JPH07112437B2

JPH07112437B2 - 澱粉からの発酵生産物の製造方法

Info

Publication number: JPH07112437B2
Application number: JP57034995A
Authority: JP
Inventors: 昌彦唐沢; 修戸坂; 晴雄平馬; 政俊石橋; 茂穂池田; 寛依吉井
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1982-03-05
Filing date: 1982-03-05
Publication date: 1995-12-06
Anticipated expiration: 2010-12-06
Also published as: JPS58152485A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は微生物の澱粉からの発酵生産物の製造方法に
関する。

ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属の微生
物には、その変異株も含めて、グルタミン酸、リジン、
フエニルアラニン、アルギニン、ヒスチジン、その他の
アミノ酸、イノシン酸、グアニル酸、キサンチル酸、ア
デニル酸等のプリンヌクレオチド，イノシン、アデノシ
ン等のプリンヌクレオシド等の発酵生産能を有するもの
が多く知られている。しかしながらこれらのブレビバク
テリウム属及びコリネバクテリウム属の微生物のいずれ
も澱粉を炭素源として利用する能力を持つていないので
澱粉を予め糖化して使用しなければならない。一方バチ
ルス属の微生物の多くは澱粉を炭素源としてよく利用す
るが、イノシン、アデノシン、トリプトフアン等少量の
例を除いて、発酵生産性を有しない。

これに対し本発明者らは、発酵生産能を有するブレビバ
クテリウム属又はコリネバクテリウム属の微生物のプロ
トプラスト化した細胞とバチルス属の澱粉を炭素源とし
て利用する能力を有する微生物のプロトプラスト化した
細胞とを融合せしめることにより、発酵生産能と澱粉を
炭素源として利用する能力とを併せ持つ菌株を分離する
ことに成功した。

発酵生産能を有するブレビバクテリウム属、コリネバク
テリウム属の微生物としては多数のものが知られてい
る。これらの微生物は、アスパラキン酸、グルタミン
酸、グルタミン、リジン、ヒスチジン、イソロイシン、
ロイシン、メチオニン、プロリン、フエニルアラニン、
スレオニン、トリプトフアン、チロシン等のアミノ酸、
イノシン、アデノシン、グアノシン等のプリンヌクレオ
シド、イノシン酸、アデニル酸、グアニル酸等のプリン
ヌクレオチド、その他のものを生産する。

これらの発酵生産能を有する微生物は、グルタミン酸、
グルタミン生産菌の一部を除いて次のような野性株の変
異株である。

ブレビバクテリウム・デイバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミワム ATCC13032 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコラ ATCC17965 これらの野性株はいずれもＬ−グルタミン酸を生産する
ものであるが、これらの野性株に、アミノ酸、プリンヌ
クレオシド、プリンヌクレオチド等を生産せしめること
が既に知られている性質を人工変異により付与すれば、
これらの発酵生産物を生産する菌株を誘導することがで
きる。

ブレビバクテリウム属の微生物、コリネバクテリウム属
の微生物及びバチルス属の微生物をプロトプラスト化す
る方法は、例えば、ペニシリンＧに暫時接触せしめた
後、高張液中でリゾチームにより細胞壁を除く方法があ
る。プロトプラストとした細胞を融合せしめる方法も又
通常の方法でよく、例えば、ポリエチレングリコール、
ポリビニルアルコール等を含む高張液中にて両プロトプ
ラストを接触せしめる方法によれば良い結果が得られ
る。融合せしめた後通常の方法で、細胞壁を再生せしめ
る。

細胞壁が再生された菌株より発酵生産能と澱粉を炭素源
として利用する能力とを併せ持つ融合株を分離するに
は、例えば澱粉を唯一の炭素源とする培地に生育できる
ものであつてかつブレビバクテリウム属又はコリネバク
テリウム属の微生物が有していた発酵生産性と同じ発酵
生産物の生産性を有する菌株を分離すればよい。

かくして得られた融合株を用いて発酵生産を行うには、
澱粉を糖化又は液化しないで用いることができるほか
は、通常の培地を用いて通常の方法で培養すればよい。

尚得られた融合株は両親株が有していた形質を遺伝形質
として有しているものであつて、このような融合株につ
いては、獲得した遺伝形質の内容がなんであつても、い
ずれの親株が属する属又は種に属せしめることができな
いものである。

実施例１コリネバクテリウム・エキイAJ11789（FERM−P6412）、
アデニン要求性、８−アザグアニン耐性、サフアンピシ
リン耐性、サルフアグアニジン耐性、およびバチルス・
ズブチリスAJ11790（FERM−P6413）（８−アザグアニン
耐性）、サルフアグアニジン耐性、アルギニン要求性、
デコイニン耐性、サイコフラニン耐性）をペプトン1g/d
l、酵母エキス1g/dl、塩化ナトリウム0.5g/dl、アデニ
ン10mg/dlとシユークロース0.5g/dlを含み、水酸化ナト
リウムで、pH7.2に調節した完全栄養培地（以下「CM培
地」と記す）を用いて31.5℃にて24時間培養した。菌体
を集め、各のを10mlのCM培地を入れた大型試験管に接種
し、31.5℃にて振とう培養し、対数増殖期（10⁸cell/m
l）にペニシリンＧ（3Unit/10ml）を培地に添加した。9
0分間更に培養を続け、培養液から菌体を回収し、該細
胞をpH7.0の高張希釈液（以下「HP液」と記す;0.25Mシ
ユークローズ、0.25Mコハク酸２−ナトリウム、100mM塩
化カルシウム、20mMリン酸１カリウム、100mMリン酸２
カリウム、そして5mMEDTAを含みpH7〜10.5に調節した希
釈液）で洗浄した。

コリネバクテリウム・エキイの菌体を遠心分離し、得ら
れた菌体を、5000μg/mlリゾチーム、14g/dlシユークロ
ースおよび0.24g/dl硫酸マグネシウムを含む最少培地
（表１）に再懸濁し、31.5℃に静置した。プロトプラス
トの形成を光学顕微鏡で観察すると共に、細胞をHP液で
遠心洗浄後、一つはHP液で希釈して0.5Mコハク酸２ナト
リウムを含有した最少培地へ接種し、さらに0.8g/dl軟
寒天を含む同培地で重層した。もう一つは、リン酸緩衝
液で希釈してCM培地に接種し、さらに0.8g/dl軟寒天を
含む同培地で重層し、31.5℃で培養した。

プレートに出現するコロニーは、各々高張条件で生育す
るコロニー（栄養細胞とプロトプラスト）、低張条件で
生育するコロニー（栄養細胞のみ）を示し、その実験結
果を表２に示した。バチルス・ズブチリスの菌体のプロ
トプラスト化は、菌体を遠心分離し、得られた菌体を10
00μg/mlリゾチーム、14g/dlシユークロースおよび0.24
g/dl硫酸マグネシウムを含む最小培地（表１）に再懸濁
して31.5℃に静置した。

以下コリネバクテリウム・エキイと同様の方法で、高張
条件、低張条件で生育するコロニーを調べた（表３）。
コリネバクテリウム・エキイの細胞はリゾチーム処理20
時間で、バチルス・ズブチリスの細胞はリゾチーム処理
30分間で、プロトプラストを形成した。

上記の方法で得られたプロトプラストを含んだ最少培地
を各々遠心分離して、それぞれ等量のプロトプラストを
0.5mlのHP液（pH10.5）に懸濁し、33％PEG溶液を5ml添
加して36℃で30分間放置した。放置時間につれてプロト
プラストの凝集が生じ融合が進行した。

この融合したプロトプラストを遠心分離後、pH10.5のHP
液で洗浄後、HP液に懸濁した。この懸濁液を100μg/ml
デコイニン、1000μg/ml8−アザグアニン、５μg/mlサ
イコフラニン、1000μg/mlサルフア剤および0.5Mコハク
酸２ナトリウムを含んだAJ11789の最少培地上に接種
し、同培地（0.8％軟寒天培地）をその上に重層して31.
5℃で約10日間培養を行なつた。

このようにして得られた薬剤耐性コロニー（融合株）の
出現頻度は10^-4〜10^-6で親株の復帰変異率より10³〜10⁴
倍以上高かつた。そのうちの１株AJ11791（FERM−P641
4）について、10mg/dlグアニン及び40mg/dlアルギニン
を含むコリネバクテリウム・エキイAJ11789の最少培地
での、各薬剤に対する生育度を調べた結果を表４〜７に
示す。培養は31.5℃で24時間行なった。

この結果より、プレートに出現したコロニーは両親株の
表現型を有するコリネバクテリウム属とバチルス属との
組換え株であり、これらの組換え株はその表現型に関し
ては全く安定であつた。

得られた融合株の澱粉資化性について調べるため、10mg
/dlグアニン及び40mg/dlアルギニンを含むコリネバクテ
リウム・エキイAJ11789の最少澱粉培地（グルコースの
代りに澱粉を炭素源として使用）を用いて生育を調べた
結果を表８に示す。

この結果より、AJ11791は澱粉資化能を有することがわ
かつた。

表10に示した組成の培地を最終20mlになるよう肩付フラ
スコに入れ、115℃にて10分間加熱殺菌した。これに表
９に示す菌株を３白金耳接種し、34℃で５日間振とう培
養（110回／分、7cm振幅）した。

培地中に蓄積した５′−イノシン酸の蓄積を表９に示
す。

この結果より明らかなように融合株AJ11791はAJ11790が
有している澱粉資化能とAJ11789が有している５′−イ
ノシン酸生産能の両者を併有するものである。

実施例２ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムAJ11082（F
ERM−P3840）（Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン
耐性、α−クロロカプロラクタム耐性、アラニン要求
性、フロロピルビン酸感受性）とバチルス・ズブチリス
AJ11159（FERM−P4121）（アデニン要求性）の二種類の
親株を用いて融合株の取得実験を行なつた。

ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタムAJ11082の
最少培地の組成を表11に示す。

細胞培養及びプロトプラストの調製よび融合処理は実施
例１と同じに行なつた。融合株の選択は、PEG処理した
プロトプラスト混液を3000μg/mlS−（２−アミノエチ
ル）システイン（AECと略す）および0.5Mコハク酸２ナ
トリウムを含んだ、シユークロースの代りに澱粉を主炭
素源としたブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11082の最少培地上に接種し、同培地（0.8％軟寒天培
地）をその上に重層した。31.5℃で約10−14日培養後、
プレート上に出現したコロニーよりAJ11792（FERM−P64
15）を融合株として分離した。

このようにして得られたコロニーの澱粉資化能につい
て、AJ11082の最少澱粉培地（シユークロースの代りに
スターチを使用）における生育度（表12）およびAECに
対する耐性度（表13）を検討した。

得られたコロニーは澱粉の資化性およびAECに対する耐
性を有していて両親株の表現型を有することより、得ら
れたコロニーはブレビバクテクリウム属とバチルス属と
の組換え株である。これらの組換え株はその表現型に関
しては全く安定であつた。

下記の組成の培地を20ml宛、500ml容振盪フラスコに入
れ110℃で10分間蒸気殺菌した。これにあらかじめ、CM
培地（スラント）で生育せしめた表14に示す菌株を一白
金耳ずつ接種し、31.5℃にて72時間振盪培養した。72時
間培養後の培地中のＬ−リジン生成量（Ｌ−リジン塩酸
として）は表14のごとくであつた。

培地組成澱粉 10 g/dl (NH₄)₂SO₄ 4.5 g/dl KH₂PO₄ 0.15g/dl MgSO₄・7H₂O 0.04g/dl FeSO₄・7H₂O １ mg/dl MnSO₄・4H₂O １ mg/dl サイアミン・塩酸塩 1000 μg/l ビオチン 100 μg/l 大豆蛋白加水分解液 1.0 ml/dl アデニン 10 mg/dl アラニン 40 mg/dl 消泡剤 20 mg/dl 炭酸カルシウム（別殺菌）５ g/dl pH 7.2（KOHで中和）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:13 1:07） (72)発明者石橋政俊神奈川県横浜市旭区東希望ケ丘133−１希望ケ丘第３コ−ポラスＣ−111 (72)発明者池田茂穂神奈川県横浜市港南区日野町2300−213 (72)発明者吉井寛依神奈川県横浜市金沢区釜利谷町2153−75 (56)参考文献特開昭54−14580（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−109587（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】発酵生産能を有するブレビバクテリウム属
又はコリネバクテリウム属の微生物のプロトプラスト化
した細胞とバチルス属の澱粉を炭素源として利用する能
力を有する微生物のプロトプラスト化した細胞とを融合
せしめることにより作成した、発酵生産能と澱粉を炭素
源として利用する能力とを併せ持つ融合株を澱粉を炭素
源とする培地中に培養することを特徴とする、澱粉から
の発酵生産物の製造方法。