＦ
ＥＲＭ ＢＰ−８４３およびＦＥＲＭ ＢＰ−８４
４として寄託されている。またＭｏｕｓｅ ＬＡ９−
ＥＧＦ−３は財団法人発酵研究所にＩＦＯ−５００５５
として寄託されている。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ＰＴＢ
３７０およびエシェリヒアコリ（’Ｅ ５ｃｂｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨＩ／ｐＴＢ３７２、ｐＲＫ２
４８ｃＩｔｓは、財団法人発酵研究所（Ｉ Ｆ Ｏ）
ニそれぞれＩＦＯ−１４３７９オヨびＩＦＯ−１４３８
０とシテ、また昭和５９年１０月５日から通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にそれぞれＦ
ＥＲＭ ＢＰ−８４３およびＦＥＲＭ ＢＰ−８４
４として寄託されている。またＭｏｕｓｅ ＬＡ９−
ＥＧＦ−３は財団法人発酵研究所にＩＦＯ−５００５５
として寄託されている。
実施例１．ＤＮＡフラグメントの合成
りＮＡフラグメントはフォスフォ１−リエステル法によ
る同相合成（Ｉｔｏ、Ｈ，ら「ヌクレイッり アシッズ
リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）Ｊ １０
．１７５５ （１９８２））で、ν□ 各々合成した。また、原料となるダイマーブロックは、
Ｂｒｏｋａらの方法（Ｂｒｏｋａ、Ｃ，ら。
る同相合成（Ｉｔｏ、Ｈ，ら「ヌクレイッり アシッズ
リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）Ｊ １０
．１７５５ （１９８２））で、ν□ 各々合成した。また、原料となるダイマーブロックは、
Ｂｒｏｋａらの方法（Ｂｒｏｋａ、Ｃ，ら。
「ヌクレイツク アシソズ リサーチ（Ｎｕｃｌ。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）Ｊ、８．５４６１ （１９
８０）〕に従い合成したもの、あるいは市販品（和光純
薬工業）の完全保護ダイマーを、ピリジン（Ｐｙ）、
トリエチルアミン（ＴＥＡ）、水（３： ｌ ： １．
ｖ／ｖ）の混液に溶解させ、シアノエチル基を除去後、
ペンタン、 Ｚ−テ）Ｌｔ （１：１、ｖ／ｖ）の混液
中で、粉末としたものを用いた。ＤＮＡフラグメントの
合成手順は次の通りである。
８０）〕に従い合成したもの、あるいは市販品（和光純
薬工業）の完全保護ダイマーを、ピリジン（Ｐｙ）、
トリエチルアミン（ＴＥＡ）、水（３： ｌ ： １．
ｖ／ｖ）の混液に溶解させ、シアノエチル基を除去後、
ペンタン、 Ｚ−テ）Ｌｔ （１：１、ｖ／ｖ）の混液
中で、粉末としたものを用いた。ＤＮＡフラグメントの
合成手順は次の通りである。
ジメトキシトリチルヌクレオシドを付着させた（１）ジ
クロルメタン中３％（ｗ／ｖ）トリクロロ
ニ２５ｍｇの１％ポリスチレン（バッケム社）を、次の
試薬で順次処理した。
クロルメタン中３％（ｗ／ｖ）トリクロロ
ニ２５ｍｇの１％ポリスチレン（バッケム社）を、次の
試薬で順次処理した。
酢酸（ＴＣＡ） （Ｔ ａ ｎ ａ ｋ ａ 、 Ｔ
、ら「ヌク Ｆレイツク アシッズ リサーチ
（Ｎｕｃｌ、Ａｃ’ｉｄｓ Ｒｅｓ、）Ｊ、１０．３
２４９ （＋９８２）〕で１分×２（２回同じ操作を
行ったことを示す） （２）ジクロルメタン ×４ （３）ピリジン ×３ （４）２０ｍｇのジヌクレオチドブロック又は３０ｍｇ
の七ツマーブロックを含む０．３ｍｌの乾燥ピリジン （５）上記溶液を減圧下濃縮（ピリジン共沸）（６）２
５ｍｇのメシチレンスルホニルニトロトリアゾリッド トリアゾールを含む０．３ｍｌの乾燥ピリジンで４０℃
、２０分間 （７）ピリジン Ｉ２ （８ＨＯ％（Ｖ／Ｖ）無水酢酸およびＯ．１Ｍジメチル
アミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含有するピリジン２ ｍ
ｌで２分間 （９）ピリジン Ｉ２ （ｌＯ）ジクロルメタン Ｉ３ 適当なジスクレオチドあるいはモノヌクレオチドブロッ
クを用いて、この約４０分のサイクルを反復し、目的と
するオリゴヌクレオチド鎖を完結させた。合成完了後．
０．５Ｍの１，１，３．３−テトラメチルグアニジウム
−ピリジン−２−フルトキシム（Ｒｅ ｅ ｓ ｅ，Ｃ
．Ｂ．ら「テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔ ｔ．）Ｊ 、２７２７＜１ ９７
８））で４０’ｃ、１・１時間処理し、重合体担体より
目的物を取り出し、次に濃アンモニア水で６０℃，４時
間処理して、ジメトキシトリチル基以外の保護基をすべ
て除いたにの試料を逆相の０８シリカゲル（リクロプレ
ップＲＰー８．メルク社）のカラム（５６ ３ 。
、ら「ヌク Ｆレイツク アシッズ リサーチ
（Ｎｕｃｌ、Ａｃ’ｉｄｓ Ｒｅｓ、）Ｊ、１０．３
２４９ （＋９８２）〕で１分×２（２回同じ操作を
行ったことを示す） （２）ジクロルメタン ×４ （３）ピリジン ×３ （４）２０ｍｇのジヌクレオチドブロック又は３０ｍｇ
の七ツマーブロックを含む０．３ｍｌの乾燥ピリジン （５）上記溶液を減圧下濃縮（ピリジン共沸）（６）２
５ｍｇのメシチレンスルホニルニトロトリアゾリッド トリアゾールを含む０．３ｍｌの乾燥ピリジンで４０℃
、２０分間 （７）ピリジン Ｉ２ （８ＨＯ％（Ｖ／Ｖ）無水酢酸およびＯ．１Ｍジメチル
アミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含有するピリジン２ ｍ
ｌで２分間 （９）ピリジン Ｉ２ （ｌＯ）ジクロルメタン Ｉ３ 適当なジスクレオチドあるいはモノヌクレオチドブロッ
クを用いて、この約４０分のサイクルを反復し、目的と
するオリゴヌクレオチド鎖を完結させた。合成完了後．
０．５Ｍの１，１，３．３−テトラメチルグアニジウム
−ピリジン−２−フルトキシム（Ｒｅ ｅ ｓ ｅ，Ｃ
．Ｂ．ら「テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔ ｔ．）Ｊ 、２７２７＜１ ９７
８））で４０’ｃ、１・１時間処理し、重合体担体より
目的物を取り出し、次に濃アンモニア水で６０℃，４時
間処理して、ジメトキシトリチル基以外の保護基をすべ
て除いたにの試料を逆相の０８シリカゲル（リクロプレ
ップＲＰー８．メルク社）のカラム（５６ ３ 。
Ｏｘ２．Ｏｃｍ）にかけ、３０％アセトニトリルで溶出
した分画を，８０％酢酸で室温、１５分間処理した。エ
ーテル洗浄後，さらにイオン交換高速液体クロマトグラ
フィー（パーティジル１０８ＡＸ，ワットマン社）で精
製（Ｇａ ｉ ｔ，Ｍ．Ｊ。
した分画を，８０％酢酸で室温、１５分間処理した。エ
ーテル洗浄後，さらにイオン交換高速液体クロマトグラ
フィー（パーティジル１０８ＡＸ，ワットマン社）で精
製（Ｇａ ｉ ｔ，Ｍ．Ｊ。
ら Ｊ．Ｃ．Ｓ．、ｒケミカル コミユニケーシヨンズ
（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｒｎｕｎ．）Ｊ ＋ ３７ （１９
８２））を行ない、純粋なりＮＡフラグメントを得た。
（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｒｎｕｎ．）Ｊ ＋ ３７ （１９
８２））を行ない、純粋なりＮＡフラグメントを得た。
この様にして合成した２２種のＤＮＡフラグメントは第
３図に示した通りである。
３図に示した通りである。
実施例２ オリゴＤＮＡのリン酸化
各々のＤＮＡフラグメントを２ ５ 、、、 ｌのリン
酸化反応液〔オリゴＤＮＡ２．５．”ｇ，５０ｍＭＴ’
ｒ ｉ ｓ−ＨＣ Ｉ， ｐＴ（７． ６， ｌ Ｏ
ｍＭ ＭｇＣＩ２ 、１ ０ｍＭ ２−メルカプト
エタノール。
酸化反応液〔オリゴＤＮＡ２．５．”ｇ，５０ｍＭＴ’
ｒ ｉ ｓ−ＨＣ Ｉ， ｐＴ（７． ６， ｌ Ｏ
ｍＭ ＭｇＣＩ２ 、１ ０ｍＭ ２−メルカプト
エタノール。
］ｍＭ ＡＴＰ，２’．５ユニツト′ｒ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（全酒造）〕中で，３７℃．１時間反応
させ，５′末端をリン酸化した。この反応液をこのまま
凍結し、融解後，次の反応に用いた。
オチドキナーゼ（全酒造）〕中で，３７℃．１時間反応
させ，５′末端をリン酸化した。この反応液をこのまま
凍結し、融解後，次の反応に用いた。
実施例３ ＤＮＡフラグメントの連結ｈｌ！ＧＦ遺伝
子の２重鎖構成の１連の段階は第４図に示した通りであ
る（図中−印は５′末端水酸基がリン酸化されているこ
とを示す）、たとえばブロックＩの連結は次の様にした
．１２種（ＤＮＡフラグメント１から１２に各々対応す
る）の実施例２の操作で得たＤＮＡフラグメントのリン
酸化反応液を５，−ｌずつ加え．６０，、１とした。
子の２重鎖構成の１連の段階は第４図に示した通りであ
る（図中−印は５′末端水酸基がリン酸化されているこ
とを示す）、たとえばブロックＩの連結は次の様にした
．１２種（ＤＮＡフラグメント１から１２に各々対応す
る）の実施例２の操作で得たＤＮＡフラグメントのリン
酸化反応液を５，−ｌずつ加え．６０，、１とした。
これに１．４ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造）
を加え，１４℃で２５時間インキュベートした後，６５
℃で１０分間処理し、反応をとめた。
を加え，１４℃で２５時間インキュベートした後，６５
℃で１０分間処理し、反応をとめた。
ここで主生成物となったブロック■の２Ｍ体を。
制限エンドヌクレアーゼＥｅｏＲＩ（全酒造）で消化す
るために、この反応液に次の３成分を５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ，０．０１％牛血清７）ｌｉブミン（ＢＳＡ）、７
ｍＭＭｇＣＩ２になるように加え、１２０ユニツトのＥ
ｃｎＲＩで３７℃，１．５時間反応させ，６％含有アク
リルアミドゲルを用いて、緩衝液（ｐＨ８．３）（１
００ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ−ＨＣＩ，１００ｍＭホウ酸，
２ｍＭ ＥＤＴＡ）中．２５ｍＡ−で１．５時間電気泳
動にかけた．泳動後．０．６ｍｇ／ｌのエチジウムブロ
マイド（ＥｔＢｒ）でゲルを染色し．１０１ｂｐのＤＮ
Ａ断片を含むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動用
緩衝液内に沈め、ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出し
た〔「ジャーナル オブ モレキュラーバイオロジー（
Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ．）Ｊ 。
るために、この反応液に次の３成分を５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ，０．０１％牛血清７）ｌｉブミン（ＢＳＡ）、７
ｍＭＭｇＣＩ２になるように加え、１２０ユニツトのＥ
ｃｎＲＩで３７℃，１．５時間反応させ，６％含有アク
リルアミドゲルを用いて、緩衝液（ｐＨ８．３）（１
００ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ−ＨＣＩ，１００ｍＭホウ酸，
２ｍＭ ＥＤＴＡ）中．２５ｍＡ−で１．５時間電気泳
動にかけた．泳動後．０．６ｍｇ／ｌのエチジウムブロ
マイド（ＥｔＢｒ）でゲルを染色し．１０１ｂｐのＤＮ
Ａ断片を含むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動用
緩衝液内に沈め、ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出し
た〔「ジャーナル オブ モレキュラーバイオロジー（
Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ．）Ｊ 。
１１０、１１９ （１９７７）、）。この透析チューブ
内液を０．Ｏ ＩＭ Ｔｒ ｉ ｓ−ＨＣＩ，（ｐＨ７
。
内液を０．Ｏ ＩＭ Ｔｒ ｉ ｓ−ＨＣＩ，（ｐＨ７
。
６）、０．１ＭＮａｃｌおよびＯ．ＯＯＩＭ ＥＤＴＡ
で飽和したフェノールで３回抽出し、さらにエーテル抽
出した後、Ｎ ａ Ｃ １を０．２Ｍとなるように加え
た。続いて２倍量の冷エタノールを加えて，−２０℃で
ＤＮＡを沈澱させた。以上と同様の操作によってさらに
ブロックＩＩ（Ｉ１３からＩ２２を含む）を調製した。
で飽和したフェノールで３回抽出し、さらにエーテル抽
出した後、Ｎ ａ Ｃ １を０．２Ｍとなるように加え
た。続いて２倍量の冷エタノールを加えて，−２０℃で
ＤＮＡを沈澱させた。以上と同様の操作によってさらに
ブロックＩＩ（Ｉ１３からＩ２２を含む）を調製した。
実施例４ ｈＥＧＦ遺伝子のクローニング（第５図）
クローニングベクターには大腸菌のプラスミドＰ Ｂ
Ｒ３２２を使用した。ｐＢＲ３２２ＤＮＡを２０、−１
の反応液（１０ｒｎＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ。
Ｒ３２２を使用した。ｐＢＲ３２２ＤＮＡを２０、−１
の反応液（１０ｒｎＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ。
ｐＨ８，０，７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭＮａＣ＋
、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール。
、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール。
０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１９ユニツ
トのＥｃｏＲＩ （宝酒造）、５ユニツトのＢａｍＨ
Ｉ（宝／？ｉ造）〕中、３７℃、１時間反応させた後、
水で３倍稀釈し、６５℃で１０分間処理し、酵素を失活
させた。この反応液０．５．＝１と約２０当量のＤＮＡ
フラグメン１−ブロック！および■とを混合し、６６
ｍ Ｍ Ｔ ｒ ｉ ｓ −ＨＣ１（ｐＨ７，５）、６
．６ｒｒｔＭ ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ ジチオスレイト
ール（ＤＤＴ）および１ｍＭＡ ”Ｉ” Ｐ存在下、１
０−１の反応液として、１４℃。
トのＥｃｏＲＩ （宝酒造）、５ユニツトのＢａｍＨ
Ｉ（宝／？ｉ造）〕中、３７℃、１時間反応させた後、
水で３倍稀釈し、６５℃で１０分間処理し、酵素を失活
させた。この反応液０．５．＝１と約２０当量のＤＮＡ
フラグメン１−ブロック！および■とを混合し、６６
ｍ Ｍ Ｔ ｒ ｉ ｓ −ＨＣ１（ｐＨ７，５）、６
．６ｒｒｔＭ ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ ジチオスレイト
ール（ＤＤＴ）および１ｍＭＡ ”Ｉ” Ｐ存在下、１
０−１の反応液として、１４℃。
２時間Ｔ４ＤＮＡリガーゼにューイングランド・バイオ
ラボ社製）を作用させて、ｈＴ”ＧＦ遺伝子をプラスミ
ドに結合させた。
ラボ社製）を作用させて、ｈＴ”ＧＦ遺伝子をプラスミ
ドに結合させた。
この反応液を用い、既知の方法に従い、大腸菌０８１株
（Ｓｅ １ｓｏｎ、Ｍ、Ｅ、ら、「ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）Ｊ、２１７． １１１’０−１１１４（１９６
Ｂ））を形質転換させた。すなわち。
（Ｓｅ １ｓｏｎ、Ｍ、Ｅ、ら、「ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）Ｊ、２１７． １１１’０−１１１４（１９６
Ｂ））を形質転換させた。すなわち。
−７０°Ｃで保存していた５０．、ｌのコンピテントセ
ルロー１ａｎａ）ｔａｎ、Ｄ、、ｒジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ。
ルロー１ａｎａ）ｔａｎ、Ｄ、、ｒジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、）Ｊ、１６６．５５７ （１９８３））を０
℃、１５分間インキュベー１−シた後、４．−１の上記
反応液を添加した。さらに０°Ｃ１３０分間インキュベ
ートした後、４２℃、１．５分間おき、さらに０℃で５
分間おいた。この反応液に２００、ＬＡ ｌのＬＢ培地
（ＩＩ当リすクト１−リプトンｌ。
℃、１５分間インキュベー１−シた後、４．−１の上記
反応液を添加した。さらに０°Ｃ１３０分間インキュベ
ートした後、４２℃、１．５分間おき、さらに０℃で５
分間おいた。この反応液に２００、ＬＡ ｌのＬＢ培地
（ＩＩ当リすクト１−リプトンｌ。
ｇ、バクトイ−スト抽出物５ｇ、ＮａＣ１８ｇを含む）
を加え、３７℃、５０分間インキュベートした。この大
腸菌を３５、− ｇ ／ ｍ ｌのアンピシリンを含む
■、Ｂ寒天培地上にまき、３７°Ｃで１晩培養した。生
じたアンピシリン耐性コロニー中。
を加え、３７℃、５０分間インキュベートした。この大
腸菌を３５、− ｇ ／ ｍ ｌのアンピシリンを含む
■、Ｂ寒天培地上にまき、３７°Ｃで１晩培養した。生
じたアンピシリン耐性コロニー中。
６０株を選び、さらに７、− ｇ ／ ｍ ｌのテトラ
サイクリンを含むｒ、Ｂ寒天培地に接種したが、５９株
ははえなかった。次にこの５９株中１６株を選択し、こ
の転換株のプラスミドＤＮＡをアルカリ法（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ、Ｔ、ら、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ））Ｊ 。
サイクリンを含むｒ、Ｂ寒天培地に接種したが、５９株
ははえなかった。次にこの５９株中１６株を選択し、こ
の転換株のプラスミドＤＮＡをアルカリ法（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ、Ｔ、ら、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ））Ｊ 。
３６８−３６９ （１９８２））により粗精製し。
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＴ消化、さらにＥｃ。
Ｒ１およびＢｇｌＩＩ消化、ＰｓｔＩ消化した。これら
消化物の２％アガロースゲルでの泳動パターンから、１
４株が正しくｈＥＧＦ遺伝子の挿入されている転換株で
あることがわかった。この様にして得たクローニングベ
クターをｐＴＢ３６１と名付けた。 このプラスミドｐ
Ｔ８３６１を持つ大腸菌Ｃ８１組み換え体の１白金耳を
、３５、−ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１．
５ｍｌに接種し、３７℃で一夜、振盪培養した。この培
養液０．３ｒｎｌを２００ ｍ ｌフラスコに分注した
２５ｍ１の同じ培地に加え、３７℃、６．５時間振盪培
養した後、この培養液を５００ｍ１フラスコに分注した
同培地１２５ｍ１に加え、さらに４５分間振盪培養した
０次にクロラムフェニコールを１７０、− ｇ ／ ｍ
ｌになるように添加し、さらに−夜培養をつづけ、プ
ラスミドＤＮＡの増幅をはかった。この培養液１５０ｍ
１を、６０００ｒｐｍ、４℃、９分間遠心分離し、得ら
れた菌体を生理食塩水で洗浄し、４ｍｌの反応液（２５
ｍＭＴｒ １ｓ−ＨＣｌｅ ｐＨ８，ｏｆ ５０ｍＭ
グルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌリゾチ
ーム〕を加え、１！ｌＦＱした。氷中で２０分間おいた
後、８ｍｌのアルカリ溶液〔１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ。
消化物の２％アガロースゲルでの泳動パターンから、１
４株が正しくｈＥＧＦ遺伝子の挿入されている転換株で
あることがわかった。この様にして得たクローニングベ
クターをｐＴＢ３６１と名付けた。 このプラスミドｐ
Ｔ８３６１を持つ大腸菌Ｃ８１組み換え体の１白金耳を
、３５、−ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１．
５ｍｌに接種し、３７℃で一夜、振盪培養した。この培
養液０．３ｒｎｌを２００ ｍ ｌフラスコに分注した
２５ｍ１の同じ培地に加え、３７℃、６．５時間振盪培
養した後、この培養液を５００ｍ１フラスコに分注した
同培地１２５ｍ１に加え、さらに４５分間振盪培養した
０次にクロラムフェニコールを１７０、− ｇ ／ ｍ
ｌになるように添加し、さらに−夜培養をつづけ、プ
ラスミドＤＮＡの増幅をはかった。この培養液１５０ｍ
１を、６０００ｒｐｍ、４℃、９分間遠心分離し、得ら
れた菌体を生理食塩水で洗浄し、４ｍｌの反応液（２５
ｍＭＴｒ １ｓ−ＨＣｌｅ ｐＨ８，ｏｆ ５０ｍＭ
グルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌリゾチ
ーム〕を加え、１！ｌＦＱした。氷中で２０分間おいた
後、８ｍｌのアルカリ溶液〔１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ。
０．２Ｎ Ｎａ０Ｈ）を添加し、水中で５分間したら
、６ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ４゜８）を加
え、１０分間水中でおき、ｔｏ、ｏｏ。
、６ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ４゜８）を加
え、１０分間水中でおき、ｔｏ、ｏｏ。
ｒｐｍで４℃、２０分間遠心分離した。得られた上澄液
に２倍量のエタノールを加え、振盪した後、＝２０℃で
１０分間おき、１０．０００ｒｐｍで４℃、２０分間遠
心分離した。沈殿物を風乾後、４ｍｌのｌｉ！ｉ衝液（
１ｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ （ｐＨ８、０）、１ ０ｍ
Ｍ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣ１（ｐＨ８，０）
〕に溶かし、塩化セシウム（ＣｓＣ１）を３．９ｇ、Ｅ
ｔＢｒを３ｍｇ加え、Ｂｅｃｋｍａｎ５０Ｔｉローター
で３５．ＯＯＯｒｐｍ、１５℃、６４時間Ｃ５ＣＬ−Ｅ
ｔＢｒ平衡密度勾配遠心分離にかけた。プラスミドＤ
Ｎ Ａのバンドを集め、２倍量の緩衝液（１ｍ Ｍ Ｎ
ａ ２ Ｅ Ｉ） Ｔ Ａ 、 ｐ ［（８。
に２倍量のエタノールを加え、振盪した後、＝２０℃で
１０分間おき、１０．０００ｒｐｍで４℃、２０分間遠
心分離した。沈殿物を風乾後、４ｍｌのｌｉ！ｉ衝液（
１ｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ （ｐＨ８、０）、１ ０ｍ
Ｍ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣ１（ｐＨ８，０）
〕に溶かし、塩化セシウム（ＣｓＣ１）を３．９ｇ、Ｅ
ｔＢｒを３ｍｇ加え、Ｂｅｃｋｍａｎ５０Ｔｉローター
で３５．ＯＯＯｒｐｍ、１５℃、６４時間Ｃ５ＣＬ−Ｅ
ｔＢｒ平衡密度勾配遠心分離にかけた。プラスミドＤ
Ｎ Ａのバンドを集め、２倍量の緩衝液（１ｍ Ｍ Ｎ
ａ ２ Ｅ Ｉ） Ｔ Ａ 、 ｐ ［（８。
０、］ＯｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ、ｐＨ８，０）
を加え、等量のクロロホルム−フェノール（１： １゜
ｖ ／ ｖ ）を加えて２回洗浄し、ＥｔＢｒを除去後
。
を加え、等量のクロロホルム−フェノール（１： １゜
ｖ ／ ｖ ）を加えて２回洗浄し、ＥｔＢｒを除去後
。
エタノール沈殿を行なった。さらに沈殿物を０゜６ｍｌ
の緩衝液（１ｒｎＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒ ｉ
５−ＨＣＬ、ｐＨ８，０，０，３Ｍ Ｎ、１（”。
の緩衝液（１ｒｎＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒ ｉ
５−ＨＣＬ、ｐＨ８，０，０，３Ｍ Ｎ、１（”。
１〕に溶かし、もう一度エタノール沈殿を行なった。
ここで単踵したプラスミドｐＴＩ３３６１に組み込まれ
ているｈＥＧＦ遺伝子の塩基配列はＷａｌｌａｃｅらの
方法（Ｗａ ｌ ｌ ａ ｅ ｅ、 Ｒ，Ｂ、ら。
ているｈＥＧＦ遺伝子の塩基配列はＷａｌｌａｃｅらの
方法（Ｗａ ｌ ｌ ａ ｅ ｅ、 Ｒ，Ｂ、ら。
「ジーン（Ｇ ｅ ｎ ｅ）Ｊ、■、２］−２６（１９
８１）〕に従った。すなわち、ｐＴＢ３６１ＤＮＡを１
０、−１の反応液（７ｍ、Ｍ Ｔ ｒ ｉ ５−ＨＣｌ
。
８１）〕に従った。すなわち、ｐＴＢ３６１ＤＮＡを１
０、−１の反応液（７ｍ、Ｍ Ｔ ｒ ｉ ５−ＨＣｌ
。
ｐＨ７，５，７ｍＭ ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ ＮａＣ１
，，１ユニットのＰｖｕＩＩ（全酒造）〕中、３７℃、
１時間反応させた。この反応液にプライマーとしてＤＮ
Ａフラグメント＃７の水溶液（１，０Ａ２６０／ ｍ
ｌ ） ｌ 、−１を加え、１００℃で５分加熱後、
水浴で急冷した。以後の操作はジデオキシ法の一般法ど
おりで行なった。同様にして、プライマーにＤＮＡフラ
グメント＃１４、＃１８を用いてｈＥＧＦ３Ｊ！を伝子
の塩基配列が正しいことを確認した。
，，１ユニットのＰｖｕＩＩ（全酒造）〕中、３７℃、
１時間反応させた。この反応液にプライマーとしてＤＮ
Ａフラグメント＃７の水溶液（１，０Ａ２６０／ ｍ
ｌ ） ｌ 、−１を加え、１００℃で５分加熱後、
水浴で急冷した。以後の操作はジデオキシ法の一般法ど
おりで行なった。同様にして、プライマーにＤＮＡフラ
グメント＃１４、＃１８を用いてｈＥＧＦ３Ｊ！を伝子
の塩基配列が正しいことを確認した。
実施例５ ｈＥＧＦの発現用プラスミドの構築ならび
に形質転換体の製造（第５図） ｉ）上記実施例４で得られたｔ ｏ 、、、 ｇのｐＴ
Ｂ３６１を反応液（５０ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ Ｔｒ
ｉ ５−ＨＣＩ（ｐＨ７，６） ＋ ６ｍ
Ｍ Ｍ ｇｅｔ ２ 。
に形質転換体の製造（第５図） ｉ）上記実施例４で得られたｔ ｏ 、、、 ｇのｐＴ
Ｂ３６１を反応液（５０ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ Ｔｒ
ｉ ５−ＨＣＩ（ｐＨ７，６） ＋ ６ｍ
Ｍ Ｍ ｇｅｔ ２ 。
６ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０１％ＢＳＡ、
５０ユニットＥｃｏＲＩ、１０ユニツトＰｓｔＴ（全酒
造）〕中、３７°Ｃ２１，５時間反応させた後、２％ア
ガロースゲル電気泳動により１７２ｂｐＤＮＡ断片を常
法（前述）に従って情製した。一方、発現用ベクターに
はｐｔｒｐ７８１ ［Ｋｕｒｏｋａｗａ、Ｔ、ら、「
ヌクレイックアシノズ リサーチ（Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅｓ、）Ｊ 、１１，３０７７−３０８５ （
１９８３）〕を使用した− ｐｔｒｐ７８１ｂＮＡを
上記と同窪にして、Ｅ ｅ ｏ ＲＴおよびＰｓｔＴ消
化し、この反応液に２倍量の水を加え、６５℃で１０分
間おき、酵素を失活させた。
５０ユニットＥｃｏＲＩ、１０ユニツトＰｓｔＴ（全酒
造）〕中、３７°Ｃ２１，５時間反応させた後、２％ア
ガロースゲル電気泳動により１７２ｂｐＤＮＡ断片を常
法（前述）に従って情製した。一方、発現用ベクターに
はｐｔｒｐ７８１ ［Ｋｕｒｏｋａｗａ、Ｔ、ら、「
ヌクレイックアシノズ リサーチ（Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅｓ、）Ｊ 、１１，３０７７−３０８５ （
１９８３）〕を使用した− ｐｔｒｐ７８１ｂＮＡを
上記と同窪にして、Ｅ ｅ ｏ ＲＴおよびＰｓｔＴ消
化し、この反応液に２倍量の水を加え、６５℃で１０分
間おき、酵素を失活させた。
この様にして得た１７２ｂＰＤＮＡおよびプラスミドＤ
ＮＡは各々１両端にＥ ｃ ｏ ＲＩ消化およびＰ ｓ
ｔ Ｉ ’／Ｍ化により生じた単鎖の付着端を有する
。
ＮＡは各々１両端にＥ ｃ ｏ ＲＩ消化およびＰ ｓ
ｔ Ｉ ’／Ｍ化により生じた単鎖の付着端を有する
。
これら両者を混合し、６６ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ５−１
−ＩＣＩ、ｐＨ７，５，６，６ｍＭ ＭｇＣ１２，１
０ｍＭＤＴ’ｒおよびＩｍＭＡＴＰ存在下、１４℃、５
．５時間Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＦ２社）を作用させて
ＤＮＡを結合し、前出と同様な方法で大腸菌ＤＨＬ株を
形質転換させた。次にこの大腸菌を７、− ｇ ／ ｍ
ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上にまき、
３７℃で１日培養した。生じたテトラサイクリン耐性コ
ロニーを、次に３５、Ｌｍ ｇ ／ ｍ ｌのアンピシ
リンを含むＩ−Ｂ寒天培地に接種し、はえない転換株を
選び出した。さらに前出と同様な方法で、転・換株のプ
ラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、
さらにＢｇＩＩＩおよびＨｉ ｎ ｄ ｍで消化して、
ｈＥＧＦ遺伝子が正しく挿入された転換株を選択した。
−ＩＣＩ、ｐＨ７，５，６，６ｍＭ ＭｇＣ１２，１
０ｍＭＤＴ’ｒおよびＩｍＭＡＴＰ存在下、１４℃、５
．５時間Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＦ２社）を作用させて
ＤＮＡを結合し、前出と同様な方法で大腸菌ＤＨＬ株を
形質転換させた。次にこの大腸菌を７、− ｇ ／ ｍ
ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上にまき、
３７℃で１日培養した。生じたテトラサイクリン耐性コ
ロニーを、次に３５、Ｌｍ ｇ ／ ｍ ｌのアンピシ
リンを含むＩ−Ｂ寒天培地に接種し、はえない転換株を
選び出した。さらに前出と同様な方法で、転・換株のプ
ラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、
さらにＢｇＩＩＩおよびＨｉ ｎ ｄ ｍで消化して、
ｈＥＧＦ遺伝子が正しく挿入された転換株を選択した。
この様にして得た発現用プラスミドをｐＴＢ ３７０と
、 １↓ また形質転換体をエシェリヒアコリ Ｄ Ｈ１／
１ｐＴＢ ３７０と名づけだ。
１町 １１）へＰＬプロモーター遺伝子を持つＪ！現用ベクタ
ーは次の様にして構築した（第６図）プラスミドｐｔｒ
ｐ６０１ （Ｙ、Ｆｕｊ １ｓａＷａら、「ヌクレイツ
ク アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ ＲＯｓ、）Ｊ、１上。
、 １↓ また形質転換体をエシェリヒアコリ Ｄ Ｈ１／
１ｐＴＢ ３７０と名づけだ。
１町 １１）へＰＬプロモーター遺伝子を持つＪ！現用ベクタ
ーは次の様にして構築した（第６図）プラスミドｐｔｒ
ｐ６０１ （Ｙ、Ｆｕｊ １ｓａＷａら、「ヌクレイツ
ク アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ ＲＯｓ、）Ｊ、１上。
３５８１ （１９８３））を制限酵素Ｅ ｃ ｏ Ｒ
ＩおよびＣ１ａ Ｉで切断した後、生じた単鎖の付着端
をＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）でうめ、フェノール処理し、エタノール沈
殿を行なった。この直鎖状ＤＮＡを１４℃でＴ４ＤＮＡ
リガーゼを作用させて環状ＤＮＡとし。
ＩおよびＣ１ａ Ｉで切断した後、生じた単鎖の付着端
をＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）でうめ、フェノール処理し、エタノール沈
殿を行なった。この直鎖状ＤＮＡを１４℃でＴ４ＤＮＡ
リガーゼを作用させて環状ＤＮＡとし。
前出と同様な方法で大腸菌を形質転換させ、これよりｔ
ｒｐプロモーター下流がＥ ｃ ｏ ＲＩとなったプラ
スミドを単離し、ｐＴＢ５６と名付けた。
ｒｐプロモーター下流がＥ ｃ ｏ ＲＩとなったプラ
スミドを単離し、ｐＴＢ５６と名付けた。
次にこのプラスミドｐＴＢ５６をＰｖｕＩＩで消化し直
鎖状ＤＮＡとした後、合成オリゴヌクレオチド（Ｅｃｏ
ＲＩリンカ−）と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡ４ＤＮＡリガーゼな
った。この反応物をＥｃ ｏＲｌで消化した後、２％ア
ガロースゲル電気泳動によりｔｒｐプロモーター遺伝子
を含む約０．２８ｋｂｐＤＮＡ断片を定法に従って精製
した。
鎖状ＤＮＡとした後、合成オリゴヌクレオチド（Ｅｃｏ
ＲＩリンカ−）と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡ４ＤＮＡリガーゼな
った。この反応物をＥｃ ｏＲｌで消化した後、２％ア
ガロースゲル電気泳動によりｔｒｐプロモーター遺伝子
を含む約０．２８ｋｂｐＤＮＡ断片を定法に従って精製
した。
一方、ｐ Ｂ Ｒ３２２Ｄ Ｎ ＡをＥｃｏＲＩン肖化
して直鎖状Ｉ）ＮＡとした後、５′末端のリン酸基をア
ルカリ性フォスファターゼ処理により除去し、前記０．
２８ｋｂｐＤＮＡＥｃｏＲＩ断片と混合し、１４℃でＴ
４ＤＮＡリガーゼを作用させ、ＤＮＡを結合し、大腸菌
を形質転換させ、これよりｔｒｐプロモーターがｐＢＲ
３２２のＥｃ ｏ ＲＴ部位にクローニングされたプラ
スミドを弔離し、ｐＴＢ５７と名付けた。
して直鎖状Ｉ）ＮＡとした後、５′末端のリン酸基をア
ルカリ性フォスファターゼ処理により除去し、前記０．
２８ｋｂｐＤＮＡＥｃｏＲＩ断片と混合し、１４℃でＴ
４ＤＮＡリガーゼを作用させ、ＤＮＡを結合し、大腸菌
を形質転換させ、これよりｔｒｐプロモーターがｐＢＲ
３２２のＥｃ ｏ ＲＴ部位にクローニングされたプラ
スミドを弔離し、ｐＴＢ５７と名付けた。
次にこのプラスミドｐ −ｒ Ｂ ５７をＥ ｃ、 ｏ
ＲＩで部分消化して得られる直鎖状ＤＮＡを前出と同
様の操作で処理し１片方のＥ ｃ ｏ Ｒｎ認識部位を
つぶし、環状ＤＮＡとした後、大腸菌を形質転換させ、
得られたコロニーよりプラスミドを得、制限酵素の切断
でのパターンよりｔｒｐプロモーターの上流側にあるＥ
ｃ ｏ Ｒｎ認識部位がなくなったプラスミドをｐＴ
Ｂ９１と名付けた。
ＲＩで部分消化して得られる直鎖状ＤＮＡを前出と同
様の操作で処理し１片方のＥ ｃ ｏ Ｒｎ認識部位を
つぶし、環状ＤＮＡとした後、大腸菌を形質転換させ、
得られたコロニーよりプラスミドを得、制限酵素の切断
でのパターンよりｔｒｐプロモーターの上流側にあるＥ
ｃ ｏ Ｒｎ認識部位がなくなったプラスミドをｐＴ
Ｂ９１と名付けた。
さらにプラスミドｐＴＢ９１をＥ ｅ ｏ ＲＩで消化
後、単鎖の付着端をＤＮＡポリメラーゼ■でうめ、合成
オリゴヌクレオチド（ＢｇｌＩＩリンカ−）と混ぜ、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、ｔｒ’ ｐプロモー
ター遺伝子の下流にＢｇｌ ｎ認識部位を導入し、こ
のプラスミドをｐＴＢ３３４と名づけた。
後、単鎖の付着端をＤＮＡポリメラーゼ■でうめ、合成
オリゴヌクレオチド（ＢｇｌＩＩリンカ−）と混ぜ、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、ｔｒ’ ｐプロモー
ター遺伝子の下流にＢｇｌ ｎ認識部位を導入し、こ
のプラスミドをｐＴＢ３３４と名づけた。
この様にして得たｐＴＢ５７とｐＴＢ３３４を用い、ｔ
ｒｐプロモーターの上流にＥｃｏ Ｒｎ認識部位、お
よび下流にＢｇｌ Ｉｎ認識部位を持つプラスミドを
構築した。まずｐＴＢ ３４４を制限酵素Ｈｐａ Ｉ
およびＰｓｔ Ｉで切断した後。
ｒｐプロモーターの上流にＥｃｏ Ｒｎ認識部位、お
よび下流にＢｇｌ Ｉｎ認識部位を持つプラスミドを
構築した。まずｐＴＢ ３４４を制限酵素Ｈｐａ Ｉ
およびＰｓｔ Ｉで切断した後。
２％アガロースゲル電気泳動により約０．７８ｋｂｐＤ
ＮＡ断片を溶出精製した。
ＮＡ断片を溶出精製した。
またｐＴＢ ５７も同様の制限酵素で切断した後、１％
アガロースゲル電気泳動により、３．８５ｋｂｐＤＮＡ
断片を溶出精製した。これら両者を混合しＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合した後、大腸菌を形質転換させ、得
られたコロニーよりプラスミドを得、制限酵素の切断で
のパターンより目的のプラスミドを持つ転換株を選択し
た。これより単離したプラスミドをｐＴＢ３４０と名付
けた。
アガロースゲル電気泳動により、３．８５ｋｂｐＤＮＡ
断片を溶出精製した。これら両者を混合しＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合した後、大腸菌を形質転換させ、得
られたコロニーよりプラスミドを得、制限酵素の切断で
のパターンより目的のプラスミドを持つ転換株を選択し
た。これより単離したプラスミドをｐＴＢ３４０と名付
けた。
次に入ＰＬプロモーターを持つプラスミドｐＡＤ３２９
（Ａｄｈｙａ、Ｓ、ら、「セル（Ｃａｔｌ）」、□、
９３９−９４４ （１９８２））より、入ＰＬプロモー
ター遺伝子を持つ０．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を単離し
た。まずプラスミドｐＡＤ３２９を制限酵素ＢｇｌＩ［
およびＨｐａＩで消化後、２％アガロースゲル電気泳動
にかけ、約０．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片を溶出精製した
１次いでこの０．４５ｋｂＰのＤＮＡ断片をＨｉｎｆ■
により部分消化した後、２％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約０．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を溶出精製した。
（Ａｄｈｙａ、Ｓ、ら、「セル（Ｃａｔｌ）」、□、
９３９−９４４ （１９８２））より、入ＰＬプロモー
ター遺伝子を持つ０．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を単離し
た。まずプラスミドｐＡＤ３２９を制限酵素ＢｇｌＩ［
およびＨｐａＩで消化後、２％アガロースゲル電気泳動
にかけ、約０．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片を溶出精製した
１次いでこの０．４５ｋｂＰのＤＮＡ断片をＨｉｎｆ■
により部分消化した後、２％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約０．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を溶出精製した。
この様にして得た０、３５ｋｂｐのＤＮＡ断片は両端に
Ｂｇｌｎ消化およびＨｉｎｆ Ｉ消化により生じた付
着端を有する。
Ｂｇｌｎ消化およびＨｉｎｆ Ｉ消化により生じた付
着端を有する。
一方、プラスミドｐＴＢ ３４０を制限酵素Ｂｇ１■お
よびＥ ｃ ｏ ＲＩで消化した後、１％アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、約４．３５ｋｂｐＤＮＡを溶出し、
精製した。ここで得られたＤＮＡは両端にＢｇｌＩＩ消
化およびＥ ｃ ｏ ＲＩ消化により生じた付着端を有
する。この様にして得られた入Ｐプロモーター遺伝子を
含む０．３５ｋｂｐＤＮＡ断片と約４．３５ｋｂｐのＤ
ＮＡとを混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで環状ＤＮＡとした
後、大腸菌を形質転換させ、これより入Ｐ プロモータ
ーを持ち、その上流にＢｇｌ Ｉｎ認識部位、下流に
Ｅｃｏ Ｒ１認識部位を有するプラスミドを単離し、
これをｐＴ８２８１と名付けた。
よびＥ ｃ ｏ ＲＩで消化した後、１％アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、約４．３５ｋｂｐＤＮＡを溶出し、
精製した。ここで得られたＤＮＡは両端にＢｇｌＩＩ消
化およびＥ ｃ ｏ ＲＩ消化により生じた付着端を有
する。この様にして得られた入Ｐプロモーター遺伝子を
含む０．３５ｋｂｐＤＮＡ断片と約４．３５ｋｂｐのＤ
ＮＡとを混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで環状ＤＮＡとした
後、大腸菌を形質転換させ、これより入Ｐ プロモータ
ーを持ち、その上流にＢｇｌ Ｉｎ認識部位、下流に
Ｅｃｏ Ｒ１認識部位を有するプラスミドを単離し、
これをｐＴ８２８１と名付けた。
これを用いてｈＥＧＦの発現用プラスミドを構築した（
第５図）、まず実施例４で前述したプラスミドｐＴＢ３
６１ １０，１−ｇを反応液〔１００ｍＭ ＮａＣ１，
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
第５図）、まず実施例４で前述したプラスミドｐＴＢ３
６１ １０，１−ｇを反応液〔１００ｍＭ ＮａＣ１，
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
ｐＨ８，０，７ｍＭ ＭｇＣ１２，２ｍＭ ２−メル
カブトエタノール、０．０１％ＢＳＡ、５０ユニットＥ
ｃｏＲＩ、２０ユニットＢａｍＨＩ （宝酒造）〕中
、３７℃、１．５時間反応させた後。
カブトエタノール、０．０１％ＢＳＡ、５０ユニットＥ
ｃｏＲＩ、２０ユニットＢａｍＨＩ （宝酒造）〕中
、３７℃、１．５時間反応させた後。
２％アガロースゲル電気泳動により、ｈＥＧＦ遺伝子を
含む１７９ｂＰのＤＮＡ断片を溶出し、精製した。一方
、プラスミドＰＴ８２８１も上記と同様にしてＥｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩ消化し。
含む１７９ｂＰのＤＮＡ断片を溶出し、精製した。一方
、プラスミドＰＴ８２８１も上記と同様にしてＥｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩ消化し。
２倍量の水を加えて６５℃、１０分間おき、酵素を失活
させた。これら両者を混合し、１４℃でＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを作用させ、ＤＮＡを結合した。
させた。これら両者を混合し、１４℃でＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを作用させ、ＤＮＡを結合した。
大腸菌の形質転換は次の様に行なった。大腸菌Ｎ４８３
０株（ファルマシア・ジャパン社市販）の−晩培養液に
ＬＢ培地を加え、１００倍に稀釈した。３７℃で２時間
振盪培養した後３，３０Ｏｒｐｍ、４℃、８分間遠心分
離し、得られた菌体を１０ｍＭ ＮａＣ１で洗浄した。
０株（ファルマシア・ジャパン社市販）の−晩培養液に
ＬＢ培地を加え、１００倍に稀釈した。３７℃で２時間
振盪培養した後３，３０Ｏｒｐｍ、４℃、８分間遠心分
離し、得られた菌体を１０ｍＭ ＮａＣ１で洗浄した。
これに５０ｍＭＣａＣｌ２溶液を添加し、水中で１５分
間おき、３．３０Ｏｒｐｍで４℃、４分間遠心分離し、
もう一度５０ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁した。この１００
、、、．１に懸濁した大腸菌Ｎ４８３０に上記で得た反
応液７）−１を添加し、０℃、４５分間インキュベート
した０次いで３７℃、２分間インキュベートし、９００
．”ｌのＬＢ培地を加えた後、３０℃で１時間インキュ
ベートした。この大腸菌を３５、μｇ ／ ｍ ｌのア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にまき、３０℃で一晩
培養した。生じたアンピシリン耐性コロニーは、すべて
７．ｘｇ／ｍｌのテトラサイクリンに対する耐性能をな
くしていた。
間おき、３．３０Ｏｒｐｍで４℃、４分間遠心分離し、
もう一度５０ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁した。この１００
、、、．１に懸濁した大腸菌Ｎ４８３０に上記で得た反
応液７）−１を添加し、０℃、４５分間インキュベート
した０次いで３７℃、２分間インキュベートし、９００
．”ｌのＬＢ培地を加えた後、３０℃で１時間インキュ
ベートした。この大腸菌を３５、μｇ ／ ｍ ｌのア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にまき、３０℃で一晩
培養した。生じたアンピシリン耐性コロニーは、すべて
７．ｘｇ／ｍｌのテトラサイクリンに対する耐性能をな
くしていた。
次に、この転換株の一部からプラスミドＤＮＡをとり、
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる消化、さらにＢｇｌ
ＩＩ消化により、ｈＥＧＦ遺伝子の正しく挿入された転
換株を選択した。この様にして得たプラスミドをｐＴＢ
３７２と名づけた。
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる消化、さらにＢｇｌ
ＩＩ消化により、ｈＥＧＦ遺伝子の正しく挿入された転
換株を選択した。この様にして得たプラスミドをｐＴＢ
３７２と名づけた。
上記で得られたｐＴＢ ３７２を次に前述同様の操作に
よりｐＲＫ２４８ｃ Ｉ ｔ ｓ （レプレッサー）
（Ｂｅｒｎａｒｄ、Ｈ，ら、「メソッズ インエンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）Ｊ ＋ ６８，４８２−４９２（１９７９））
を含有する大腸菌ＤＨＩ株の形質転換に用い、得られた
形質転換体を３５、− ｇ ／ ｍｌのアンピシリンお
よび７ ％ ｇ ／ ｍ ｌのテトラサイクリンを含有
するＬＢ寒天培地上にまき、３０℃で一晩培養した。生
じたコロニーから前述同様に得たプラスミドＤＮＡを制
限酵素で消化し、そのパターンよりｈＥＧＦ遺伝子を含
む形質転換株を選び、これをエシェリヒアコリ ＤＨＩ
／ＰＴＢ３７２．ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓと名づけた。
よりｐＲＫ２４８ｃ Ｉ ｔ ｓ （レプレッサー）
（Ｂｅｒｎａｒｄ、Ｈ，ら、「メソッズ インエンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）Ｊ ＋ ６８，４８２−４９２（１９７９））
を含有する大腸菌ＤＨＩ株の形質転換に用い、得られた
形質転換体を３５、− ｇ ／ ｍｌのアンピシリンお
よび７ ％ ｇ ／ ｍ ｌのテトラサイクリンを含有
するＬＢ寒天培地上にまき、３０℃で一晩培養した。生
じたコロニーから前述同様に得たプラスミドＤＮＡを制
限酵素で消化し、そのパターンよりｈＥＧＦ遺伝子を含
む形質転換株を選び、これをエシェリヒアコリ ＤＨＩ
／ＰＴＢ３７２．ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓと名づけた。
実施例６ ｈＥＧＦの製造法
ｉ）エシェリヒアコリ ＤＨＩ／ｐＴＢ３７０を７ 、
” ｇ ／ ｍ ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地
中、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液０゜５ｍｌ
に７．”ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む１０ｍ１の
Ｍ９培地〔０，４％カザミノ酸、１％グルコースを含む
〕を加え、３７℃、４時間振盪培養した後、３β−イン
ドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えて３０．”ｇ／ｍｌ
となるようにした。
” ｇ ／ ｍ ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地
中、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液０゜５ｍｌ
に７．”ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む１０ｍ１の
Ｍ９培地〔０，４％カザミノ酸、１％グルコースを含む
〕を加え、３７℃、４時間振盪培養した後、３β−イン
ドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えて３０．”ｇ／ｍｌ
となるようにした。
このまま、さらに４時間培養を続けた後、この培養液１
０．５ｍｌを７．０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心分
離し、得られた菌体を−７０”Ｃで凍結した。これを溶
解後、１ｍｌの反応液［７Ｍグアニジン塩酸塩、２ｍＭ
フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、
Ｏ，ＬＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ、ｐＨ７，０）中、０
℃、１時間インキュベートした。この反応液を２０，０
００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心分離し、得られた上澄
液をＴＥＮ （２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ、ｐＨ
８，０゜１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｍ ＮａＣ１）１
１に対して４℃で２回透析し、析出した不溶物を２０゜
０００ｒｐｍ、４℃、３０分間の遠心分離で除去した。
０．５ｍｌを７．０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心分
離し、得られた菌体を−７０”Ｃで凍結した。これを溶
解後、１ｍｌの反応液［７Ｍグアニジン塩酸塩、２ｍＭ
フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、
Ｏ，ＬＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ、ｐＨ７，０）中、０
℃、１時間インキュベートした。この反応液を２０，０
００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心分離し、得られた上澄
液をＴＥＮ （２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ、ｐＨ
８，０゜１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｍ ＮａＣ１）１
１に対して４℃で２回透析し、析出した不溶物を２０゜
０００ｒｐｍ、４℃、３０分間の遠心分離で除去した。
この様にして得られた溶液は一２０℃で保存した。
ｉｉ）エシェリヒアコリ ＤＨＩ／ｐＴＢ３７２゜ｐＲ
Ｋ２４８ｃＩｔｓを３５ 、ｍ ｇ ／ ｍ ｌのアン
ピシリンおよび７βｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む
Ｍ９培地中、２９℃で一晩振盪培養した。この培養液０
．５ｍｌに３５、− ｇ ／ ｍ ｌのアンピシリンを
含むｌｏｍｌのＭ９培地を加え、２９℃で４時間振盪培
養し、続いて４２℃で２時間振盪培養を続けた後、前述
と同様な処理を行ない、得られた溶液、よ−２゜、Ｃ１
保存ｔ、 、：、 ’□ 上記ｉ）、ｉｉ）で得られた各生産物をラジオレセプタ
ーアッセイ法（ＲＲＡ法）（Ｃｏｈａｎ。
Ｋ２４８ｃＩｔｓを３５ 、ｍ ｇ ／ ｍ ｌのアン
ピシリンおよび７βｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む
Ｍ９培地中、２９℃で一晩振盪培養した。この培養液０
．５ｍｌに３５、− ｇ ／ ｍ ｌのアンピシリンを
含むｌｏｍｌのＭ９培地を加え、２９℃で４時間振盪培
養し、続いて４２℃で２時間振盪培養を続けた後、前述
と同様な処理を行ない、得られた溶液、よ−２゜、Ｃ１
保存ｔ、 、：、 ’□ 上記ｉ）、ｉｉ）で得られた各生産物をラジオレセプタ
ーアッセイ法（ＲＲＡ法）（Ｃｏｈａｎ。
Ｓ、ら、「プロシージング オブ ナショナルアカデミ
−オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ
、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ）Ｊ 、工２．１３１７−１３２１
（１９７５））で分析した。
−オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ
、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ）Ｊ 、工２．１３１７−１３２１
（１９７５））で分析した。
ＥＧＦ活性は、同じ活性を示す精製マウスＥＧＦ＠準の
重量で表わした。まずヒト胎児包皮細胞Ｆｌｏｗ７００
０ （ｆ ｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔ。
重量で表わした。まずヒト胎児包皮細胞Ｆｌｏｗ７００
０ （ｆ ｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔ。
ｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、市販）を１０％の牛胎児血清を含む
ダルベツコ・ミニマル・エセンシャル（ＤＭＥＭ）培地
を用いて、直径１．６ｃｍの細胞培養用ディツシュ（Ｌ
ｉｎｂｒｏ、Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｉｎｃ、市販）で培養した。この培地を捨て、０．１％
ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄後、０．２ｍｌ
の同培地と。
ダルベツコ・ミニマル・エセンシャル（ＤＭＥＭ）培地
を用いて、直径１．６ｃｍの細胞培養用ディツシュ（Ｌ
ｉｎｂｒｏ、Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｉｎｃ、市販）で培養した。この培地を捨て、０．１％
ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄後、０．２ｍｌ
の同培地と。
クロラミンＴ法により１２９■でラベルしたマウスＥＧ
Ｆ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒａ５ｅａｒｃ
ｈ、Ｉｎｃ、市販）５ｎｇ、および上記で得た各生産物
を適量加え、３７℃で１時間培養した。
Ｆ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒａ５ｅａｒｃ
ｈ、Ｉｎｃ、市販）５ｎｇ、および上記で得た各生産物
を適量加え、３７℃で１時間培養した。
次に同培地で洗浄後、０．２Ｎ ＮａＯＨで処理し、チ
ューブへ移し、７線カウンターで、とりこまれた ■を
測定した。同様の操°作で重量既知のマウスＥＧＦとの
競合反応により得られた検量曲線より、生産物中のヒト
ＥＧＦ量を算出した。結果は第１表に示した。
ューブへ移し、７線カウンターで、とりこまれた ■を
測定した。同様の操°作で重量既知のマウスＥＧＦとの
競合反応により得られた検量曲線より、生産物中のヒト
ＥＧＦ量を算出した。結果は第１表に示した。
第 １ 表 ヒトＥＧＦ遺伝子の大腸菌での発現またエ
シェリヒアコリ ＤＨＩ／ｐＴＢ３７０株を培養し、Ｉ
ＡＡで誘導後、すでに記載した方法で融解物中のＥＧＦ
活性を発育とあわせて測定した。その結果を第７図に示
した０図中、破線は菌株の発育を、実線はＥＧＦ活性を
示す。
シェリヒアコリ ＤＨＩ／ｐＴＢ３７０株を培養し、Ｉ
ＡＡで誘導後、すでに記載した方法で融解物中のＥＧＦ
活性を発育とあわせて測定した。その結果を第７図に示
した０図中、破線は菌株の発育を、実線はＥＧＦ活性を
示す。
実施例７ ｈＥＧＦの動物細胞での産生（１）プラス
ミドｐＴＢ ５０６の構築ＳＶ４０プロモーターおよび
ＩＬ−２遺伝子を有するｐＴＢ１０６（特願昭６０−１
３３４９０号明細書実施例１（ｉ））を原料に、そのＩ
Ｌ−２遺伝子領域の５″末端に存在するＰｓｔＩ切断部
位をＥ ｃ ｏ ＲＩ切断部位に変換し、また同遺伝子
領域の３′末端に存在するＢａｍＨＩ切断部位の直前に
Ｂｇ Ｉ■切断部位を挿入したプラスミドＰＴＢ ３９
６を構築した。
ミドｐＴＢ ５０６の構築ＳＶ４０プロモーターおよび
ＩＬ−２遺伝子を有するｐＴＢ１０６（特願昭６０−１
３３４９０号明細書実施例１（ｉ））を原料に、そのＩ
Ｌ−２遺伝子領域の５″末端に存在するＰｓｔＩ切断部
位をＥ ｃ ｏ ＲＩ切断部位に変換し、また同遺伝子
領域の３′末端に存在するＢａｍＨＩ切断部位の直前に
Ｂｇ Ｉ■切断部位を挿入したプラスミドＰＴＢ ３９
６を構築した。
このｐＴＢ ３９６をＥ ｃ ｏ ＲＩおよびＢｇｌｎ
で切断してＩＬ−２遺伝子領域を除いたプラスミドＤＮ
Ａを製造した。一方−ｐＴＢ３６１をＥｃｏ ＲＩおよ
びＢａｍＨＩ切断してＥＧＦ遺伝子を切り出し、これを
上記プラスミドＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ
たｐＴＢ４１３を構築した。
で切断してＩＬ−２遺伝子領域を除いたプラスミドＤＮ
Ａを製造した。一方−ｐＴＢ３６１をＥｃｏ ＲＩおよ
びＢａｍＨＩ切断してＥＧＦ遺伝子を切り出し、これを
上記プラスミドＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ
たｐＴＢ４１３を構築した。
次にＰＴＢ３１４（特願昭６０−１３３４９０号明細書
実施例１ （ｉｉｉ））より、Ｃ１ａＩおよびＨｉｎｄ
ｍ切断によりエーペルソンマウス白血病ウィルス（Ａ−
ＭｕＬＶ）ＣＧｏｆ ｆ、Ｓ、Ｐ。
実施例１ （ｉｉｉ））より、Ｃ１ａＩおよびＨｉｎｄ
ｍ切断によりエーペルソンマウス白血病ウィルス（Ａ−
ＭｕＬＶ）ＣＧｏｆ ｆ、Ｓ、Ｐ。
ら、［セル（Ｃｅ ｌ ｌ） Ｊ 、 ２２ ： ７７
７−７８５（１９８０）］のＬＴＲ領域を含むＤＮＡ断
片を切り出し、Ｃ１ａＩおよびＨｉｎｄＩＩ［切断した
ｐＴＢ４１３のＣ１ａｌおよびＨｉｎｄ［切断部位に挿
入してｐＴＢ ５０６を構築した（第８図）。
７−７８５（１９８０）］のＬＴＲ領域を含むＤＮＡ断
片を切り出し、Ｃ１ａＩおよびＨｉｎｄＩＩ［切断した
ｐＴＢ４１３のＣ１ａｌおよびＨｉｎｄ［切断部位に挿
入してｐＴＢ ５０６を構築した（第８図）。
（ｉｉ）動物細胞の形質転換
ファルコンシャーレ（直径６ｃｍ）に１０％牛脂児血清
を含むダルベツコ改変イーグルＭＥＭ培地を入れ、マウ
スＨＰＲＴ （ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓａ）欠
損り細胞（ＬＡ９ｍ胞）（Ｌｉｔｔｌｅｆ １ｅｌｄ、
Ｊ、Ｗ、ｒエクスベリメンタル セル リサーチ（Ｅｘ
ｐ、Ｃａ１ｌＲｅｓ、Ｊ 、４１ ：１９０−１９６
（１９６６）］を３７℃で一晩培養した。培養後、この
細胞（７ＸＩＯ％個／ディシュ）に対して、プラスミド
ｐ４ａＡ８（ヒトＨＰＲＴｃＤＮＡを含むプラスミド）
（Ｊｏｌｌｙ、Ｄ、Ｊ、ら、「プロシージング オブ
ナショナル アカデミ−オブ サイ ｒ］エ
ンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｅ ｔ、
）０°１′″１““″−°°”３”９８３
）） ｉ″０．５−ｇと１０ＰｇのｐＴＢ５０６
ＤＮＡとを Ｌグラハムらの方法〔「ウィロ
ロジー（Ｖｉｒｏｌ ｌｏｇｙ）Ｊ ｐ
５ユニ ４５６−４６７ （１９７３））に従っ
て混合、接種し、共形質転換を行った。４時間３７℃で
培養後、新たな培地に替えて一夜培養し、翌日１０％牛
脂児血清を含むＨＡＴ培地（１５，−ｇ／ｍｌヒポキサ
ンチン、１．”ｇ／ｍｌアミノプテリン、５．”ｇ／ｍ
ｌチミジンを含むダルベツコ改変イーグルＭＥＭ培地）
に替えて、３７℃で培養を続けた。
を含むダルベツコ改変イーグルＭＥＭ培地を入れ、マウ
スＨＰＲＴ （ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓａ）欠
損り細胞（ＬＡ９ｍ胞）（Ｌｉｔｔｌｅｆ １ｅｌｄ、
Ｊ、Ｗ、ｒエクスベリメンタル セル リサーチ（Ｅｘ
ｐ、Ｃａ１ｌＲｅｓ、Ｊ 、４１ ：１９０−１９６
（１９６６）］を３７℃で一晩培養した。培養後、この
細胞（７ＸＩＯ％個／ディシュ）に対して、プラスミド
ｐ４ａＡ８（ヒトＨＰＲＴｃＤＮＡを含むプラスミド）
（Ｊｏｌｌｙ、Ｄ、Ｊ、ら、「プロシージング オブ
ナショナル アカデミ−オブ サイ ｒ］エ
ンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｅ ｔ、
）０°１′″１““″−°°”３”９８３
）） ｉ″０．５−ｇと１０ＰｇのｐＴＢ５０６
ＤＮＡとを Ｌグラハムらの方法〔「ウィロ
ロジー（Ｖｉｒｏｌ ｌｏｇｙ）Ｊ ｐ
５ユニ ４５６−４６７ （１９７３））に従っ
て混合、接種し、共形質転換を行った。４時間３７℃で
培養後、新たな培地に替えて一夜培養し、翌日１０％牛
脂児血清を含むＨＡＴ培地（１５，−ｇ／ｍｌヒポキサ
ンチン、１．”ｇ／ｍｌアミノプテリン、５．”ｇ／ｍ
ｌチミジンを含むダルベツコ改変イーグルＭＥＭ培地）
に替えて、３７℃で培養を続けた。
３〜４日に一度培養液の交換を行って培養を続けると、
約２〜３週間後ＨＰＲＴ となった細胞が増殖してコ
ロニーを形成した。
約２〜３週間後ＨＰＲＴ となった細胞が増殖してコ
ロニーを形成した。
（ｉｉｉ）形質転換体のクローニングおよびＥＧＦの定
量 実施例７ （ｉｉ）で得た形質転換細胞のクローニング
を、リミテッドダイリューシ１ン法に従って行なった。
量 実施例７ （ｉｉ）で得た形質転換細胞のクローニング
を、リミテッドダイリューシ１ン法に従って行なった。
クローニング終了後クローン細胞は１０％牛脂児血清を
含むイーグル改変ＭＥＭ培地にて培養した０分層された
クローン細胞はファルコンシャーレ（直径６ｃｍ）にま
き、細胞がコンフルエントになった時、細胞をラバーポ
リスマンを用いてはがし、遠心（２０００ｒｐｍＸ５分
間）にて集めた０次に集めた細胞に２００、−１のＮＥ
Ｔを加え、超音波処理（５秒間Ｘ２）にて細胞を破壊し
、遠心（２０００Ｏｒｐｍ、４’Ｃ，３０分間）した後
、得られた上澄液中のＥＧＦ活性を実施例６の方法に従
い測定した。形質転換細胞クローンのうちマウスＬＡ９
−ＥＧＦ−３細胞は１．４ｎｇ／１０’細胞のＥＧＦを
産生していることが判明した。結果を第２表に示す。
含むイーグル改変ＭＥＭ培地にて培養した０分層された
クローン細胞はファルコンシャーレ（直径６ｃｍ）にま
き、細胞がコンフルエントになった時、細胞をラバーポ
リスマンを用いてはがし、遠心（２０００ｒｐｍＸ５分
間）にて集めた０次に集めた細胞に２００、−１のＮＥ
Ｔを加え、超音波処理（５秒間Ｘ２）にて細胞を破壊し
、遠心（２０００Ｏｒｐｍ、４’Ｃ，３０分間）した後
、得られた上澄液中のＥＧＦ活性を実施例６の方法に従
い測定した。形質転換細胞クローンのうちマウスＬＡ９
−ＥＧＦ−３細胞は１．４ｎｇ／１０’細胞のＥＧＦを
産生していることが判明した。結果を第２表に示す。
第 ２ 表 ヒトＥＧＦ遺伝子のマウス細胞
第１図はｈＥＧＦに対応する本発明の合成遺伝子のＤＮ
Ａ配列およびアミノ酸配列を示した図であり、第２図は
本発明のｈＥＧＦ遺伝子合成の際のＤＮＡフラグメント
への分割の一例を示した図であり、第３図は本発明のｈ
ＥＧＦ対応合成遺伝子製造用ＤＮＡフラグメントの一例
を示す図であり、第４図は第３図の各ＤＮＡフラグメン
トを連結してｈＥＧＦ合成遺伝子を製造する模式図であ
る。 第５、図は本発明のｈＥＧＦ対応合成遺伝子を組込んだ
発現用プラスミドの構築図であり、第６図はプラスミド
ｐＴ８２８１の構築図である。第７図は本発明方法の一
例における菌体の発育とＥＧＦ活性を示すグラフである
。第８図は実施例７（＋）における動物細胞形質転換用
プラスミドｐＴＢ５０６の構築図を示す。
Ａ配列およびアミノ酸配列を示した図であり、第２図は
本発明のｈＥＧＦ遺伝子合成の際のＤＮＡフラグメント
への分割の一例を示した図であり、第３図は本発明のｈ
ＥＧＦ対応合成遺伝子製造用ＤＮＡフラグメントの一例
を示す図であり、第４図は第３図の各ＤＮＡフラグメン
トを連結してｈＥＧＦ合成遺伝子を製造する模式図であ
る。 第５、図は本発明のｈＥＧＦ対応合成遺伝子を組込んだ
発現用プラスミドの構築図であり、第６図はプラスミド
ｐＴ８２８１の構築図である。第７図は本発明方法の一
例における菌体の発育とＥＧＦ活性を示すグラフである
。第８図は実施例７（＋）における動物細胞形質転換用
プラスミドｐＴＢ５０６の構築図を示す。
Claims (4)
- （１）ＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
子を有するＤＮＡ。 - （２）複数個のオリゴデオキシヌクレオチドを酵素的に
連結し、所望によりベクターに挿入することを特徴とす
る、ＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
子を有するＤＮＡの製造法。 - （３）ＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
子を有するＤＮＡによって形質転換した宿主。 - （４）ＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
子を有するＤＮＡによって形質転換した宿主を増殖させ
ることを特徴とするヒト表皮細胞増殖因子の製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60176976A JPH0644866B2 (ja) | 1985-08-13 | 1985-08-13 | ヒト表皮細胞増殖因子生産用形質転換体 |
| CA000492430A CA1263619A (en) | 1984-10-09 | 1985-09-08 | Dna, production and use thereof |
| US06/784,844 US4849350A (en) | 1984-10-09 | 1985-10-04 | Novel DNA, production and use thereof |
| EP85112653A EP0177915B1 (en) | 1984-10-09 | 1985-10-05 | Novel dna, production and use thereof |
| DE8585112653T DE3581255D1 (de) | 1984-10-09 | 1985-10-05 | Dns, deren herstellung und verwendung. |
| AT85112653T ATE59861T1 (de) | 1984-10-09 | 1985-10-05 | Dns, deren herstellung und verwendung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60176976A JPH0644866B2 (ja) | 1985-08-13 | 1985-08-13 | ヒト表皮細胞増殖因子生産用形質転換体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6240290A true JPS6240290A (ja) | 1987-02-21 |
| JPH0644866B2 JPH0644866B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=16022998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60176976A Expired - Lifetime JPH0644866B2 (ja) | 1984-10-09 | 1985-08-13 | ヒト表皮細胞増殖因子生産用形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0644866B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07509140A (ja) * | 1993-04-26 | 1995-10-12 | ダイウォン ファーマシューティカル カンパニー，リミテッド | ヒト上皮成長因子をコードする新規な遺伝子およびその製造方法 |
-
1985
- 1985-08-13 JP JP60176976A patent/JPH0644866B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07509140A (ja) * | 1993-04-26 | 1995-10-12 | ダイウォン ファーマシューティカル カンパニー，リミテッド | ヒト上皮成長因子をコードする新規な遺伝子およびその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0644866B2 (ja) | 1994-06-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |