JPH0457974B2 - - Google Patents
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- JPH0457974B2 JPH0457974B2 JP58087965A JP8796583A JPH0457974B2 JP H0457974 B2 JPH0457974 B2 JP H0457974B2 JP 58087965 A JP58087965 A JP 58087965A JP 8796583 A JP8796583 A JP 8796583A JP H0457974 B2 JPH0457974 B2 JP H0457974B2
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- electrophoresis
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、電気泳動用媒体材料の製造方法に関
するものであり、さらに詳しくは、特にDNAの
塩基配列決定操作における電気泳動分析に使用す
るのに適した電気泳動膜を含む電気泳動用媒体材
料の製造方法に関するものである。
するものであり、さらに詳しくは、特にDNAの
塩基配列決定操作における電気泳動分析に使用す
るのに適した電気泳動膜を含む電気泳動用媒体材
料の製造方法に関するものである。
ポストラベル法に基づくDNAやRNAの塩基配
列決定法においては、ポリアクリルアミドゲル膜
を用いたスラブ電気泳動操作が必須の操作となつ
ている。特に近年において遺伝子関連の研究が進
むにつれて、DNA塩基配列決定の操作の迅速化
が急務となつている。
列決定法においては、ポリアクリルアミドゲル膜
を用いたスラブ電気泳動操作が必須の操作となつ
ている。特に近年において遺伝子関連の研究が進
むにつれて、DNA塩基配列決定の操作の迅速化
が急務となつている。
ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド
のような単量体を触媒の存在下にてＮ、N′−メ
チレンビスアクリルアミドのような二官能性の架
橋剤を用い架橋重合させることにより得られる。
なお、このポリアクリルアミドゲル膜の形成に際
して通常は、尿素あるいはホルムアミドのような
変性剤を含有させる。
のような単量体を触媒の存在下にてＮ、N′−メ
チレンビスアクリルアミドのような二官能性の架
橋剤を用い架橋重合させることにより得られる。
なお、このポリアクリルアミドゲル膜の形成に際
して通常は、尿素あるいはホルムアミドのような
変性剤を含有させる。
上記の重合反応はラジカル架橋重合であり、酸
素の影響により反応が阻害されるため、ゲル膜は
酸素を遮断した状態で作成する必要がある。この
理由から、現在では一般に、ポリアクリルアミド
ゲル膜は２枚のガラス板で形成されたセル（一定
の空間、たとえば0.3mm〜１mmを有する）の中に
ゲル形成液を注入させ、酸素を遮断した状態で架
橋重合させてゲル膜を形成させている。
素の影響により反応が阻害されるため、ゲル膜は
酸素を遮断した状態で作成する必要がある。この
理由から、現在では一般に、ポリアクリルアミド
ゲル膜は２枚のガラス板で形成されたセル（一定
の空間、たとえば0.3mm〜１mmを有する）の中に
ゲル形成液を注入させ、酸素を遮断した状態で架
橋重合させてゲル膜を形成させている。
この方法は２枚のガラス板の間でゲル膜を形成
するために、取り扱い性が悪く、かつ量産化が困
難であるといつた大きな欠点を有している。
するために、取り扱い性が悪く、かつ量産化が困
難であるといつた大きな欠点を有している。
以上のようにして形成したポリアクリルアミド
ゲル膜を用いる電気泳動は、たとえば、次のよう
にして実施される。
ゲル膜を用いる電気泳動は、たとえば、次のよう
にして実施される。
ポリアクリルアミドゲル膜は、ガラス板に挟ん
だままの状態で垂直に立てられ、前電気泳動を行
なつたのち、サンプルスロツトに試料（マキサ
ム・ギルバート分解した32Pラベル化DNA）を一
定量注入し、電気泳動を行なう。そして、一定時
間（例、約６時間〜12時間）の電気泳動を行なつ
た後、片面のガラス板を注意深く除去し、ポリ塩
化ビニリデンフイルムなどの合成樹脂製フイルム
でゲル膜を覆い、これを用いてオートラジオグラ
フイー処理を行なう。すなわち、ゲル膜を被覆し
ているフイルムの上にＸ線フイルム、増感紙を順
次のせて、低温（たとえば、−80℃）で一定時間
（たとえば、約10〜20時間）露光を行なう。そし
て露光終了後、Ｘ線フイルムを現像し、DNAの
分離泳動パターンを読みとることによりその
DNAの塩基配列を決定することができる。
だままの状態で垂直に立てられ、前電気泳動を行
なつたのち、サンプルスロツトに試料（マキサ
ム・ギルバート分解した32Pラベル化DNA）を一
定量注入し、電気泳動を行なう。そして、一定時
間（例、約６時間〜12時間）の電気泳動を行なつ
た後、片面のガラス板を注意深く除去し、ポリ塩
化ビニリデンフイルムなどの合成樹脂製フイルム
でゲル膜を覆い、これを用いてオートラジオグラ
フイー処理を行なう。すなわち、ゲル膜を被覆し
ているフイルムの上にＸ線フイルム、増感紙を順
次のせて、低温（たとえば、−80℃）で一定時間
（たとえば、約10〜20時間）露光を行なう。そし
て露光終了後、Ｘ線フイルムを現像し、DNAの
分離泳動パターンを読みとることによりその
DNAの塩基配列を決定することができる。
オートラジオグラフイー処理は以上のように長
時間を必要とするため、その迅速化が望まれ、更
に読みとりの高分解能化も望まれている。
時間を必要とするため、その迅速化が望まれ、更
に読みとりの高分解能化も望まれている。
高分解能化を達成する手段としては、オートラ
ジオグラフイー処理に際してゲル膜を乾燥状態と
する方法が知られている。すなわち、電気泳動終
了後にゲル膜を10％酢酸水溶液中に浸漬して、
DNAを固定化しつつ尿素などの変性剤を除去す
る。ガラス板とゲル膜の接着力は極めて弱いか、
または実質的に接着力がないため、この浸漬工程
において、ゲル膜はガラス板から剥離し、液中に
浮遊する。このゲル膜を注意深く取出し、濾紙上
にのせた後、減圧下で乾燥することにより濾紙上
に固定する。このようにして乾燥したゲル膜を使
つてオートラジオグラフイー処理を実施した場合
には分解能が大きく向上する。しかし、上記のよ
うなゲル膜の分離および乾燥工程は、ゲル膜が極
めてもろいため、高度の熟練と注意を必要とし、
また、実際にこの工程においてゲル膜の破損が発
生することも多い。
ジオグラフイー処理に際してゲル膜を乾燥状態と
する方法が知られている。すなわち、電気泳動終
了後にゲル膜を10％酢酸水溶液中に浸漬して、
DNAを固定化しつつ尿素などの変性剤を除去す
る。ガラス板とゲル膜の接着力は極めて弱いか、
または実質的に接着力がないため、この浸漬工程
において、ゲル膜はガラス板から剥離し、液中に
浮遊する。このゲル膜を注意深く取出し、濾紙上
にのせた後、減圧下で乾燥することにより濾紙上
に固定する。このようにして乾燥したゲル膜を使
つてオートラジオグラフイー処理を実施した場合
には分解能が大きく向上する。しかし、上記のよ
うなゲル膜の分離および乾燥工程は、ゲル膜が極
めてもろいため、高度の熟練と注意を必要とし、
また、実際にこの工程においてゲル膜の破損が発
生することも多い。
そこで本発明の目的は、湿潤状態でのゲル膜と
支持体との接着性を高く（接着力を大きく）し
て、さらにゲル膜の脱尿素処理後の乾燥工程にお
いても、ゲル膜が支持体から剥離しない電気泳動
用媒体材料を提供することにある。
支持体との接着性を高く（接着力を大きく）し
て、さらにゲル膜の脱尿素処理後の乾燥工程にお
いても、ゲル膜が支持体から剥離しない電気泳動
用媒体材料を提供することにある。
本発明は、グロー放電処理が施されたポリマー
シートの上に、アクリルアミド系化合物、架橋
剤、水溶性ポリマー、アガロース、および、変性
剤としての尿素またはホルムアミドが水に溶解も
しくは分散してなる溶液もしくは分散液を塗布し
たのち、この塗布層においてアクリルアミド系化
合物と架橋剤とを架橋重合させてポリアクリルア
ミド系水性ゲルからなるゲル媒体層を形成するこ
とからなる電気泳動用媒体材料の製造方法にあ
る。
シートの上に、アクリルアミド系化合物、架橋
剤、水溶性ポリマー、アガロース、および、変性
剤としての尿素またはホルムアミドが水に溶解も
しくは分散してなる溶液もしくは分散液を塗布し
たのち、この塗布層においてアクリルアミド系化
合物と架橋剤とを架橋重合させてポリアクリルア
ミド系水性ゲルからなるゲル媒体層を形成するこ
とからなる電気泳動用媒体材料の製造方法にあ
る。
本発明の製造方法により得られる電気泳動用媒
体材料は特定の表面活性化処理を施した支持体層
と水性ゲル媒体層との二層構造を含むものであ
り、前述のような電気泳動用媒体層（水性ゲル媒
体）の乾燥工程における各種の操作によつても、
その二層構造が分離しにくいため、ゲル媒体層の
破損が発生することは殆どなく、また濾紙などを
使用する必要がないなど、電気泳動操作が全体と
して容易になるとの利点がある。
体材料は特定の表面活性化処理を施した支持体層
と水性ゲル媒体層との二層構造を含むものであ
り、前述のような電気泳動用媒体層（水性ゲル媒
体）の乾燥工程における各種の操作によつても、
その二層構造が分離しにくいため、ゲル媒体層の
破損が発生することは殆どなく、また濾紙などを
使用する必要がないなど、電気泳動操作が全体と
して容易になるとの利点がある。
さらに、本発明の電気泳動用媒体材料は、水平
に置いた支持体の上に電気泳動用媒体層などの水
性ゲル媒体層を直接形成する方法によつても製造
することが可能であるため、本発明は、従来の電
気泳動用媒体材料の製造方法に比べて量産化にも
大きく寄与するものである。
に置いた支持体の上に電気泳動用媒体層などの水
性ゲル媒体層を直接形成する方法によつても製造
することが可能であるため、本発明は、従来の電
気泳動用媒体材料の製造方法に比べて量産化にも
大きく寄与するものである。
次に本発明を詳しく説明する。
本発明の電気泳動用媒体材料の支持体として
は、各種のポリマー（例、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフエノールＡのポリカルボネート、
ポリ塩化ビニル、塩化ビニリデン・塩化ビニルコ
ポリマー、ポリメチルメタアクリレート、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、セルロースアセテート
類、セルロースアセテートプロピオネート等）の
シート（フイルム、板状物も含む）をあげること
ができる。これらの内で特にポリエチレンテレフ
タフタレートから形成されたシートを用いること
が好ましい。
は、各種のポリマー（例、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフエノールＡのポリカルボネート、
ポリ塩化ビニル、塩化ビニリデン・塩化ビニルコ
ポリマー、ポリメチルメタアクリレート、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、セルロースアセテート
類、セルロースアセテートプロピオネート等）の
シート（フイルム、板状物も含む）をあげること
ができる。これらの内で特にポリエチレンテレフ
タフタレートから形成されたシートを用いること
が好ましい。
本発明において用いる支持体には、予めグロー
放電処理が施される。
放電処理が施される。
グロー放電処理は上記のような支持体表面を親
水化することのできる条件で実施される。ポリマ
ー材料の表面処理技術としてのグロー放電処理は
既に公知であり、本発明における支持体のグロー
放電処理に際しても、それらの公知の技術を利用
することができる。すなわち、たとえば、酸素分
圧1Torr以下の真空下に被処理対象の支持体材料
を置き、その支持体材料を移動させながら、その
表面でグロー放電を行なう方法を利用することが
できる。なお、プラスチツク材料のグロー放電処
理については、特開昭55−18469号、特開昭53−
129262号、特開昭51−54672号などの各公開公報
に開示されており、本発明の支持体のグロー放電
処理に際しては、それらに開示されている条件を
用いることができる。
水化することのできる条件で実施される。ポリマ
ー材料の表面処理技術としてのグロー放電処理は
既に公知であり、本発明における支持体のグロー
放電処理に際しても、それらの公知の技術を利用
することができる。すなわち、たとえば、酸素分
圧1Torr以下の真空下に被処理対象の支持体材料
を置き、その支持体材料を移動させながら、その
表面でグロー放電を行なう方法を利用することが
できる。なお、プラスチツク材料のグロー放電処
理については、特開昭55−18469号、特開昭53−
129262号、特開昭51−54672号などの各公開公報
に開示されており、本発明の支持体のグロー放電
処理に際しては、それらに開示されている条件を
用いることができる。
なお、支持体へのグロー放電処理は通常は、水
性ゲル媒体層が付設される側にのみ施されるが、
他の側の表面に対してもグロー放電処理を施すこ
ともでき、その場合には、本発明の電気泳動用媒
体材料を必要に応じてガラス板などに仮付設する
際において、特に接着剤を用いることなく水など
を媒介にして接合することが可能となるなどの利
点がある。
性ゲル媒体層が付設される側にのみ施されるが、
他の側の表面に対してもグロー放電処理を施すこ
ともでき、その場合には、本発明の電気泳動用媒
体材料を必要に応じてガラス板などに仮付設する
際において、特に接着剤を用いることなく水など
を媒介にして接合することが可能となるなどの利
点がある。
次に、水性ゲル媒体層（電気泳動用媒体層、以
下においてポリアクリルアミド膜ともいう）につ
いて説明する。
下においてポリアクリルアミド膜ともいう）につ
いて説明する。
本発明において用いられる水性ゲル媒体層、ア
クリルアミド系化合物と架橋剤とが水の存在下で
架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル
である電気泳動用媒体層である。
クリルアミド系化合物と架橋剤とが水の存在下で
架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル
である電気泳動用媒体層である。
ポリアクリルアミドゲル膜の製造に際して、ア
クリルアミド系化合物と架橋剤とは、水溶液また
は水分散液として水中に溶解または分散させてお
き、水中で両者を架橋重合させて、架橋重合した
水性ゲル媒体を形成する。本明細書においては、
特にことわらない限り、（水中に）溶解と（水中
に）分散の両者を含めて単に（水中に）溶解とい
い、水溶液と水分散液の両者を含めて単に水溶液
という。また、溶媒または分散媒として、所望に
より加えられる有機溶媒と水との混合物をも包含
する。
クリルアミド系化合物と架橋剤とは、水溶液また
は水分散液として水中に溶解または分散させてお
き、水中で両者を架橋重合させて、架橋重合した
水性ゲル媒体を形成する。本明細書においては、
特にことわらない限り、（水中に）溶解と（水中
に）分散の両者を含めて単に（水中に）溶解とい
い、水溶液と水分散液の両者を含めて単に水溶液
という。また、溶媒または分散媒として、所望に
より加えられる有機溶媒と水との混合物をも包含
する。
本発明に用いることができるアクリルアミド系
化合物としては、アクリルアミド、Ｎ−メチルア
クリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、
ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミド系
化合物が挙げられ、これらの化合物は単独で、あ
るいは二種以上を併用して用いることができる。
そして、これらのアクリルアミド系化合物のうち
ではアクリルアミドが最も好ましく、またアクリ
ルアミドと他のアクリルアミド系化合物の一種以
上の併用も好ましい。
化合物としては、アクリルアミド、Ｎ−メチルア
クリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、
ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミド系
化合物が挙げられ、これらの化合物は単独で、あ
るいは二種以上を併用して用いることができる。
そして、これらのアクリルアミド系化合物のうち
ではアクリルアミドが最も好ましく、またアクリ
ルアミドと他のアクリルアミド系化合物の一種以
上の併用も好ましい。
架橋剤としては「Electrophoresis」1981，２，
220−228等に記載の公知の化合物（一種又は二種
以上の組合せ）を用いることができる。架橋剤の
具体例としては、Ｎ、N′−メチレンビスアクリ
ルアミド（BIS）；Ｎ、N′−プロピレンビスアク
リルアミド（PBA）；ジアクリルアミドジメチル
エーテル（DAE）；１，２−ジアクリルアミドエ
チレングリコール（DEG）；エチレンウレアビス
アクリルアミド（EUB）；エチレンジアクリレー
ト（EDA）；Ｎ、N′−ジアリルタータルジアミド
（Ｎ、N′−diallyltartardiamide：DATD）：Ｎ、
N′−ビスアクリリルシスタミン（Ｎ、N′−
bisacrylylcystamine、ABC）等の二官能性化合
物が挙げられる。
220−228等に記載の公知の化合物（一種又は二種
以上の組合せ）を用いることができる。架橋剤の
具体例としては、Ｎ、N′−メチレンビスアクリ
ルアミド（BIS）；Ｎ、N′−プロピレンビスアク
リルアミド（PBA）；ジアクリルアミドジメチル
エーテル（DAE）；１，２−ジアクリルアミドエ
チレングリコール（DEG）；エチレンウレアビス
アクリルアミド（EUB）；エチレンジアクリレー
ト（EDA）；Ｎ、N′−ジアリルタータルジアミド
（Ｎ、N′−diallyltartardiamide：DATD）：Ｎ、
N′−ビスアクリリルシスタミン（Ｎ、N′−
bisacrylylcystamine、ABC）等の二官能性化合
物が挙げられる。
架橋剤は、単量体と架橋剤の総重量に対して約
２重量％から約30重量％が用いられ、特に約３重
量％から約10重量％が好ましく用いられる。
２重量％から約30重量％が用いられ、特に約３重
量％から約10重量％が好ましく用いられる。
ゲル濃度としては、S.Hjerten：「Arch.
Biochem.Biophys.」１（Suppl.），147（1962）に
記載の定義に従つて表示して、単量体、架橋剤お
よび水からなるゲル媒体の容積に対して、単量
体、架橋剤および水からなるゲル媒体の容積
（100ml）に対して、単量体と架橋剤の量が約３ｇ
から約30ｇの範囲で好ましく用いられる。
Biochem.Biophys.」１（Suppl.），147（1962）に
記載の定義に従つて表示して、単量体、架橋剤お
よび水からなるゲル媒体の容積に対して、単量
体、架橋剤および水からなるゲル媒体の容積
（100ml）に対して、単量体と架橋剤の量が約３ｇ
から約30ｇの範囲で好ましく用いられる。
本発明に従うポリアクリルアミドゲル膜の形成
時に共存させられる変性剤、尿素、ホルムアミド
であり、これらのうちで尿素が好ましく用いられ
る。
時に共存させられる変性剤、尿素、ホルムアミド
であり、これらのうちで尿素が好ましく用いられ
る。
変性剤の量は単量体と架橋剤とを含む水性ゲル
の容積（100ml）に対し、約40ｇから60ｇの範囲
で用いられる。また尿素を用いる場合には、単量
体と架橋剤とを含む水性ゲル媒体１に対し約６
モル（約360ｇ）から飽和溶解量まで、好ましく
は約７モル（約420ｇ）から飽和溶解量までの範
囲を用いることができる。
の容積（100ml）に対し、約40ｇから60ｇの範囲
で用いられる。また尿素を用いる場合には、単量
体と架橋剤とを含む水性ゲル媒体１に対し約６
モル（約360ｇ）から飽和溶解量まで、好ましく
は約７モル（約420ｇ）から飽和溶解量までの範
囲を用いることができる。
本発明に従うゲル媒体にはPH緩衝剤を含有させ
ることができる。緩衝剤としては、PH8.0から
10.0、好ましくはPH8.0から9.0の範囲内のPH値に
緩衝できる緩衝剤であればいずれをも用いること
ができる。用いうる緩衝剤としては、日本化学会
編『化学便覧 基礎編』（東京、丸善(株) 1966年
発行）1312−1320ページ； 『Data for Biochemical Research』（R.M.C.
Dawson et al編 第２版、Oxford at the Clar
endon Press、1969年発行）476−508ページ； 『Biochemistry』、５467（1966）； 『Analytical Biochemistry』104，300−310
（1980）等の刊行物に記載の緩衝剤があげられる。
ることができる。緩衝剤としては、PH8.0から
10.0、好ましくはPH8.0から9.0の範囲内のPH値に
緩衝できる緩衝剤であればいずれをも用いること
ができる。用いうる緩衝剤としては、日本化学会
編『化学便覧 基礎編』（東京、丸善(株) 1966年
発行）1312−1320ページ； 『Data for Biochemical Research』（R.M.C.
Dawson et al編 第２版、Oxford at the Clar
endon Press、1969年発行）476−508ページ； 『Biochemistry』、５467（1966）； 『Analytical Biochemistry』104，300−310
（1980）等の刊行物に記載の緩衝剤があげられる。
そして、その具体例としてはトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン（Tris）、Ｎ、Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Bicine）、Ｎ
−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−２−
ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸のNa塩ま
たはＫ塩等、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−N′−３−プロパンスルホン酸のNa塩または
Ｋ塩等、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル］−３−アミノプロパンスルホン酸のNa塩また
はＫ塩および、これらのいずれかと必要により組
合せられる酸、アルカリまたは塩等をあげること
ができる。特に好ましい緩衝剤の例としては、
Tris、ホウ酸およびEDTA・2Na塩の組合せ
（PH8.2）がある。
シメチル）アミノメタン（Tris）、Ｎ、Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Bicine）、Ｎ
−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−２−
ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸のNa塩ま
たはＫ塩等、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−N′−３−プロパンスルホン酸のNa塩または
Ｋ塩等、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル］−３−アミノプロパンスルホン酸のNa塩また
はＫ塩および、これらのいずれかと必要により組
合せられる酸、アルカリまたは塩等をあげること
ができる。特に好ましい緩衝剤の例としては、
Tris、ホウ酸およびEDTA・2Na塩の組合せ
（PH8.2）がある。
本発明に従うポリアクリルアミドゲル膜は、更
に水溶性の合成高分子化合物を含む。この合成高
分子化合物は、単量体と架橋剤の総重量に対して
２重量％から100重量％の範囲で用いられ、好ま
しくは５重量％から50重量％の範囲で用いられ
る。
に水溶性の合成高分子化合物を含む。この合成高
分子化合物は、単量体と架橋剤の総重量に対して
２重量％から100重量％の範囲で用いられ、好ま
しくは５重量％から50重量％の範囲で用いられ
る。
上記の水溶性の合成高分子化合物の分子量とし
ては、１万から約100万の範囲が好ましい。
ては、１万から約100万の範囲が好ましい。
水溶性合成高分子の好ましい例としては、付加
重合型または縮重合型の、水溶性ポリマーを用い
ることができる。付加重合型ポリマーの具体例と
しては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン、ポリアクリルアミド等の非イオン性水溶
性ポリマーが挙げられる。また縮重合型ポリマー
の具体例としてポリエチレングリコール、ポリプ
ロピレングリコール等の非イオン性水溶性ポリア
ルキレングリコールが挙げられる。なかでも、ポ
リエチレングリコール、ポリアクリルアミドが特
に好ましい。このポリマーを添加することによ
り、湿潤ゲル膜は可塑的となり、もろさが改良さ
れる。また乾燥ゲル膜の状態でも、可塑化効果は
さらに有効に作用し、ひびわれ等のもろさが改良
される。
重合型または縮重合型の、水溶性ポリマーを用い
ることができる。付加重合型ポリマーの具体例と
しては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン、ポリアクリルアミド等の非イオン性水溶
性ポリマーが挙げられる。また縮重合型ポリマー
の具体例としてポリエチレングリコール、ポリプ
ロピレングリコール等の非イオン性水溶性ポリア
ルキレングリコールが挙げられる。なかでも、ポ
リエチレングリコール、ポリアクリルアミドが特
に好ましい。このポリマーを添加することによ
り、湿潤ゲル膜は可塑的となり、もろさが改良さ
れる。また乾燥ゲル膜の状態でも、可塑化効果は
さらに有効に作用し、ひびわれ等のもろさが改良
される。
本発明に従うポリアクリルアミドゲル膜は更に
アガロースを含有する。アガロースは、種類とし
て特に制限はなく、低電気浸透性、中電気浸透
性、高電気浸透性アガロースのいずれをも用いる
ことができる。用いることのできるアガロースの
例としては、特開昭55−5730号、特開昭55−
110946号、特表昭57−502098号等の公報に開示さ
れているアガロース等を用いることもできる。ア
ガロースの添加量は単量体と架橋剤を含むゲル組
成液の容積100mlに対して約0.2ｇから約２ｇ、好
ましくは約0.3ｇから約1.2ｇの範囲から選ばれ
る。アガロースを含有させた組成においては、溶
液温度を変化させることにより、適当な溶液粘度
にコントロールすることが可能となる。
アガロースを含有する。アガロースは、種類とし
て特に制限はなく、低電気浸透性、中電気浸透
性、高電気浸透性アガロースのいずれをも用いる
ことができる。用いることのできるアガロースの
例としては、特開昭55−5730号、特開昭55−
110946号、特表昭57−502098号等の公報に開示さ
れているアガロース等を用いることもできる。ア
ガロースの添加量は単量体と架橋剤を含むゲル組
成液の容積100mlに対して約0.2ｇから約２ｇ、好
ましくは約0.3ｇから約1.2ｇの範囲から選ばれ
る。アガロースを含有させた組成においては、溶
液温度を変化させることにより、適当な溶液粘度
にコントロールすることが可能となる。
本発明に従う電気泳動用媒体層は、上記のよう
にアクリルアミドに代表される単量体、二官能性
のアリル（allyl）化合物またはアクリル化合物
（架橋剤）、水溶性ポリマー、およびアガロースを
実質的に均一な水溶液中で単量体と架橋剤とをラ
ジカル架橋重合させて得られるもであり、単量体
と架橋剤から形成された三次元架橋重合体に水溶
性ポリマーとアガロースが実質的に分散されて、
後二者のポリマー鎖が三次元架橋重合体とからみ
あつている構造を有すると推定される。
にアクリルアミドに代表される単量体、二官能性
のアリル（allyl）化合物またはアクリル化合物
（架橋剤）、水溶性ポリマー、およびアガロースを
実質的に均一な水溶液中で単量体と架橋剤とをラ
ジカル架橋重合させて得られるもであり、単量体
と架橋剤から形成された三次元架橋重合体に水溶
性ポリマーとアガロースが実質的に分散されて、
後二者のポリマー鎖が三次元架橋重合体とからみ
あつている構造を有すると推定される。
上記のラジカル架橋重合反応は、分子状酸素の
不存在下で過酸化物の存在および／または紫外線
照射等の公知の方法により発生させることができ
る。更に該反応は加熱および紫外線照射により加
速することもできる。
不存在下で過酸化物の存在および／または紫外線
照射等の公知の方法により発生させることができ
る。更に該反応は加熱および紫外線照射により加
速することもできる。
ラジカル架橋重合用触媒としては、
「Electrophoresis」1981、２、213−219、同
1981、２、220−228；青木、永井編「最新電気泳
動法」（1973年発行）等に記載の公知の低温ラジ
カル重合開始剤のうちから適宜選択して用いるこ
とができる。好ましいラジカル重合開始剤の具体
例としては、β−ジメチルアミノプロピオニトリ
ル（DMAPN）−ペルオクソ二硫酸アンモニウム
混合物、Ｎ、Ｎ、N′、N′−テトラメチルエチレ
ンジアミン（TEMED）−ペルオクソ二硫酸アン
モニウム混合物、TEMED−リボフラビン混合
物、TEMED−リボフラビン−過酸化水素混合物
と紫外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル
重合開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重
量に対して約0.3重量％から約５重量％、そして
好ましくは約0.5重量％から約３重量％の範囲で
ある。
「Electrophoresis」1981、２、213−219、同
1981、２、220−228；青木、永井編「最新電気泳
動法」（1973年発行）等に記載の公知の低温ラジ
カル重合開始剤のうちから適宜選択して用いるこ
とができる。好ましいラジカル重合開始剤の具体
例としては、β−ジメチルアミノプロピオニトリ
ル（DMAPN）−ペルオクソ二硫酸アンモニウム
混合物、Ｎ、Ｎ、N′、N′−テトラメチルエチレ
ンジアミン（TEMED）−ペルオクソ二硫酸アン
モニウム混合物、TEMED−リボフラビン混合
物、TEMED−リボフラビン−過酸化水素混合物
と紫外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル
重合開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重
量に対して約0.3重量％から約５重量％、そして
好ましくは約0.5重量％から約３重量％の範囲で
ある。
本発明に従うゲル媒体には、必要に応じて抗酸
化剤を含有させることができる。抗酸化剤として
は、ゲル電気泳動媒体に配合しうることが知られ
ている種々の化合物を用いることができる。抗酸
化剤の具体例としては、ジチオスレイトール、２
−メルカプトエタノールを挙げることができる。
化剤を含有させることができる。抗酸化剤として
は、ゲル電気泳動媒体に配合しうることが知られ
ている種々の化合物を用いることができる。抗酸
化剤の具体例としては、ジチオスレイトール、２
−メルカプトエタノールを挙げることができる。
その他の添加剤としては湿潤剤があり、本発明
のゲル媒体にはグリセリン、エチレングリコール
等のポリオール化合物を含有させることもでき
る。ポリオール化合物の含有量は、ゲル媒体の容
積100mlに対して約５ｇから約40ｇの範囲から選
ばれる。このうちではグリセリンが特に好まし
い。湿潤剤を配合することによりゲル媒体の保持
時の極端な水分の蒸発による乾燥を防ぐことが可
能となり、また極端な乾燥に起因するもろさの発
生を防ぎ、ひびわれを防ぐ等のゲル媒体の物性が
改善されるとの利点がある。
のゲル媒体にはグリセリン、エチレングリコール
等のポリオール化合物を含有させることもでき
る。ポリオール化合物の含有量は、ゲル媒体の容
積100mlに対して約５ｇから約40ｇの範囲から選
ばれる。このうちではグリセリンが特に好まし
い。湿潤剤を配合することによりゲル媒体の保持
時の極端な水分の蒸発による乾燥を防ぐことが可
能となり、また極端な乾燥に起因するもろさの発
生を防ぎ、ひびわれを防ぐ等のゲル媒体の物性が
改善されるとの利点がある。
本発明に従うゲル媒体層は、前述のグロー放電
処理を施した親水性表面を有する支持体の上にゲ
ル形成液を公知の方法により塗布して設けたの
ち、そのゲル形成液を架橋重合させることによ
り、ゲル媒体層を成形することができる。
処理を施した親水性表面を有する支持体の上にゲ
ル形成液を公知の方法により塗布して設けたの
ち、そのゲル形成液を架橋重合させることによ
り、ゲル媒体層を成形することができる。
ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場
合には、ゲル形成液の上をさらにカバーシートで
覆うことが好ましい。カバーシートとしては、前
記の支持体と同様な素材からなるものを用いるこ
とができ、また、グロー放電処理を施したシート
を用いることもできる。なおカバーシートの厚さ
は約300μｍ以下、好ましくは約4μｍ〜約200μｍ
の範囲から選ぶことができる。
合には、ゲル形成液の上をさらにカバーシートで
覆うことが好ましい。カバーシートとしては、前
記の支持体と同様な素材からなるものを用いるこ
とができ、また、グロー放電処理を施したシート
を用いることもできる。なおカバーシートの厚さ
は約300μｍ以下、好ましくは約4μｍ〜約200μｍ
の範囲から選ぶことができる。
本発明の製造方法により得られる電気泳動用媒
体材料における電気泳動用媒体層との支持体との
接着性（接合性）は非常に高く、通常の工程にお
いては電気泳動用媒体層と支持体とは常に一体と
して、処理することができる。従つて、本発明の
製造方法により得られる電気泳動用媒体材料を用
いることにより、特にDNAの塩基配列決定のた
めの電気泳動操作において従来必要とされていた
複雑な操作工程の省略が可能になり、また支持体
上にゲル膜をのせたままで、電気泳動操作、乾燥
操作、さらにオートラジオグラフイー処理を実施
することが可能となる。
体材料における電気泳動用媒体層との支持体との
接着性（接合性）は非常に高く、通常の工程にお
いては電気泳動用媒体層と支持体とは常に一体と
して、処理することができる。従つて、本発明の
製造方法により得られる電気泳動用媒体材料を用
いることにより、特にDNAの塩基配列決定のた
めの電気泳動操作において従来必要とされていた
複雑な操作工程の省略が可能になり、また支持体
上にゲル膜をのせたままで、電気泳動操作、乾燥
操作、さらにオートラジオグラフイー処理を実施
することが可能となる。
以下に本発明の実施例を記載するが、これらは
本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の範囲を限定するものではない。
実施例 １
厚さ180μｍの無色透明ポリエチレンテレフタ
レート（PET）シートを真空下（ただし、酸素
分圧：0.05Torr）に置き、10ｍ／分の速度で該
シートを動かしながら、その表面にグロー放電処
理（200V、1.0A）を施し、表面を親水化した支
持体を得た。
レート（PET）シートを真空下（ただし、酸素
分圧：0.05Torr）に置き、10ｍ／分の速度で該
シートを動かしながら、その表面にグロー放電処
理（200V、1.0A）を施し、表面を親水化した支
持体を得た。
このPET支持体のグロー放電処理した表面上
に、アクリルアミド11.87ｇ、BIS630mg、アガロ
ース1600（和光純薬(株)製）0.3ｇ、ポリアクリルア
ミド2.5ｇ、尿素42ｇ、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン1.08ｇ、ホウ酸0.55ｇ、および
EDTA・2Na塩93mgからなる100mlの水溶液に、
重合開始剤としてペルオクソ二硫酸アンモニウム
（5wt％水溶液）1.3ml、TEMED33μを加えたも
のを0.5mmの厚みで形成し、ポリアクリルアミド
膜を得た。
に、アクリルアミド11.87ｇ、BIS630mg、アガロ
ース1600（和光純薬(株)製）0.3ｇ、ポリアクリルア
ミド2.5ｇ、尿素42ｇ、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン1.08ｇ、ホウ酸0.55ｇ、および
EDTA・2Na塩93mgからなる100mlの水溶液に、
重合開始剤としてペルオクソ二硫酸アンモニウム
（5wt％水溶液）1.3ml、TEMED33μを加えたも
のを0.5mmの厚みで形成し、ポリアクリルアミド
膜を得た。
なお比較のために、表面にグロー放電処理を施
していないPET支持体を用いて同様のゲル膜を
作成した。
していないPET支持体を用いて同様のゲル膜を
作成した。
以上のようにして得られた電気泳動用媒体材料
を使用して、32P−DNAをマキサム・ギルバート
分解した試料について電気泳動にかけ、DNA塩
基配列決定の実験を行なつた。電気泳動後に電気
泳動用媒体材料を10％酢酸水溶液中に１時間浸漬
して、ゲル膜の脱尿素とDNA固定のための処理
を行なつた。このゲル膜を乾燥し、次いでオート
ラジオグラフイー処理を常法にしたがつて行なつ
た。
を使用して、32P−DNAをマキサム・ギルバート
分解した試料について電気泳動にかけ、DNA塩
基配列決定の実験を行なつた。電気泳動後に電気
泳動用媒体材料を10％酢酸水溶液中に１時間浸漬
して、ゲル膜の脱尿素とDNA固定のための処理
を行なつた。このゲル膜を乾燥し、次いでオート
ラジオグラフイー処理を常法にしたがつて行なつ
た。
10％酢酸水溶液中にゲル膜を浸漬した時の支持
体とゲル膜の接着状態を観察したところ、グロー
放電処理を施した支持体を用いた電気泳動用媒体
材料は接着性が優れていて、ゲル膜は支持体に強
固に接着していた。さらに、乾燥操作後のゲル膜
と支持体との間の接着状態も良好で、オートラジ
オグラフイー処理においても特に問題はなく、良
好な電気泳動特性が得られた。
体とゲル膜の接着状態を観察したところ、グロー
放電処理を施した支持体を用いた電気泳動用媒体
材料は接着性が優れていて、ゲル膜は支持体に強
固に接着していた。さらに、乾燥操作後のゲル膜
と支持体との間の接着状態も良好で、オートラジ
オグラフイー処理においても特に問題はなく、良
好な電気泳動特性が得られた。
これに対して、グロー放電処理をしていない支
持体を使用した電気泳動用媒体材料は、接着性が
劣つていて、ゲル膜は支持体から剥離した。
持体を使用した電気泳動用媒体材料は、接着性が
劣つていて、ゲル膜は支持体から剥離した。
Claims (1)
- １ グロー放電処理が施されたポリマーシートの
上に、アクリルアミド系化合物、架橋剤、水溶性
ポリマー、アガロース、および、変性剤としての
尿素またはホルムアミドが水に溶解もしくは分散
してなる溶液もしくは分散液を塗布したのち、こ
の塗布層においてアクリルアミド系化合物と架橋
剤とを架橋重合させてポリアクリルアミド系水性
ゲルからなるゲル媒体層を形成することからなる
電気泳動用媒体材料の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58087965A JPS59212751A (ja) | 1983-05-19 | 1983-05-19 | 電気泳動媒体材料の製造方法 |
| US06/854,345 US4699705A (en) | 1983-05-19 | 1986-04-21 | Element for electrophoresis using aqueous polyacrylamide gel |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58087965A JPS59212751A (ja) | 1983-05-19 | 1983-05-19 | 電気泳動媒体材料の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59212751A JPS59212751A (ja) | 1984-12-01 |
| JPH0457974B2 true JPH0457974B2 (ja) | 1992-09-16 |
Family
ID=13929565
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58087965A Granted JPS59212751A (ja) | 1983-05-19 | 1983-05-19 | 電気泳動媒体材料の製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4699705A (ja) |
| JP (1) | JPS59212751A (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4865707A (en) * | 1986-10-21 | 1989-09-12 | Northeastern University | Capillary gel electrophoresis columns |
| US5665216A (en) * | 1986-10-21 | 1997-09-09 | Northeastern University | Capillary column for high performance electrophoretic separation and detection of SDS proteins and system and using the same |
| US4997537A (en) * | 1986-10-21 | 1991-03-05 | Northeastern University | High performance microcapillary gel electrophoresis |
| JPH0660887B2 (ja) * | 1987-09-14 | 1994-08-10 | 富士写真フイルム株式会社 | 電気泳動方法 |
| US5055517A (en) * | 1988-04-29 | 1991-10-08 | At Biochem | Electrophoretic media |
| US5219923A (en) * | 1988-04-29 | 1993-06-15 | At Biochem, Inc. | Electrophoretic media |
| CS257291A3 (en) * | 1990-12-13 | 1992-06-17 | Jan J Prof Mudr Opplt | Multi-layered, non-sequential discontinuous polyacrylamide gels, forming equilibrium molecular sieves for biomolecules separation |
| EP0497448A1 (en) * | 1991-02-01 | 1992-08-05 | Beckman Instruments, Inc. | Capillary gel electrophoresis in the presence of at least one neutral non-urea denaturing agent |
| AU6525094A (en) * | 1993-03-26 | 1994-10-24 | United States Biochemical Corporation | Improved sequencing gel |
| EP0738338A4 (en) * | 1993-11-17 | 1997-03-05 | Applied Hydrogel Technology Co | METHODS FOR SEPARATING BIOLOGICAL MATERIALS |
| US6783651B1 (en) * | 1994-03-31 | 2004-08-31 | Invitrogen Corporation | System for pH-neutral stable electrophoresis gel |
| US6143154A (en) * | 1994-03-31 | 2000-11-07 | Novex | System for PH-neutral stable electrophoresis gel |
| US5578180A (en) * | 1994-03-31 | 1996-11-26 | Novel Experimental Technology | System for PH-neutral longlife precast electrophoresis gel |
| US5747600A (en) * | 1994-06-24 | 1998-05-05 | Fang; Ta-Yun | Reconstitutable polyacrylamide materials and methods for producing same |
| FR2794758A1 (fr) * | 1999-06-11 | 2000-12-15 | Roussy Inst Gustave | Gels de polyacrylamide contenant en outre un polymere hydrophile |
| US6713538B2 (en) * | 2000-09-15 | 2004-03-30 | Isp Investments Inc. | Post-treatment of a polymeric composition |
| US7056426B2 (en) * | 2003-01-17 | 2006-06-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Pre-cast electrophoresis slab gels with extended storage life |
| US20040140215A1 (en) * | 2003-01-17 | 2004-07-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Pre-cast electrophoresis slab gels with extended storage life |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4851864U (ja) * | 1971-10-20 | 1973-07-05 | ||
| JPS6016614B2 (ja) * | 1977-04-18 | 1985-04-26 | 富士写真フイルム株式会社 | 写真感光材料支持体用ポリエステルフィルムの表面処理方法 |
| JPS5518469A (en) * | 1978-07-28 | 1980-02-08 | Fuji Photo Film Co Ltd | Method of treating surface |
| JPS581324A (ja) * | 1981-06-26 | 1983-01-06 | Hitachi Ltd | 集積化マルチバイブレ−タ |
| US4415428A (en) * | 1982-01-27 | 1983-11-15 | Fmc Corporation | Support for electrophoresis and method of producing same |
| JPS581323A (ja) * | 1982-04-30 | 1983-01-06 | Sharp Corp | 電子装置 |
| US4481094A (en) * | 1982-05-17 | 1984-11-06 | Techamerica Group, Inc. | Stabilized polyacrylamide gels and system for SDS electrophoresis |
| JPS59164950A (ja) * | 1983-03-11 | 1984-09-18 | Fuji Photo Film Co Ltd | 電気泳動用媒体材料 |
| JPS59166850A (ja) * | 1983-03-11 | 1984-09-20 | Fuji Photo Film Co Ltd | 電気泳動用媒体材料 |
| JPS59212752A (ja) * | 1983-05-19 | 1984-12-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | 電気泳動用媒体材料 |
| JPS59212753A (ja) * | 1983-05-19 | 1984-12-01 | Science & Tech Agency | 電気泳動用媒体材料 |
-
1983
- 1983-05-19 JP JP58087965A patent/JPS59212751A/ja active Granted
-
1986
- 1986-04-21 US US06/854,345 patent/US4699705A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59212751A (ja) | 1984-12-01 |
| US4699705A (en) | 1987-10-13 |
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