JPS6130680B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアガロース誘導体、特に電気泳動及び
拡散相互作用に新たに使用されるアガロース誘導
体に関する。 電気泳動技術においては生物物質を分離するの
に篩分けゲルを使用することが知られている。か
かるゲルは、低分子量のフラクシヨンを通過させ
るが高分子量のフラクシヨンを通過させないとい
うようにフラクシヨンの移動に選択的に作用する
微孔質構造の存在を特徴とする。かかる技術は最
初、篩分けゲルとしてでんぷんを用いて行われ
た。スミシーズ（Smithies、O.）による
Biochem、J.61、629（1955年）参照。しかしな
がら、でんぷんゲルには以下のような不便な点が
あつた。(1)不透明であること。(2)不連続であるた
め乾燥してそのまま保存することができないこ
と。(3)耐変形性が低いこと。(4)多孔性の範囲が限
定されていること。(5)でんぷんにより分離された
たんぱく質の回収率が低く、回収されたままでは
低分子量のでんぷん汚染物を含むこと。その後電
気泳動ゲル篩分け媒体としてポリアクリルアミド
が発展した。次いで、「段積みゲル（stacking
gel）」が工夫され、一般的なゲル篩分けとして円
板式電気泳動となつた。 ポリアクリルアミドは乾燥して破砕することな
く貯蔵できる非常に透明で、典型的には連続した
ゲルを形成する。かかるゲルは広範囲の濃度及び
多孔性で調製しうる。 ポリアクリルアミドゲルは、初期のでんぷんゲ
ルよりは有利であるが、完全に満足であるという
わけではなく、いくつかの不便な点があつた。た
とえば、ポリアクリルアミドを合成するのに使用
するアクリルアミドモノマーは蓄積性神経毒素で
あり、重合条件に依存して重合ゲル中に種々の量
のモノマーが残存し健康状態に危険を生ずる。重
合条件はまたゲルの多孔性及び異なつた水溶液中
での異つた膨潤傾向に影響を及ぼす。このためか
かるゲルの再生産性には限度があり、したがつて
広範囲の用途には使用できない。更に、ポリアク
リルアミドはかくれもなく特に低濃度においてゲ
ル強度が低い。その上、かかるゲルは残留性及び
凍結融解特性が欠如しているため脱色及び調製用
のゲル媒体として使用することが困難である。 篩分けゲルが多くの利点と用途を有するため、
新しい種類及び改良種の開発が強く刺激された。
この問題に関して多くの出版物があるけれども、
分離されたたんぱく質を変性せず、かかる分離技
術に通常使用されている条件を受け入れる（尿
素、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチルフエノキ
シポリエトキシエタノール等）便利な方法は記載
されていない。 低濃度のポリアクリルアミドゲルの耐変形性が
低いことを克服するため、ゲルにアガロースを配
合することが提案された。ピーコツク
（peacock、A.）らによるバイオケミストリー
（Biochemistry）７、668（1968年）参照。同様
な方法がボード（Bode）により提案された。ア
ナール・バイオケミストリー（Anal.
Biochemistry）83、204（1977年）参照。彼は寒
天ゲルに液体ポリアクリルアミドを配合したが、
かかる配合の実際の上限はわずか５％であること
をみいだした。クラムバツハ（Chrambach、A.
）らによるアナール・バイオケミストリーク０、
32（1976年）には、付着力を増加させてガラス管
内のポリアクリルアミドゲルの機械的安定性を増
加させるための手段としてビスアクリルアミドの
かわりにジアリルタルタルジイミド（DATD）を
使用することが開示されている。この系はまた、
酸化加水分解よりゲルの分離性を容易にする（酸
化加水解によりたんぱく質が分解される傾向があ
るが）。 同様に、ゲルを四級アンモニウム化合物で膨潤
するか又はH₂O₂中に溶解することにより（この
場合もたんぱく質を分解する危険があり、研究員
はたんぱく質を遊離した）ポリアクリルアミド中
で分離されたたんぱく質を回収する試みがなされ
た。ピーコツク及びデイングマン（Dingman、
C.）によるバイオケミストリー７、668（1968
年）参照。 調製用のポリアクリルアミドゲルを使用する際
のたんぱく質の回収の困難さを克服する手段とし
て、1MのNaOHで処理することにより変換しう
る架橋方法が開示されている。ビー・ラドラ（B.
Radola）によりベルリン、ワルター・デグルイ
ター（Walter DeGruyter）で1980年に出版され
た電気泳動1979年の第235貢（ブラウン・
（Brown、M.）ら著）参照。しかしながらかかる
過酷な条件では分析するたんぱく質試料を分解す
る危険がある。 ビー・ラドラによりベルリン、ワルター・デグ
ルイターで1980年に出版された電気泳動1979年の
第234頁（ブラウンら）及びロウエ（Lowe、C.）
によるイント・ジエイ・バイオケミストリー
（Int.J.Biochem.8、177（1977年）に記載されて
いるようなアガロースとポリアクリルアミドとの
組合せの試みは、２つのゲル媒体がほぼ反対の特
性を有するという認識に基いていた。即ち、アガ
ロースは低濃度においてゲル強度が高いのに対
し、ポリアクリルアミドは７％未満の低濃度にお
いてゲル強度が低い。アガロースゲルは典型的に
はわずかに半透明であるが、ポリアクリルアミド
ゲルは多くの配合において結晶ように透明であ
る。アガロースは大部分の血清たんぱく質（分子
量50000乃至500000）をほとんど篩分けしないの
に対し、ポリアクリルアミドゲルはこの分子量範
囲内のたんぱく質を選択する媒体である。ビー・
デイー・エイチ・リミテツド（BDH Ltd.）によ
りイギリス、プール（Poole）で出版された「メ
ソーズ・イン・ゾーン・エレクトロフオレシス
（Methods in Zone Electrophoresis）」（1969
年）の第75頁（サージエント・ジエイ・アール
（Sargent J.R.）著）参照。しかしながら、実際
には複合ゲルによる方法は限られた場合において
のみしか成功しなかつた。これら二つの媒体の伝
統的な用途には分子量500000以上のたんぱく質を
篩分けするアガロースを使用する。一方分子量
500000未満のたんぱく質は、分子量2000末満のも
のを排斥するために容易に合成しうるポリアクリ
ルアミドゲル中で最もよく溶解する。アシユトン
（Ashton、G.）によるネイチヤー（Nature）
180、917（1957年）及びバイオラド（BioRad）
1980カタログ第36頁バイオラド実験室、カリフオ
ルニア、リツチモンド出版参照。大きな、非常に
多孔性のアガロースゲルにポリアクリルアミドを
充てんする方法については、その微細構造
（ultrastructure）がリーズ（Rees）らによるジ
エイ・モレキユラー・バイオロジー（J.
Molecular Biology）90、269（1974年）に詳細に
報告されているので、結局それは平凡な救済法で
あり、各媒体の最高の性質を折衷したものである
と判明した。 電気泳動及びクロマトグラフイーの双方に適用
するための篩分け媒体を開発する別法は、適当な
濃度条件下で中性の多糖類をゲル化せず架橋する
方法である。かかる架橋篩分け媒体の例としては
イナゴマメのゴム（デユエル（Duel、H.）及び
ニユーコン（Neukon、H.）によるアドバン・ケ
ム・セル（AdVan.Chem.Ser.）第11巻第51頁
（1954年））、デキストラン（フローデイン
（Flodin、P.）による「デキストランゲル及びゲ
ル過への適用」フアーマシア（Pharmacia）、
スウエーデン、ウプサラ出版（1962年））、ガール
ゴム（グプタ（Gupta、K.）、サーニ（Sahni、
Ｍ）らによるジエイ・クロマトグラフイー（J.
Chromatography）169、183（1979年））、及びセ
ルロース（ペスカ（Peska、J.）及びスタンベル
グ（Stamberg、J.）による米国特許第4055510号
1977年10月25日発行）がある。かかる手順の主要
な欠点は、調整用のたんぱく質回収用途用に架橋
したあとゲルが容易には溶解しないこと、及び大
部分の電気泳動分離技術に要求される必要な緩衝
液又は両性電解質の存在下でゲルが容易には重合
しないことである。ガイスレー（Guiseley）によ
る1976年５月11日に発行された米国特許第
3956273号には変性アガロースが開示されてい
る。このものは、アガロースの主要な成分である
二糖類に約0.01乃至1.0の置換度である種の置換
基を導入することにより調製される。かかる置換
基は低級脂肪族炭化水素、低級ヒドロキシ炭化水
素、及びアシル基であり、置換基の分子量は最高
約100である。かかる変性アガロースゲルはゲル
化温度及び融点が低く、ゲルの透明度も増加して
いる。ガイスレーの特許にはかかる変性アガロー
スの多孔性及びその篩分け特性については何も記
載されていない。 アガロース誘導体が有効な篩分けゲル媒体であ
ることが発見され、電気泳動手段により生物物質
を分離するためにかかるゲルを使用することが本
発明の一目的である。本発明の別の目的は限定さ
れた孔寸法を有し、かつ篩分けゲル特性を示すア
ガロース誘導体組成物を提供することである。そ
の他の目的は以下の文中で明らかとなろう。 本発明によれば、電気泳動篩分けゲルとして有
用であり、分子量100乃至約1000000及び平均孔直
径が約10^-9ｍ、以上であるような配座形態を有す
る少くとも一つの置換基を含む（置換度（Ｄ、
Ｓ、）が約0.001乃至約2.0）アガロース誘導体が
提供される。確認されうるかぎりでは、置換基の
存在が立体的にヘリツクス及び接続帯（junction
zone）の形成を禁止する。そして、それが本明
細書中のアガロース誘導体の篩分け特性を説明す
る効果である。一般的に言えば、アガロースに置
換基を導入することにより程度篩分け作用が付与
される。この効果は置換基の嵩が小さい場合には
非常に小さい。置換基の分子量が大きい場合に
は、ヘリツクス及び接続帯の形成が禁止されるこ
とに加えアガロース孔への接近が制限される。多
かれ少かれ置換基の配座形態（conformational
shape）に依存してかかる嵩高い部分がアガロー
ス孔を封鎖又は閉鎖することにより篩分け特性を
破壊することもある。 置換基は、必要とされる立体的配座他に、親和
性、疎水性あるいはイオン交換性を付与するよう
に選択される。それによつて分子の寸法及び一以
上の前述の性質の双方に基く分離に備える。 以下はこれらの特徴の説明である。 (1) アガロース誘導体がアルカリ緩衝液条件下で
負電荷を有する場合（すなわち、たとえばカル
ボキシレート又はスルフエートアニオン）に
は、ゲル電気泳動条件下で水の陰極流
（cathodal flow）が増大し、その結果中性の置
換基に比べて篩分けされたたんぱく質の陰極変
化が生ずる。これにより非常に塩基性のたんぱ
く質の移動度が抑制される分離となる。 (2) アガロース誘導体が電気泳動緩衝液条件下で
正電荷を有する場合には、ゲル中の水は陽極流
（anodal flow）となり、その結果中性の置換基
に比べて陽極に移動して篩分け分離される。そ
の結果非常に酸性のたんぱく質の移動度が抑制
された分離となる。 (3) アガロース誘導体がたんぱく質と疎水性相互
作用を有する長い（C₃以上）アルキル基又は
芳香族を含む場合には、マトリツクスの篩分け
効果と分離されるたんぱく質の親油性の双方の
関数で分離が行われる。 (4) アガロース誘導体が分離されるたんぱく質あ
るいはその他の物質に生物親和性を示す場合に
は、マトリツクスの篩分け効果と親和性効果の
組合せの関数で分離が行われる。 すべての場合において、選択された置換基は典
型的な電気泳動緩衝液（PH５〜９）の存在下にお
ける加熱（＜80℃）に対して安定でなければなら
ないし、アガロース誘導体の典型的な溶解及びゲ
ル形成（典型的には15分以内）中に50％より多く
の誘導体が失われてはならない。 置換度とは、アガロースの主要な構造単位であ
るＤ−ガラクトースと３・６−アンヒドロ−Ｌ−
ガラクトースから成る二糖類分子中に存在する理
論上４個の反応サイトにより定義しうる。この基
準に基いて、すべての反応サイトが完全に反応し
ている物の置換度（D.S.）が4.0である。前述の
ように、本明細書中のアガロース誘導体のD.S.は
約0.001乃至約2.0である。一般に、D.S.は孔寸法
の必要な低下を行うのに必要な値より大きくはな
い。 本発明による篩分け特性を示すアガロース誘導
体組成物は、アガロースの二種類鎖に置換基を導
入する公知の合成手順を用いて調製される。かか
る方法には、ウイリアムソン（Williamson）の
エーテル合成法のような一工程反応、グラフトポ
リマーのラジカル反応及び二官能性試薬の架橋を
最小にする反応が含まれる。かくしてアガロース
をまず強アルカリ、好ましくはたとえばアルカリ
金属水酸化物の0.5乃至1.5モル水溶液に溶解さ
せ、その後ジメチルスルフエート、臭化エチル、
１−ブロモプロパン、２−プロモプロパン、３−
ブロモプロパン、プロピレンオキシド、エチレン
オキシド、２−クロロエタノール、エピクロロヒ
ドリン、ブチレンオキシド、ジエポキシブタン等
の適する試薬を添加する。かかる反応をアルカリ
水溶液中で実施する場合には反応中に溶液が変色
あるいは暗色化して、その他の点では全く満足で
あるが変色した生成物が得られるので、寒天又は
アガロースをアルカリ水溶液と接触させる前にた
とえば還元によりアガロースのアルデヒド末端基
を保護するのが好ましい。かくしてアルデヒド基
を含む着色反応がおこることを防ぐことができ
る。保護剤としては硼水素化物特に硼水素化ナト
リウムのようなアルカリ金属硼水素化物がよく、
アルデヒト末端基を還元してアルコール（ヒドロ
キシ基）とするものである。 適当な条件下で架橋を生じさせ、水に不溶な生
成物を形成しうるエピクロルヒドリンのような二
官能試薬は、架橋を生じさせず、その結果水溶性
の生成物、すなわち、90℃において小くとも２重
量％程度は可溶であるような生成物を形する条件
下においてのみ使用される。よく知られているよ
うに、架橋は寒天又はアガロースの希釈溶液（約
3.5重量％未満）を反応使用すること及びその他
の当業者に公知の技術により回避することができ
る。二官能性試薬を使用する場合には、水に不溶
な生成物の形成を回避することが必要である以
外、濃度あるいは条件に関して重要なことはな
い。 反応は好ましくは約70゜乃至100℃又はそれ以
上の高温で実施するが、アルデヒド末端基が保護
されていない場合には変色を最低にするため、あ
るいは比較的発揮性の試薬を使用する場合には損
失を少なくするため低温を使用してもよい。低温
においては反応はゆつくりであるから、アガロー
スとの反応が所望の程度進行する前に選択した試
薬が水と反応して分解する場合もある。 反応が完了した後、混合を50乃至60℃に冷却す
る。（比較的高温であつても）、アルカリを酸と中
和させるか、透析又はその他の従来の手順により
アルカリを除去して、生成物を従来の手順により
精製する。たとえば溶液を冷却によりゲル化さ
せ、凍結させてから溶解して水洗し乾燥させる
か、生成物の非溶媒である水と混和性の有機液
体、たとえば、メタノール、エタノールと反応溶
液を混合することにより生成物を沈殿させ、過
し、非溶媒で水洗して乾燥させる。 本発明の方法はまたＮ・Ｎ−ジメチルホルムア
ミド、ピリジン等のような有機溶媒中でも実施し
うる。実際にかかる溶媒中の反応は、たとえばア
セチルクロライド又はプロピオニルクロライドを
用いたアシル化の場合には好ましい。かかる条件
下ではアルデヒド末端基の保護は通常不要であ
り、反応中の変色はほとんどあるいは全くない。
更に、必要に応じてアシルハロゲン化物のかわり
に酸無水物を用いてアシル化しうる。 使用するアシル化剤、アルケニル化剤、アシル
化剤あるいはヒドロキシアルキル化剤の精確な量
は、反応条件及び所望する置換度（D.S.）に依存
する。試薬はある程度水（存在する場合）と反応
する傾向があるため、通常理論的に必要な量に比
べて大過剰使用する。 置換器としてヒドロキシエチル基を4.0重量％
含む本明細書中のアガロース誘導体の平均孔直径
は69±22×10^-6ｍ（μ）であるが、9.0重量％の
ヒドロキシエチル基を含むものの平均孔直径は更
に小さく42±18×10^-6ｍである。置換基を導入し
ていないアガロースの平均孔直径は、典型的には
106±52×10^-6ｍである。 本発明のアガロース誘導体はまた、アクリロニ
トリル、アクリルアミド、α・β不飽和カルボン
酸等のような種々のエチレン系不飽和モノマーと
のグラフト共重合によつても調整しうる。この手
順は、アガロース分子に高分子量の置換基を導入
するのに有用である。 低分子量の中間体が互いに結合する遂次反応に
より、高分子量の多官能性置換基をアガロースに
導入してもよい。この方法は一工程反応であれば
高分子量置換基の溶解性と反応性の限界を回避す
ることができる。かかる反応はアガロースの結合
した反応中間体を形成し、次いで一又は二官能性
アミン、アミノアルコール、チオール又はジチオ
ールとのカツプリングを含む。第三工程において
はアミド結合の形成、すなわち有用なアミン又は
チオール部分と他のアルキル又は芳香族基との置
換反応により置換基の全体を形成することが可能
である。最初のマトリツクス活性化工程において
は、臭化シアン、塩化シアヌル、ジビニルスルホ
ン、エピクロルヒドリン及びビスエポキシドのよ
うな二官能性試薬を一度だけアガロースマトリツ
クスと反応するような条件下で使用するので、第
二及び／又は第三の工程では別の反応体と反応さ
せることができる。一般には必要ないが。更に高
次の工程を可能である。 一般的に言えば、アガロース誘導体中の置換基
は二糖類単位中のヒドロキシル基の酸素原子によ
りアガロース分子と結合しているので、置換基は
エステル、エーテル、アミド、アミン、イソ尿素
及びカルバメート結合により二糖類と結合してい
る。アガロース分子にもともと存在する基あるい
は導入された基以外の酸素を含む基が置換基を結
合させるための反応サイトである。置換基の代表
例を第表に示す。 篩分け特性の他に、本発明のアガロース誘導体
ゲルは以下の望ましい特徴を示す。 (1) 形成されたゲル中には神経毒素もその他の化
学的危険も残存しない。 (2) ゲルの透明度はポリアクリルアミドゲルと本
質的に同じであり、対応するアガロース（末誘
導体）又はでんぷんゲルより優れている。 (3) 分子量500000未満のたんぱく質及びその他の
生成物質の篩分け特性はポリアクリルアミドゲ
ルと同一である。 (4) ゲルにより分離されたたんぱく質を再融解又
は凍結融解により外部から汚染されることなく
調製的に使用しうる。 (5) 篩分け及び／又は疎水性、イオン交換、又は
生物親和性相互作用を同時に適用することによ
り複雑な物成混合物を分離するこができる。明
らかに、本発明のアガロース誘導体はこれまで
の篩分けゲルより有利である。 本発明を以下の例により説明する。 本発明のアガロース誘導体篩分けゲルを用いた
電気泳動による生物物質の分離 例 １ この例の目的は、本発明のアガロース誘導体の
篩分け特性を未変性アガロースの場合と比較する
ことである。かくしてグラシラリア
（gracilaria）寒天から誘導したアガロース１％と
0.002モルのエチレンジアミン四酢酸ジナトリウ
ム塩を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン／酢酸ナトリウム緩衝液（0.04M）から成る
ゲルを水平様式で操作する電気泳動室に注いだ。
幅10mmの20本のレーン（lane）（又はトラフ）を
アガロースラブから切断し、各試験用アガロース
の１％溶液で充てんし、次に室温でゲル化した。
試験用アガロースはテングサ及びグラシラリア寒
天の双方から誘導したもの及びテングサから誘導
したアガロースから調整した本発明のヒドロキシ
エチル化アガロースである。各レーン中の中心の
試料にECO RI、即ち、RI（fi⁺プラスミド）遺
伝子を有するE.coli−RY（制限されたラムダ
DAN溶液より単離された制限エンドヌクレアー
ゼ）を10μ注入した臭化エチジウム（0.5μｇ/
ml）を用いて17時間電気泳動を行ない、各バンド
の写真を撮影した。ダイジエスト（digest）中に
存在する６個の特徴であるDNAフラグメントの
電気泳動移動は他のアガロースのいずれと比較し
てもヒドロキシエチル化アガロース中では約50％
遅延した。更に、電気泳動パターンは圧縮され、
バンドはアガロース誘導体ゲル中で鋭くなつた。
これらの効果は明らかに本発明のアガロースゲル
の篩分け特性を示す。 前述のヒドロキシエチル化アガロースは、アル
カリ媒体中でアガロースをエチレンオキシドと反
応させ、反応混合物からヒドロキシエチル化アガ
ロース生成物を回収することにより得られた。反
応の詳細はガイスレーによる米国特許第3956273
号に記載されている。 例 ２ ９％のヒドロキシエチル組成物を有するアガロ
ース誘導体の４％重量／容積（w/v）分散液を溶
解するまで沸点に加熱した。得られたゾルを75℃
に冷却し、２つのガラスプレート（10cm×10cm）
及び２mmのプラスチツクのＵ字型スペーサ及びプ
ラスチツクのスペーサの片側に固くガラスプレー
トを保持する数個の金属クランプから成るゲルプ
レート流延組立体にピペツトで注入した。アガロ
ースゾルを放冷する前に、５個の幅１cmの歯を含
むプラスチツク試料のくしをゲル組立体の上部に
挿入した。ゲル化後、試料のくしを金属クランプ
に沿つて除去し、組立体の３つの側壁低部を防水
プラスチツクテープで固定した。次いでゲルプレ
ートを標準垂直様式電気泳動室の上部の溜め中に
位置するゴム製グロメツトに挿入した。 80μｇ／４mlのたんぱく質試料を、40％のサツ
カロース緩衝溶液として各試料のスロツトに入れ
た。使用したPH8.9の電気泳動緩衝液（0.1モル）
は（ヒドロキシメチル）アミノメタン、エチレン
ジアミン、四酢酸ジナトリウム塩及び硼酸を含有
した。レイモンド（Raymond）らによるアナー
ル・バイオケム（Anal.Biochem）３、23（1962
年）参照。120Vで１時間たんぱく質試料の電気
泳動を行つた後、ゲルを10％のスルホサリチル酸
中に固定し、クマシーブリリアントブルーＲ−
250で染色し、メタノール：水：酢酸（５：５：
１）で脱色した。 この手順を用いて、等電点は同じであるが分子
量が異なるたんぱく質を第表に示した各媒体に
ついて示されたバンドの番号に分離することがで
きた。表中のデータは明らかに本発明のアガロー
ス誘導体ゲルの篩分け特性が優れていることを示
す。 本発明の孔寸法の測定 アガロースの未誘導体及び２種の置換度のヒド
ロキシエチル置換基を有するアガロースから調製
した４％ゲルの微細構造を透過及び走査電子顕微
鏡により研究した。固定及び染色手順は、グルタ
ルアルデヒドのカコジレート緩衝溶液を使用した
のち四酸化オスミウムを浸透させ、アルコール滴
定濃度を増加させつつ脱水して最後にZVI Er El
と記載されているエポキシ樹脂を浸透させること
により行つた。 これらの条件下で各ゲルについて平均孔直径及
び標準偏差を測定し、第表に示すようにヒドロ
キシエチル置換基の関数として表した。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 生物混合物を分離する方法にしてヒドロキシ
   エチル化アガロースであつてその孔直径を10^-9ｍ
   より低下させないような配座形態を有する少なく
   とも一つのヒドロキシエチル基を含む（置換度
   0.001乃至2.0）ヒドロキシエチル化アガロースを
   ゲルマトリツクスとして使用するゲル電気泳動
   に、前記混合物を付することにより前記混合物中
   の成分をその分子の大きさの関数として分離する
   方法。 ２ 特許請求の範囲第１項に記載の方法におい
   て、生物混合物がDNAフラグメントである方
   法。 ３ 特許請求の範囲第１項に記載の方法におい
   て、生物混合物がたんぱく質である方法。