JPH0147480B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、インシユリン分泌増強活性因子の構
成成分である新規な蛋白性要素物質に係るもので
ある。更に詳しくは、ボルデテラ属に属する微生
物の菌体及び培養上清中にインシユリン分泌を促
進し且つ、血糖値を正常に維持調整する薬理効果
を有する成分、すなわちボルデテラ属産生インシ
ユリン分泌増強活性物質（以下、Ｎ―IAPと略称
す。）の副作用を軽減した新規な蛋白性要素物質
に係るものである。 糖尿病薬であるＮ―IAPは、その特徴的なイン
シユリン分泌の促進及び血糖値を正常に維持調整
する薬理作用と併せて、高分子蛋白質であるが故
に、Ｎ―IAPを投与した時に発現する抗体産生に
より、Ｎ―IAPを再び投与すると、アナフイラキ
シを誘発する欠点を有している。すなわち、糖尿
病の治療及び予防に有効であるインシユリン分泌
増強活性以外の副作用の除去、特にアナフイラキ
シを抑制されたより安全な医薬品の提供が望まれ
ている。 本発明者等は鋭意研究の結果、Ｎ―IAPを、高
濃度の尿素水溶液を用いて解離をおこなうことに
より新規な蛋白性要素物質を単離・同定すること
に成功した。この単離・同定された新規な蛋白性
要素物質はそれぞれ単独では、インシユリン分泌
増強作用は不活性であるが、この蛋白性要素物質
をそれぞれ別途に投与すると、驚くべきことに
IAPを投与したときと同等のインシユリン分泌促
進作用及び血糖値を正常に維持調整する作用を有
し、更に、Ｎ―IAPの投与したときに発現する抗
体産生により、Ｎ―IAPを再投与するとアナフイ
ラキシを誘発する欠点が著しく軽減することが判
明した。すなわち、単独では、糖尿病の治療及び
予防に有効であるインシユリン分泌増強作用は不
活性であるが、それぞれを別途に投与することに
よりインシユリン分泌増強活性を有し、しかも副
作用を大幅に減弱した新規な蛋白性要素物質の分
離・同定を達成したものである。 以下本発明の構成について説明する。 インシユリン分泌増強活性物質 本発明に於ける出発物質であるインシユリン分
泌増強活性物質（以下、“Ｎ―IAP”と略称する）
は、病源性菌として公知のボルデテラ属に属する
微生物（百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症
菌）、特に好ましくは百日咳Ｉ相菌（Bordetella
pertussis phase Ｉ）を固形培地や液体培地にて
培養し、その菌体もしくは培地から採取、精製し
て得られる蛋白性物質である。 菌体ならびに培養物からのＮ―IAPの有利な採
取および精製は、溶解度法、クロマトグラフイー
法、分子篩法、電気泳動法および生物学的方法の
一つ又は、これ等の方法の組合せなど、当該分野
で汎用の多くの分別精製方法により達成され得、
従つて本発明は特定の採取精製法に何等限定され
るものではない。 Ｎ―IAPの極めて有利な採取精製法の１例とし
て、カラムクロマトグラフイー的手段を提示し得
る。この場合、微生物の培養上清液は、ハイドロ
キシアパタイト（生化学工業(株)製）、カルボキシ
メチルセフアロースCL―6B（フアルマシア・フ
アイン・ケミカルズ社製）、の充填材より成るカ
ラムを通し次いで、セフアクリルＳ―200（フアル
マシア・フアインケミカルズ社製）を用いるゲル
ろ過法により精製されるＮ―IAPはこれらのカラ
ムに極めて選択的に吸着され、次いで0.5M
NaCl含有の0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）等の適切
に選定された溶出液により溶離されて精製物を与
える。この精製物に透析操作を適宜施こすことに
より、不要な塩類が除去されて高活性のＮ―IAP
が得られる。又、Ｎ―IAPは菌体内にも存在する
ので、所望の場合には、例えば菌体浮遊液に
NaClを添加して菌体にＮ―IAPを溶解中に浸出
せしめる手段などを採用してもよい。 Ｎ―IAPを産生するボルデテラ属の微生物は、
前記の通り百日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗
血症菌として周知であるが、他方、これらの病源
菌を、培地組成の変更、紫外線、Ｘ線等の各種放
射線照射又は変異誘起剤の適用等の慣用の各種手
段で変異せしめて得られる変異株も又、Ｎ―IAP
産生菌として有用である。 培養方法としては、液体振盪培養方法が活性及
び収率の点で好ましいが、他の方法によることも
妨げない。 なお、ボルデテラ属に属する微生物の菌学的性
質、培養条件等はBergy′s Manual of
Deteminative Bacteriology 第８版1974年Baltimore：The Williams ＆
Willkna CO.，Ｊ・Exp・Med.129：523〜550
（1969）、細菌学実習提要：第３版第６頁以下、昭
和47年（丸善(株)発行）、等に記載されている。 次に、Ｎ―IAPの各種物性に付き詳述する。 存在状態及び溶解特性： 脱塩後、凍結乾燥して得られる粉末は、非潮解
性白色または淡褐色粉末であり、約３〜５mg／ml
までは室温で水に溶解、6NHCl中では不溶性白
沈を生じ、ピリジン、ドデシル硫酸ナトリウム、
メルカプトエタノール、システイン溶液に溶解す
る。冷時（４℃）、精製活性物質の溶液に硫安、
ドライアイス・アセトンあるいはエタノール、ト
リクロル酢酸、塩化亜鉛溶液及びその他の数種の
金属イオンを含む溶液等の添加により、各々白
濁、沈澱を生ずる。水とクロロホルムあるいはｎ
―ブタノール混合液では不溶性となり両液の界面
に集まる。 Ｎ―IAPの水溶液を80℃以上に加温すると白濁
する。0.5MNACl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に対し本Ｎ―IAPを溶解し、次いで蒸留水を外液
として透析すると、一時白濁するが透析の続行に
より完全に再溶解し、白濁は消失する。また、高
濃度溶液では0.01M酢酸緩衝液（PH4.5）に対し、
徹底的に透析すると淡褐色に着色して溶解するこ
ともある。 分子量： 10〜30％の密度勾配のアクリルアミドゲル37：
１の架橋比で、濃縮ゲルのPHが6.8、泳動ゲルの
PHが8.8、泳動電圧：90Vで16時間泳動する平板
法SDS―ポリアクリルアミド―デイスク電気泳動
法（ラムリー法）で処理した後、20％TCAで１
時間処理し、次いでクマージーブルーで染色す
る。尚蛋白質のSDS化を１％SDSで100℃５分間
処理する。SDS―ゲル電気泳動法によるＮ―IAP
の分子量は105700±5000である。 組 成： Lowry法による蛋白質98重量％以上ある。尚、
各成分の測定方法は下記各文献に依つた。 蛋白質 Lowry，O.H.，N.J.Rosebrough，A.L.Farr，
and R.J.Randall. J.Biol.Chem.193：265 1951蛋白質成分のアミ
ノ酸組成及び組成比（μM／100μM；6NHClで
110℃、24時間加水分解、日立―835高速アミノ酸
分析器にて分析）： アスパラギン酸（Asp）7.5〜7.9、スレオニン
（Thr）6.8〜7.8、セリン（Ser）5.9〜7.6、グルタ
ミン酸（Glu）8.8〜9.4、プロリン（Pro）5.5〜
6.4、グリシン（Gly）8.7〜9.6、アラニン（Ala）
9.1〜10.8、シスチン／２（Cys／２）1.0〜2.0、バ
リン（Val）6.6〜7.6、メチオニン（Met）2.5〜
3.3、イソロイシン（Ile）3.6〜4.1、ロイシン
（Leu）7.5〜8.7、チロシン（Tyr）5.1〜6.6、フ
エニルアラニン（Phe）3.7〜4.5、リジン（Lys）
3.1〜4.4、ヒスチジン（His）0.9〜1.4、アルギニ
ン（Arg）6.1〜6.6であつた。 等電点PH（ポリアクリルアミドゲル等電点電気
泳動法により泳動し、種々の標準蛋白との泳動パ
ターンと比例測定）：9.3±0.2 デイスク電気泳動パターン： アクリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度
7.5％、1NKOH―氷酢酸緩衝液（PH4.3））、試料
30μｇ、通電4mA、２時間／ゲル１本、アミドブ
ラツク10Bによる染色、７％酢酸溶液による脱色
の条件下でのデイスク電気泳動において、距離
（スペーサ・ゲル先端を基準として）2.3±0.2cm
の位置に極めて先鋭な単一のバンドを与える。 生物学的性質： 哺乳動物に対しインシユリン分泌増強作用及び
耐糖能良化作用を有し、これらの作用は１回の投
与で数週間乃至数ケ月にわたつて持続する。急性
毒性（LD₅₀）はddy系マウス（静注）で約200μ
ｇ／Kg体重である。 要素物質 １ 前記Ｎ―IAPは、5M尿素の蛋白変性剤の共
存下、カラムクロマトグラフ法等により分別さ
れて２種の要素物質に分離されることが確認さ
れた。 要素物質の有利な単離精製法の１例として、
5M尿素存在下に於けるイオン交換法を提示し
得る。 即わち、Ｎ―IAPを３〜5M、好ましくは４
〜5M尿素存在下PH5.4―6.8好ましくはPH5.8―
6.5のリン酸緩衝液で12時間―96時間、好まし
くは24時間―45時間インキユベイトし、前記リ
ン酸緩衝液によつて平衡化したCM―セフアロ
ース カラムクロマトグラフにて分離・精製を
行なう。その結果、Ｎ―IAPか分子量の異なる
二種の要素物質（以下、分子量の大きい順に蛋
白性要素物質CP―Ａ及びPs―１とそれぞれ命
名する）に分離され、これらの要素物質は同一
カラムによる再ゲルろ過により、、デイスク電
気泳動的に単一な物質として得られる。 このようにして得られた要素物質CP―Ａは
単独では、インシユリン分泌増強活性を示さな
い。またCP―Ａは塩基性蛋白質であることが
確認された。 ２ CP―Ａは単独では殆んど目的とするインシ
ユリン分泌増強活性を示さない。すなわちイン
シユリン分泌増強不活性であるが、要素物質
CP―Ａともう一つの要素物質Ps―１とをin
vitroで混合するとＮ―IAPを再構成し、更に
CP―ＡとPs―１とを別々に投与、例えばCP―
Ａを3μｇ／rat当り右股関節よりIVで投与し、
８時間経過後Ps―１を左股関節静脈より投与
すると、Ｎ―IAPと同等のインシユリン分泌増
強活性が発現し、しかも前記Ｎ―IAPを投与し
たときに発現する抗体産生が著しく減少し、Ｎ
―IAPを再投与すると誘発されるアナフイラキ
シの発生が著しく低減されることが判明した。 ３ 各要素物質の物性： (1) CP―Ａ 分子量：SDS―ゲル電気泳動法 75000±5000 塩基性蛋白質 アミノ酸分析： Asp.6.4±0.7，Thr.7.3±0.8，Ser.8.2±0.9，
Glu.9.3±1.0，Pro.6.3±0.7，Gly.11.1±1.0，
Ala.9.0±0.9，Cys.／21.2±0.3，Val.6.2±0.6，
Met.2.7±0.4，Ile.3.4±0.4，Leu.8.4±0.9，
Tyr.5.6±0.6，Phe.3.6±0.5，Lys.4.7±0.5，
His.1.1±0.3，Arg.4.9±0.5 組 成： Lowry法による蛋白質98重量％以上 (2) Ps―１ 分子量：SDS―ゲル電気泳動法 28000±1200 等電点：PH5.8 アミノ酸分析 Asp.9.3±1.0，Thr.7.4±0.8，Ser.10.6±1.0，
Glu，10.6±1.0，Pro.4.4±0.5，Gly.11.2±1.0，
Ala.10.6±1.0，Cys／２ 1.3±0.3，Val.6.7±
0.7，Met.1.6±0.3，Ile.3.2±0.4，Leu.5.5±0.6，
Tyr.4.6±0.5，Phe.3.5±0.4，Lys.2.2±0.3
His.1.7±0.3 Arg.5.9±0.6 組 成： Lowry法による蛋白質98重量％以上 実施例 Ｎ―IAPの製造及び精製 １ 百日咳Ｉ相菌前野株IID 513（Bordetella
pertussis phase ，Maeno Strain IID
513）の凍結乾燥保存菌株（北里大学薬学部微
生物学教室提供）をBrodet―Gengou平板培地
で37℃、２日間培養後、下記第１表に組成を示
すイオン交換樹脂加Cohen―Wheelerの変法培
地（CW培地）200mlを分注した500mlの振盪コ
ルベンに１白金耳接種し、37℃、20〜22時間振
盪培養した。この培養液の菌量を、分光光度計
（波長650nm）で測定し、加えた時の菌量が最
終濃度約0.1×10⁹個／mlとなるように、イオン
交換樹脂加CW培地１を分注した２の振盪
コルベンに加え、37℃、48時間振盪培養（振盪
回数97回／分）を行つた。 尚、上記菌株の菌学的性質は、先にあげた百日
咳Ｉ相菌に関する文献の記載と一致した。 第 １ 表 Cohen―Wheelerの変法培地組成 カザミノ酸 1.0ｇ 酵母エキス １ｇ リン酸二水素カリウム 0.5ｇ 可溶性濃粉 ２ｇ 0.5％硫酸銅液 １ml １％塩化カルシウム液 １ml ４％塩化マグネシウム液 １ml ポリペプトン ５ｇ １％シスチン液 2.5ml 0.5％硫酸鉄液 １ml 塩化ナトリウム 2.5ｇ （蒸留水を加えた総量1000mlとし、20％NaCH
水溶液でPH7.2に調整後、陰イオン交換樹脂（ダ
イヤイオンSA―20AP；三菱化成(株)製）３ｇを加
え、121℃で15分間、高圧蒸気滅菌して使用に供
した。） 得られた48時間振盪培養液を、56℃で30分間加
温した後、４℃で遠心分離（15000rpm）して培
養上清液と菌体とに分離した。得られた培養上清
液をＮ―IAPの精製単離のための出発材料とし
た。 10の培養上清液を1N塩酸でPH6.0に調整後、
第１精製工程としてハイドロキシアパタイトカラ
ム（2.5×４mm）に流速200ml／時間で流した。 大部分の蛋白質は吸着されずそのままカラムを
通過し、目的とするインシユリン分泌増強活性
（後記活性測定法参照）も殆んど検知されなかつ
た。尚、蛋白質濃度の測定は後記第２表註記の
Lowryの方法による。 その後、吸着された物質についてはまず0.01M
リン酸緩衝液（PH6.0）でカラムを洗い、次いで
リン酸緩衝液のモル濃度を0.1にPHを7.0に夫々上
げて吸着された蛋白質を順次溶出する。しかし目
的のＮ―IAPはまだこの条件では溶出されず；更
に同じ条件のリン酸緩衝液に0.5MのNaClを含む
同組成のリン酸緩衝液で溶出した。この条件で溶
出された蛋白質に一致して目的Ｎ―IAPを効率よ
く回収することができた。 得られた粗Ｎ―IAPを濃縮し、ついで透過分子
量限界8000の透析膜（Thomas社製Cat.NO.3787
―F25）に入れた後蒸留水に対して２回（計12時
間）0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）に対して２回
（計12時間）夫々透析した。更に精製を進める為
に、上記透析後のＮ―IAPを含む溶液を0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH6.0）で平衡化されたカルボキシ
メチルセフアロースCL―6Bカラム（1.5×10cm）
に通した。このカラムに吸着されない物質には全
く活性は存在しなかつたが、次いでリン酸緩衝液
のモル濃度を0.1にPHを7.0に上げ、更に食塩0.5M
を加えた溶出液で溶出してＮ―IAPを得た。 この部分は、デイスク電気泳動法的には未だわ
ずかな不純物を含むため、このＮ―IAPを含む溶
液を濃縮し、セフアクリルＳ―200によりゲルろ
過法をおこなう。 以上の精製工程によつて精製されたＮ―IAPの
活性の回収率、精製度等は第２表に示す通りであ
る。

【表】 上記最終工程で得られた物質の純度をポリアク
リルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度7.5％、
1N KOH―氷酢酸緩衝液（PH4.3））デイスク電
気泳動法によつて検定した。 実験方法は、J.V.Maizel，Jrの方法
（Biochem.Biophys.Res.Comm.1963，13 483）
によつた。 尚、ゲル１本当りの試料は30μｇ（蛋白質とし
て）、通電は4mAで２時間、染色はアミド・ブラ
ツク10B、脱色は７％酢酸溶液による。 ２ 百日咳Ｉ相菌東浜株IID 510（Bordetella
pertussis phase I.Tohama Strain IID 510）
の凍結乾燥保存菌株（北里大学薬学部微生物学
教室提供）を用いて、実施例―１と同様の方
法にてＮ―IAPを生成した。 本生成物のデイスク電気泳動（PH4.3ゲル使
用）で単一なバンドを与え、等電点PHは9.3±
0.2を示した。またその組成は、蛋白質約98重
量％以上であり、かつアミノ酸組成および組成
比は、第４表に示す通りであつた。

【表】

【表】 実施例 要素物質の製造及び精製 精製したインシユリン分泌増強活性物質（Ｎ―
IAP）10mgを5M尿素含有の0.05Mリン酸緩衝液
（PH6.4）で24時間透析した後、同じ緩衝液で平衡
化したCM―セフアロースCL―6Bカラム（16φ×
200mm）に装填し、流速：２ml／時及び３ｇ／フ
ラクシヨンの条件にて0.1Mリン酸、0.5M塩化ナ
トリウム及び5M尿素を含む水溶液を用い食塩密
度勾配にて溶出する。この結果を第１図に示し
た。インシユリン分泌増強物質はこの操作により
２種の分子量の異なる要素物質（前記の通り分子
量の大きい順にCP―Ａ及びPs―１と命名）に分
離された。 これ等の構成成分を更に精製度を高めるため
に、まず、CP―Ａ分画を、進めて濃縮後、セフ
アクリルＳ―200カラム（16φ×1100mm）を用い
て、ゲルろ過をおこなつた。この結果、純粋な
CP―Ａを3.8mg得た。要素物質CP―ＡとPs―１
の蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（μM／
100μM）は下記の通りである。 CP―Ａ Asp.6.4，Thr.7.3，Ser.8.2，Glu.9.3，Pro.6.3.
Gly.11.1，Ala.9.0，Cys.／２ 1.2，Val.6.2，
Met.2.7，Ile.3.4，Leu.8.4，Tyr.5.6，Phe.3.6，
Lys.4.7 His.1.1 Arg.4.9 Ps―１ Asp.9.3，Thr.7.4，Ser.10.6，Glu.10.6，
Pro.4.4，Gly.11.2 Ala.10.6 Cys.／２ 1.3，
Val.6.7，Met.1.6，Ile.3.2，Leu.5.5，Tyr.4.6，
Phe.3.5，Lys.2.2，His.1.7 Arg.5.9 ３ 上記各例で単離精製された要素物質CP―Ａ
及びPs―１は、第２図に示す通り、デイスク
電気泳動的に単一物質であることが確認され
た。 又、インシユリン分泌増強活性因子と要素物
質CP―Ａ及びPs―１とをSDS・デイスク電気
泳動法により比較検討した結果を、第３図に示
す。 尚、要素物質CP―Ａ及びPs―１の物性は、
前記“要素物質の物性”の項に詳記した通りで
ある。又、各電気泳動の実験条件は実施例に
準ずる。 実施例 薬理効果 １ インシユリン分泌増強活性測定法 各活性物質の当該活性は種々のインシユリン分
泌刺激物質に対する動物の反応性で測定出来る
が、通常はグルコースを刺激物質として用いる。 Γ 検定用使用動物 ウイスター系雄性ラツト（体重130〜140ｇ） Γ 試験方法 各力価の活性物質を生理食塩液に溶解し、その
0.2mlをエーテル麻酔下で股静脈内に注入し、３
日後にインシユリン分泌増強活性を測定する。な
お実験開始日18〜20時間絶食させる。測定方法
は、ラツト尾静脈より0.1mlの血液を採取後、直
ちに30％グルコース溶液を体重100ｇ当り１ml腹
腔内に投与し、正確に15分後、0.1mlの血液を再
び採取する。インシユリン分泌増強活性は、グル
コース投与前、後の血糖値および血中インシユリ
ン値の差より求める。血糖値はグルコースオキシ
ダーゼ法、インシユリンは二抗体法にて測定す
る。血糖値及びインシユリンの測定方法は夫々下
記文献及びキツトによる。 血糖値：グルコースオキシダーゼ法 Bergmeyer，H.―U.，and Bernet，E.in
“Methods of enzymatic analysis”
Bergmeyer，H.―U.，eds，New York
Academic press Ｐ 123（1963） グルコスタツト インシユリン：二抗体法 Morgan，C.R.，and Razarow，A.Diabetes
12 115（1963） インシユリンリアキツト―ダイナボツト社製 まず以下の式に従つて活性物質投与群及び対照
群ラツトのΔI／ΔG値を求める。

【表】 尚、血糖値を活性の計算に用いるのは分泌され
るインシユリン量が血糖値によつて大きく影響さ
れるためである。 次に活性物質の力価は、 単位（Unit）＝（本物質投与群ラツトの平均ΔI／ΔG
―対照群の平均ΔI／ΔG／対照群の平均ΔI／ΔG）×10
0 で求める。 各物質の比活性は力価単位を、重量で除したも
のとする。 ３ インシユリン分泌増強活性 本発明者が単離、精製したインシユリン分泌増
強活性物質は哺乳動物のインシユリン分泌を促進
し、且つ血糖値を正常値に維持調整する作用を示
し、さらに抗体産生を増強し、細胞性免疫を高め
る作用をも示す。本活性因子は極めて微量でこれ
等の作用を示す事から各種糖尿病の治療および予
防薬として、或いは免疫機能の異常による疾患
（例えば、悪性腫瘍、再生不良性貧血、リユウマ
チ関節炎等）に対する医薬として有用である。 本発明者は、この様な有効な活性を示すＮ―
IAPを、その要素物質に分離すると、薬理作用が
不活性となるが、これ等の要素物質をそれぞれ別
途に投与することによつて、その薬理活性を示す
新規な単一物質を得ることに成功した。要素物質
CP―Ａ及びPs―１のインシユリン分泌増強活性
を第６表に示す。 ４ 副作用および毒性 本発明者が単離、精製したインシユリン分泌増
強活性物質は、きわめて微量で、インシユリン分
泌増強活性を示し、各種糖尿病の治療および予防
薬として極めて有用と考えられる。しかしこのイ
ンシユリン分泌増強活性物質には、本来の活性と
は別に、白血球数を増加させる作用、ヒスタミン
に対する感受性を増加させる作用等のいわゆる副
作用を示し、さらに強い抗体産生の発現、すなわ
ち抗原性を示す事が判明した。特に抗原性は、二
回目以後の投与時にアナフイラキシ―シヨツク等
の重篤な結果をもたらしかねない。インシユリン
分泌増強活性物質は極めて微量で、本来の効果を
示すことから、この副作用が発現する可能性は少
ないものと考えられるが、より安全で有効な医薬
品と言う意味からは、本来の効果を低下させない
で、副作用を除去する事が望ましい事は言うまで
もない。 本発明者はインシユリン分泌増強活性物質を要
素物質に分離し、これ等要素物質をそれぞれ別途
に投与することによつて、インシユリン分泌増強
活性はインシユリン分泌増強物質と同程度の活性
を有し、更に抗原性が1/30以下に減弱し、急性毒
性値（LD₅₀値）も減少することが確認された。
要素物質CP―Ａ及びPs―１の抗原性を第６表に
示す。 Γ 抗原性の測定法 ハートレイ系雄性モルモツト（体重250ｇ）一
群６匹に、試料を連日３回投与し、投与後22日目
に、同じ試料１mgを静脈内に注射し、その後のア
ナフイラキシ―シヨツクによる死亡数を観察し
た。

【表】 要素物質CP―Ａ及びPs―１の静注LP₅₀値を第
７表に示す。

【表】 要素物質CP―Ａはもう一つの要素物質Ps―１
と組合せて主に糖尿病治療薬として有用と考えら
れる。現在糖尿病に対する薬物療法は、インシユ
リン注射あるいは血糖降下薬の経口投与のみでい
ずれも対症療法にすぎず、殆んど不治の病と言つ
てさしつかえない。しかもインシユリン注射のた
めに毎日通院しなければならない繁雑さがあり、
血糖降下薬の投与では血糖値の異常低下の発現が
常に危険視されている。要素物質CP―Ａの特徴
は、もう一つの要素物質Ps―１と組合せると、
インシユリン分泌活性を有するのみならず血糖値
をいろいろな条件で高めた時（高血糖状態、特に
摂食時に類するグルコース負荷時）にのみ血中イ
ンシユリンを増加させて血糖値をすみやかに正常
に戻す作用を発現する。要素物質CP―Ａをもう
一つの要素物質Ps―１と別々に投与する利点と
しては、１回投与で数週間から数ケ月にわたつて
活性が持続することがあり、更に特に、特願昭52
−10397号及び特願昭52−49641号に開示されてい
るインシユリン分泌増強活性物質の、抗体産生の
発現により連続投与することができなかつた欠点
を解決し、連続投与可能ならしめたことである。
更に、要素物質CP―Ａはもう一つの要素物質Ps
―１を組合せることによつて糖尿病、糖尿病の合
併症及び糖尿病が起因となる様々な成人病の治療
薬としてばかりでなく、前糖尿病状態への適用
や、現在全く治療法がなく悲惨な状態にある若年
型糖尿病の予防及び治療薬ならびに診断薬として
有用である。 以上、詳述の通り、要素物質CP―Ａはもう一
つの要素物質Ps―１と組合せることによつて、
糖尿病の治療および予防薬、免疫調節剤として極
めて有用であり、人体に対する有効量は、活性物
質の比活性に応じて固形物として、インシユリン
分泌増強活性用途においては約数10Units／Kg
（体重）〜数万Units／Kg（重量）の範囲であり、
免疫増強活性用途については約数10Units／Kg
（体重）〜数万Units／Kg（体重）の範囲である。 患者に対する投与方法は、各活性用途とも静脈
内投与が最も有効であり、その他腹腟内、筋肉内
および皮下投与、あるいは消化管内への直接投
与、経口投与、直腸内投与および舌下、皮内、鼻
粘膜、動脈、リンパ乃至気管投与も有効である。 投与形態としては、各活性用途とも注射液、坐
薬、腸溶・胃溶剤、舌下錠および吸入剤等を例示
し得る。注射液の最も単純な組成を例示すれば、
インシユリン分泌増強活性10000Units，NaCl ９
mgおよび滅菌蒸留水で１mlとしたものをあげ得
る。 又、薬剤に調合する際に、活性を劣化せしめる
ことのない任意の他成分を混合し得ることも当業
者にとり自明であろう。

【図面の簡単な説明】

第１乃至第３図は、本発明実験説明図であり、
第１図は、CM―セフマロースCL―6Bカラムク
ロマトグラフイーである。第２図は、Disc―電
気泳動図である。第３図は要素物質のSDS―
Dise電気泳動動図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ SDS―ゲル電気泳動法による分子量が75000
   ±5000；Lowry法による蛋白質98重量％以上で
   あり、且つ蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比
   （μM／100μM）は、ASp.6.4±0.7，Thr.7.3±0.8，
   Ser.8.2±0.9，Glu.9.3±1.0，Pro.6.3±0.7，
   Gly.11.1±1.0，Ala.9.0±0.9，Cys.／２ 1.2±
   0.3，Val.6.2±0.6，Met.2.7±0.4，Ile，3.4±0.4，
   Leu.8.4±0.9，Tyr，5.6±0.6，Phe.3.6±0.5，
   Lys.4.7±0.5，His.1.1±0.3及びArg.4.9±0.5であ
   り：且つ塩基性蛋白質であり、Ps1との組合せに
   より、インシユリン分泌増強活性の発見に係わる
   ことを特徴とする蛋白性要素物質CP―Ａ。 ２ ボルデテラ属に属する微生物を精製して得ら
   れたインシユリン分泌増強活性物質を3M〜5M尿
   素含有リン酸緩衝液（PH5.4―6.8）で12―96時間
   インキユベイトし、次いで、リン酸緩衝液（PH
   5.4―6.8）によつて平衡化したCM―セフアロー
   スCL―6Bカラムにて分離・精製をおこなうこと
   を特徴とする蛋白性要素物質CP―Ａの製造方法。