JPS6141547B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6141547B2 JPS6141547B2 JP59049352A JP4935284A JPS6141547B2 JP S6141547 B2 JPS6141547 B2 JP S6141547B2 JP 59049352 A JP59049352 A JP 59049352A JP 4935284 A JP4935284 A JP 4935284A JP S6141547 B2 JPS6141547 B2 JP S6141547B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nrrl
- steroids
- add
- medium
- mycobacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
- C07J1/0003—Androstane derivatives
- C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/005—Degradation of the lateral chains at position 17
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は２ないし10個の炭素原子の17−アルキ
ル側鎖を有するステロイドをキレート化剤の非存
在下で選択的に分解してアンドロスタ−１・４−
ジエン−３・17−ジオン（以下ADDと略記す
る）及びアンドロスト−４−エン−３・17−ジオ
ン（以下ADと略記する）にする突然変異菌であ
りかつ新規な微生物に関する。ADD及びADは有
用なステロイドを製造する重要な中間体である。
ル側鎖を有するステロイドをキレート化剤の非存
在下で選択的に分解してアンドロスタ−１・４−
ジエン−３・17−ジオン（以下ADDと略記す
る）及びアンドロスト−４−エン−３・17−ジオ
ン（以下ADと略記する）にする突然変異菌であ
りかつ新規な微生物に関する。ADD及びADは有
用なステロイドを製造する重要な中間体である。
（先行技術）
微生物によつてステロイドを変換することは広
く研究され文献で証明されている。明らかに、最
初のその様な研究はマモリ（Manoli）及びベル
セロン（Vercellone）によりなされ1937年のBer.
70、470及びBre.70 2079にみられる。彼等は醗
酵酵母による17−ケトステロイドの17β−ヒドロ
キシステロイドへの還元を開示した。それ以来、
ペーターソン（Peterson）及びムーレイ
（Murray）が真菌類リゾプス ニグリカンス
（Rhizopusnogricans）によるプロジエステロン
の11−αヒドロキシル化を開示した。（米国特許
2602769号（1952）参照）。より最近ではクライチ
ー（Kraychy）等が米国特許第3684657号
（1972）に17−アルキル側鎖に少くとも８個の炭
素原子を含むステロイドをミコバクテリウム種
NRRL Ｂ−3683を使つて醗酵しアンドロスト−
４−エン−３・17−ジオン、アンドロスト−１・
４−ジエン−３・17−ジオン及び20α−ヒドロキ
シメチル−プレグナ−１・４−ジエン−３−オン
を製造するステロイド17−アルキルの微生物によ
る選択的分解を開示している。更により最近にお
いてはマーシエツク（Marsheck）等が米国特許
第3759791号（1973）に17−アルキル側鎖に少な
くとも８個の炭素原子を含むコレスタン又はスチ
グマスタン系のステロイドのミコバクテリウム種
NRRL Ｂ−3805による醗酵でアンドロスト−４
−エン−３・17−ジオンを微生物によつて選択的
に製造することを開示している。
く研究され文献で証明されている。明らかに、最
初のその様な研究はマモリ（Manoli）及びベル
セロン（Vercellone）によりなされ1937年のBer.
70、470及びBre.70 2079にみられる。彼等は醗
酵酵母による17−ケトステロイドの17β−ヒドロ
キシステロイドへの還元を開示した。それ以来、
ペーターソン（Peterson）及びムーレイ
（Murray）が真菌類リゾプス ニグリカンス
（Rhizopusnogricans）によるプロジエステロン
の11−αヒドロキシル化を開示した。（米国特許
2602769号（1952）参照）。より最近ではクライチ
ー（Kraychy）等が米国特許第3684657号
（1972）に17−アルキル側鎖に少くとも８個の炭
素原子を含むステロイドをミコバクテリウム種
NRRL Ｂ−3683を使つて醗酵しアンドロスト−
４−エン−３・17−ジオン、アンドロスト−１・
４−ジエン−３・17−ジオン及び20α−ヒドロキ
シメチル−プレグナ−１・４−ジエン−３−オン
を製造するステロイド17−アルキルの微生物によ
る選択的分解を開示している。更により最近にお
いてはマーシエツク（Marsheck）等が米国特許
第3759791号（1973）に17−アルキル側鎖に少な
くとも８個の炭素原子を含むコレスタン又はスチ
グマスタン系のステロイドのミコバクテリウム種
NRRL Ｂ−3805による醗酵でアンドロスト−４
−エン−３・17−ジオンを微生物によつて選択的
に製造することを開示している。
（発明が解決しようとする問題点）
特公昭46−17951、46−16147、46−29193号は
キレート化剤の存在下で微生物によりADD又は
AD系化合物を製造する方法を記載しているが、
これらの方法ではキレート化剤が何れも必須であ
る。
キレート化剤の存在下で微生物によりADD又は
AD系化合物を製造する方法を記載しているが、
これらの方法ではキレート化剤が何れも必須であ
る。
（問題を解決する手段）
２ないし10個の炭素原子の17−アルキル側鎖を
有するステロイドをキレート化剤の組成物非存在
下で選択的に分解しアンドロスタ−1.4−ジエン
−３・17−ジオン（以下ADDと云う）及びアン
ドロスト−４−エン−３・17−ジオン（以下AD
と云う）を醗酵液中に蓄積するそれらの能力によ
つて特徴づけられる突然変異菌はミコバクテリウ
ム属の微生物から本明書細に開示される突然変異
手順又は他の突然変異手順を用いて得ることが出
来る。製造される微生物は新規突然変異微生物ミ
コバクテリウム、フオーツイトウムNRRL Ｂ−
8153及びミコバクテリウム フレイNRRL Ｂ−
8154でありこれらは２ないし10個の炭素原子の17
アルキル側鎖を有するステロイドを選択的に
ADD及びADに分解するのに用いられる。適当な
ステロイド基質の例はシトステロール、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロール
及び２ないし10個の炭素原子の17アルキル側鎖を
有する類似ステロイド類である。これらのステロ
イド基質は純粋なかたちでも粗製形でもよい。
有するステロイドをキレート化剤の組成物非存在
下で選択的に分解しアンドロスタ−1.4−ジエン
−３・17−ジオン（以下ADDと云う）及びアン
ドロスト−４−エン−３・17−ジオン（以下AD
と云う）を醗酵液中に蓄積するそれらの能力によ
つて特徴づけられる突然変異菌はミコバクテリウ
ム属の微生物から本明書細に開示される突然変異
手順又は他の突然変異手順を用いて得ることが出
来る。製造される微生物は新規突然変異微生物ミ
コバクテリウム、フオーツイトウムNRRL Ｂ−
8153及びミコバクテリウム フレイNRRL Ｂ−
8154でありこれらは２ないし10個の炭素原子の17
アルキル側鎖を有するステロイドを選択的に
ADD及びADに分解するのに用いられる。適当な
ステロイド基質の例はシトステロール、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロール
及び２ないし10個の炭素原子の17アルキル側鎖を
有する類似ステロイド類である。これらのステロ
イド基質は純粋なかたちでも粗製形でもよい。
２ないし10個の炭素原子の17アルキル側鎖を有
するステロイド類を選択的に分解し醗酵液中に
ADD及びADを蓄積する能力を有することで特徴
づけられる突然変異菌を得るために、ミコバクテ
リウムフオーツイトウムATCC 6842及びミコバ
クテリウム フレイUC 3533はここに開示される
様に突然変異を起こさせられ、新規な実験室でつ
くられた突然変微生物を与えた。
するステロイド類を選択的に分解し醗酵液中に
ADD及びADを蓄積する能力を有することで特徴
づけられる突然変異菌を得るために、ミコバクテ
リウムフオーツイトウムATCC 6842及びミコバ
クテリウム フレイUC 3533はここに開示される
様に突然変異を起こさせられ、新規な実験室でつ
くられた突然変微生物を与えた。
1974年のATCCカタログはATCC 6842をリス
トに載せる事と並んで次の事を開示している。ジ
エー．シー．クルツ2.（J.C.Cruz2.）冷膿瘍。
Acta Med.リオデジヤネイロ１：１（1936）。培
地9037C″。M.フオーツイトウムATCC6842はス
テロール類を非選択的に小さい分子量の化合物例
えばCO2＋H2Oに分解する。このようにこの微生
物はADD及びADへの選択的ステロイド分解者と
してはふさわしくない。
トに載せる事と並んで次の事を開示している。ジ
エー．シー．クルツ2.（J.C.Cruz2.）冷膿瘍。
Acta Med.リオデジヤネイロ１：１（1936）。培
地9037C″。M.フオーツイトウムATCC6842はス
テロール類を非選択的に小さい分子量の化合物例
えばCO2＋H2Oに分解する。このようにこの微生
物はADD及びADへの選択的ステロイド分解者と
してはふさわしくない。
ニトロソグアニジンを用いたM.フオーツイト
ウムATCC 6842及びM.フレイ UC 3533｛UC
はジアツプジヨンカンパニー カルチヤー コレ
クシヨン（The Upjohn Conpany Culture
Collection）を表わす。｝の突然変異は２ないし
10個の炭素原子の17−アルキル側鎖を持つステロ
イドを選択的に分解してADDとADをつくる新規
な突然変異菌の製造を生じた。これらの突然変異
微生物は米国イリノイ州ペオリア（Peoria）米国
農務省ノーザンリージヨナル リサーチ ラボラ
トリー（Northern Regional Research
Laboratory）から入手第号NRRL Ｂ−8153及び
NRRL Ｂ−8154を与えられそこで永久収集中に
寄託がなされている。これらの微生物のサブカル
チヤーはこの寄託所からそこに請求することによ
り自由に入手しうる。培養基を入手しうることが
政府の行為により主題の文書をもつて与えられた
特許権を減損せしせて主題発明の実施の権利を構
成するものではないことが理解されるべきであ
る。微生物工業技術研究所の申請書受託番号は微
工研菌寄第3946号（M.フオーツイトウム）及び
第3947号（M.フレイ）である。
ウムATCC 6842及びM.フレイ UC 3533｛UC
はジアツプジヨンカンパニー カルチヤー コレ
クシヨン（The Upjohn Conpany Culture
Collection）を表わす。｝の突然変異は２ないし
10個の炭素原子の17−アルキル側鎖を持つステロ
イドを選択的に分解してADDとADをつくる新規
な突然変異菌の製造を生じた。これらの突然変異
微生物は米国イリノイ州ペオリア（Peoria）米国
農務省ノーザンリージヨナル リサーチ ラボラ
トリー（Northern Regional Research
Laboratory）から入手第号NRRL Ｂ−8153及び
NRRL Ｂ−8154を与えられそこで永久収集中に
寄託がなされている。これらの微生物のサブカル
チヤーはこの寄託所からそこに請求することによ
り自由に入手しうる。培養基を入手しうることが
政府の行為により主題の文書をもつて与えられた
特許権を減損せしせて主題発明の実施の権利を構
成するものではないことが理解されるべきであ
る。微生物工業技術研究所の申請書受託番号は微
工研菌寄第3946号（M.フオーツイトウム）及び
第3947号（M.フレイ）である。
主題発明の微生物は前に論じられた米国特許第
3759791号に開示されたミコバクテリウムの種
NRRL Ｂ−3805と区別される。NRRL Ｂ−3805
は主題発明のM.−フオーツイトウム及びM.フレ
イとは明確に異なるミコバクテリウム バツカエ
（M.vaccae）の一般特性を有する。これらの微生
物の比較に対してはデターミネーテイブ バクテ
オロジー（Determinative Bacteriology）第８版
ウイリアムズアンド ウイルキンズ カンパニー
（Williams and Wilkins Company）1974、695〜
696ページのバーギーの便覧（Bergeys Manual）
を参照されたし。
3759791号に開示されたミコバクテリウムの種
NRRL Ｂ−3805と区別される。NRRL Ｂ−3805
は主題発明のM.−フオーツイトウム及びM.フレ
イとは明確に異なるミコバクテリウム バツカエ
（M.vaccae）の一般特性を有する。これらの微生
物の比較に対してはデターミネーテイブ バクテ
オロジー（Determinative Bacteriology）第８版
ウイリアムズアンド ウイルキンズ カンパニー
（Williams and Wilkins Company）1974、695〜
696ページのバーギーの便覧（Bergeys Manual）
を参照されたし。
M.フオーツイトウム NRRL Ｂ−8153及びM.
フレイ NRRL Ｂ−8154の形態及び薬品感受性
は親培養基のM.フオーツイタム ATCC 6842及
びM.フレイ UC 3533とそれぞれ区別できな
い。M.フオーツイタム及びM.フレイ培養基の両
方共アクチノミセターレス（Actinomycetales）
目のミコバクテリアセア（Mycobacteriaceae）
科に属する抗酸性、非運動性、非胞子形成性桿菌
である。ルニヨン イー．エイチ．（Runyon E.
H）1959 Med.Chin.North America43：273のル
ニヨンの分類によればM.フオーツイトウムは非
色素生成性群ミコバクテリウムであり、即ち急
速に低温で成長して無色のコロニーを比較的単純
な培地上に生成する。M.フレイもまた群ミコ
バクテリウムであるが単純培地上で生育されたと
き濃い黄色ないし橙色である。コロニーを生成す
る。
フレイ NRRL Ｂ−8154の形態及び薬品感受性
は親培養基のM.フオーツイタム ATCC 6842及
びM.フレイ UC 3533とそれぞれ区別できな
い。M.フオーツイタム及びM.フレイ培養基の両
方共アクチノミセターレス（Actinomycetales）
目のミコバクテリアセア（Mycobacteriaceae）
科に属する抗酸性、非運動性、非胞子形成性桿菌
である。ルニヨン イー．エイチ．（Runyon E.
H）1959 Med.Chin.North America43：273のル
ニヨンの分類によればM.フオーツイトウムは非
色素生成性群ミコバクテリウムであり、即ち急
速に低温で成長して無色のコロニーを比較的単純
な培地上に生成する。M.フレイもまた群ミコ
バクテリウムであるが単純培地上で生育されたと
き濃い黄色ないし橙色である。コロニーを生成す
る。
M.フオーツイトウム ATCC 6842及びM.フオ
ーツイタム NRRL Ｂ−8153はそれらのステロ
イド分子に対する作用において明らかに区別でき
る。上に関示されたように、M.フオーツイトウ
ム ATCC 6842はステロイドを分解しAD及び
ADDをつくることに関しステロイドの非選択分
解者であつて炭素源としてステロイドを摂取し究
極的にCO2と水にしてしまうのに対してM.フオ
ーツイトウム NRRL Ｂ−8153はステロイドの
選択分解者であつてADとADDを製造する。この
M.フオーツイトウムNRRL Ｂ−8153の性質はこ
こに開示される様にそれ自身を非常に有用なもの
にしている。更にM.フレイ UC 3533とM.フレ
イ NRRL Ｂ−8154もまたそれらのテロイド分
子に対する作用において区別される。M.フレイ
UC 3533はステロイドを分解しAD及びADDを
つくることに関しステロイドの非選択分解者であ
つて炭素源としてステロイドを摂取し究極的に
CO2と水にしてしまうのに対してNRRL Ｂ−
8154はステロイドの選択分解者であつてADと
ADDを製造する。
ーツイタム NRRL Ｂ−8153はそれらのステロ
イド分子に対する作用において明らかに区別でき
る。上に関示されたように、M.フオーツイトウ
ム ATCC 6842はステロイドを分解しAD及び
ADDをつくることに関しステロイドの非選択分
解者であつて炭素源としてステロイドを摂取し究
極的にCO2と水にしてしまうのに対してM.フオ
ーツイトウム NRRL Ｂ−8153はステロイドの
選択分解者であつてADとADDを製造する。この
M.フオーツイトウムNRRL Ｂ−8153の性質はこ
こに開示される様にそれ自身を非常に有用なもの
にしている。更にM.フレイ UC 3533とM.フレ
イ NRRL Ｂ−8154もまたそれらのテロイド分
子に対する作用において区別される。M.フレイ
UC 3533はステロイドを分解しAD及びADDを
つくることに関しステロイドの非選択分解者であ
つて炭素源としてステロイドを摂取し究極的に
CO2と水にしてしまうのに対してNRRL Ｂ−
8154はステロイドの選択分解者であつてADと
ADDを製造する。
M.フオーツイトウム ATCC 6842及びM.フレ
イ UC 3533のM.フオーツイトウム NRRL Ｂ
−8153及びM.フレイ NRRL Ｂ−8154への突然
変異はそれぞれニトロソグアニジンの使用により
達成された。手順の詳細は後述される。突然変異
手順は一般に技術において知られているが、主題
突然変異手順の使用により得られるかも知れない
突然変異菌の型はもしあつたとしても教えている
技術はもとより示唆している公知の技術さえもな
い。またここに開示される突然変異の手順及び変
換の手順はミコバクテリウムに対して詳述されて
いるが同様の又は等しい手順がここに開示される
様に他の属の微生物にも使用できる事が理解され
るべきである。
イ UC 3533のM.フオーツイトウム NRRL Ｂ
−8153及びM.フレイ NRRL Ｂ−8154への突然
変異はそれぞれニトロソグアニジンの使用により
達成された。手順の詳細は後述される。突然変異
手順は一般に技術において知られているが、主題
突然変異手順の使用により得られるかも知れない
突然変異菌の型はもしあつたとしても教えている
技術はもとより示唆している公知の技術さえもな
い。またここに開示される突然変異の手順及び変
換の手順はミコバクテリウムに対して詳述されて
いるが同様の又は等しい手順がここに開示される
様に他の属の微生物にも使用できる事が理解され
るべきである。
変換手順
主題発明の選択的変換はM.フオーツイトウム
NRRL Ｂ−8153又はM.フレイ NRRL Ｂ−
8154の生育しいる培養基の中において、選ばれた
ステロイド基質を培養期間中に加えるか、又は培
養前に栄養培地中に混入することによつて行うこ
とが出来る。ステロイドは単独で又は別のステロ
イドと組み合わせて加えることができる。制限す
るものではないが好ましい培養基中のステロイド
の濃度範囲は１当り約0.1から約100グラムであ
る。培養基では炭素源例えば資化しうる炭水化物
及び窒素源例えば資化しうる窒素化合物又は蛋白
質物質を含んだ栄養培地中において生育がなされ
る。好ましい炭素源はブドウ糖、ブラウンシユガ
ー、シヨ糖、グリセロール、澱粉、とうもろこし
澱粉、乳糖、デキストリン、糖密などを含む。好
ましい窒素源にはコーンステイープリカー、酵
母、自己分解醸造用酵母とミルク固形物、大豆
粉、綿実粉、コーンミール、ミルク固形物、カゼ
インパンクレチン消化物、フイツシユミール、ジ
スチラース・ソリツドブル動物ペプトン液、肉く
ず及び骨くず、アンモニウム塩などが含まれる。
これらの炭素及び窒素源の組み合わせが有利に使
用できる。微量の金属、例えば亜鉛、マグネシウ
ム、マンガン、コバルト、鉄などは水道水及び精
製されない成分が培地滅菌前に培地成分として使
用されるから加えられる必要はない。
NRRL Ｂ−8153又はM.フレイ NRRL Ｂ−
8154の生育しいる培養基の中において、選ばれた
ステロイド基質を培養期間中に加えるか、又は培
養前に栄養培地中に混入することによつて行うこ
とが出来る。ステロイドは単独で又は別のステロ
イドと組み合わせて加えることができる。制限す
るものではないが好ましい培養基中のステロイド
の濃度範囲は１当り約0.1から約100グラムであ
る。培養基では炭素源例えば資化しうる炭水化物
及び窒素源例えば資化しうる窒素化合物又は蛋白
質物質を含んだ栄養培地中において生育がなされ
る。好ましい炭素源はブドウ糖、ブラウンシユガ
ー、シヨ糖、グリセロール、澱粉、とうもろこし
澱粉、乳糖、デキストリン、糖密などを含む。好
ましい窒素源にはコーンステイープリカー、酵
母、自己分解醸造用酵母とミルク固形物、大豆
粉、綿実粉、コーンミール、ミルク固形物、カゼ
インパンクレチン消化物、フイツシユミール、ジ
スチラース・ソリツドブル動物ペプトン液、肉く
ず及び骨くず、アンモニウム塩などが含まれる。
これらの炭素及び窒素源の組み合わせが有利に使
用できる。微量の金属、例えば亜鉛、マグネシウ
ム、マンガン、コバルト、鉄などは水道水及び精
製されない成分が培地滅菌前に培地成分として使
用されるから加えられる必要はない。
変換プロセスは約72時間から15日又はそれ以上
の範囲をとることができる。培養温度は約25℃か
ら約37℃の範囲をとることができ30℃がNRRL
−8153に好ましく、35℃がNRRL Ｂ−8154に好
ましい。
の範囲をとることができる。培養温度は約25℃か
ら約37℃の範囲をとることができ30℃がNRRL
−8153に好ましく、35℃がNRRL Ｂ−8154に好
ましい。
内容物は滅菌空気で通気され撹拌されて微生物
の生育が促進され、またかくして変換過程の有効
性が高められる。
の生育が促進され、またかくして変換過程の有効
性が高められる。
シリカゲル板｛イー．メルク（E.Merck）ダル
ムシユタツト（Darmstadt）｝及び容量で２：３
の酢酸エチル−シクロヘキサンからなる溶媒系を
使つた薄層クロマトグラフイーによつて証明され
る様に変換過程が完了したら所望の変換されたス
テロイドはこの技術において良く知られた方法で
回収される。例えば、醗酵液と細胞とを含む醗酵
（変換）反応混合物はステロイド用の水に混和し
ない有機溶媒で抽出することができる。適当な溶
媒はジクロルメタン（好ましい）、塩化メチレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、塩化エチレン、
トリクロルエチレン、エーテル、酢酸アミル、ベ
ンゼンなどがある。
ムシユタツト（Darmstadt）｝及び容量で２：３
の酢酸エチル−シクロヘキサンからなる溶媒系を
使つた薄層クロマトグラフイーによつて証明され
る様に変換過程が完了したら所望の変換されたス
テロイドはこの技術において良く知られた方法で
回収される。例えば、醗酵液と細胞とを含む醗酵
（変換）反応混合物はステロイド用の水に混和し
ない有機溶媒で抽出することができる。適当な溶
媒はジクロルメタン（好ましい）、塩化メチレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、塩化エチレン、
トリクロルエチレン、エーテル、酢酸アミル、ベ
ンゼンなどがある。
別の方法としては、醗酵液及び細胞が最初に慣
用の方法例えば過又は遠心分離で分離され、つ
いで別々の適当な溶媒で抽出される。細胞は水混
和性溶媒又は水に混和しない溶媒のいずれかで油
出できる。細胞が無くなつた醗酵液は水と混和し
ない溶媒で抽出できる。
用の方法例えば過又は遠心分離で分離され、つ
いで別々の適当な溶媒で抽出される。細胞は水混
和性溶媒又は水に混和しない溶媒のいずれかで油
出できる。細胞が無くなつた醗酵液は水と混和し
ない溶媒で抽出できる。
抽出物は珪藻土を通して過され液は減圧蒸
留されて乾固される。生じる所望の変換されたス
テロイドを含む残溜物は次に酢酸エチル−シクロ
ヘキサン（20：80）の最少量に溶かすことができ
る。この溶液は乾燥シリカゲル上で酢酸エチル−
ベンゼン（20：80）の溶媒系を用いてクロマトグ
ラフにかけることができる。ADD及びADは酢酸
エチル−クロロホルム（15：85）の溶媒系で溶す
ることによつてシリカゲルから分離することがで
きる。化合物はついで溶媒の蒸発とヘキサンでの
再結晶化により別々のものとして単離することが
できる。
留されて乾固される。生じる所望の変換されたス
テロイドを含む残溜物は次に酢酸エチル−シクロ
ヘキサン（20：80）の最少量に溶かすことができ
る。この溶液は乾燥シリカゲル上で酢酸エチル−
ベンゼン（20：80）の溶媒系を用いてクロマトグ
ラフにかけることができる。ADD及びADは酢酸
エチル−クロロホルム（15：85）の溶媒系で溶す
ることによつてシリカゲルから分離することがで
きる。化合物はついで溶媒の蒸発とヘキサンでの
再結晶化により別々のものとして単離することが
できる。
主題発明変換方法の所望生成物は既知ステロイ
ド中間体ADD及びADである。これらの化合物は
有用はステロイドホルモンの合成における中間体
として有用である。例えばADDは米国特許
3274183中に開示された方法に従つてエストロン
をつくるのに使用することができる。またADは
米国特許2143453、：2253798：226488及び
2356154に開示された方法に従つてテストステロ
ンをつくるのに使用できる。
ド中間体ADD及びADである。これらの化合物は
有用はステロイドホルモンの合成における中間体
として有用である。例えばADDは米国特許
3274183中に開示された方法に従つてエストロン
をつくるのに使用することができる。またADは
米国特許2143453、：2253798：226488及び
2356154に開示された方法に従つてテストステロ
ンをつくるのに使用できる。
次の実施例は主題発明の方法及び生成物の例示
であるが制限的に解釈されるべきではない。別に
注意がさられない限りすべてのパーセントは対重
量によりかつすべての溶媒混合比は対容量によ
る。
であるが制限的に解釈されるべきではない。別に
注意がさられない限りすべてのパーセントは対重
量によりかつすべての溶媒混合比は対容量によ
る。
実施例 １
突然変異M.フオーツイトウム NRRRL Ｂ−
8154のM.フオーツイトウム ATCC 6842から
の製造 (a) ニトロソグアニジン変異誘起 M.フオーツイトウム ATCC 6842が28℃で
次の滅菌種培地中で生育される。
8154のM.フオーツイトウム ATCC 6842から
の製造 (a) ニトロソグアニジン変異誘起 M.フオーツイトウム ATCC 6842が28℃で
次の滅菌種培地中で生育される。
ニユートリエントブロス｛デイフコ（Difco）｝
８ｇ/ 酵母ブロス １ｇ/ グリセロール ５ｇ/ 蒸留水 補充分量 １ PHは1N NaOHで121℃20分間の滅菌に先だつ
て7.0に調節する。
８ｇ/ 酵母ブロス １ｇ/ グリセロール ５ｇ/ 蒸留水 補充分量 １ PHは1N NaOHで121℃20分間の滅菌に先だつ
て7.0に調節する。
細胞は約５×108／mlの密度に生育され、遠
心分離で小さく丸められついで等容量の滅菌
0.1Mクエン酸ナトリウムPH5.6で洗われる。洗
われた細胞は等容量のクエン酸緩衝液中に再懸
濁され試料が力価測定のために除かれ（細胞計
数）かつニトロソグアニジンが最終濃度50μ
ｇ／mlまで加えられる。細胞懸濁液は37℃で水
浴中において30分間培養されそのあと試料は再
度力価測定のために除かれ残りは遠心分離され
て等容量の滅菌0.1M燐酸カリウムPH7.0で洗わ
れる。最後に、細胞は炭素源を除いたものから
なる滅菌された最少塩類培地に再懸濁される。
心分離で小さく丸められついで等容量の滅菌
0.1Mクエン酸ナトリウムPH5.6で洗われる。洗
われた細胞は等容量のクエン酸緩衝液中に再懸
濁され試料が力価測定のために除かれ（細胞計
数）かつニトロソグアニジンが最終濃度50μ
ｇ／mlまで加えられる。細胞懸濁液は37℃で水
浴中において30分間培養されそのあと試料は再
度力価測定のために除かれ残りは遠心分離され
て等容量の滅菌0.1M燐酸カリウムPH7.0で洗わ
れる。最後に、細胞は炭素源を除いたものから
なる滅菌された最少塩類培地に再懸濁される。
NH4NO3 0.1 ｇ/
K2HPO4 0.25 ｇ/
MgSO4・7H2O 0.25 ｇ/
NaCl 0.005ｇ/
FeSO4・7H2O 0.001ｇ/
蒸 留 水 １への補充十分量
PHは1N HClで121℃20分間の滅菌に先だつて
7.0に調節される。細胞はついで突然変異菌を
選別するために扁平培養基に出される。
7.0に調節される。細胞はついで突然変異菌を
選別するために扁平培養基に出される。
(b) 突然変異体M.フオーツイトウム NRRL Ｂ
−8153の選別及び単離 上に記された様に突然変異誘起がなされた細
胞は希釈され次のものからなる培地を含む扁平
培養基上に広げられる。｛フレーザー及びジエ
レル（Fraser and Jerrel）1963 J.Biol.
Chem.205：291〜295を修正したもの｝ グリセロール 10.0 ｇ/ K2HPO4 0.5 ｇ/ NH4Cl 1.0 ｇ/ MgSO4・7H2O 0.5 ｇ/ FeCl3・6H2O 0.05ｇ/ 蒸 留 水 １への補充に十分な量 寒天（15ｇ/）が加えられ培地は121℃で30分
間オートクレーブにかけられついで滅菌ペトリ
皿に注がれる。
−8153の選別及び単離 上に記された様に突然変異誘起がなされた細
胞は希釈され次のものからなる培地を含む扁平
培養基上に広げられる。｛フレーザー及びジエ
レル（Fraser and Jerrel）1963 J.Biol.
Chem.205：291〜295を修正したもの｝ グリセロール 10.0 ｇ/ K2HPO4 0.5 ｇ/ NH4Cl 1.0 ｇ/ MgSO4・7H2O 0.5 ｇ/ FeCl3・6H2O 0.05ｇ/ 蒸 留 水 １への補充に十分な量 寒天（15ｇ/）が加えられ培地は121℃で30分
間オートクレーブにかけられついで滅菌ペトリ
皿に注がれる。
この培地での生育は突然変異誘起手順でつく
られた大部分の栄養的オーキソトローフ（栄養
要求変異株）を除き、例えば化学的に限定され
た培地上で生育するためにビタミン、生育因子
などを要求する培養株は除かれる。28℃で約７
日間培養した後、生じる集落は突然変異株を選
別するのに適当な試験扁平培養基にレプリケー
トされついでグリセルロールを基準にした培地
を含む対照扁平培養基上にもどされる。試験扁
平培養基はピーターソン（Peterson）、ジー．
イー．（G.E.）、エイチ．エル．ルイス（H.L.
Lewis）及びジエー．アール．デービス（J.R.
Dauis）1962。「寒天培地中のコレステロール
及び他の水不溶性炭素源の均一分散液の調製」
ジエー．リピツド リサーチ（J.Lipid
Research）３：275〜276に記された様につく
られる。これらの扁平培養基中の最少塩類培地
は実施例１の(a)部中に前記された通りである。
寒天（15ｇ/）及びシトステロール又はアン
ドロステンジオン（AD）などの適当な炭素源
（1.0ｇ/）が加えられ生じる懸濁液は30分間
121℃でオートクレーブにかけられる。滅菌さ
れた熱い混合物はついて滅菌混合容器に注がれ
若干分間混合され、ついで滅菌ペトリ皿に注が
れる。発泡がこの手順において問題になりがち
であるが混合物が熱い時に混合しかつ溶けた寒
天扁平培養基の表面を炎にあてることによつて
減じることができる。この方法で均一な水不溶
の炭素源の分散液が得られ、これは非常に均一
なしかし不透明な寒天扁平培養基の調製を促進
する。
られた大部分の栄養的オーキソトローフ（栄養
要求変異株）を除き、例えば化学的に限定され
た培地上で生育するためにビタミン、生育因子
などを要求する培養株は除かれる。28℃で約７
日間培養した後、生じる集落は突然変異株を選
別するのに適当な試験扁平培養基にレプリケー
トされついでグリセルロールを基準にした培地
を含む対照扁平培養基上にもどされる。試験扁
平培養基はピーターソン（Peterson）、ジー．
イー．（G.E.）、エイチ．エル．ルイス（H.L.
Lewis）及びジエー．アール．デービス（J.R.
Dauis）1962。「寒天培地中のコレステロール
及び他の水不溶性炭素源の均一分散液の調製」
ジエー．リピツド リサーチ（J.Lipid
Research）３：275〜276に記された様につく
られる。これらの扁平培養基中の最少塩類培地
は実施例１の(a)部中に前記された通りである。
寒天（15ｇ/）及びシトステロール又はアン
ドロステンジオン（AD）などの適当な炭素源
（1.0ｇ/）が加えられ生じる懸濁液は30分間
121℃でオートクレーブにかけられる。滅菌さ
れた熱い混合物はついて滅菌混合容器に注がれ
若干分間混合され、ついで滅菌ペトリ皿に注が
れる。発泡がこの手順において問題になりがち
であるが混合物が熱い時に混合しかつ溶けた寒
天扁平培養基の表面を炎にあてることによつて
減じることができる。この方法で均一な水不溶
の炭素源の分散液が得られ、これは非常に均一
なしかし不透明な寒天扁平培養基の調製を促進
する。
対照扁平培養基上で生育するがADを唯一の
炭素源として含む試験扁平培養基上では生育し
ない集落は栄養寒天扁平培養基上に塗沫するこ
とによつて精製される。28℃で生育の後、個々
のクローンは栄養寒天扁平培養基から滅菌つま
ようじで拾われ炭素源としてADを含む格子を
入れられた扁平塩養基に接種することにより再
試験される。それでもなお親株と異なる表現型
を示す精製された単離物は次いで振とうフラス
コ中で評価される。
炭素源として含む試験扁平培養基上では生育し
ない集落は栄養寒天扁平培養基上に塗沫するこ
とによつて精製される。28℃で生育の後、個々
のクローンは栄養寒天扁平培養基から滅菌つま
ようじで拾われ炭素源としてADを含む格子を
入れられた扁平塩養基に接種することにより再
試験される。それでもなお親株と異なる表現型
を示す精製された単離物は次いで振とうフラス
コ中で評価される。
(c) 振とうフラスコ評価
振とうフラスコ（500ml）は次の成分からな
る生成変換培地100mlを含む。
る生成変換培地100mlを含む。
グリセロール 10.0 ｇ/
K2HPO4 0.5 ｇ/
NH4Cl 1.0 ｇ/
MgSO4・7H2O 0.5 ｇ/
FeCl3・6H2O 0.05ｇ/
蒸 留 水 補充に十分量 １
大豆粉（１ｇ/）が培地中に混合され次に
シトステロール（10ｇ/）も培地に混合され
る。フラスコが121℃で30分間オートクレーブ
にかけられた後、それらは28℃に冷やされ次に
10mlの次の様に調製された種生育菌が接種され
る。
シトステロール（10ｇ/）も培地に混合され
る。フラスコが121℃で30分間オートクレーブ
にかけられた後、それらは28℃に冷やされ次に
10mlの次の様に調製された種生育菌が接種され
る。
(b)部分から精製された単離物は28℃で寒天斜
面培養基上に生育される。斜面培養基から取ら
れた一ループの細胞は次の成分からなる100ml
の滅菌種培地を含む500mlのフラスコに接種す
るのに使用される。
面培養基上に生育される。斜面培養基から取ら
れた一ループの細胞は次の成分からなる100ml
の滅菌種培地を含む500mlのフラスコに接種す
るのに使用される。
ニユートリエントブロス（デイフコ） ８ｇ/
酵母抽出物 １ｇ/
グリセロール ５ｇ/
蒸 留 水 補充十分量 １
PHはフラスコを121℃で20分間オートクレー
ブにかけるに先立つて1N NaOHで7.0に調節さ
れる。種フラスコは28℃で72時間培養される。
ブにかけるに先立つて1N NaOHで7.0に調節さ
れる。種フラスコは28℃で72時間培養される。
上に開示された様に10mlの種生育菌がついで
100mlの滅菌変換培地を含む500mlのフラスコの
各各に接種されるのに使用される。フラスコは
ついで28℃ないし30℃で回転振とう機上で培養
され種種の間隔で試が取り上げられる。10mlの
サンプルが除かれ３容量の塩化メチレンと振と
うして抽出される。抽出物の部分はシリカゲル
と上記溶媒系即ち、２：３（容積）酢酸エチル
−シクロヘキサンを用いて薄層クロマトグラフ
イーで分析されまた、気液クロマトグラフイー
で分析される。ADD及びADの存在の証明が親
株M.フオーツイトウム ATCC 6842からつく
られた新規突然変異株によるシトステロールの
選択的分解を確なものとする。
100mlの滅菌変換培地を含む500mlのフラスコの
各各に接種されるのに使用される。フラスコは
ついで28℃ないし30℃で回転振とう機上で培養
され種種の間隔で試が取り上げられる。10mlの
サンプルが除かれ３容量の塩化メチレンと振と
うして抽出される。抽出物の部分はシリカゲル
と上記溶媒系即ち、２：３（容積）酢酸エチル
−シクロヘキサンを用いて薄層クロマトグラフ
イーで分析されまた、気液クロマトグラフイー
で分析される。ADD及びADの存在の証明が親
株M.フオーツイトウム ATCC 6842からつく
られた新規突然変異株によるシトステロールの
選択的分解を確なものとする。
実施例 ２
シトステロールのADD及びADへの変換
使用された培地は実施例１の(c)中のものと同じ
である。
である。
この培地が30分間121℃でオートクレーブにか
けて滅菌されそれから30℃に冷やされついで実施
例１、(c)に記された様に調製された突然変異株ミ
コバクテリウムM.フオーツイトウム BRRL Ｂ
−8153の種培養基の10部分で接種される。接種さ
れた混合物は30℃で336時間深部生育を促進する
ために撹拌しながら培養される。培養に続き、混
合物はジクロルメタンで抽出される。抽出物は無
水硫酸ナトリウム上で乾燥され、溶媒は減圧蒸留
で除かれる。生じる残留物は最少量の酢酸エチル
−シクロヘキサン（20：80）中に溶解される。こ
の溶液は次に乾燥シリカゲル上で酢酸エチル−ベ
ンゼン（20：80）溶媒系を用いてクロマトグラフ
にかけられる。アンドロスト−４−エン−３・17
−ジオン及びアンドロスタ−１・４−ジエン−
３・17−ジオンの存在は薄層クロマトグラフイー
により示される。これらの化合物は酢酸エチル−
クロロホルム（15：85）溶媒系で溶出してシリカ
ゲルから分離される。化合物は次に溶媒蒸発及び
ヘキサンでの再結晶化で単離される。収率は5.0
ｇ／リツトル。
けて滅菌されそれから30℃に冷やされついで実施
例１、(c)に記された様に調製された突然変異株ミ
コバクテリウムM.フオーツイトウム BRRL Ｂ
−8153の種培養基の10部分で接種される。接種さ
れた混合物は30℃で336時間深部生育を促進する
ために撹拌しながら培養される。培養に続き、混
合物はジクロルメタンで抽出される。抽出物は無
水硫酸ナトリウム上で乾燥され、溶媒は減圧蒸留
で除かれる。生じる残留物は最少量の酢酸エチル
−シクロヘキサン（20：80）中に溶解される。こ
の溶液は次に乾燥シリカゲル上で酢酸エチル−ベ
ンゼン（20：80）溶媒系を用いてクロマトグラフ
にかけられる。アンドロスト−４−エン−３・17
−ジオン及びアンドロスタ−１・４−ジエン−
３・17−ジオンの存在は薄層クロマトグラフイー
により示される。これらの化合物は酢酸エチル−
クロロホルム（15：85）溶媒系で溶出してシリカ
ゲルから分離される。化合物は次に溶媒蒸発及び
ヘキサンでの再結晶化で単離される。収率は5.0
ｇ／リツトル。
実施例 ３
実施例２中のM.フオーツイトウム NRRL Ｂ
−8153をM.フレイ NRRL Ｂ−8154に替えかつ
又実施例２中の培養温度30℃に替えて、ADDと
ADの混合物が得られる。収率は１ｇ／リツト
ル。
−8153をM.フレイ NRRL Ｂ−8154に替えかつ
又実施例２中の培養温度30℃に替えて、ADDと
ADの混合物が得られる。収率は１ｇ／リツト
ル。
実施例 ４
実施例２及び３中のシトステロールをコレステ
ロールに替えてADDとADの混合物が得られる。
ロールに替えてADDとADの混合物が得られる。
実施例 ５
実施例２及び３中においてシトラステロールを
スチグマステロールに替えて、ADDとADの混合
物が得られる。
スチグマステロールに替えて、ADDとADの混合
物が得られる。
実施例 ６
実施例２及び３中のシトステロールをカンペス
テロールに替えてADDとADの混合物が得られ
る。
テロールに替えてADDとADの混合物が得られ
る。
実施例 ７
実施例２〜６のステロイドの任意の組み合わせ
を実施例２及び３中のシトステロールの外に又は
シトラステロールの代わりに加えることにより、
ADDとAD混合物が得られる。
を実施例２及び３中のシトステロールの外に又は
シトラステロールの代わりに加えることにより、
ADDとAD混合物が得られる。
Claims (1)
- １ 17アルキル側鎖中に２〜10個の炭素原子を含
有するステロイドの存在下で、好気的条件下で、
水性栄養培地中で醗酵液中にアンドロスタ−１・
４−ジエン−３・17−ジオン及びアンドロスト−
４−エン−３・17−ジオンをキレート化剤の非存
在下に於ても蓄積する能力があることを特徴とす
るミコバクテリウムフオルツイツムNRRL Ｂ−
8153及びミコバクテリウム フレイ NRRL Ｂ
−8154から選ばれる新規な人工的に造られた突然
変異株。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66256376A | 1976-03-01 | 1976-03-01 | |
| US662563 | 1976-03-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60133884A JPS60133884A (ja) | 1985-07-17 |
| JPS6141547B2 true JPS6141547B2 (ja) | 1986-09-16 |
Family
ID=24658223
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59049352A Granted JPS60133884A (ja) | 1976-03-01 | 1984-03-16 | 新規な突然変異微生物 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60133884A (ja) |
| CH (2) | CH637993A5 (ja) |
| DD (1) | DD130789A5 (ja) |
| DE (1) | DE2703645C3 (ja) |
| FR (1) | FR2345464A1 (ja) |
| IL (3) | IL60476A (ja) |
| MX (3) | MX4503E (ja) |
| NL (1) | NL170435C (ja) |
| PL (2) | PL113212B1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4293645A (en) * | 1976-03-01 | 1981-10-06 | The Upjohn Company | Process for preparing androsta-1,4-diene-3,17-dione and androst-4-ene-3,17-dione |
| NL189865C (nl) * | 1976-10-22 | 1993-08-16 | Upjohn Co | Werkwijze voor het bereiden van androst-4-een-3,17-dion en de daarbij toegepaste micro-organismen. |
| US4293646A (en) * | 1978-08-07 | 1981-10-06 | The Upjohn Company | Composition of matter and process |
| DE3521111A1 (de) * | 1985-06-10 | 1986-12-11 | Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen | Verfahren zur herstellung von 4-androsten-3,17-dion und 1,4-androstadien-3,17-dion |
| DE3544662A1 (de) * | 1985-12-13 | 1987-06-19 | Schering Ag | Verfahren zur herstellung von 4-androsten-3,17-dion und 1,4-androstadien-3,17-dion |
| CN106282080B (zh) * | 2016-08-10 | 2019-09-03 | 江南大学 | 一种新金色分枝杆菌来源的甾酮c27-单加氧酶及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1494461A (fr) * | 1965-09-23 | 1967-09-08 | Richter Gedeon Vegyeszet | Procédé de préparation de stéroïdes ayant une structure de 1, 4-diène-3, 17-diones |
| FR1497292A (fr) * | 1965-10-22 | 1967-10-06 | Koninklijke Gist Spiritus | Procédé pour l'obtention de stéroïdes ne contenant pas de substituant earboné en position 17 |
| US3759791A (en) * | 1970-12-10 | 1973-09-18 | Searle & Co | Selective microbiological preparation of androst-4-ene-3,17-dione |
| DD125677A5 (ja) * | 1975-06-06 | 1977-05-11 |
-
1977
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- 1977-01-31 MX MX779661U patent/MX6933E/es unknown
- 1977-01-31 MX MX779660U patent/MX6932E/es unknown
- 1977-02-02 IL IL60476A patent/IL60476A/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-02-02 IL IL51370A patent/IL51370A/xx unknown
- 1977-02-09 NL NLAANVRAGE7701346,A patent/NL170435C/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-02-24 CH CH234077A patent/CH637993A5/de not_active IP Right Cessation
- 1977-02-25 DD DD7700197560A patent/DD130789A5/xx unknown
- 1977-02-28 FR FR7705773A patent/FR2345464A1/fr active Granted
- 1977-03-01 PL PL1977218427A patent/PL113212B1/pl unknown
- 1977-03-04 PL PL1977196355A patent/PL111029B1/pl unknown
-
1980
- 1980-07-03 IL IL60476A patent/IL60476A0/xx unknown
-
1982
- 1982-12-09 CH CH718582A patent/CH638563A5/de not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-03-16 JP JP59049352A patent/JPS60133884A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL196355A1 (pl) | 1978-01-02 |
| CH638563A5 (en) | 1983-09-30 |
| FR2345464B1 (ja) | 1982-06-04 |
| IL60476A (en) | 1981-06-29 |
| DD130789A5 (de) | 1978-05-03 |
| NL170435B (nl) | 1982-06-01 |
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| MX6933E (es) | 1986-12-05 |
| PL111029B1 (en) | 1980-08-30 |
| MX6932E (es) | 1986-12-05 |
| DE2703645B2 (de) | 1980-08-07 |
| IL51370A (en) | 1981-06-29 |
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| DE2703645A1 (de) | 1977-09-08 |
| MX4503E (es) | 1982-05-24 |
| PL113212B1 (en) | 1980-11-29 |
| IL60476A0 (en) | 1980-09-16 |
| FR2345464A1 (fr) | 1977-10-21 |
| IL51370A0 (en) | 1977-04-29 |
| CH637993A5 (en) | 1983-08-31 |
| JPS60133884A (ja) | 1985-07-17 |
| DE2703645C3 (de) | 1981-11-12 |
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