JPS6137730A - 制ガン作用を有する蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＬｉＬＬ糺ｍ 本発明は制ガン作用を有する新規な蛋白質に関する。

ｉ迷ｍ カースウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ　）らは、バチルスカ
ルメツティ　グエリン（Ｂ　ａｃｉ　Ｉ　ｌｕｓ　Ｃａ
ｌｌｅｔｔｅＧｕｅｒｉｎ　、　Ｂ　ＣＧ　）で感作し
たマウスに、１４日目にエンドトキシンを投与すると、
２時間後にその血清中に、Ｌ−細胞に対して細胞毒性を
有する因子が産生されることを見い出し、これをツーモ
ア　ネクロシス　ファクター（Ｔ　ｕｍｏｒ　　ｎｅｃ
ｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ、　Ｔ　Ｎ　Ｆ　）と名付けた
（　Ｐ　ｒｏｃ、　　Ｎ　ａｔ。

Ａｃａｄ　、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７２巻、３６６６頁。

１９７５年〕。グリーン（Ｇ　ｒｅｅｎ）らは、上記物
質を硫酸アンモニウムによる分画沈澱、ゲルか過などに
より部分精製し、上記ＴＮＦの分子量が約１５００００
であると報告した（　Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＬＩＳＡ、７３巻、３８１頁。

１９７６年〕。その後マテイウース（Ｍ　ａｔｔｈｅｗ
ｓ　）らは、ウサギにＢＣＧを投与し、２週問後にエン
ドトキシンを投与して、ＴＮＦを産生じ、精製して、ゲ
ルろ過法による分子量が３９０００で、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法（Ｐｏ１ｙａｃｒｙｌ　−ａｍＩｄ
ｅ　ＱｆＩ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、　Ｐ　
Ａ　Ｇ　Ｅ　）によって６７０００であると報告した（
　Ｂ　ｒ、Ｊ　、　Ｃａｎｃｅｒ　。

４２巻、４１６頁、１９８０年〕。更に原中らは、プロ
ピオンバクテリウム　アクネス（Ｐ　ｒｏｐｌｏｎｉ−
ｂａｃｔｅｒｉｕｉ　　ａｃｎｅｓ　）とエンドトキシ
ンを用いて、マウス及びウサギでＴＮＦを産生じ、その
分子量はゲルろ過法及びＰＡＧＥにより３９０００であ
ると報告した〔日本臨床、４０巻、１８７２頁、１９８
２年〕。

上記の如＜、ＴＮＦはその生理活性から当初より悪性腫
瘍治療剤として期待されてきたが、これらはヒト以外の
動物血清から製造され、工業的規模での製造が困難であ
ること、精製が困難であること、またヒト以外の動物に
由来する蛋白成分であるため、抗原性の問題等があり、
ヒトの治療上の安全性等に問題があった。しかして、ヒ
ト培養株化細胞から、同様の生理活性物質を製造する試
みがなされ、例えばアミノ（ＡＭＩＮＯ）らは、ヒト培
養株化リンパ系１１１Ｍ−７００２又はＢ−７００１に
７カインゲンマメレクチン（ＰＨＡ）を作用させること
により、マウスＬ−細胞に対して細胞毒性作用を有する
可溶性因子（ＨＬＴ−ＬＣＬ）の誘導産生を報告した（
　Ｔ　ｈｅ　　Ｊ　０ｕｒｎａｌｏｆ　　　１　１１ｔ
ｌｎｏｌｏ！；ｌＶ、ＶＯｌ、　　１　１　３　　　、
ＮＯ、４，１３１３３４〜１３４５　（１９７４））。

該報告によれば、上記可溶性因子の分子量はゲルろ過法
で６８０００〜１５００００の範囲とされたが、未だそ
の本体を単離同定するには至っていない。

ａＪ■しＵ 本発明者らも上記し一細胞に対して細胞毒性を有する物
質の本体を究めるべく鋭意研究を重ねてきた。その結果
、ヒト由来の培養株化リンパ系細胞から、上記生理活性
を有し、しかも報告された可溶性因子とは相違する別個
の蛋白質を単離精製することに成功し、これが制ガン作
用を有し、ヒトの治療上安全性の高いことを見出しここ
に本発明に到達した。

１１悲ｌ」 本発明の新規な蛋白質は、ヒト由来の培養株化リンパ系
細胞に、抗腫瘍物質誘導剤を作用させることによって誘
導産出され、以下の特性を有することにより特徴付けら
れる。

（１）　分子量 Ａ、　ウルトロゲルＡｃＡ３４を用いたゲル２濾過法に
よる分子量 ウルトロゲルＡＯＡ５４　（ＬＫＢ社製、アメリカ）を
カラム（２５Ｘ１０００ｍｍ、ファルマシア社製、スエ
ーデン）に充填し、０．０４Ｍトリス−塩酸（ｐ　Ｈ７
，８）の緩衝液を用い、本発明物質試料２００μｇ　（
蛋白量）を添加し、ゲルか過を行ない（第１図）、試料
の溶出位置より標準分子量キット〔ベーリンガー・マン
ハイム社製、西ドイツ〕から求めた標準曲線（第２図）
を用いて分子量を算出した。肖上記蛋白量は、ブラッド
フォード（Ｂ　ｒａｄｆｏｒｄ　）の方法（Ａ　ｎａｌ
、　Ｂ　１ｏｃｈｃｖ、。

７２巻、２４８頁、１９７６年〕に準じてクーマジーブ
リリアントプルー　Ｇ−２５０による色素結合法により
求めたものであり、以下同様である。

また第１図及び第２図において（１）〜（５）は夫々標
準分子量キットにおける以下のマーカーを示し、また各
図中（Ａ）が本発明物質試料を示す。

（１）−・・アルドラーゼ（分子量１５８０００）（２
）−・・牛血清アルブミン（分子量６８０００　）（３
）・・・オボアルプミン（分子量４５０００）（４）・
・・キモトリプシノーゲンＡ （分子量２５０００　） （５）・・・リボヌクレアーゼ（分子量１３７０Ｇ）そ
の結果、本発明物質（Ａ）は、牛血清アルブミンの後に
溶出し、その分子量は約５３０００であると認められる
。

Ｂ、　　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたゲルろ過法
による分子量 ファルマシアＦＰＬＧシステム（ファルマシア社製、ス
エーデン）にＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（東洋曹達社製
）カラムを接続し、０．２ＭＮａ　ＣＱ１０．１Ｍリン
酸ナトリウム（ＥＩＨ７，０）の緩衝液を用いて、本発
明物質試料１００μ９　（蛋白量）を付加してゲル濾過
を行ない、高速液体クロマト用標準分子量キット〔オリ
エンタル酵母社製〕を用い、これらの溶出パターンより
、本発明物質試料の分子量を算出した（第３図）。該第
３図において（６）〜く１０）は、夫々上記標準分子量
キットにおける以下のマーカーを示し、該図中（Ａ＞が
本発明物質試料を示す。

（６）　−・・グルタミン酸脱水素酵素（分子量２９０
０００　） （７）−・・乳酸脱水素酵素（分子量１４２００Ｇ）（
８）−・・エノラーゼ（分子量６７０００）（９）・・
・アデニル酸キナーゼ（分子量３２００Ｇ　）（１０）
−・・チトクロームＣ（分子量１２３００）その結果、
本発明物質の溶出時間は、約１５分であり、アデニル酸
キナーゼの前に溶出し、その分子量は約５３０００と算
出される。

（２）　等電点 等電点測定装置（バイオ・ラド社製、アメリカ）とアン
ホライン（Ａ■ｐｈｏｌｉｎｅ）ポリアクリルアミドプ
レート（Ｅ）Ｈ３，５〜９．５）（ＬＫＢ社製、アメリ
カ）を使用し、標準等一点測定マーカーキット（ファル
マシア社製、スエーデン）を使用し、本発明物質の等電
点を測定した。すなわち、濾紙片に本発明物質試料的５
μｇ　（蛋白量）を吸収させ、ゲル上にのせ、１０Ｗ定
電力にて、約２時間泳動させ、電流が一定となった時点
で泳動を終了した。ゲルは１１１ｉＩＮ隔で切り取り、
緩衝液にて溶出し、Ｌ−細胞に対する活性の測定に供し
た。等電点は等電点マーカーを基準に算出した。その結
果、本発明物質の等電点は１）８６．７±０．５と算出
された。

（３）　溶解性、色及び性状 本発明物質試料を３ｓａ蛋白量／Ｉ　Ｑ濃度に０．０２
Ｍ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）に溶解した溶
液は、無色透明である。

該溶液にアセトン又はエタノールを７０Ｖ／Ｖ％以上加
えると沈澱を生ずる。

また本発明物質の３−ｇ蛋白量／ＩＩ　Ｑ水溶液は、弱
酸性を示す。

（４）　呈色反応 ビユウレツト反応、フォリンローリ−反応法、ならびに
塩酸加水分解後のニンヒドリン反応についてペプチド結
合ならびにアミノ酸の呈色反応は、いずれも陽性である
。

また、本発明の蛋白質は、以下の生理活性を有する点に
おいて特徴付けられる。

（ａ）Ｌ−細胞に対する細胞毒性作用 前記カースウェル（ＣａｒＳＷｅｌｌ　）らの方法及び
クロスターガード（Ｋｌｏｓｔｅｒ　　ｇａａｒｄ　）
の方法ＣＭｏｆ、、Ｉｎ＋、、１７巻、６１３頁、１９
８０年〕に準じて、本発明物質のし一細胞殺細胞効果を
評価した。すなわち、Ｌ−細胞を２５０単位／Ｉ　Ｑの
ペニシリンと１２５μＱ／ＴＡＱのストレプトマイシン
とを含むイーグルス　ミニマル　エッセンシャルメデイ
ウム（ＭＥＭ）培地に２Ｘ１０５ｉ１１１胞／Ｉ　Ｑと
なる濃度で懸濁させ、このＬ−細胞懸濁液台８，１１１
１及び適当濃度に希釈した本発明物質試料名０．１１１
２を、９６穴マイクロプレート（コースタ−社製、アメ
リカ）の各ウェルに入れ、これを５％炭酸ガス含有空気
中、３７℃で４８時間培養する。培養細胞をニュートラ
ル　レッド（ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ　）で染色し、生
細胞数をタイターチックマルチスキャン（フローラボラ
トリーズ社製、アメリカ）により比色定量する。活性は
Ｌ−細胞を５０％段す力を１単位とし、これに試料の希
釈倍数を乗する。

その結果、本発明物質のＬ−ｍｉｌｌに対する細胞毒性
は、約１０６単位／■ｇ蛋白質以上を示し、後記実施例
において、比活性として明示する。

（ｂ）メスＡ−ザル：ｌ−’？　（Ｍｅｔｈ　Ａ　−５
ａｒＣＯ１ａ　）担ガンマウスによる抗１ｍ作用 ２Ｘ１０５個メスＡ−ザルコーマ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ
マウス腹部皮内に移植し、７８後腫瘍の大きさが直径７
〜８１■となったマウスの尾静脈より、上記し一細胞に
対する細胞毒性作用測定法（ａ）で５×１０３〜５×１
０５単位／ｌｌＱに希釈した本発明物質試料の０．２１
を注射し、４８時間後、前記カースウェルらの方法に準
じて、以下の判定基準により抗腫瘍作用を判定した。

（−）：変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 （丑）：中程度の出血性壊死（移植箔表面の真ん中から
５０％以上にわたって壊死） （＋ｌ＋）　：顕著な出血性壊死（移植筋の中央部が重
度に壊死し、周囲の癌組織がわずか に残った状態） 得られた結果を下記第１表に示す。

第　　１　　表 投　　与　　量　　　　　　　　　　　評　　　　　価
（ｇ蛋　Ｉ／マウス）−、＋＋＋１１ −（生理食塩水＞　　　　８０００ ０．１２５　　　　　３　　３　　２　　０２．５０　
　　　　　０　　５　　３　　０５．００　　　　　　
０　　３　　４　　１１０．００　　　　　　０　　１
　　３　　４次に本発明の新規蛋白質を得る方法につい
て記述する。

本発明の物質は、基本的には公知の方法に従い、ヒト由
来の培養株化リンパ系細胞に、抗腫瘍物質誘導剤を作用
させることによって誘導される。ここで培養株化リンパ
系細胞としては、特に限定がなく、既に確立されている
公知の各種リンパ系細胞株、或いは正常のリンパ系細胞
を各種のウィルス、薬剤、放射線等で処理し培養株化し
た細胞株等を使用できる。その具体例としては、例えば
Ｉｇｖｕｎｏｌ、　　Ｃｏｍｍｕｎ、、　　９　　（８
）　　、ｐ７３１　〜７３４（１９８０）、蛋白質核酸
酵素、２３巻、６号、２９１〜３０５頁、及び生化学デ
ーターブック■、ｐ８２９〜９０５、株式会社東京化学
同人、１９８０年６月２３日発行に記載の■−細胞系、
Ｂ−細胞系、ミニロイド細胞系、ｎｏｎ　−Ｔ細胞系及
びｎｏｎ　−Ｂ細胞系等の各細胞株を例示することがで
きる。

また上記培養株化リンパ系細胞に作用させる抗腫瘍物質
誘導剤としては、公知の各種ウィルス、ダラム陰性菌由
来のエンドトキシン、植物由来のレクチン、免疫賦活作
用を有する物質等を使用することができる。その代表例
としては、例えば大腸菌、緑膿菌、チフス菌等に由来す
るりボボリサツカライド（ＬＰＳ）等のダラム陰性菌由
来のエンドトキシン；タチナタマメレクチン（フンカナ
バリンＡ、ＣｏｎＡ）、ダイズマメレクチン（ＳＢＡ）
、アカインゲンマメレクチン（ＰＨＡ）等の植物由来の
レクチン：センダイウィルス（ＨＶＪ）等のウィルス及
びバチルス　カルメツティ　グエリン（ＢＣＧ）、コリ
ネバクテリウムバルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｇ＋　　ｐａｒｖｕｍ）　、プロピオンバクテリウム
　アクネス （ｐｒｏｐ＋ｏｎｔｂａｃｔｅｒｔｕｍ　　ａｏｎｅｓ
　）　、ミコバクテリウム　ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｉ　　ｂｕｔｙｒｉｃｕｒ）コリネバクテ
リウム　グラニュロサム（Ｑ　ｏｒｙｎｅ−ｂａＣｔｅ
ｒｉＵＩ　　０ｒａｎｕｌＯ８ｔ１１）、ストレプトコ
ツ力スビロジネス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐ
ｙｒｏｏｅｎｅｓ　＞、プラスモデイウム（Ｐ　Ｉａｓ
ｓ＋ｏｄｉｕｇｉ　）　、ザイモザン（ＺＶＩＯ８ａｎ
）　、ノカルディア　アストロイデス（Ｎ　ｏｃａｒｄ
ｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）　、リステリア　モノサ
イトジェネス（ＬｖＳｔｅｒｉａ　　ｍｏｎｏｃｙｔｏ
ｏｅｎｅｓ　＞、グルカン（ＱｌｕＯａｎ）　、細胞膜
骨格（ｃｅｌｌｗａｌｌｓｋｅｌｔｏｎ　）　、デキス
トラン硫酸（ｄｅＸｔｒａｒｌｓｕＨａｔｅ　）　、ム
ラミルジペブタイド（１ｕｒａｌｙ１−ｄｉｐｅｐｔｉ
ｄｅ　）　、クレスチン（呉羽工業社製）等の免疫賦活
作用を有する物質及び１２−Ｏ−テトラデカノイルホル
ボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）等の発癌プロモー
ター等を例示することができ、これらは組合せて用いる
こともできる。

上記培養株化リンパ系細胞は、抗腫瘍物質誘導剤の処理
に先立ち、必要に応じて適宜培養、増殖させることがで
きる。該培養条件としては、特に制限はなく常法に従う
ことができる。例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ
培地等の通常の栄養培地を牛胎児血清（Ｆｅ２）等の血
清補液で改質した培地中、インビトロで増殖させる方法
、又はヒト以外の哺乳動物に上記細胞を移植し、その体
内で増殖させる方法等を適宜採用できる。後者の方法で
は、移植する動物は、ヒト細胞に対し免疫反応を起こす
場合があり、好ましくは幼弱用の動物、２００〜６００
レム程度の放射線処理、抗血清処理、免疫抑制剤処理等
により免疫を抑制した動物、ヌードマウス等を使用する
のがよい。

上記の如くして増殖されたヒト由来の培養株化細胞は、
これを前記栄養培地（通常ｐＨ６，５〜８．０）にて、
細胞濃度がｌＸ１０Ａ〜１×１０７個／１１２程度に浮
遊させ、これに前記抗腫瘍物質誘導剤を作用させること
により、所望の本発明物質を誘導産生させることができ
る。抗腫瘍物質誘導剤による処理は、例えばエンドトキ
シン及び免疫賦活作用を有する物質の場合は、１〜１０
０μｇ／ｌ１１２程度の濃度で、レクチンの場合は、１
０〜５００ｕｇ／ｗＤ程度の濃度で、ウィルスの場合は
、５０〜５０００ＨＡ／１１１１０の程度の濃度で加え
、通常３７℃下、１〜６日間インキュベートすればよい
。か（して、その栄養培地中に本発明物質が産生される
（以下斯くして得られる液を粗製溶液と言う）。

上記で得た粗製溶液からの本発明物質の採取及び分離精
製は、得られる粗製溶液中に含有される肖該物−質の性
質を利用した物理化学的又は生化学的手段に従い実施さ
れる。例えば塩析、クロマトグラフィー、電気泳動法、
抽出法、遠心分離法、透析法等を適宜組合せることによ
り行なわれる。

より好ましくは、上記粗製溶液を次の工程に付すことに
より実施される。

（１）限外濾過濃縮及び熱処理 （２）等電点沈澱 （３）セレックス（Ｃｅ１ｌｅｘ　）　ＱＡ　Ｅりｏｖ
トゲラフイー （４）クルトロゲルＡｃＡ３４ゲルか過クロマトグラフ
ィー （５）クロマトフオーカシングクロマトグラフィ（６）
ウルトロゲルＡＣＡ５４ゲルか過クロマトグラフィー （７）レッド・セファロースクロマトグラフィー（８）
ＴＳＫゲルＧ３０ｏｏｓｗクロマトグラフィー 以下に、これら行程の詳報を説明する。

精製工程１ 粗製溶液をペリコンカセット（ミリボア社製、アメリカ
）を用い、５〜１０倍に濃縮し、これを６０℃、３０分
程度の熱処理に付す。これを低温室（−２５℃程度）に
放置し、溶解後、遠心分離（３０００ｒｐｍｘ２０分程
度）ヲ行ナウ。コノ操作により、変性蛋白の大部分が除
去される。活性回収率（前記し１胞に対する細胞毒性活
性測定法による）は、５０〜９０％であり、精製度は１
．５〜５倍である。

精製工程２ 精製工程１で得られた上清液を、ｐＨ５，０〜５．５に
調製しくＩＮ酢酸水溶液）、加熱処理により除去できな
かった不純蛋白を等電点沈澱により除く。ｐＨ１ｌ整後
、低温室（４℃程度）で放置し、冷却遠心弁１１ｔ　（
７０００ｒｐｉ　ｘ２０分程程度し、上清のＥ）Ｈを８
．５程度に調整（２Ｍトリス）する。この操作による活
性回収率は６０〜９０％であり、精製度は２〜８倍であ
る。

精製工程３ 精製工程２で得られた生理活性画分の濃縮液を透析用チ
ューブ（半柱化学薬品社製）を用い、５０〜１００倍量
の０．０２Ｍトリスφ塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，５）に対
して４℃程度で、数回外液を交換しながら透析する。透
析液を冷却遠心分離（４℃程度、７０００ｒｐｉ　ｘ２
０〜３０分程程度を行ない、清澄な上清を得る。次いで
この上清液をセレツクスＱＡＥ　（バイオ・ラドφラボ
ラトリー社製、アメリカ）に吸着させ、０〜ＩＭ。

Ｎａ　ＣＱの０．０２Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，
５）で連続的濃度勾配法に従い、もしくは段階的に濃度
を上昇させて生理活性区分を溶離する。

得られた生理区分を限外濾過濃縮、又は硫安塩析により
濃縮する。この方法による生理活性区分の回収率は５０
〜９０％であり、ｍ製度は約４〜１０倍である。

精製工程４ 精製工程３で得られた生理活性区分の濃縮液をバイオ・
ゲルＡ１．５＋ａ（バイオ・ラド社製、アメリカ）ｔＩ
）るいはウルトＯゲルＡｃＡ３４．４４又は５４を充填
したカラム（カラムサイズ５０×１００１００Ｏに付し
、ゲル濾過を行なう。この工程における活性回収率は７
０〜９０％であり、精製度は４〜１０倍である。

精製工程５ 精製工程４で得られた生理活性画分を濃縮し、透析用チ
ューブに入れ、５０〜１００倍量の０．０２５Ｍイミダ
ゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）に対して４℃程度で
数回外液を交換しながら透析する。透析液をクロマトフ
オーカシング用ゲル（ファルマシア製、スウェーデン）
に付し、吸着させ、ｐＨ勾配を作成し、生理活性画分を
溶離する。この方法による活性回収率は３０〜７０％で
あり、精製度は４〜１０倍である。

精製工程６ 精製工程５で得られた生理活性画分を硫安塩析、もしく
は限外濾過濃縮により濃縮する。次いで、この濃縮液を
バイオゲルＡ１．５ｍあるいはウルトロゲルＡｃＡ３４
．４４又は５４を充填したカラム（カラムサイズ１６Ｘ
１０００ｍｍ＞に付し、ゲルか過を行なう。この工程に
おける活性回収率は７０〜９０％であり、精製度は４〜
１０倍である。精製工程７ 精製工程６で得られた生理活性画分を硫安塩析、もしく
は限外濾過濃縮により濃縮後、透析用チューブに入れ、
０．０２Ｍトリス−塩酸（ＤＨ７，８）緩衝液に対し充
分に透析する。透析した生理活性画分をレッド・セファ
ロース（ファルマシア製・スエーデン）に付する。吸着
した生理活性物質の溶離は０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ＥＩ　Ｈ７，８）及び同緩衝液に１．０Ｍ　　ＫＣ
Ｑを溶解させた緩衝液を用いて、連続的濃度勾配法に従
い、又は段階的に濃度を上げることにより行なう。この
方法による活性回収率は４０〜８０％であり、精製度は
１０〜２５倍上昇する。

精製工程８ 精製工程７で得られた活性区分を限外濾過に′より濃縮
し、バイオ・ゲルＡ１．５１あるいはウルトロゲルＡＯ
Ａ４４又は５４を充填したカラム（１６ｘｌ　０００鵬
膳）に付し、ゲル濾過を行なう。

あるいはトーヨーソーダ高速液体りＯマド用カラムＧ２
０００ＳＷ又はＧ３０００ＳＷ　（東洋曹達社製）を用
いてゲルか過を行なう。この工程における活性回収率は
２５〜７５％であり、精製度は約３〜１０倍である。　
　゛ 精製工程１〜８を通しての活性回収率は、５〜３０％で
あり、精製度は約１．０Ｘ１０５〜ｉ、ｏｘｉｏ”倍で
ある。

この様にして得られた生理活性を有する本発明の蛋白質
の特性を測定した結果は、前記した通りである。

かくして本発明の蛋白質を得る。得られる本発明物質は
前述した通り、Ｌ−細胞に対してインビトロで直接ｌｌ
ｌ１胞毒作用を有し、またインビボで抗腫瘍作用を有す
るに加え、以下の薬理試験例に示す通りヒトガン１１１
１１！乃至メラノーマｌ１ｌｉ！に対しても細胞毒作用
乃至殺細胞作用を示し、しかも低毒性であ゛る。尚、本
発明蛋白質の上記生理活性作用は熱安定性（６０℃、３
０分間）を示す。

薬理試験例工　細胞毒乃至殺細胞作用 （ａ）　　ヒトガン細胞殺細胞作用 ヒトバーキットリンパ腫由来株ＲａＪｉ　　（Ｊ。

Ｎａｔ、　Ｑａｎｃｅｒ　Ｉ　ｎｓｔ　、、３７巻、５
４７頁、１９６６年〕、ヒト胃癌（印環細胞癌）由来株
Ｋａｔｏ　−１［（Ｊ　Ｄｎ、　Ｊ　、　ＥＸＥ）、　
Ｍｅｄ、、４８巻、６１頁、１９７８年〕及びヒト鼻咽
腔癌由来株Ｋ　Ｂ　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　１８
巻、１０１７頁、１９５８年〕の各細胞に対する本発明
物質の殺細胞効果を評価した。すなわち、ヒトバーキッ
トリンパ腫由来細胞株及びヒト胃癌由来細胞株を、２５
０単位／置Ｑのペニシリン、１２５μｇ／ＩＧのストレ
プトマイシン及び１０％非働化牛脂児血清を含むＲＰＭ
１１６４０培地で２Ｘ１０５ｔｓＷ＆／ｍ　ａ　ｃｍ整
した。また、ヒト鼻咽腔癌由来細胞株を、２５０単位、
＞１’（＋のペニシリン、１２５μｇ／■Ｑのストレプ
トマイシン及び１０％非働化牛血清を含むイーグルス　
ミニマル　エツセンシャル　メディウム培地を用いて２
×１０５細胞／Ｉ　Ｑに調整した。

上記各細胞調整液０．１１Ｑと各種濃度に希釈した本発
明物質０．１１Ｑとを９６穴マイクロプレートの各ウェ
ルに入れ、これを５％炭酸ガス含有空気中、３７℃で４
８時間培養した。

培養４８時間後に細胞をトリバンプルーで染色し、顕微
鏡下でビルケルチュルク計算盤（エルマオプテイ力ルワ
ークス社製、日本）を使用して生細胞数を算出した。こ
の結果、本発明物質の各種細胞の増殖を５０％抑制する
濃度は、ヒトバーキットリンパ腫由来細胞に対しては約
１５ｎｏ蛋σ１／、１１．ヒト胃癌由来細胞に対しては
約４０ｎｇ蛋白量／■Ｑ１ヒト鼻咽腔癌由来細胞に対し
ては約３０ｎｇ蛋白量／■Ｑであった。

（ｂ）　　メラノーマ細胞に対する細胞毒性作用へルソ
ン（Ｈｅｌｓｏｎ）らの方法（Ｎ　ａｔｕｒｅ、　　。

２５８巻、７３１頁、１９７５年）に準じて、本発明物
質のメラノー’？Ａ−３７５（Ｊ、Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ　ｎｓｔ　、、５１巻、１４１７頁、
１９７３年〕細胞に対する細胞毒性作用を評価した。即
ち、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレ
プトマイシン及び１０％非働化牛脂児血清を含むイーグ
ルス培地を用いてメラノーマＡ−３７５細胞５Ｘ１０Ａ
細胞／ＩＩ　Ｇの懸濁液を調整した。

この細胞懸濁被合１１Ｑ及び本発明物質を適当に希釈調
整した試料溶液１■Ｑを３．５ｃｓ＋径のシャーレに入
れ、５％炭酸ガス含有空気中下３７℃で培養した。

培養３８目に上記（ａ　）と同様にして＠胞をトリバン
ブルーで染色し、顕微鏡下でビルケルチュルク計算盤を
使用して生細胞数を算出した。この結果、本発明物質の
メツラーマＡ−３７５細胞の増殖を５０％抑制するのに
必要な量は約４５ｎＱ蛋白量／鳳Ｑであった。

薬理試験例■　急性毒性 ８通合のｄｄＹ系雌雄マウスを各々１０匹用い、本発明
物質を１９−９蛋白量／ｋｏの割合で静脈内投与し、急
性毒性を調べた。

その結果死亡例は認められず、ＬＤｓ　ｏは１９、　Ｏ
鳳ａ／ｋｏ以上であることが確認された。また、観察期
間中、本発明物質に起因すると考えられる明らかな中毒
症状は認められなかった。

以上の通り本発明物質は各種細胞に対し細胞毒作用乃至
殺細胞作用を奏し、また低毒性であるところから抗腫瘍
剤として有用である。

本発明物質はこれを抗腫瘍剤として利用するに当っては
、その有効量を含−有する各種形態に調整され、該形態
に応じた各種投与経路により投与される。その製剤形態
としては通常液状溶液、懸濁液、乳濁液等を例示でき、
これらは一般に静脈、皮下又は筋゛内向に投与される。

これらはまた使用前に適当な担体の添加によって液状に
なし得る乾燥品として提供することもできる。該抗腫瘍
剤の投与量は、疾患の程度、患者の年齢、性別等によっ
て異なるが、通常、蛋白量として約９．５〜９５μＱ／
ｋＱ１日を１〜数回に分けて投与するのが好ましい。

以下に参考例及び実施例を示し、本発明をより具体的に
述べるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１ 以下の細胞及び抗腫瘍物質誘導剤を各々使用した。

（１）抗腫瘍物質誘導剤 センダイウィルス（ＨＶ　Ｊ　：　Ｓ　ｅｎｄａｉ　　
ｖｉｒｕｓ。

Ｈｅｍａｏｏｌｕｔｉｎａｔｉｎｏ　　ｖｉｒｕｓ　　
ｏｆ　　Ｊ　ａｐａｎ）は、カンチル（Ｋ、　Ｃａｎｔ
ｅｌｌ）より供与されたもので、１０〜１２日目の受精
鶏卵に接種し、３日後に漿尿液を採取した。漿尿液を連
続超遠心 （３５０００ｒｐｍ　）してＨＶＪを精製し、その沈渣
をＰＢＳ　（−）で浮遊させた。精＠ＨＶＪは、使用時
まで適当に分注し、−８０℃にて凍結保存した。

他に抗腫瘍物質誘導剤としてＰＨＡ　（ディフコ社、ア
メリカ）　、ＣｏｎＡ　（和光純薬社）、ＬＰＳ（大農
園０５５　：　８５、ディフコ社）、コリネバクテリウ
ム・バルバム（ウェルカム社、イギリス）及びＴＰＡを
使用した。

（２）　細胞 本発明物質の産生に利用した細胞は、ヒト由来の培養株
化リンパ系細胞（ＣＣＲＦ−ＯＥＭ。

ＤＮＤ−４１、ＴＡＬＬ−１、ＲＰＭＩ−８４０２、Ｃ
ＣＲＦ−）（ＳＢ−２１１１胞、いずれもＩｍｍｕｎｏ
ｌ、　　Ｃｏｗｎｕｎ、、　　９　　（８）　　、Ｅ）
７３　１　〜７３４（１９８０）記載のものである）を
、１０％ＦＣ８２１ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、
３７℃にて５％炭酸ガスインキュベーター内で静置培養
して肩整した。

また上記各ヒトリンパ系細胞の各々ｌＸ１０７個を、自
家繁殖させた生後２４時間以内の新生ハムスター（ゴー
ルデン・ハムスター）に皮下移植し、週に２回の割で家
兎抗ハムスター胸腺リンパ球血清（ＡＬＳ）を０．１１
ｆｌ投与して、４〜５３１間後に生着腫瘍塊を副出し、
これをイーグルＭＥＭ培地で洗浄後、細断器で細断し、
細胞濾過器を通して調製したものも使用した。実施例１
上記参考例１−（２）で調製した各ヒト由来培養株化リ
ンパ系細胞を、イーグルＭＥＭ培地にて遠心洗浄後、１
０％ＦＣ８ｔ１ｒｉＲＰＭＩ−１６４０培地で２．５Ｘ
１０”個／Ｉ１２に調製した。

上記細胞浮遊液に、前記参考例１−（１）に示した各抗
腫瘍物質誘導剤の所定量（ＰＨＡは５０ｕＱ／１１１、
ＣＯｎＡは１０μｇ／Ｉ１２、ＨＶＪは５００ＨＡ／Ｉ
ｆｆ、ＬＰＳハｌＯμｍ１１／＋１１１２、＋ＰＡは１
０ｎｏ／１１２）を添加し、３７℃で１〜６日間撹拌培
養し、得られる培養上清を遠心分離（１００００ｒｐｉ
＋）により採取し、−２０’Ｃにて凍結保存した（粗製
溶液）。

斯くして得た粗製溶液のＬ−細胞に対する細胞毒性作用
（力価、単位／１１２）を、下記第２表に示す。尚、上
記力価の測定は、培養上清を無菌濾過後行なった。また
ＨＶＪを含む培養上清は、ＨＶＪを不活性化するために
Ｕ■処理（１５ｗＵｖランプ、２０ｃ■下、３０分処理
）後、力価測定を行なった。

第２表 ＴＡＬＬ−１６０１５６３１５− ＲＰＭＩ− ＣＣＲＦ− Ｈ８Ｂ−２６０１０６０２０− ＣＣＲＦ− ＣＥＭ　　６０　１０１３０　２０　３０（２）　上記
（１）と同様にして、５Ｘ１０”個／ｍｌＲＰＭＩ−１
６４０培地単独、のＣＣＲＦ−ＣＥＭＩＣｌ　００〜４
０００ＨＡ／＋９（７）ＨＶＪをｉ加し、２４時間培養
して、同様に粗製溶液を得た。

その力価（単位／−）を下記第３表に示す。

第　　３　　表 粗製溶液　ＨＶＪ添加量　　粗製溶液力価Ｎｏ、　　　
（ＨＡ／曽）（／− （３）　　１０％ＦＣ］ｌＯＲＰＭＩ−１６４０培地を
用いて５Ｘ１０６個／戒に調製したＣＣＲＦ−ＯＥＭに
５０〜２００μｇ／−のＰＨＡを添加し、７２時間培養
し、前記（１）と同様に粗製溶液（Ｎ　ｏ、　７〜９）
を得た。

また、上記においてＰＨＡ５０μｇ／ａＱの添加４８時
間培養後、更にＰＨＡの５０μｇ／或（粗製溶液Ｎｏ、
１０）　、Ｃ，Ｄａｒｖｕｍ（７）５０μ０　／ｗｌＪ
（粗１１ｉ３１１ＴＮｏ、１１　）　、又はＨＶＪの５
００ＨＡ／＋１１９（粗製溶液Ｎｏ、１２）を添加して
更に４日間培養して粗製溶液を得た。それらの力価（単
位／−）を下記第４表に示す。− 第４表 粗製溶　　　抗ＩＩ物質誘導剤　　　　力　価液Ｎ００
（μ　又はＨＡ／ＩＩＩＱ）　　　（単　／−）７　　
ＰＨＡ（５０）　　　　　　　　　６９８　　ＰＨＡ（
１００）　　　　　　　　６５９　　ＰＨＡ　（２００
）　　　　　　　　８０１０　　ＰＨＡ　　＋ＰＨＡ １１　　ＰＨＡ　　＋Ｃ，ｐａｒｖｕｍ１２　　ＰＨＡ
　　十ＨＶＪ （４）　本発明物質の単離 上記（２）において、ＣＣＲＦ＝ＣＥＭにＨＶＪ　（５
００ＨＡ／戒）を作用させて得た粗製３１１（７０単位
／Ｉｇ）をペリコンカセット（ミリボア社製、アメリカ
）で１０倍に濃縮する。これを６０℃、３０分の熱処理
を行ないウィルスを失活させた。熱処理後、粗製濃縮溶
液を一夜、−２５℃で放置し、翌日溶解後、発生した不
溶物を３０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離を行なって
除去した。

この操作による活性回収率は８５％であり、精製度は３
倍であった。

次いで該溶液に１Ｎ酢酸を加え、ｐＨ５，５に調整した
。これを７０００　ｒｐｍで２０分間冷却遠心分離（４
℃）し、不溶物質を除去し、その上清を２Ｍトリスにて
直ちにＩ）８８．５に調整した。

この操作による活性回収率は８０％であり、精製度は３
倍であった。全工程を通じての活性回収率は　６８％、
精製度は９倍であった。

次いで、この溶液を０．０２Ｍトリス−塩酸（ｐ　Ｈ８
，５）緩衝液に対して、透析を行なった。

この透析活性区分をあらかじめ０．０２Ｍトリス−塩酸
（＋）８８．５）緩衝液で平衡化したＣｅ１ｌｅｘ　Ｑ
ＡＥ　（バイオφラド　ラボラトリ−社製、アメリカ）
に付した。流速１２０ｍｇ／時、５１１Ｇ／分画の条件
下に同緩衝液で充分洗浄した後、０．０２Ｍトリス−塩
！！　（Ｅ）Ｈ８，５）５００１９及び、１．０Ｍ　　
Ｎａ　ＣＱを含む０．０２Ｍトリス−塩酸（ｐ　Ｈ８，
５）を使用し、連続的に濃縮勾配を上昇させ、吸着物質
を溶離した。この方法では非吸着区分に活性は認められ
ず、すべての活性は吸着された。吸着した活性はＮａ　
Ｃ１１の０．０５Ｍ〜０．３Ｍの間に溶出された。活性
区分を集め、限外濾過濃縮装置ＴＣＰ−１０（アミコン
社製・アメリカ）を用い、４℃で限外枦３Ｍ濃縮した。

この方法による活性回収率は８０％であり、精製度は４
倍であった。全工程を通じての活性回収率は５４．４％
、精製度は３６倍であった。

上記方法で得られた活性区分を０．０２Ｍトリス−塩酸
ｍｔｒ液で平衡化したウルトロゲルＡＣＡ３４（カラム
サイズ５０ｘ１０００ａ＋ｍ）を用い、ゲルか過を行な
った。活性区分は１０７０−〜１３００−の間に流出し
た。活性区分を集め、限外か過濃縮１ｉｉ［を用い、４
℃で濃縮を行なった。

この方法による活性回収率は７８％であり、精製度は５
倍であった。全工程を通じての活性回収率は４２．２％
、精製度は１８０倍であった。

活性濃縮液を０．０２５Ｍイミダゾール−塩酸（ｐ　Ｈ
７，４）で緩衝化したクロマトフオーカシング用ゲル（
ファルマシア社製、スウェーデン）に吸着させた。溶出
はポリバッファー−７４（ファルマシア社製、スウェー
デン）−塩酸（１）Ｈ４、Ｏ）でｐＨ勾配を作成し溶出
した。活性はＥ）Ｈ６，Ｏ〜７．２の藺に溶出された。

この方法による活性回収率は６５％であり、精製度は６
．５倍であった。全工程を通じての活性回収率は２７．
６％、精製度は１１７０倍であった。　上記活性区分を
集め、限外濾過濃縮装置により、濃縮し、０．０２Ｍト
リス−塩酸（１）８７．８）で平衡化したウルトロゲル
ＡｃＡ３４（カラムサイズ２５Ｘ１０００１１＋ｍ）を
用いて、ゲルか過を行なった。活性は１９０〜２３０Ｉ
Ｑの間に認められた。活性区分を集め限外濾過濃縮を行
なった。

この方法により活性回収Ｑは７０％であり、精製度は６
．７倍であった。全工程を通じての活性回収率は１９．
３％、精Ｉ４度は７．８４Ｘ１０”倍であった。

次に、上記濃縮液をあらかじめ０．０２Ｍトリス−塩酸
（ｐ　Ｈ７，８）緩衝液で平衡化したレッドセファロー
ス（ファルマシア社製、スウェーデン）に付加した。流
速１０−７時、３−／分画の条件下に同緩衝液で充分洗
浄した後、０．０２Ｍトリス−塩酸（ｐ　Ｈ７，８）及
び１．ＯＭＫＣ＆’を含む０．０２Ｍトリス−塩！（ｇ
）８７．８）を用い、連続的に濃度勾配を上昇させ、吸
着物質を溶離した。

活性物質はＫＣＱ濃度０．１〜０．７Ｍの間に溶出され
た。

この方法による活性回収率は６０％であり、精製度は２
０倍であった。全工程を通じての活性回収率は１１．５
８％、精製度は１．５７Ｘ１０５倍であった。

次いで、この活性区分を限外か過濃縮し、あらかじめ０
．０２Ｍトリス−塩酸（ｐ　Ｈ７，８）緩衝液で平衡化
したＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ　（東洋曹達社製）カラ
ムに付加し、＾速液体クロマトグラフィーによるゲルか
過を行なった。

この方法による活性回収率は４５％であり、精製度は４
倍であった。全工程を通しての活性回収率は５．２１％
、精製度は６．２８Ｘ１０’倍であった。　斯くして、
本発明の蛋白質を得た。該蛋白質は前述した生理活性及
び物理化学的性状を示す。尚、本生ｍｌ活性を有する蛋
白質の比活性は３．１４Ｘ１０＠単位／１０蛋白質であ
った。

（５）　前記（１）において、ＤＮＤ−４１にＰＨＡを
作用させて得た粗製溶液（２４単位／１１２）を用いて
、上記（４）と同様にして、本発明蛋白質を得た。全工
程を通じての活性回収率は、６．２１％であり、精製度
は３．５２Ｘ１０’倍であり、比活性は１．５４Ｘ１０
”単位／ＩＩＪ蛋白質であった。

（６）　前記（１）において、ＴＡＬＬ−１にＨＶＪを
作用させて得た粗製溶液（６３単位／１９）を用いて、
上記（４）と同様にして、本発明蛋白質を得た。全工程
を通じての活性回収率は、１０．０１％であり、精製度
Ｇ＊４．５２Ｘ１０’倍であり、比活性は１．２５Ｘ１
０”単位／Ｉｇ蛋白質であった。

（７）　前記（１）において、ＲＰＭＩ−８４０２にＣ
ＯｎＡを作用させて得た粗製溶液（１２単位／ＷｔＩ）
を用いて、上記（４）と同様にして、本発明蛋白質を得
た。全工程を通じての活性回収率は、５．３％であり、
精製度は６．８５×１０ｅ倍であり、比活性は２．９０
Ｘ１０８単位／１０蛋白質であった。

（８）　前記（３）において、ＣＣＲＦ−ＯＥＭに２０
０１Ｍ１１９のＰＨＡを作用させて得た粗製溶液（８０
単位／−）を用いて、上記（４）と同様にして、本発明
蛋白質を得た。全工程を通じての活性回収率は、２．４
％であり、ｌＩ製度は１．３５Ｘ１０フ倍であり、比活
性は３．１０Ｘ１０θ単位／１ｇ蛋白質であった。

（９）　上記（４）と同様にして、前記（１）〜（３）
において得た各粗製溶液を用いて、略々同様の活性回収
率、精製度、比活性にて、同一の物性を有する本発明蛋
白質を得た。

以下、本発明物質を用いた製剤例を挙げる。

製剤例１ 本発明蛋白質１ｘ１ｏｅ単位の生理食塩水溶液１００ｍ
を無菌か過後２−ずつ分注し、凍結乾燥して、注射用抗
腫瘍剤を得る。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図は夫々ゲルろ過法による本発明物質試
料の溶出位置を示すグラフである。 （以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト由来の培養株化リンパ系細胞に、抗腫瘍物質
   誘導剤を作用させることによつて誘導産生される下記の
   特性を有する蛋白質。 ａ）ゲルろ過法による分子量： ５５０００±３０００ ｂ）等電点：ｐＨ６．７±０．５ ｃ）３ｍｇ蛋白量／ｍｌの０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝
   液（ｐＨ７．８）溶液において無色透明であり、アセト
   ン又はエタノールを該溶液に７０Ｖ／Ｖ％以上加えると
   沈澱を生ずる ｄ）水溶液は弱酸性を示す ｅ）ビユウレツト反応、フオリンローリー反応法ならび
   に塩酸加水分解後のニンヒドリン反応についてペプチド
   結合ならびにアミノ酸の呈色反応を示す ｆ）培養細胞マウスＬ−細胞に対してインビトロで直接
   細胞毒作用を有する及び ｇ）メスＡザルコーマ担ガンマウスに対してインビボで
   抗腫瘍作用を有する。