JPS6141549B2 - - Google Patents
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- JPS6141549B2 JPS6141549B2 JP53079723A JP7972378A JPS6141549B2 JP S6141549 B2 JPS6141549 B2 JP S6141549B2 JP 53079723 A JP53079723 A JP 53079723A JP 7972378 A JP7972378 A JP 7972378A JP S6141549 B2 JPS6141549 B2 JP S6141549B2
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- protoplasts
- exchange
- gene
- streptomyces
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
- C12N15/03—Bacteria
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
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- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、ストレプトミセス属における遺伝子
交換をプロトプラスト融合によつて容易に行う新
規な方法に関する。 自然突然変異と関連する遺伝子交換は、微生物
が特定の環境に適応するのに必要な変異能を維持
するために天然に備わつているひとつの方法であ
る。遺伝子交換は、少くとも同一種間では明らか
に自然界で起つている。微生物における遺伝子交
換を行うために実験室で用いられている古典的手
段には、接合（conjugation）、DNA形質転換
（DNA transformation）およびフアージによる形
質導入（phage−mediated transduction）があ
る。この交換には、染色体内または染色体外遺伝
物質のいずれかが含まれ得る。遺伝子交換の結
果、遺伝子組換え、プラスミツド移動、異核共存
体（heterokaryon）形成または部分二部体
（merodiploid）形成によりハイブリツド株が得ら
れる。効果的な自然交配様式を持つていない微生
物のための効率的遺伝子交換の実験条件を見出す
ことは極めて困難であり、ある場合には成功しな
いこともあり得る。DNA形質転換の難点は、
DNAの取込み（uptake）に対する物理的および
酵素的障壁（たとえば、細胞膜、核酸分解酵素に
よる）である。フアージによる形質導入において
は、目的とする微生物への形質導入能を有するウ
イルスの単離と同定が、形質導入系の開発上の主
な難点となつている。微生物における遺伝子交換
を行うための一般的方法が未だなく、一般的理論
も不充分であることが、多くの微生物における遺
伝子交換の効果的手段の開発を妨げている。 しかしながら、遺伝子交換は、今なお、産業上
かつ治療上重要な代謝産物、たとえば抗生物質を
産生する微生物種における変異能増進のための重
要な一手段であることに変りはない。この手段の
産業上の応用には、抗生物質、抗腫瘍物質あるい
はその他の有用な性質を有する微生物生産物のよ
うな特定の代謝産物を高濃度に産生する種を作り
出すこと、有用な性質を有する新規代謝産物を産
生するハイブリツド種を作り出すことが含まれ
る。 細胞融合により遺伝物質の交換を行うためのひ
とつの新しい方法が、ある種の真核微生物を用い
た遺伝研究で成功している。細胞融合を利用する
遺伝子交換が原核微生物で成功したのは、シエフ
アー等およびフオーダーとアルフオルデイが、バ
チルス属のプロトプラスト融合と細胞再生の手段
を考案した後のことであつた〔P.Schaeffer et
al.、Proc.Nat.Acad.Sci.、73、2151−2155
（1976）；K.Fodor and L.Alfoldi、Proc.Nat.
Acad.Sci.、73 2147−2150（1976）〕。 本発明者は、原核性（procaryotic）のストレ
プトミセス属においてプロトプラスト融合による
遺伝子交換が可能であることを見出した。この発
見は、産業上重要なストレプトミセス属の同種間
および異種間の遺伝子交換を容易に行う一般的で
かつそれ故に重要な手段の利用を可能にするもの
である。本発明者は、またストレプトミセス属と
これと近縁なノカルジア属の間でプロトプラスト
融合による遺伝子交換が可能であることも見出し
た。アクチノミセス科に属する他の属間における
プロトプラスト融合による遺伝子交換もまた本発
明の一部をなすものである。 本発明者は、プロトプラスト融合によつてスト
レプトミセス属における遺伝子交換を容易に行う
ことができることを見出した。本発明方法は、次
の多段工程を含むものである。 (1) プロトプラストの形成と安定化 (2) プロトプラスト融合による遺伝子交換 (3) 融合したプロトプラストからの細胞再生 再生されたハイブリツド株（組換株を含む）は
次いで特定の所望性質についてスクリーニングす
る。所望の性質には、たとえば抗生物質や抗腫瘍
物質のような既知代謝産物をより高収率で生産し
あるいはより容易に回収することを含む。ハイブ
リツド種の場合の所望の性質には、新規な有用代
謝産物を産生することあるいは既知代謝産物の産
生を改善することが含まれる。 本発明は、プロトプラスト融合の手法を用いる
ことを特徴とするストレプトミセス属およびノカ
ルジア属における遺伝子交換を容易に行う方法を
提供する。この新規方法は、(1) プロトプラスト
の形成と安定化、(2) プロトプラスト融合による
遺伝子交換、および(3) 融合したプロトプラスト
からの細胞再生、の各工程からなる多段工法であ
る。 プロトプラストの形成および安定化は、(a) リ
ゾチームに感作させる条件下で細胞を増殖させ、
(b) この細胞を高張緩衝液中、リゾチームで処理
して細胞壁を除去し、プロトプラストを形成させ
ることによつて行われる。細胞壁の除去は、半抑
制（subinhibitory）濃度のグリシンを含む液体
培地中で、細胞を数世代増殖させることによつて
行われる。グリシンの存在下に増殖させると、ス
トレプトミセスの細胞壁は、酵素リゾチームに対
して感受性となる〔M.Okanishi、et al、J.Gen.
Microbiol.、80、389〜400（1974）〕。グリシンが
存在しない条件での細胞増殖も多くの場合にプロ
トプラストを形成するが、そのプロトプラスト形
成は遅く、効率も劣る。 この培地は、適当な液体培地であればよく、た
とえば栄養ブロス（nutrient broth）あるいはト
リプチカーゼ・ソイ・ブロス（trypticase soy
broth、TSB）が用いられる。グリシンの存在下
に増殖させた後、その細胞を処理してプロトプラ
ストを形成させる。これは、通常菌体を洗浄し、
高張培地に再懸濁させることによつて行われる。
適切な高張培地は、たとえばシヨ糖、マグネシウ
ムイオン、カルシウムイオンおよびリン酸を含
む。Okanishi等（同上によつて記載されている
培地Ｐは、適切な高張培地の一例である。この細
胞懸濁液にリゾチーム（１〜２mg/ml）を加え、
凡そ30〜37℃で、プロトプラストの形成が完了す
るまで培養する（0.5〜2.0時間）。プロトプラス
ト形成の完了は、位相差顕微鏡で監視できる。 プロトプラスト融合は、二つの親生物のプロト
プラストを混合し、親プロトプラストの融合を誘
導することによつて行われる。親生物は、同種の
株（種内）であつてもよいし、異種の株（種間）
であつてもよい。このプロトプラスト混合物を遠
心分離し、得られたプロトプラストペレツトを少
量の高張緩衝液に再懸濁する。融合は、親プロト
プラストをポリエチレングリコール（PEG）で
処理することによつて促進される。たとえば、
PEGの高張緩衝液溶液（40％溶液が好ましい）
をプロトプラスト再懸濁液に加えることができ
る。得られた融合プロトプラストは、高張寒天培
地（たとえば、Okanishi等（同上）の培地R2ま
たはその改変培地）上で培養する。 融合プロトプラストからの細胞再生は、適当な
温度で高張寒天培地上で融合プロトプラストを培
養することによつて行われる。適当な温度は、親
株が生育する至適温度から決定できる。遺伝子交
換を確認するには、栄養要求性、抗生物質耐性の
ような適当な遺伝指標を有する株を用いるのが好
ましい。 この際、特に種間遺伝交雑においては、予めプ
ロトプラストの再生に最も適した細胞の生理的生
育状態を定めておくのがよい。プロトプラストの
再生率は、プロトプラスト融合を行う前の細胞の
生理状態によつて、＜10-5から５×10-1の間で変
動する。本発明と同日に特許出願した発明〔発明
者 バルツ、発明の名称 効率のよい細胞再生と
行い得るストレプトミセスのプロトプラストを得
る方法〕は、生育し得る細胞を効率よく再生させ
るストレプトミセスのプロトプラストを得る方法
に関する。この方法には、プロトプラストの復帰
のための至適状態を決定することが含まれてい
る。この至適状態、すなわち最も有効な状態は、
指数増殖期と静止増殖期との間の転換期である。 この最も有効な生育状態は、ストレプトミセス
の生育サイクルを監視することによつて決定でき
る。この決定は、濁度法によつて、600nｍにお
ける吸光（A600）の光学密度（OD）の変化を測
定することによつて簡便に行われる。一般に、ス
トレプトミセスの種は、可溶性培地において細胞
濃度が低い（A600が1.5未満）ときは、急速な指
数増殖を行い、約1.5時間から数時間のうちに細
胞数が２倍となる。細胞増殖がA600値で1.5ない
し4.0に達すると細胞は、静止増殖期の前の転換
期に入る。この転換期は２〜24時間継続し、この
間に、種によつて異なるが、細胞の量は50％ない
し６倍増となる。 仮性ハイブリツド株（組換体を含む）は、次い
で再クローンし、標準的方法で遺伝的検査を行つ
て、両親からの遺伝子を有することを確認する。
真性ハイブリツド株（組換体を含む）は、さらに
所望の有利な性質について検査する。 通常、ストレプトミセス属とノカルジア属の間
では、自然の相反性のため、遺伝子交換は非現実
的であるかまたは不可能であるが、本発明の方法
はこの属間交換にも有用である。本方法は、デオ
キシリボ核酸（DNA）の交換または組換を高い
確率で行うものである。本方法は、同種内の変異
株同志の遺伝子交換に特に有用であるが、種間遺
伝子移送も容易に行う。本方法は、抗生物質を産
生するストレプトミセスの株を創生するうえで、
特に重要である。 例えば、この方法をストレプトミセス・フラジ
エ菌株に適用すると、１mlあたり104〜105の組換
確率、あるいは１個の生存プロトプラストあたり
104〜10-3の頻度が容易に得られた。本発明者の
研究室では、以前に標準法に従つてストレプトミ
セス・フラジエの遺伝子交換を行つたが組換クロ
ーンを見出すことが出来ず（107ml中１以下）、不
成功に終つた〔D.A.Hopwood、Bact.Rev.、31、
373〜403（1976）〕。従つて、本発明の手段によ
り、特定のストレプトミセス・フラジエの組換確
率は、少なくとも104倍増加することになる。 本発明は、通常非自動伝播性の染色体外DNA
（プラスミツド）をストレプトミセス属に属する
ある種から他の種へ伝播させる際にも有用であ
る。従つて適切な条件下では、抗生物質の合成あ
るいはその制御のためのプラスミツドにコード化
された遺伝要素を、抗生物質合成能力の不足して
いる菌株から、よりすぐれた菌株へ移動させるこ
とが出来る。 さらに、本発明の方法はストレプトミセス属と
密接に関連したノカルジア属にも拡張出来る。本
発明者はノカルジア属内は勿論のこと、ストレプ
トミセス属とノカルジア属との間でも、プロトプ
ラスト融合によつて誘導される遺伝子伝播が行わ
れ得ることを見出した。 本発明は、産業上の重要性から、ストレプトミ
セス属およびノカルジア属に属する種に対して特
に有用である。ストレプトミセス属およびノカル
ジア属に属する種では、アミノグリコシド、マク
ロリド、β−ラクタム、ポリエーテルおよびグリ
コペプチドのような抗生物質を産生する種が好ま
しい。少なくとも一方の親株がストレプトミセス
属もしくはノカルジア属に属する抗生物質産生菌
である場合が、本発明に用いて遺伝子交換を行わ
せるのに好ましい例である。例えば、一方の親株
がストレプトミセス属もしくはノカルジア属に属
するマクロリド産生菌、アミノグリコシド産生
菌、β−ラクタム産生菌、ポリエーテル産生菌、
またはグリコペプチド産生菌である場合が遺伝子
交換を行わせる好ましい例である。 ストレプトミセス属（S.）に属するアミノグリ
コキシド産生菌としては、以下のものが知られて
いる： S.カナマイセチカス（カナマイシン）、S.クレ
ストミセチカス（アミノシジン）、S.グリセオフ
ラブス（抗生物質MA1267）、S.ミクロスポレウ
ス（抗生物質SF−767）、S.リボシジフイカス
（抗生物質SF−733）、S.フラボペルシカス（スペ
クチノマイシン）、S.スペクタビリス（アクチノ
スペクタシン）、S.リモ−サス・フオルマ・パロ
モマイシナス（パロモマイシンン、カテヌリ
ン）、S.フラジエ変異イタリカス（アミノシジ
ン）、S.ブルエンシス変異ブルエンシス（ブルエ
スソマイシン）、S.カテヌラエ（カテヌリン）、S.
オリボレチカリ変異セルロフイラス（デストマイ
シンＡ）、S.テネブラリウス（トブラマイシン、
アプラマイシン）、S.ラベンドウラ（ネオマイシ
ン）、S.アルボグリセオルス（ネオマイシン）、S.
アルブス変異メタマイシヌス（メタマイシン）、
S.ヒグロスコピカス変異サガミエンシス（スペク
チノマイシン）、S.ビキニエンシス（ストレプト
マイシン）、S.グリセウス（ストレプトマイシ
ン）、S.エリスクロモゲネス変異ナルトエンシス
（ストレプトマイシン）、S.ポーレンシス（ストレ
プトマイシン）、S.ガルブス（ストレプトマイシ
ン）、S.ラメウス（ストレプトマイシン）、S.オリ
バセウス（ストレプトマイシン）、S.アシユウエ
ンシス（ストレプトマイシン）、S.ヒグロスコピ
カス変異リモネウス（バリダマイシン）、S.リモ
フアシエンス（デストマイシン）、S.ヒグロスコ
ピカス・フオルマ・グレボサス（グレボマイシ
ン）、S.フラジエ（ヒブリマイシン、ネオマイシ
ン）、S.ユーロシデイカス（抗生物質A16316−
Ｃ）、S.アカカヌス（Ｎ−メチルヒグロマイシン
Ｂ）、S.クリスタリナス（ヒグロマイシンＡ）、S.
ノボトエンシス（ヒグロマイシン）、S.ヒグロス
コピカス（ヒグロマイシン）、S.アトロフアシエ
ンス（ヒグロマイシン）、S.カスガスピナス（カ
スガマイシン）、S.カスガエンシス（カスガマイ
シン）、S.ネトロプシス（抗生物質LL−AM31）、
S.リビダス（リビドマイシン）、S.ホフエンシス
（セルドマイシン錯塩）、およびS.カンナス（リボ
シル・パロマミン）。 ストレプトミセス（S.）およびノカルジア（N.
）属に属するマクロリド抗生物質産生菌の具体例
には以下のものが含まれる： N.ガードネリ（プロアクチノマイシン）、N.メ
センテリカ（メセンテリン）、S.カエレスチス
（抗生物質M188）、S.プラテンシス（プラテノマ
イシン）、S.ロシエイ変異ボリビリス（抗生物質
T2636）、S.ベネズエラ（メチマイシン）、S.グリ
セオフスカス（バンドリン）、S.ナルボネンシス
（ジヨサマイシン、ナルボマイシン）、S.フンギシ
デイカス（抗生物質NA−181）、S.グリセオフア
シエンス（抗生物質PA133A、Ｂ）、S.ロセオシ
トレウス（アルボサイクリン）、S.ブルネオグリ
セウス（アルボサイクリン）、S.ロセオクロモゲ
ネス（アルボサイクリン）、S.シネロクロモゲネ
ス（シネロマイシンＢ）、S.アルブス（アルボミ
セチン）、S.フエレウス（アルゴマイシン、ピク
ロマイシン）、S.ロシエイ（ランカシジン、ボレ
リジン）、S.ビオラセオニゲル（ランカシジン）
S.グリセウス（ボレリジン）、S.マイゼウス（イ
ングラマイシン）、S.アルブス変異コイルミセチ
カス（コレイマイシン）、S.ミカロフアシエンス
（アセチル−ロイコマイシン、エスピノマイシ
ン）、S.ヒグロスコピカス（トウリマイシン、レ
ロマイシン、マリドマイシン、チロシン、カルボ
マイシン）、S.グリセオスピラリス（レロマイシ
ン）、S.ラベンジユラ（アルドガマイシン）、S.リ
モサス（ニユートラマイシン）、S.デルタ（デル
タマイシン）、S.フンギシデイカス変異エスピノ
ミセチカス（エスピノマイシン）、S.フルデイシ
デイカス（ミデカマイシン）、S.アンボフアシエ
ンス（フオロマシジンＤ）、S.ユーロシデイカス
（メチマイシン）、S.グリセオルス（グリセオマイ
シン）、S.フラボクロモゲネス（アマロマイシ
ン、シンコマイシン）、S.フイムブリアトウス
（アマロマイシン）、S.フアスシクルス（アマロマ
イシン）、S.エリスレウス（エリスロマイシン）、
S.アンテイビオテイカス（オレアンドマイシ
ン）、S.オリボクロモゲネス（オレアンドマイシ
ン）、S.スピニクロモゲネス変異スラガオエンシ
ス（クジマイシン）、S.キタサトエンシス（ロイ
コマイシン）、S.ナルボネンシス変異ジヨサミセ
チカス（ロイコマイシンA3、ジヨサマイシン）、
S.アルボグリセオルス（ミコノマイシン）、S.ビ
キニエンシス（カルコマイシン）、S.シラトウス
（シラマイシン）、S.ジヤカルテンシス（ニダマイ
シン）、S.ユーリテルマス（アンゴラマイシン）、
S.フラジエ（チロシン、ラクテノシン、マクロシ
ン）、S.ゴシキエンシス（バンダマイシン）、S.グ
リセオフラブス（アクマイシン）、S.ハルステジ
（カルボマイシン）、S.テンダ（カルボマイシ
ン）、S.マクロスポレウス（カルボマイシン）S.
テルモトレランス（カルボマイシン）およびS.ア
ルビレチクリ（カルボマイシン）。 ストレプトミセス属（S.）およびノカルジア属
（N.）に属するβ−ラクタム抗生物質産生菌の具
体例としては、以下のものが知られている： S.リツプマニー（A16884、MM4550、
MM13902）、N.ユニフオルミス（ノカルジシ
ン）、S.クラブリゲルス（A16886B、クラブラン
酸）、S.ラクタムジユランス（セフアマイシン
Ｃ）、S.グリセウス（セフアマイシンＡ、Ｂ）、S.
ヒグロスコピカス（デアセトキシセフアロスポリ
ンＣ）、S.ワダヤメンシス（WS−3442−Ｄ）、S.
カルトレウシス（SF1623）、S.ヘテロモルフアス
とS.パナイエンシス（C2081X）、S.シナモネンシ
ス、S.フイムブリアトウス、S.ハルステジ、S.ロ
シエイとS.ビリドクロマゲネス（セフアマイシン
Ａ、Ｂ）、S.カツトレア（チエナマイシン）、およ
びS.オリバセウス、S.フラボビレンス、S.フラブ
ス、S.フルボビリジス、S.アルジエンテオルスと
S.シオエンシス（MM4550とMM13902）。 ストレプトミセス属（S.）に属するポリエーテ
ル抗生物質産生菌の具体例としては、以下のもの
が知られている： S.アルブス（A204、A28695AとＢ、サリノマ
イシン）、S.ヒグロスコピカス（A218、エメリシ
ド、DE3936）、A120A、A28695AとＢ、エテロマ
イシン、ジアネマイシン）、S.グリセウス（グリ
ソリキシン）、S.コングロバトウス（イオノマイ
シン）、S.ユーロシジカス変異アステロシジカス
（レイドロマイシン）、S.ラサリエンシス（ラサロ
シド）、S.リボシジフイカス（ロノマイシン）、S.
カカオイ変異アソエンシス（リソセリン）、S.シ
ナモネンシス（モネンシン）、S.オーレオフアシ
エンス（ナラシン）S.ガリナカウス
（RP30504）、S.ロングウデンシス（リソセリ
ン）、S.フラベオルス（CP38936）、S.ムタビリス
（Ｓ−11743a）およびS.ビオラセオニゲル（ニジ
エリシン）。 ストレプトミセス属（S.）およびノカルジア属
（N.）に属するグリコペプチド抗生物質産生菌の
具体例としては、以下のものが知られている： N.フルクチフエリ（リストマイシン）、N.ルリ
ダ（リストセチン）、N.アクチノイデス（アクチ
ノイジン）、S.オリエンタリスとS.ハラノマシエ
ンシス（バンコマイシン）、S.カンデイダス（Ａ
−35512、アボパルシン）およびS.エブロスポレ
ウス（LL−AM374）。 本発明の操作をさらに十分に説明するために、
以下の実施例を提供する。 実施例 １ ストレプトミセス・フラジエ（Streptomyces
fradiae）栄養要求変異株Al（leu）およびD6
（met）を使用した。0.4％グリシンと0.4％マルト
ースを含むトリプチカーゼ・ソイ・ブロス
（TSB）50mlに、栄養細胞（vegetative cells）の
液体窒素懸濁液0.5mlを別々に接種した。これを
通気性条件下（250rpm、振幅2.5cm）、37℃にお
いて18時間培養した。菌体は遠心分離器を用いて
洗浄し、リゾチーム１mg/mlを含む培地Ｐ（スク
ロース103ｇ、硫酸カリウム0.25ｇ、微量成分溶
液*２ml、リン酸二水素カリウム0.05ｇ、塩化マ
グネシウム６水和物2.03ｇ、塩化カルシウム２水
和物3.68ｇ、0.25M−TES**緩衝液（PH7.2）
100ml、以上を蒸留水で全量１とする；*１
当り塩化亜鉛40mg、塩化第二鉄６水和物200mg、
塩化第二銅２水和物10mg、塩化マンガン４水和物
10mg、ホウ酸ナトリウム10水和物10mg及びモリブ
デン酸アンモニウム４水和物10mgを含有する；*
＊Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタスルホン酸；M.Okanishi et al.、同
上；以下同様）20mlに再懸濁した。懸濁した菌体
細胞を30℃において２時間培養し、得られた二つ
のプロトプラストを混合して遠心分離に付し、培
地P1mlに再懸濁した。種々の濃度のPEG6000の
溶液（0.9ml）を調製し、各々をプロトプラスト
懸濁液0.1mlに加えて細胞膜融合を誘発させた。
融合させたプロトプラストは直ちに倍地Ｐに稀釈
し、改良型R2培地（Okanishi et al.、同上、20
％シヨ糖を加え、カザミノ酸は含まれていない）
にのせた。結果は表１に総括した。
交換をプロトプラスト融合によつて容易に行う新
規な方法に関する。 自然突然変異と関連する遺伝子交換は、微生物
が特定の環境に適応するのに必要な変異能を維持
するために天然に備わつているひとつの方法であ
る。遺伝子交換は、少くとも同一種間では明らか
に自然界で起つている。微生物における遺伝子交
換を行うために実験室で用いられている古典的手
段には、接合（conjugation）、DNA形質転換
（DNA transformation）およびフアージによる形
質導入（phage−mediated transduction）があ
る。この交換には、染色体内または染色体外遺伝
物質のいずれかが含まれ得る。遺伝子交換の結
果、遺伝子組換え、プラスミツド移動、異核共存
体（heterokaryon）形成または部分二部体
（merodiploid）形成によりハイブリツド株が得ら
れる。効果的な自然交配様式を持つていない微生
物のための効率的遺伝子交換の実験条件を見出す
ことは極めて困難であり、ある場合には成功しな
いこともあり得る。DNA形質転換の難点は、
DNAの取込み（uptake）に対する物理的および
酵素的障壁（たとえば、細胞膜、核酸分解酵素に
よる）である。フアージによる形質導入において
は、目的とする微生物への形質導入能を有するウ
イルスの単離と同定が、形質導入系の開発上の主
な難点となつている。微生物における遺伝子交換
を行うための一般的方法が未だなく、一般的理論
も不充分であることが、多くの微生物における遺
伝子交換の効果的手段の開発を妨げている。 しかしながら、遺伝子交換は、今なお、産業上
かつ治療上重要な代謝産物、たとえば抗生物質を
産生する微生物種における変異能増進のための重
要な一手段であることに変りはない。この手段の
産業上の応用には、抗生物質、抗腫瘍物質あるい
はその他の有用な性質を有する微生物生産物のよ
うな特定の代謝産物を高濃度に産生する種を作り
出すこと、有用な性質を有する新規代謝産物を産
生するハイブリツド種を作り出すことが含まれ
る。 細胞融合により遺伝物質の交換を行うためのひ
とつの新しい方法が、ある種の真核微生物を用い
た遺伝研究で成功している。細胞融合を利用する
遺伝子交換が原核微生物で成功したのは、シエフ
アー等およびフオーダーとアルフオルデイが、バ
チルス属のプロトプラスト融合と細胞再生の手段
を考案した後のことであつた〔P.Schaeffer et
al.、Proc.Nat.Acad.Sci.、73、2151−2155
（1976）；K.Fodor and L.Alfoldi、Proc.Nat.
Acad.Sci.、73 2147−2150（1976）〕。 本発明者は、原核性（procaryotic）のストレ
プトミセス属においてプロトプラスト融合による
遺伝子交換が可能であることを見出した。この発
見は、産業上重要なストレプトミセス属の同種間
および異種間の遺伝子交換を容易に行う一般的で
かつそれ故に重要な手段の利用を可能にするもの
である。本発明者は、またストレプトミセス属と
これと近縁なノカルジア属の間でプロトプラスト
融合による遺伝子交換が可能であることも見出し
た。アクチノミセス科に属する他の属間における
プロトプラスト融合による遺伝子交換もまた本発
明の一部をなすものである。 本発明者は、プロトプラスト融合によつてスト
レプトミセス属における遺伝子交換を容易に行う
ことができることを見出した。本発明方法は、次
の多段工程を含むものである。 (1) プロトプラストの形成と安定化 (2) プロトプラスト融合による遺伝子交換 (3) 融合したプロトプラストからの細胞再生 再生されたハイブリツド株（組換株を含む）は
次いで特定の所望性質についてスクリーニングす
る。所望の性質には、たとえば抗生物質や抗腫瘍
物質のような既知代謝産物をより高収率で生産し
あるいはより容易に回収することを含む。ハイブ
リツド種の場合の所望の性質には、新規な有用代
謝産物を産生することあるいは既知代謝産物の産
生を改善することが含まれる。 本発明は、プロトプラスト融合の手法を用いる
ことを特徴とするストレプトミセス属およびノカ
ルジア属における遺伝子交換を容易に行う方法を
提供する。この新規方法は、(1) プロトプラスト
の形成と安定化、(2) プロトプラスト融合による
遺伝子交換、および(3) 融合したプロトプラスト
からの細胞再生、の各工程からなる多段工法であ
る。 プロトプラストの形成および安定化は、(a) リ
ゾチームに感作させる条件下で細胞を増殖させ、
(b) この細胞を高張緩衝液中、リゾチームで処理
して細胞壁を除去し、プロトプラストを形成させ
ることによつて行われる。細胞壁の除去は、半抑
制（subinhibitory）濃度のグリシンを含む液体
培地中で、細胞を数世代増殖させることによつて
行われる。グリシンの存在下に増殖させると、ス
トレプトミセスの細胞壁は、酵素リゾチームに対
して感受性となる〔M.Okanishi、et al、J.Gen.
Microbiol.、80、389〜400（1974）〕。グリシンが
存在しない条件での細胞増殖も多くの場合にプロ
トプラストを形成するが、そのプロトプラスト形
成は遅く、効率も劣る。 この培地は、適当な液体培地であればよく、た
とえば栄養ブロス（nutrient broth）あるいはト
リプチカーゼ・ソイ・ブロス（trypticase soy
broth、TSB）が用いられる。グリシンの存在下
に増殖させた後、その細胞を処理してプロトプラ
ストを形成させる。これは、通常菌体を洗浄し、
高張培地に再懸濁させることによつて行われる。
適切な高張培地は、たとえばシヨ糖、マグネシウ
ムイオン、カルシウムイオンおよびリン酸を含
む。Okanishi等（同上によつて記載されている
培地Ｐは、適切な高張培地の一例である。この細
胞懸濁液にリゾチーム（１〜２mg/ml）を加え、
凡そ30〜37℃で、プロトプラストの形成が完了す
るまで培養する（0.5〜2.0時間）。プロトプラス
ト形成の完了は、位相差顕微鏡で監視できる。 プロトプラスト融合は、二つの親生物のプロト
プラストを混合し、親プロトプラストの融合を誘
導することによつて行われる。親生物は、同種の
株（種内）であつてもよいし、異種の株（種間）
であつてもよい。このプロトプラスト混合物を遠
心分離し、得られたプロトプラストペレツトを少
量の高張緩衝液に再懸濁する。融合は、親プロト
プラストをポリエチレングリコール（PEG）で
処理することによつて促進される。たとえば、
PEGの高張緩衝液溶液（40％溶液が好ましい）
をプロトプラスト再懸濁液に加えることができ
る。得られた融合プロトプラストは、高張寒天培
地（たとえば、Okanishi等（同上）の培地R2ま
たはその改変培地）上で培養する。 融合プロトプラストからの細胞再生は、適当な
温度で高張寒天培地上で融合プロトプラストを培
養することによつて行われる。適当な温度は、親
株が生育する至適温度から決定できる。遺伝子交
換を確認するには、栄養要求性、抗生物質耐性の
ような適当な遺伝指標を有する株を用いるのが好
ましい。 この際、特に種間遺伝交雑においては、予めプ
ロトプラストの再生に最も適した細胞の生理的生
育状態を定めておくのがよい。プロトプラストの
再生率は、プロトプラスト融合を行う前の細胞の
生理状態によつて、＜10-5から５×10-1の間で変
動する。本発明と同日に特許出願した発明〔発明
者 バルツ、発明の名称 効率のよい細胞再生と
行い得るストレプトミセスのプロトプラストを得
る方法〕は、生育し得る細胞を効率よく再生させ
るストレプトミセスのプロトプラストを得る方法
に関する。この方法には、プロトプラストの復帰
のための至適状態を決定することが含まれてい
る。この至適状態、すなわち最も有効な状態は、
指数増殖期と静止増殖期との間の転換期である。 この最も有効な生育状態は、ストレプトミセス
の生育サイクルを監視することによつて決定でき
る。この決定は、濁度法によつて、600nｍにお
ける吸光（A600）の光学密度（OD）の変化を測
定することによつて簡便に行われる。一般に、ス
トレプトミセスの種は、可溶性培地において細胞
濃度が低い（A600が1.5未満）ときは、急速な指
数増殖を行い、約1.5時間から数時間のうちに細
胞数が２倍となる。細胞増殖がA600値で1.5ない
し4.0に達すると細胞は、静止増殖期の前の転換
期に入る。この転換期は２〜24時間継続し、この
間に、種によつて異なるが、細胞の量は50％ない
し６倍増となる。 仮性ハイブリツド株（組換体を含む）は、次い
で再クローンし、標準的方法で遺伝的検査を行つ
て、両親からの遺伝子を有することを確認する。
真性ハイブリツド株（組換体を含む）は、さらに
所望の有利な性質について検査する。 通常、ストレプトミセス属とノカルジア属の間
では、自然の相反性のため、遺伝子交換は非現実
的であるかまたは不可能であるが、本発明の方法
はこの属間交換にも有用である。本方法は、デオ
キシリボ核酸（DNA）の交換または組換を高い
確率で行うものである。本方法は、同種内の変異
株同志の遺伝子交換に特に有用であるが、種間遺
伝子移送も容易に行う。本方法は、抗生物質を産
生するストレプトミセスの株を創生するうえで、
特に重要である。 例えば、この方法をストレプトミセス・フラジ
エ菌株に適用すると、１mlあたり104〜105の組換
確率、あるいは１個の生存プロトプラストあたり
104〜10-3の頻度が容易に得られた。本発明者の
研究室では、以前に標準法に従つてストレプトミ
セス・フラジエの遺伝子交換を行つたが組換クロ
ーンを見出すことが出来ず（107ml中１以下）、不
成功に終つた〔D.A.Hopwood、Bact.Rev.、31、
373〜403（1976）〕。従つて、本発明の手段によ
り、特定のストレプトミセス・フラジエの組換確
率は、少なくとも104倍増加することになる。 本発明は、通常非自動伝播性の染色体外DNA
（プラスミツド）をストレプトミセス属に属する
ある種から他の種へ伝播させる際にも有用であ
る。従つて適切な条件下では、抗生物質の合成あ
るいはその制御のためのプラスミツドにコード化
された遺伝要素を、抗生物質合成能力の不足して
いる菌株から、よりすぐれた菌株へ移動させるこ
とが出来る。 さらに、本発明の方法はストレプトミセス属と
密接に関連したノカルジア属にも拡張出来る。本
発明者はノカルジア属内は勿論のこと、ストレプ
トミセス属とノカルジア属との間でも、プロトプ
ラスト融合によつて誘導される遺伝子伝播が行わ
れ得ることを見出した。 本発明は、産業上の重要性から、ストレプトミ
セス属およびノカルジア属に属する種に対して特
に有用である。ストレプトミセス属およびノカル
ジア属に属する種では、アミノグリコシド、マク
ロリド、β−ラクタム、ポリエーテルおよびグリ
コペプチドのような抗生物質を産生する種が好ま
しい。少なくとも一方の親株がストレプトミセス
属もしくはノカルジア属に属する抗生物質産生菌
である場合が、本発明に用いて遺伝子交換を行わ
せるのに好ましい例である。例えば、一方の親株
がストレプトミセス属もしくはノカルジア属に属
するマクロリド産生菌、アミノグリコシド産生
菌、β−ラクタム産生菌、ポリエーテル産生菌、
またはグリコペプチド産生菌である場合が遺伝子
交換を行わせる好ましい例である。 ストレプトミセス属（S.）に属するアミノグリ
コキシド産生菌としては、以下のものが知られて
いる： S.カナマイセチカス（カナマイシン）、S.クレ
ストミセチカス（アミノシジン）、S.グリセオフ
ラブス（抗生物質MA1267）、S.ミクロスポレウ
ス（抗生物質SF−767）、S.リボシジフイカス
（抗生物質SF−733）、S.フラボペルシカス（スペ
クチノマイシン）、S.スペクタビリス（アクチノ
スペクタシン）、S.リモ−サス・フオルマ・パロ
モマイシナス（パロモマイシンン、カテヌリ
ン）、S.フラジエ変異イタリカス（アミノシジ
ン）、S.ブルエンシス変異ブルエンシス（ブルエ
スソマイシン）、S.カテヌラエ（カテヌリン）、S.
オリボレチカリ変異セルロフイラス（デストマイ
シンＡ）、S.テネブラリウス（トブラマイシン、
アプラマイシン）、S.ラベンドウラ（ネオマイシ
ン）、S.アルボグリセオルス（ネオマイシン）、S.
アルブス変異メタマイシヌス（メタマイシン）、
S.ヒグロスコピカス変異サガミエンシス（スペク
チノマイシン）、S.ビキニエンシス（ストレプト
マイシン）、S.グリセウス（ストレプトマイシ
ン）、S.エリスクロモゲネス変異ナルトエンシス
（ストレプトマイシン）、S.ポーレンシス（ストレ
プトマイシン）、S.ガルブス（ストレプトマイシ
ン）、S.ラメウス（ストレプトマイシン）、S.オリ
バセウス（ストレプトマイシン）、S.アシユウエ
ンシス（ストレプトマイシン）、S.ヒグロスコピ
カス変異リモネウス（バリダマイシン）、S.リモ
フアシエンス（デストマイシン）、S.ヒグロスコ
ピカス・フオルマ・グレボサス（グレボマイシ
ン）、S.フラジエ（ヒブリマイシン、ネオマイシ
ン）、S.ユーロシデイカス（抗生物質A16316−
Ｃ）、S.アカカヌス（Ｎ−メチルヒグロマイシン
Ｂ）、S.クリスタリナス（ヒグロマイシンＡ）、S.
ノボトエンシス（ヒグロマイシン）、S.ヒグロス
コピカス（ヒグロマイシン）、S.アトロフアシエ
ンス（ヒグロマイシン）、S.カスガスピナス（カ
スガマイシン）、S.カスガエンシス（カスガマイ
シン）、S.ネトロプシス（抗生物質LL−AM31）、
S.リビダス（リビドマイシン）、S.ホフエンシス
（セルドマイシン錯塩）、およびS.カンナス（リボ
シル・パロマミン）。 ストレプトミセス（S.）およびノカルジア（N.
）属に属するマクロリド抗生物質産生菌の具体例
には以下のものが含まれる： N.ガードネリ（プロアクチノマイシン）、N.メ
センテリカ（メセンテリン）、S.カエレスチス
（抗生物質M188）、S.プラテンシス（プラテノマ
イシン）、S.ロシエイ変異ボリビリス（抗生物質
T2636）、S.ベネズエラ（メチマイシン）、S.グリ
セオフスカス（バンドリン）、S.ナルボネンシス
（ジヨサマイシン、ナルボマイシン）、S.フンギシ
デイカス（抗生物質NA−181）、S.グリセオフア
シエンス（抗生物質PA133A、Ｂ）、S.ロセオシ
トレウス（アルボサイクリン）、S.ブルネオグリ
セウス（アルボサイクリン）、S.ロセオクロモゲ
ネス（アルボサイクリン）、S.シネロクロモゲネ
ス（シネロマイシンＢ）、S.アルブス（アルボミ
セチン）、S.フエレウス（アルゴマイシン、ピク
ロマイシン）、S.ロシエイ（ランカシジン、ボレ
リジン）、S.ビオラセオニゲル（ランカシジン）
S.グリセウス（ボレリジン）、S.マイゼウス（イ
ングラマイシン）、S.アルブス変異コイルミセチ
カス（コレイマイシン）、S.ミカロフアシエンス
（アセチル−ロイコマイシン、エスピノマイシ
ン）、S.ヒグロスコピカス（トウリマイシン、レ
ロマイシン、マリドマイシン、チロシン、カルボ
マイシン）、S.グリセオスピラリス（レロマイシ
ン）、S.ラベンジユラ（アルドガマイシン）、S.リ
モサス（ニユートラマイシン）、S.デルタ（デル
タマイシン）、S.フンギシデイカス変異エスピノ
ミセチカス（エスピノマイシン）、S.フルデイシ
デイカス（ミデカマイシン）、S.アンボフアシエ
ンス（フオロマシジンＤ）、S.ユーロシデイカス
（メチマイシン）、S.グリセオルス（グリセオマイ
シン）、S.フラボクロモゲネス（アマロマイシ
ン、シンコマイシン）、S.フイムブリアトウス
（アマロマイシン）、S.フアスシクルス（アマロマ
イシン）、S.エリスレウス（エリスロマイシン）、
S.アンテイビオテイカス（オレアンドマイシ
ン）、S.オリボクロモゲネス（オレアンドマイシ
ン）、S.スピニクロモゲネス変異スラガオエンシ
ス（クジマイシン）、S.キタサトエンシス（ロイ
コマイシン）、S.ナルボネンシス変異ジヨサミセ
チカス（ロイコマイシンA3、ジヨサマイシン）、
S.アルボグリセオルス（ミコノマイシン）、S.ビ
キニエンシス（カルコマイシン）、S.シラトウス
（シラマイシン）、S.ジヤカルテンシス（ニダマイ
シン）、S.ユーリテルマス（アンゴラマイシン）、
S.フラジエ（チロシン、ラクテノシン、マクロシ
ン）、S.ゴシキエンシス（バンダマイシン）、S.グ
リセオフラブス（アクマイシン）、S.ハルステジ
（カルボマイシン）、S.テンダ（カルボマイシ
ン）、S.マクロスポレウス（カルボマイシン）S.
テルモトレランス（カルボマイシン）およびS.ア
ルビレチクリ（カルボマイシン）。 ストレプトミセス属（S.）およびノカルジア属
（N.）に属するβ−ラクタム抗生物質産生菌の具
体例としては、以下のものが知られている： S.リツプマニー（A16884、MM4550、
MM13902）、N.ユニフオルミス（ノカルジシ
ン）、S.クラブリゲルス（A16886B、クラブラン
酸）、S.ラクタムジユランス（セフアマイシン
Ｃ）、S.グリセウス（セフアマイシンＡ、Ｂ）、S.
ヒグロスコピカス（デアセトキシセフアロスポリ
ンＣ）、S.ワダヤメンシス（WS−3442−Ｄ）、S.
カルトレウシス（SF1623）、S.ヘテロモルフアス
とS.パナイエンシス（C2081X）、S.シナモネンシ
ス、S.フイムブリアトウス、S.ハルステジ、S.ロ
シエイとS.ビリドクロマゲネス（セフアマイシン
Ａ、Ｂ）、S.カツトレア（チエナマイシン）、およ
びS.オリバセウス、S.フラボビレンス、S.フラブ
ス、S.フルボビリジス、S.アルジエンテオルスと
S.シオエンシス（MM4550とMM13902）。 ストレプトミセス属（S.）に属するポリエーテ
ル抗生物質産生菌の具体例としては、以下のもの
が知られている： S.アルブス（A204、A28695AとＢ、サリノマ
イシン）、S.ヒグロスコピカス（A218、エメリシ
ド、DE3936）、A120A、A28695AとＢ、エテロマ
イシン、ジアネマイシン）、S.グリセウス（グリ
ソリキシン）、S.コングロバトウス（イオノマイ
シン）、S.ユーロシジカス変異アステロシジカス
（レイドロマイシン）、S.ラサリエンシス（ラサロ
シド）、S.リボシジフイカス（ロノマイシン）、S.
カカオイ変異アソエンシス（リソセリン）、S.シ
ナモネンシス（モネンシン）、S.オーレオフアシ
エンス（ナラシン）S.ガリナカウス
（RP30504）、S.ロングウデンシス（リソセリ
ン）、S.フラベオルス（CP38936）、S.ムタビリス
（Ｓ−11743a）およびS.ビオラセオニゲル（ニジ
エリシン）。 ストレプトミセス属（S.）およびノカルジア属
（N.）に属するグリコペプチド抗生物質産生菌の
具体例としては、以下のものが知られている： N.フルクチフエリ（リストマイシン）、N.ルリ
ダ（リストセチン）、N.アクチノイデス（アクチ
ノイジン）、S.オリエンタリスとS.ハラノマシエ
ンシス（バンコマイシン）、S.カンデイダス（Ａ
−35512、アボパルシン）およびS.エブロスポレ
ウス（LL−AM374）。 本発明の操作をさらに十分に説明するために、
以下の実施例を提供する。 実施例 １ ストレプトミセス・フラジエ（Streptomyces
fradiae）栄養要求変異株Al（leu）およびD6
（met）を使用した。0.4％グリシンと0.4％マルト
ースを含むトリプチカーゼ・ソイ・ブロス
（TSB）50mlに、栄養細胞（vegetative cells）の
液体窒素懸濁液0.5mlを別々に接種した。これを
通気性条件下（250rpm、振幅2.5cm）、37℃にお
いて18時間培養した。菌体は遠心分離器を用いて
洗浄し、リゾチーム１mg/mlを含む培地Ｐ（スク
ロース103ｇ、硫酸カリウム0.25ｇ、微量成分溶
液*２ml、リン酸二水素カリウム0.05ｇ、塩化マ
グネシウム６水和物2.03ｇ、塩化カルシウム２水
和物3.68ｇ、0.25M−TES**緩衝液（PH7.2）
100ml、以上を蒸留水で全量１とする；*１
当り塩化亜鉛40mg、塩化第二鉄６水和物200mg、
塩化第二銅２水和物10mg、塩化マンガン４水和物
10mg、ホウ酸ナトリウム10水和物10mg及びモリブ
デン酸アンモニウム４水和物10mgを含有する；*
＊Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタスルホン酸；M.Okanishi et al.、同
上；以下同様）20mlに再懸濁した。懸濁した菌体
細胞を30℃において２時間培養し、得られた二つ
のプロトプラストを混合して遠心分離に付し、培
地P1mlに再懸濁した。種々の濃度のPEG6000の
溶液（0.9ml）を調製し、各々をプロトプラスト
懸濁液0.1mlに加えて細胞膜融合を誘発させた。
融合させたプロトプラストは直ちに倍地Ｐに稀釈
し、改良型R2培地（Okanishi et al.、同上、20
％シヨ糖を加え、カザミノ酸は含まれていない）
にのせた。結果は表１に総括した。
【表】
【表】
前記交雑を、滅菌済みのPEG40％溶液を用い
て繰返すと、１mlあたり3.5×104の組換株数が結
果として得られた。組換株コロニーは非高張選択
倍地上に再クローンして安定性をテストした。 テストした10個の組換株の全部が原栄養求性で
安定であつた。（非選択的条件下で行つた継代培
養において選択された指標を失わなかつた）。 実施例 ２ ストレプトミセス・フラジエ（Streptomyces
fradiae）栄養要求変異株を使用した。少なくと
も一方の親株は、二種の栄養要求指標と一種のス
ペクチノマイシン（spc）耐性指標が含まれてい
た。遺伝指標を持つた各々のS.フラジエ菌株は、
0.4％グリシン含有のTSBで増殖させた。増殖し
た菌の光学濃度を比色計（Baush and lomb）を
用いて測定し、その値が600nｍにおいて1.5〜５
に達したならば、菌体を遠心分離によつて二回洗
浄し、培地Ｐ（M.Okanishi et al.、同上）に再
懸濁した。リゾチームを懸濁液に加え（１〜２
mg/ml）懸濁した菌体細胞を30℃あるいは34℃に
おいて0.5〜２時間培養した。得られたプロトプ
ラストを混合し（各々の親株懸濁液から0.5mlず
つ）、遠心分離によつて数回洗浄して培地Ｐに再
懸濁し、最後に培地P0.1mlに再懸濁した。40％
PEG6000の培地Ｐ溶液の0.9mlを最終懸濁液に加
えて細胞膜融合を誘発させた。プロトプラスト融
合は位相差顕微鏡で確認した。融合させたプロト
プラストは直ちに、以下に示す培地のいずれかに
稀釈した： 40％PEG含有培地Ｐ、培地Ｐ、または蒸留
水。 稀釈溶液は培地R2（スクロース103〜171ｇ、
硫酸カリウム0.25ｇ、微量成分溶液*２ml、リン
酸二水素カリウム0.05ｇ、塩化マグネシウム６水
和物10.12ｇ、塩化カルシウム２水和物2.95ｇ、
グルコース10ｇ、Ｌ−ブロリン３ｇ、カザミノ酸
0.1ｇ、0.25M−TES緩衝液（PH7.2）100ml、寒天
粉末22ｇ、以上を蒸留水で全量１とする；*実
施例１に同じ；M.Okanishi et al.、同上）にの
せ、組換と原栄要求性組換株の再生を観察した。
実験に用いたR2培地にはプロリンの代わりにア
スパラギンを窒素源として含ませた。組換株数
は、34℃において10〜24日間培養した後に数え
た。多くの支雑においては、原栄養要求組換株に
ついてさらに非選択指標（スペクチノマイシン耐
性）の存在をテストして、単一変異復帰株
（single mutant reversion artifacts）を除去し
た。さらにコントロールを実施して組換を確認し
た。組換株総数は混合したプロトプラストの原容
積に基いており、後者は血球計で直接計算したと
ころ一般に１mlあたり約108ないし約109個のプロ
トプラストを含んでいた。 プロトプラスト融合によるいくつかの遺伝的交
雑を表２に総括した。
て繰返すと、１mlあたり3.5×104の組換株数が結
果として得られた。組換株コロニーは非高張選択
倍地上に再クローンして安定性をテストした。 テストした10個の組換株の全部が原栄養求性で
安定であつた。（非選択的条件下で行つた継代培
養において選択された指標を失わなかつた）。 実施例 ２ ストレプトミセス・フラジエ（Streptomyces
fradiae）栄養要求変異株を使用した。少なくと
も一方の親株は、二種の栄養要求指標と一種のス
ペクチノマイシン（spc）耐性指標が含まれてい
た。遺伝指標を持つた各々のS.フラジエ菌株は、
0.4％グリシン含有のTSBで増殖させた。増殖し
た菌の光学濃度を比色計（Baush and lomb）を
用いて測定し、その値が600nｍにおいて1.5〜５
に達したならば、菌体を遠心分離によつて二回洗
浄し、培地Ｐ（M.Okanishi et al.、同上）に再
懸濁した。リゾチームを懸濁液に加え（１〜２
mg/ml）懸濁した菌体細胞を30℃あるいは34℃に
おいて0.5〜２時間培養した。得られたプロトプ
ラストを混合し（各々の親株懸濁液から0.5mlず
つ）、遠心分離によつて数回洗浄して培地Ｐに再
懸濁し、最後に培地P0.1mlに再懸濁した。40％
PEG6000の培地Ｐ溶液の0.9mlを最終懸濁液に加
えて細胞膜融合を誘発させた。プロトプラスト融
合は位相差顕微鏡で確認した。融合させたプロト
プラストは直ちに、以下に示す培地のいずれかに
稀釈した： 40％PEG含有培地Ｐ、培地Ｐ、または蒸留
水。 稀釈溶液は培地R2（スクロース103〜171ｇ、
硫酸カリウム0.25ｇ、微量成分溶液*２ml、リン
酸二水素カリウム0.05ｇ、塩化マグネシウム６水
和物10.12ｇ、塩化カルシウム２水和物2.95ｇ、
グルコース10ｇ、Ｌ−ブロリン３ｇ、カザミノ酸
0.1ｇ、0.25M−TES緩衝液（PH7.2）100ml、寒天
粉末22ｇ、以上を蒸留水で全量１とする；*実
施例１に同じ；M.Okanishi et al.、同上）にの
せ、組換と原栄要求性組換株の再生を観察した。
実験に用いたR2培地にはプロリンの代わりにア
スパラギンを窒素源として含ませた。組換株数
は、34℃において10〜24日間培養した後に数え
た。多くの支雑においては、原栄養要求組換株に
ついてさらに非選択指標（スペクチノマイシン耐
性）の存在をテストして、単一変異復帰株
（single mutant reversion artifacts）を除去し
た。さらにコントロールを実施して組換を確認し
た。組換株総数は混合したプロトプラストの原容
積に基いており、後者は血球計で直接計算したと
ころ一般に１mlあたり約108ないし約109個のプロ
トプラストを含んでいた。 プロトプラスト融合によるいくつかの遺伝的交
雑を表２に総括した。
【表】
プロトプラストを遠心分離に付し、さらに
PEGを含まない培地Ｐに再懸濁させると、実施
例１の場合と同様に、より低い濃度ではあるが、
有意濃度の組換株が得られた。このプロトプラス
ト融合の程度は、おそらく緩衝液中のカルシウム
イオンに依存する。プロトプラストを蒸留水中に
稀釈すると、組換株総数が100倍減少した。実際
上、テストに用いた全ての遺伝子組換株は、
metA arg指標を有する菌株からのspc指標を含
んでおり、metB菌株の復帰変異がデータとして
数えられた可能性はない。二重指標を有する栄養
要求性株は、原栄養要求性株に復帰することはな
いので、試験結果にはこの株の復帰変異は含まれ
ていない。表２に示されている他のコントロール
は、プロトプラスト融合の後に組換が行われるこ
とをさらに証明するものである。再クローンによ
り、すべての仮性組換体が安定であることが明ら
かにされた。実験に用いたS.フラジエ菌体は、抗
生物質タイロシン産生菌である。このS.フラジエ
の遺伝子組換株の多くは、タイロシン産生菌であ
つた。 実施例 ３ この実施例の遺伝子交雑にはストレプトミセ
ス・グリセオフスカス（Streptomyces
griseofuscus）を用いた。実験方法は次の二点を
除いて、実施例２に記載の方法と同じであつた。 (1) TBSには0.8％グリシンを加えた (2) 組換株コロニーは、34℃において７日間培養
した後に数えた。 結果は表３に総括した。１〜６の条件下では、
いずれもプロトプラストをPEGで処理し、培地
Ｐに稀釈し、そして倍地R2に接種した。いずれ
の場合も、遺伝子組換頻度はバツクグランドとし
ての原栄養要求株への復帰変異株の頻度よりも
103〜104倍高かつた。
PEGを含まない培地Ｐに再懸濁させると、実施
例１の場合と同様に、より低い濃度ではあるが、
有意濃度の組換株が得られた。このプロトプラス
ト融合の程度は、おそらく緩衝液中のカルシウム
イオンに依存する。プロトプラストを蒸留水中に
稀釈すると、組換株総数が100倍減少した。実際
上、テストに用いた全ての遺伝子組換株は、
metA arg指標を有する菌株からのspc指標を含
んでおり、metB菌株の復帰変異がデータとして
数えられた可能性はない。二重指標を有する栄養
要求性株は、原栄養要求性株に復帰することはな
いので、試験結果にはこの株の復帰変異は含まれ
ていない。表２に示されている他のコントロール
は、プロトプラスト融合の後に組換が行われるこ
とをさらに証明するものである。再クローンによ
り、すべての仮性組換体が安定であることが明ら
かにされた。実験に用いたS.フラジエ菌体は、抗
生物質タイロシン産生菌である。このS.フラジエ
の遺伝子組換株の多くは、タイロシン産生菌であ
つた。 実施例 ３ この実施例の遺伝子交雑にはストレプトミセ
ス・グリセオフスカス（Streptomyces
griseofuscus）を用いた。実験方法は次の二点を
除いて、実施例２に記載の方法と同じであつた。 (1) TBSには0.8％グリシンを加えた (2) 組換株コロニーは、34℃において７日間培養
した後に数えた。 結果は表３に総括した。１〜６の条件下では、
いずれもプロトプラストをPEGで処理し、培地
Ｐに稀釈し、そして倍地R2に接種した。いずれ
の場合も、遺伝子組換頻度はバツクグランドとし
ての原栄養要求株への復帰変異株の頻度よりも
103〜104倍高かつた。
【表】
実施例 ４
ストレプトミセス・フラジエ（Streptomyces
fradiae、met）とストレプトミセス・ビキニエン
シス（Streptomyces bikiniensis、nic ade）を
用い、各培養菌を実施例１に記載の方法に従つて
培養した。各菌株間の交雑は表４に示した。この
表では、通常の交雑手段とプロトプラスト融合法
とを比較した。表４によれば、プロトプラスト融
合による組換頻度は、通常の交雑手段による場合
の、少なくとも200倍は増加していた。
fradiae、met）とストレプトミセス・ビキニエン
シス（Streptomyces bikiniensis、nic ade）を
用い、各培養菌を実施例１に記載の方法に従つて
培養した。各菌株間の交雑は表４に示した。この
表では、通常の交雑手段とプロトプラスト融合法
とを比較した。表４によれば、プロトプラスト融
合による組換頻度は、通常の交雑手段による場合
の、少なくとも200倍は増加していた。
【表】
【表】
実施例 ５
プロトプラスト融合を用いていくつかの種間交
雑を検討した。菌株は、増殖制限濃度のグリシン
を加えて至適培養条件下に一夜培養した。プロト
プラストは、30℃においてリゾチーム１mg/mlで
１〜４時間処理することにより、各菌株から取得
した。得られたプロトプラストを混合し、培地Ｐ
（実施例１参照）に再懸濁した。40％PEG6000含
有倍地P0.9mlを最終懸濁液に加えて細胞膜融合を
誘発させた。コントロール用として、プロトプラ
スト懸濁液0.1mlを0.9mlの倍地Ｐに再懸濁した。
処理済みおよび未処理のプロトプラストは直ちに
培地Ｐに稀釈し、選択培地（カザミノ酸を含有し
ないR2）に接種した。実験には以下の各菌株を
使用した。
雑を検討した。菌株は、増殖制限濃度のグリシン
を加えて至適培養条件下に一夜培養した。プロト
プラストは、30℃においてリゾチーム１mg/mlで
１〜４時間処理することにより、各菌株から取得
した。得られたプロトプラストを混合し、培地Ｐ
（実施例１参照）に再懸濁した。40％PEG6000含
有倍地P0.9mlを最終懸濁液に加えて細胞膜融合を
誘発させた。コントロール用として、プロトプラ
スト懸濁液0.1mlを0.9mlの倍地Ｐに再懸濁した。
処理済みおよび未処理のプロトプラストは直ちに
培地Ｐに稀釈し、選択培地（カザミノ酸を含有し
ないR2）に接種した。実験には以下の各菌株を
使用した。
【表】
【表】
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトミセス属およびノカルジア属の一
方または両方のプロトプラストを形成し、安定化
させてこれらの属における遺伝子交換を行なうに
際して、 (イ) 細胞増殖の転換期においてプロトプラストの
形成を行なわせ、 (ロ) こうして形成したプロトプラストを高張緩衝
液中で混合して融合させ、 (ハ) 該融合プロトプラストを高張培地上で培養し
て細胞を再生させる ことを特徴とするプロトプラスト融合による遺伝
子交換法。 ２ プロトプラストをポリエチレングリコールで
処理してプロトプラスト融合を促進する特許請求
の範囲１記載の方法。 ３ 遺伝子交換をストレプトマイセス属内で行な
う特許請求の範囲１または２記載の方法。 ４ 遺伝子交換を種内で行なう特許請求の範囲３
記載の方法。 ５ 遺伝子交換を種間で行なう特許請求の範囲３
記載の方法。 ６ 遺伝子交換をノカルジア属内で行なう特許請
求の範囲１または２記載の方法。 ７ 遺伝子交換をストレプトマイセス属とノカル
ジア属の間で行なう特許請求の範囲１または２記
載の方法。 ８ 遺伝子交換をS.フラジエに属する株間で行な
う特許請求の範囲４記載の方法。 ９ 遺伝子交換をS.グリセオフスカスに属する株
間で行なう特許請求の範囲４記載の方法。 １０ 遺伝子交換をS.フラジエとS.ビキニエンシ
スの間で行なう特許請求の範囲５記載の方法。 １１ 遺伝子交換をS.フラジエとS.シナモネンシ
スの間で行なう特許請求の範囲５記載の方法。 １２ 遺伝子交換をS.リツプマニーとS.テネブラ
リウスの間で行なう特許請求の範囲５記載の方
法。 １３ 遺伝子交換をS.シナモネンシスとS.オーレ
オフアシエンスの間で行なう特許請求の範囲５記
載の方法。 １４ 遺伝子交換をS.オーレオフアシエンスとS.
カンデイダスの間で行なう特許請求の範囲５記載
の方法。 １５ 遺伝子交換をS.リツプマニーとS.クラブリ
ゲルスの間で行なう特許請求の範囲５記載の方
法。 １６ 遺伝子交換をN.エリスロポリスとS.コエリ
コロルの間で行なう特許請求の範囲７記載の方
法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81209777A | 1977-07-01 | 1977-07-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5414580A JPS5414580A (en) | 1979-02-02 |
| JPS6141549B2 true JPS6141549B2 (ja) | 1986-09-16 |
Family
ID=25208489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7972378A Granted JPS5414580A (en) | 1977-07-01 | 1978-06-29 | Gene exchanging method by protoplast fusion |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5414580A (ja) |
| AR (1) | AR220714A1 (ja) |
| BE (1) | BE868473A (ja) |
| CA (1) | CA1105859A (ja) |
| CH (1) | CH639694A5 (ja) |
| DE (1) | DE2827963A1 (ja) |
| FR (1) | FR2396082A1 (ja) |
| GB (1) | GB1602074A (ja) |
| HU (1) | HU189441B (ja) |
| IE (1) | IE47062B1 (ja) |
| IL (1) | IL55004A0 (ja) |
| IT (1) | IT1098354B (ja) |
| NL (1) | NL7807003A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63217165A (ja) * | 1987-03-03 | 1988-09-09 | Sanyo Electric Co Ltd | 温風暖房機の温風制御装置 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07112437B2 (ja) * | 1982-03-05 | 1995-12-06 | 味の素株式会社 | 澱粉からの発酵生産物の製造方法 |
| CA1213228A (en) * | 1983-04-13 | 1986-10-28 | Peter S. Carlson | Agricultural-chemical-producing endosymbiotic bacteria and method of preparing and using same |
| HU194306B (en) * | 1983-05-16 | 1988-01-28 | Gyogyszerkutato Intezet | Process for influencing biosynthesis of antibiotics with in vivo genetical recombination |
| US5773221A (en) * | 1995-12-15 | 1998-06-30 | Oceanix Biosciences Corporation | Method of recovering a biological molecule from a recombinant microorganism |
| DE19629271A1 (de) * | 1996-07-19 | 1998-01-22 | Wolfgang Prof Dr Piepersberg | Verfahren zur Isolierung neuer Stoffwechselleistungen in Mikroorganismen durch in situ-Gentranfer (Gen-Schwämme) |
| US6326204B1 (en) * | 1997-01-17 | 2001-12-04 | Maxygen, Inc. | Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination |
| CN107151264B (zh) * | 2011-03-23 | 2021-11-23 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | 新型糖肽类抗生素衍生物及药物组合物、以及其制备方法和用途 |
-
1978
- 1978-05-23 GB GB21350/78A patent/GB1602074A/en not_active Expired
- 1978-06-26 DE DE19782827963 patent/DE2827963A1/de active Granted
- 1978-06-26 CA CA306,181A patent/CA1105859A/en not_active Expired
- 1978-06-26 IL IL7855004A patent/IL55004A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-06-26 AR AR272717A patent/AR220714A1/es active
- 1978-06-27 BE BE1008953A patent/BE868473A/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-06-27 FR FR7819207A patent/FR2396082A1/fr active Granted
- 1978-06-29 NL NL7807003A patent/NL7807003A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-06-29 JP JP7972378A patent/JPS5414580A/ja active Granted
- 1978-06-30 CH CH718978A patent/CH639694A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-06-30 IT IT25255/78A patent/IT1098354B/it active
- 1978-06-30 HU HU78EI797A patent/HU189441B/hu not_active IP Right Cessation
- 1978-06-30 IE IE1318/78A patent/IE47062B1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY=1974 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63217165A (ja) * | 1987-03-03 | 1988-09-09 | Sanyo Electric Co Ltd | 温風暖房機の温風制御装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT7825255A0 (it) | 1978-06-30 |
| JPS5414580A (en) | 1979-02-02 |
| CA1105859A (en) | 1981-07-28 |
| HU189441B (en) | 1986-07-28 |
| NL7807003A (nl) | 1979-01-03 |
| IL55004A0 (en) | 1978-08-31 |
| FR2396082B1 (ja) | 1980-11-14 |
| GB1602074A (en) | 1981-11-04 |
| CH639694A5 (en) | 1983-11-30 |
| AR220714A1 (es) | 1980-11-28 |
| DE2827963C2 (ja) | 1987-07-23 |
| FR2396082A1 (fr) | 1979-01-26 |
| DE2827963A1 (de) | 1979-01-18 |
| IT1098354B (it) | 1985-09-07 |
| IE781318L (en) | 1979-01-01 |
| BE868473A (fr) | 1978-12-27 |
| IE47062B1 (en) | 1983-12-14 |
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