JPH0654317B2 - イムノアッセイ装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫対の構成員（mip）を測定するための、
クロトマトグラフィーによらない新規アッセイ装置に関
する。

問題の化合物の存在を分析する際に特定の化合物に指向
する天然レセプターまたは抗体を使用できることにより
創作されたイムノアッセイは萌芽しつつある。イムノア
ッセイにおいては、いずれの場合にも、リガンド及びレ
セプター（抗リガンド）を含む対応分子対、通常免疫対
が関与し、免疫対の構成員（以下mipと記す）の一方
を、検知しうるシグナルを生じる標識で標識付けする。
イムノアッセイ法はmipの複合体に結合したシグナル標
識と未結合シグナル標識との間のシグナル標識の分布に
基づく。結合シグナル標識と未結合シグナル標識とは、
未結合シグナル標識から結合シグナル標識の物理的分離
または結合シグナル標識と未結合シグナル標識との間の
検知しうるシグナルの変化の結果として区別することが
できる。

イムノアッセイは大部分、比較的精巧な装置及び注意深
い技術を必要とする臨床研究室において広範な有用化合
物、特に薬剤の定量的測定に関するものであった。半定
量的または定性的結果が求められる場合及び測定が家庭
または診療所におけるように非研究者によってなされる
場合には、イムノアッセイは商業的にはあまり広く応用
されなかった。臨床試験室でさえ、未熟練者の採用しう
る簡単かつ迅速なスクリーニングテストがあれば、著し
く経費節約に役立つであろう。

イムノアッセイの発展には、考慮すべきことが多々あ
る。その１つは、結合した場合にシグナル標識から生じ
る観察されるシグナルを未結合の場合と実質的に区別す
ることである。もう１つは、問題の化合物を含むと思わ
れる試料中の内因性物質からの干渉をできるだけ少なく
することである。更に別の考慮事項は、観察されるシグ
ナルを検出でき且つそれにより問題の濃度範囲で濃度を
区別しうる容易さである。他のファクターは、試薬製造
の容易さ、試料及び試薬溶液を調整測定する精度、試薬
の貯蔵安定性、プロトコルに要求される工程数、並びに
各工程を実施する熟練度及び正確さである。従って、家
庭や法医学において、また開業医等によつて行なわれる
検定のように、未熟練者の利用しうるアッセイ法を開発
する際には、観察結果はプロトコルを実施する方法にお
ける変動に極めて少ししか影響されるべきではなく、或
いは種々の工程を実施するため簡単な技術を準備すべき
である。

米国特許第４，１６８，１４６号明細書は、イムノアッ
セイ試験ストリップを記載している。米国特許第３，９
９０，８５０号及び同第４，０５５，３９４は診断試験
紙を記載している。種々の特許及び特許出願はイムノア
ッセイにおける検知しうるシグナルを生ずるための種々
の技術の広範な文献を提供している。本発明に使用しう
るこれらの技術の若干を説明するため以下に若干の特許
を列挙する。米国特許及び特許出願ならびに関係する標
識の種類の一般的表示のリストを以下に示す。

米国特許第３，６４６，３４６号明細書、放射性標識；
米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，７９１，９
３２号及び同第３，８１７，８３８号明細書、酵素標
識；米国特許第３，９９６，３４５号明細書、螢光物質
−消光物質標識；米国特許第４，０２，７３３号明細
書、放射性標識；米国特許第４，０６７，９５９号明細
書、螢光物質または酵素標識；米国特許第４，１０４，
０２９号明細書、化学発光標識；及び米国特許第４，１
６０，６４５号明細書、非酵素触媒標識。抗体帯域を使
用する電気泳動技術については米国特許第３，９６６，
８９７号明細書を、標識分析物を最初に抗体を介して固
体担体に結合させるＲＩＡについては米国特許第４，１
２０，９４５号明細書を参照されたい。１９７８年４月
５日に出願された米国特許出願第８９３，６５０号明細
書は酵素対標識を使用し；１９７８年４月５日に出願さ
れた米国特許出願第８９３，９１０号明細書は化学誘発
螢光標識を使用し、そして；１９７９年８月２６日に出
願された米国特許出願第６１，０９９号明細書は酵素陰
イオン電荷標識を使用している。

本発明は、免疫対の構成員（mip）を測定するための、
クロマトグラフィーによらない新規アッセイ装置に関す
る。装置は、mipが拡散運動に対抗して固定される免疫
吸着帯域を有する。免疫吸着帯域は試料及び試薬溶液の
入口として役立つ。

液体吸収帯域は、免疫吸着帯域とは直接または間接的に
液体を受理する関係にあり、免疫吸着帯域から通常横方
向に伸び、免疫吸着帯域を通って液体を吸引し且つ液体
を貯蔵するのに役立ち、また、液体が免疫吸着帯域を通
って吸引される速度を調節するのに役立ちうる。

この装置には、mipに結合したシグナル標識構成員を有
するシグナル発生系を使用する。免疫吸着帯域はシグナ
ル発生系の成分を１種またはそれ以上含んでいてよく、
該成分は免疫吸着帯域に、シグナル発生系成分の拡散運
動を許容または抑制するように結合されている。この方
法プロトコルによれば、免疫吸着帯域において検出帯域
に結合したシグナル標識の量は試料中の分析物の量に関
係する。

本発明の装置の使用方法は、アッセイ装置を液体試料
（シグナル発生系の成分を１種またはそれ以上添加した
ものでもよい）と接触させ、次いで、シグナル発生系の
残りの成分を含み且つ免疫吸着帯域を洗浄して非特異的
に結合したシグナル標識を除去するため使用する１種ま
たはそれ以上の溶液と順次接触させることからなる。シ
グナル発生系は免疫吸着帯域において、既知量の分析物
を含む標識に基づくシグナルレベルと比較しうる検出可
能のシグナルを提供する。

本発明の装置はイムノアッセイを実施するためのもので
ある。この装置は、比較的多量の流体が比較的均一な流
れで通過する狭い帯域を生ずるように工夫されている。
この帯域は、試料中の少量の分析物及び検出可能のシグ
ナルを生ずる試薬を濃縮すると同時に、その際媒体中の
分析物の量に無関係なバックグラウンドシグナルの発生
に帰因する、非特異的に結合した物質の局在化を抑制す
るのに役立つ。詳述すれば、液体試料及び液体溶液を受
理し、溶液を免疫対の構成員（mip）が結合する免疫吸
着帯域を通って送り、液体及び非特異的に結合した物質
を貯蔵帯域に吸引するアッセイ装置を提供する。試薬溶
液は免疫吸着帯域において、試料中の特定量の分析物に
関する標識と比較しうる検出可能のシグナルを発生す
る。

本発明の装置を使用するイムノアッセイ法は、他の均質
及び不均質イムノアッセイに従来使用された種々の試薬
の組合せに適合できる。これらの他のアッセイを実施し
た条件を、通常、本発明方法に適用しうる。即ち、本発
明の装置は先行技術の方法に比べて簡単なプロトコルを
可能にし、先行技術の方法と同様な定性また定量的結果
を生ずる。検出可能のシグナルを発生する成分を適切に
選択することによって、検出可能のシグナルを肉眼でま
たは種々の装置、例えば分光光度計、螢光計、シンチレ
ーション計数計等によって観察することができる。

測定すべき分析物はmipである。対応mipの特異性が問題
の分析物と試料中に存在しうる他の物質とを識別する手
段を生ずる。即ち、免疫吸着帯域のmipを適当に選択す
ることによって、免疫吸着帯域への成分の特異的結合を
生じ、これにより検出可能のシグナルを発生することが
できる。免疫吸着帯域におけるこのような成分の量を、
試料中の分析物の量に対応させることができる。

アッセイ装置の他に、シグナル発生系を含んでなる試薬
を１種またはそれ以上使用する。シグナル発生系中のキ
ー試薬は、シグナル標識として作用し且つmipに結合す
る試薬である。プロトコルの選択は、シグナル標識と免
疫吸着帯域に特異的に結合したmipとの結合体の量の増
加がアッセイ媒体中の分析物の量を決定するか、該結合
体の量の減少が分析物の量を決定するかを決めるであろ
う。

定 義 分析物とは、測定すべき化合物または組成物であって、
mipであり、モノー或いはポリエピトープ性（即ち、１
個または複数の決定部位を有する）、ハプテンまたは抗
原性のリガンド、単一化合物、または少なくとも１個の
共通のエピトープ部位若しくは決定部位を共有する複数
の化合物、またはレセプターであってよい。

mipとは、免疫対の一構成員であって、２種の異なる分
子から成り、一方の分子は表面上または空所中に他の分
子の特定の空間的及び極性構造に特異的に結合する領域
を有する。免疫対の構成員はリガンド及びレセプター
（抗リガンド）と言われ、特異的対の構成員は対応分子
対と言われる。

ａ）リガンドとは、そのレセプターが天然に存在するか
または製造されうる任意の有機化合物である。

ｂ）レセプター（抗リガンド）とは、分子の特定の空間
的及び極性構造、即ち、エピトープまたは決定部位を識
別しうる（該部位に高い結合親和力を有する）任意の高
分子化合物である。レセプターとしては、例えば、天然
に存在するレセプター、例えばチロキシン結合性グロブ
リン、抗体、酵素、Fabフラグメント、レクチン等が挙
げられる。抗体なる用語は、本明細書においてレセプタ
ーの例示として、またレセプターをより一般的に示すた
め使用する。

ｃ）抗レセプターとは、若干の状況において、リガンド
に結合し且つレセプターに対するリガンド（抗レセプタ
ー）として作用する二重の機能を示すレセプターであ
り、リガンド及び抗レセプターは互に直接には結合でき
ないが、レセプターによって結合されて免疫結合を生じ
る。抗レセプターは屡々抗体、プロテインＡ、リウマチ
因子、Ｃｌ_８等であってよい。

リガンドアナローグとは、レセプターに対して類似のリ
ガンドと競合しうる変性リガンドであり、リガンドの変
性が別の分子にリガンドアナローグを結合する手段を与
えているか、またはリガンドが別の分子に直接結合する
ため使用される官能性を有する場合には、結合体のリガ
ンド部分をリガンドアナローグと言う。リガンドアナロ
ーグは通常、別の分子、例えば、標識またはハブ（hu
b）にリガンドアナローグを結合する結合により水素を
置換する以上に、リガンドとは異なるであろう。複数の
リガンドアナローグが特に中心核、例えばハブに結合す
ることによって一緒に結合する場合に、生ずる集合体を
ポリ（リガンド−アナローグ）と言う。

アッセイ装置とは、少なくとも１個の吸収性層、通常２
以上の層を有し、これらの層は問題の物質に対して非特
異的吸着性を比較的有しない。この装置は一要素とし
て、mipを非拡散性に固定させる比較的小さい免疫吸着
帯域を有する。mipは、アッセイの経過中、吸収性固体
支持体上に実質的に固定される。また、この装置は第二
要素として直接または関接的に免疫吸着帯域と液体受理
関係にある貯蔵帯域を有する。

ａ）免疫吸着帯域は、mipを非拡散的に結合する吸収性
固体フィルム、層またはシートである。免疫吸着帯域は
アッセイ装置の全容量に比して比較的小さい流体容量を
有する。シグナル発生系の１種またはそれ以上の構成員
を直接または間接的に免疫吸着帯域に結合することがで
きる。免疫吸着帯域は対応mipに対して特異的結合性を
有する。

免疫吸着帯域内に１個またはそれ以上の帯域が縦列でま
たは重復して存在してもよい。免疫吸着帯域内には検出
帯域が含まれ、検出帯体はmipを結合する帯域と同一ま
たは異なっていてよい。

ｂ）液体吸収帯域は、免疫吸着帯域と液体を受理する点
で直接または間接的に関係する吸収性固体物質であり、
免疫吸着帯域より著しく大きい液体容量を貯蔵しうる貯
蔵帯域として作用する。この帯域は液体を免疫吸着帯域
を通して吸引し、そこから流出させるポンプとして作用
する。

シグナル発生系は１種またはそれ以上の成分を含み、少
なくとも１種の成分はmipに結合する。シグナル発生系
は、外部手段、通常電磁線の測定によって検出しうる測
定可能のシグナルを生じ、そのシグナルは免疫吸着帯域
における検出帯体で生じる。シグナル発生系は放射性物
質、酵素及び色原体物質、及び発色物質（発色物質とは
紫外または可視領域の光を吸収する染料を含む）、燐光
物質、螢光物質及び化学発光物質を含む。シグナルは多
くの場合、通常紫外または可視範囲で電磁線を吸収また
は放出することができるが、他の検出可能のシグナルを
特別の場合に適用してもよい。

シグナル発生体は検出可能のシグナルを発生する化合物
である。シグナル発生体はアッセイの間に生成するか、
または初めから存在し、何ら化学変化を受けることなく
シグナルを発生するものであってよい。化学反応を伴な
う場合には、反応してシグナルを発生する化合物をシグ
ナル発生体前駆物質と言う。

標識とは、別の分子または支持体に結合する任意の分子
であってよく、自由に選択することができる。本発にお
いて、標識は、支持体としてのアッセイ装置に結合した
mipであり、mipに結合しようと、支持体としてのアッセ
イ装置に結合しようとシグナル発生系の構成員である。

mip−支持体結合体とは、免疫吸着帯域において、アッ
セイ装置支持体に結合したmipであり、共有結合または
非共有結合により、直接または間接的に結合していてよ
い。mipは、試料及び試薬溶液が免疫吸着帯域を通って
移動する間に泳動しないように実質的に永久に支持体に
結合される。mipはその対応構成員を免疫吸着帯域に結
合するように作用する。

シグナル標識−mip結合体とは、mipに直接または間接的
に結合しているシグナル発生系の一構成員であり、mip
は免疫吸着帯域に結合しているか、または後に結合し
て、検出帯体で検出可能のシグナルを発生する。

シグナル標識−支持体結合体とは、免疫吸着帯域に共有
結合または非共有結合により直接または間接的に結合し
たシグナル発生系の一構成員であって、シグナル標識−
mip結合体と共に検出帯域においてシグナルを発生する
作用をする。

方 法 本発明の装置の使用方法は、試料溶液及び通常１種また
はそれ以上の試薬または洗浄溶液と共にアッセイ装置を
使用する。この方法は免疫吸着帯域を試料溶液と接触さ
せることを含み、この場合免疫吸着帯域の液体保有能は
試料の容量並びに免疫吸着帯域を通過する試料の部分よ
り著しく小さい。

免疫吸着帯域は固体支持体に固定されたmipを有し、そ
こでmipはその帯域から拡散するのを抑制されている。
免疫吸着帯域を通過する。試料溶液中の分析物は、mip
−支持体結合体のmipに結合され、免疫吸着帯域に濃縮
される。

シグナル標識−mip結合体は、多くの方式で含まれてい
てよい。即ち、（１）免疫複合体形成によりmip−支持
体結合体に非共有結合より結合した免疫吸着帯域にはじ
めから存在し、そして分析物と置換される；（２）試料
と共に存在し、そして分析物と競合するかまたは分析物
と一緒に作用する；（３）後から添加する。

試料を接触させた後に、免疫吸着帯域をシグナル発生系
の残りの構成員及び適当な場合には、洗浄溶液と接触さ
せ、媒体中の分析物の量に対応して検出帯域に検出可能
のシグナルを発生させる。ほとんどのプロトコルにおい
て、試薬溶液は洗浄溶液としても作用し、プロトコルに
おける工程数を最小にする。

本発明方法は、液体中に浸漬した層へまたその層から拡
散する溶質の拡散を伴なう先行技術の方法とは異なる。
従って溶質が層に、結合するかまたは液体中に溶解する
ので、層は連続的に変化する溶液組成物に遭遇する。本
発明においては、溶液と接触しているmip含有量は、溶
液が層を通って拡散するので、実質的に同じ溶液組成物
と接触する。即ち、mip含有層における溶液中の溶質の
濃度は、免疫吸着帯域と溶液との接触の間、比較的一定
にとどまる。

入口として作用する免疫吸着帯域を有するアッセイ装置
の構造は、多様に設計することができる。免疫吸着帯域
に除いてアッセイ装置は、溶液が液体吸収帯域によって
吸収される前に免疫吸着帯域より吸収されるように、通
常非透過性バリヤーによって絶縁しなければならない。
免疫吸着帯域は、非透過性バリヤーの開口部によって露
出される。この構造により、アッセイ装置を好適に溶液
中に浸漬することができる。

また、溶液を水平位置の免疫吸着帯域に、滴下により、
緩徐に流れる液流として、または免疫吸着帯域を包囲す
る容器中で適用することができる。

試料は前処理に付しても、付さなくてもよいが、通常は
処理しない。前処理を使用する場合には、シグナル生成
系の成分または他の試薬の１種またはそれ以上を含む
か、または含まない緩衝液を使用してもよい。試料溶液
がサンプリング準備済みである場合には、アッセイ装置
の免疫吸着帯域を試料と接触させ、試料の少なくとも１
部を吸収させる。その結果、試料溶液のかなりの部分は
免疫吸着帯域より入り、この帯域を通過し、貯蔵帯域中
に達する。本発明の装置を用いる場合、溶液の容量を予
め測定することは通常必要ではない。吸収される溶液の
量を、液体が液体吸収帯域を通過する距離によって管理
することできる。

この方法で、比較的多量の試料を免疫吸着帯域に導通さ
せて限定量の免疫吸着帯域中で分析物を実質的に濃縮す
ることができる。液体吸収帯域の容量及び対応mipの結
合定数が小さい場合には、多量の試料を免疫吸着帯域に
吸収させ、通過させることによって比較的低い濃度の分
析物を検出することができる。

該当する分析物は広範な環境中に存在しうる。該当する
分析物は薬剤、ホルモン、高分子物質及び微生物（これ
らは生理学的液体、例えば血液−全血清または血奨−
尿、脳脊髄液、眼水（ocular lens liquid）及び唾液
中に存在してもよい）；合成化学品；水及び空気中の汚
染物質；微量化合物、毒素並びに食物、例えば牛乳、
肉、家禽及び魚中の微生物等を包含する。事実、リガン
ドまたはリガンドが得られるレセプターとして作用しう
る任意の有機物質は、このような分析物を液体系中に、
対応mipに結合しうる形で導入しうる限り、測定するこ
とができる。

プロトコルに応じて、試料溶液中の分析物と共にシグナ
ル発生系の成分１種またはそれ以上が存在してもよい。
シグナル標識−mip結合体を含む溶液に続いて少なくと
も１種の付加的溶液を通過させて、免疫吸着帯域におけ
るシグナル標識−mip結合体の非特異的結合の除去を確
実にし、そしてまたはシグナル発生系の残りの成分を導
入することができる。シグナル発生系に１種より多くの
成分が含まれる場合に、シグナル標識−mip結合体溶液
を、その後の試薬溶液中のシグナル発生系の残りの成分
を添加する前に免疫吸着帯域に有利に吸着させることが
できる。この場合、その後の試薬溶液は、非特異的に結
合したシグナル−mip結合体を除去するための洗剤とし
て作用する。或いは、初めに接触させる試料に何も添加
せず、次にシグナル試料−mip結合体及びシグナル発生
系の他の成分を含む付加的溶液を１種またはそれ以上添
加する。

種々のプロトコルを利用でき、特別の構造は分析物の性
質、即ち、モノもしくはポリエピトープ性リガンドであ
るかまたはレセプターであるか；シグナル標識−mip結
合体の性質；並びにシグナル発生系の成分の性質及び数
による。従って、多くのプロトコルの例を挙げるが、そ
れが全部ではなく、むしろ変更の多くの機会を示すプロ
トコルの実施態様である。

下記の第Ｉ表には、分析物と、分析物の量に関連して免
疫吸着帯域でシグナルを生ずるための本発明に使用しう
る試薬との種々の組合せを示す。

２つの基本プロトコルを含む種々の組合せが可能であ
る。プロトコル２は試料及びシグナル発生系のmip成分
を合し、生じる溶液とアッセイ装置を接触させることを
含む。若干の用途には、次にアッセイ装置のストリップ
を、場合によりシグナル発生系の他の成分を含む洗浄溶
液と接触させて非特異的結合mipの完全な除去を確実に
する。また、プロトコル１において、アッセイ装置を試
料と接触させ、次にシグナル発生系のmip成分と接触さ
せ、場合により、使用する場合には通常シグナル発生系
の他の成分を含む洗浄溶液と接触させることができる。
更に、１及び７の場合には、Ｌ−mipを初めにmip−支持
体結合体に結合させて、試料中に浸漬したときにＬ−mi
pをハプテン分析物で置換させることができる。シグナ
ル標識が放射性標識または螢光物質である場合には別の
工程は必要ではない。

組合せ２及び８には、試料をシグナル標識−mipと他のm
ipとの混合物と合し、アツセイ装置を生じる溶液と接触
させる。

シグナル標識及びシグナル発生系の性質に応じて、螢光
物質を光で照射し、螢光のレベルを観察するか；または
染料を肉眼或いは分光光度計で観察でき、螢光物質を肉
眼或いは螢光計で観察できる場合には、染料、螢光物質
若しくは化学発光物質を生成する触媒系を加えるか；ま
たは化学発光或いは放射性標識の場合には放射線カウン
ターを使用することによって、シグナルを観察する。適
切な装置を入手できない場合には、通常、可視の色を生
ずる発色団を生成させるのが望ましい。精巧な装置を使
用する場合には、任意の技術を適用しうる。

試薬をそれぞれ結合させた後、インキュベーション工程
を設けることができる。各溶液を結合させるインキュベ
ーション工程は約５秒〜１６時間以上、一般に約１分〜
１時間、更に一般には約５分〜３０分であることができ
る。これに対して、アツセイ装置を各溶液と接触させる
時間は、吸着すべき溶液の容量及び溶液が液体吸収帯域
中に拡散する速度に左右される。この時間は、溶液中の
mipの濃度、免疫吸着帯域の領域におけるmipの濃度、対
応mipの結合定数、シグナルの生成速度度に応じて調節
する。免疫吸着帯域を通って溶液が拡散する時間を調節
しうる方法は、免疫吸着帯域及び液体吸収帯域の組成、
構造、寸法及び形、温度、溶媒等に関係する。本発明方
法及び装置を使用する機会の広範さを考慮すれば、本発
明による特殊な時間範囲は重要ではないであろう。

多くの場合、アツセイ装置と溶液を接触させる種々の溶
液の結合、及び読み取りを約０〜５０℃の範囲、更に普
通には約１５〜４０℃の範囲の温度で実施する。種々の
試薬の結合及びインキュベーション工程には、温度は一
般に約１５〜５０℃屡々２０〜３５℃、好ましくは室温
である。測定が定性、半定量的または定量的であるか否
かに応じて、温度を調節してもまた調節しなくてもよ
く、周囲温度を使用するのが有利である。周囲温度を使
用する場合には屡々、試料ストリップからの観察シグナ
ルと比較するために１個またはそれ以上の対照ストリッ
プを使用することができる。

使用する溶液を通常、約５〜１１、更には５〜１０、好
ましくは約６〜９のｐＨに緩衝する。ｐＨは、シグナル
発生効率を最適にしながら、mipよる特異的結合の有意
なレベルを保持するように選択する。種々の溶液を用い
て種々のｐＨを使用しうることは明らかである。所望の
ｐＨを達成し、測定の間所望のｐＨを保持するために種
々の緩衝液を使用することができる。緩衝液としては、
例えば、硼酸塩、燐酸塩、炭酸塩、トリス、バルビター
ル等が挙げられる。使用する特定の緩衝液は本発明には
重要でないが、個々のアツセイにおいて最も好ましい緩
衝液があろう。

測定しうる分析物の濃度は、一般に約１０^−４〜１０
^−１５Ｍ、更に普通には約１０^−１６〜１０^−１３Ｍで
ある。アツセイが定性的、半定量的または定量的である
か、特定の検出技術及び問題の分析物の濃度等を考慮し
て、他の試薬の濃度を決定するのが普通である。

種々の試薬の濃度は、どのプロトコルを使用するか、分
析物の性質、免疫吸着帯域中のmip、アッセイの必要な
感度等に応じて変動する。若干の場合には、mipの一方
または他方の大過剰を使用することができ、若干のプロ
トコルではアツセイの感度はmipの比の変動に応答す
る。

例えば、分析物がポリエピトープ性抗原である場合に
は、抗リガンド−支持体結合体として及びシグナル標識
−抗リガンド結合体として過剰の抗リガンドを、アツセ
イの感度に重大な影響を及ぼすことなく使用することが
できるが、その場合にアツセイ装置をまず試料と接触さ
せ、次にシグナル発生系溶液と、好ましくは次に洗浄溶
液と接触させる。抗リガンドが分析物であり、且つプロ
トコルが抗原−支持結合体を接触させる前に、分析物と
触媒−抗リガンド結合体との結合を含む場合には、アツ
セイの感度は分析物と触媒−抗リガンド濃度との比に関
係する。

プロトコルに関する考慮すべき事について記載したが、
更に試薬の濃度は抗リガンドの結合定数または抗血清を
使用する場合には結合定数プロフィル、及び必要なアツ
セイ感度に左右されるであろう。可能な場合には、シグ
ナル標識−mipの濃度を充分低くして、免疫吸着帯域、
特に検出帯域内での非特異的結合または吸蔵を最小にす
るのが望ましい。

種々の試薬の性状及び性質の変動から比に大幅な差が生
じるため、モル比については極めておおまかにしか述べ
ることができない。例えば、問題の分析物範囲に基づい
て、免疫吸着帯域に吸引されるシグナル標識−mip結合
体の分子数は通常、結合部位に基づく分析物の最小モル
数の約０．１倍以上、免疫吸着帯域に吸引される結合部
位に基づく分析物の最大モル数の約１０００倍以下、更
に普通の場合には結合部位に基づく分析物のモル数の約
０．１〜１００倍であろう。mip−支持体結合体のmipに
関する限り、通常、免疫吸着帯域に吸引される結合部位
に基づく分析物の最小モル数の約０．００１倍以上であ
ろう。前記のように、プロトコルによって化学量論理よ
り大過剰であってもよい。免疫吸着帯域におけるmipの
量は、シグナル標識−mip結合体によって完全に結合さ
れた場合に検出可能のシグナルを生ずるのに少なくとも
充分な程度である。（試料または分析物を引用した前記
の数値は、免疫吸着帯域を通過する容量または数であっ
て、アツセイ装置に接触させる試料溶液の総量または分
析物の総量ではない）。

方法のプロトコルを作る際には、基本的事柄が試薬の添
加順序及び組合せを支配する。大過剰のシグナル標識−
mip結合体を使用する場合には、通常、分析物をアツセ
イ装置と結合させる前にシグナル標識−mip結合体を分
析物と結合させない。シグナル標識が触媒である場合に
は、シグナル標識−mipと試験装置との結合前に反応が
起る条件下でシグナル標識−mipをシグナル標識基質と
結合させないのが普通である。化学発光には触媒標識の
場合と同様の考慮をする。

プロトコルによって複雑さの程度は異なる。複雑さに影
響する事項は、容量測定、工程数、測時精度及びバック
グランドの干渉の可能性である。

通常、予備測定を回避し、装置をただ１種の溶液と接触
させることもできるが、通常、少なくとも２種の溶液と
接触させる。通常、装置をシグナル標識−mip結合体と
接触させた後に、試薬、例えば酵素基質を含む洗浄溶液
との後続接触を屡々使用する。この方法で、免疫吸着帯
域における非特異的結合及び吸蔵が実質的に存在しない
ように確実にすることができる。従って、本発明方法
は、触媒、特に酵素を使用する場合に、特別の利点を示
す。従来方法では、別に洗浄工程が必要であった。本発
明では、試薬の添加工程が洗浄工程として作用する。

免疫吸着帯域にリガンドを準備するかまたはレセプター
を準備するかの選択は多数のファクターに依存する。ポ
リエピトープ性リガンドが分析物である場合には、mip
がレセプターに対する抗体である触媒−mip結合体を使
用すると（プロトコル１６及び１７）、免疫吸着帯域に
おいて分析物の各分子に多くの触媒が結合するのでアッ
セイの応答が高くなる。しかしながら、通常は次いで、
アッセイ装置を試料、抗体、シグナル標識−mipの順序
で少なくとも３種の別々の溶液と接触させなければなら
ない。リガンドまたはレセプターの純度も重要であろ
う。mip−支持体結合体の製造に使用する抗原または抗
体中の夾雑物はアツセイににあまり影響しないが、極め
て不純な抗原または抗体をシグナル標識で機能（functi
onalization）させるのは好ましくない。しかしなが
ら、本発明はmip以外のものに結合したシグナル標識を
免疫吸着帯域から除去するメカニズムを提供する。

前記のように、プロトコルの簡単さを更に考慮する。本
発明においては、アッセイの結果に著しい影響を及ぼし
うる測定の回数を最小にするのが望ましい。アッセイ装
置をまず試料とだけ接触させる場合には、測定を全く回
避できる。試料を他の溶液と合する場合には、必要な測
定を試料の量及び適切ならば、アツセイ試料を作るその
後の希釈に限定するのが望ましい。特に、半定量的また
は定性的な結果を得るため、残りの試薬を添加するとき
にアツセイの試果に影響することなく、容量及び濃度の
かなりの変動は許されるべきである。

免疫吸着帯域に抗体を有するアツセイ装置を使用する場
合について説明する。シグナル標識−mipも抗体を使用
し、試料は抗原である。吸蔵されそして非特異的に結合
したシグナル標識−mipを減少するためその後の工程を
使用する場合には、２工程を使用することによって、即
ち、まずアツセイ装置を試料と接触させ、次にアツセイ
装置をシグナル標識−mip結合体と接触させることによ
って、所定の最小量より多量のシグナル標識−mip結合
体を使用してもアツセイの結果はあまり影響されない。
これに対して、試料及びシグナル標識−抗体結合体を初
めに合した場合に、大過剰のシグナル標識−抗体が存在
すると、免疫吸着帯域における抗体−支持体結合体への
抗原の結合が抑制されることになろう。

本発明を更に説明するため、モノエピトープ性分析物、
ポリエピトープ性分析物またはレセプター分析物を使用
し、シグナル標識として、シグナルの発生のため他の化
学試薬の添加を必要としないシグナル標識、シグナルの
発生のため付加的試薬を必要とするシグナル標識、及び
シグナルの発生のため付加的試薬を必要とし、アツセイ
装置の免疫吸着帯域に初めて存在するシグナル発生系の
成分と反応するシグナル標識を使用するプロトコルの例
を説明する。シグナル標識−mip結合体が免疫吸着帯域
に初めに存在する場合には、複雑な免疫吸着帯域を必要
とするプロトコルも記載する。

第一のプロトコル例は、分析物としてハプテン（モノエ
ピトープ性リガンド）、シグナル標識として螢光物質を
使用し、その際螢光物質はハプテンアナローグに結合す
る。このプロトコルにおいて、ハプテンを含むと思われ
る検体をハプテン−螢光物質試薬の緩衝溶液と混合して
所定の容量にする。免疫吸着帯域に抗ハプテンを含むア
ツセイ装置を試料中に浸漬し、アツセイ試料溶液を液体
吸収帯域の所定の距離まで吸収させる。次にアツセイ試
料溶液からアツセイ装置を取り出し、これを緩衝剤溶液
中に導入し、その際、緩衝剤溶液は免疫吸着帯域を通過
して、免疫吸着帯域において非特異的に結合したハプテ
ン−螢光物質試薬の完全な除去を確実にする。試薬溶液
中のハプテン−螢物質の濃度が、正の結果を得るため結
合するハプテン−螢光物質の量に比べて充分低い場合に
は、洗浄工程を省くことができる。次に、アツセイ装置
を螢光計に導入し、螢光を測定することできる。

望ましくは、検体用アツセイ装置と同じ工程により実施
することのできる標準アツセイ装置を使用する。標準ア
ツセイ装置は、免疫吸着帯域に所定量の抗体を有し、ハ
プテン分析物の存在しない試薬溶液中に導入する場合に
はハプテンの特定濃度に対応する量のハプテン−螢光物
質試薬を吸収する。標準を検体と比較することによっ
て、ハプテンの量が所定のレベルより高いかまたは低い
かを決定することができる。また、分析物と接触させう
るが、分析物の量とは無関係の標準応答を生ずる標準ア
ツセイ装置を使用することができる。

本発明のアツセイ装置に使用する洗浄は浸漬ステイック
または試験ストリップを使用する他のアツセイに使用す
る洗浄とは異なることを注意すべきである。他の洗浄の
場合には、試験ストリップを試薬を含まない溶液中に入
れ、非特異的に結合した物質を試験ストリップから溶液
中に拡散させる。その後、試験ストリップを洗浄液から
除去しなければならない。これに対して、本発明におい
ては、免疫吸着帯域を通過する溶液は非特異的に結合し
た物質を一緒に液体吸収帯域中に運び、その結果、免疫
吸着帯域を非特異的に結合するシグナル標識を含まない
新鮮な溶液と連続的に接触させる。即ち、少量で免疫吸
着帯域から非特異的に結合したシグナル標識を充分に除
去でき、その際溶液を汚染しない。

第二のプロトコルでは、抗原を使用し、その際、抗原は
免疫吸着帯域の抗リガンドと抗体に結合したシグナル標
識（この場合、酵素）との間の架橋として作使してもよ
い。このプロトコルでは、抗リガンドを有するアツセイ
装置を、リガンドを含むと思われる試料（通常希釈され
ていない）中に浸漬する。所定量のアツセイ試料溶液は
免疫吸着帯域より液体吸収帯域中に拡散し、その際アツ
セイ試料溶液中の抗原は溶液中の抗体の濃度に比例して
免疫吸着帯域中の抗リガンドに結合するようになる。ア
ツセイ装置を取り出し、緩衝試薬溶液中に浸漬するが、
この試薬溶液は試薬として大過剰の酵素−抗リガンドを
含んでいてよい。

試薬溶液が免疫吸着帯域を通って拡散するので、酵素−
抗リガンドは免疫吸着帯域において結合したリガンドに
結合する。吸収される液体の容量は、溶媒先端が移動す
る距離によって決定することができる。本発明方法は比
較的高い試薬濃度で免疫吸着帯域に試薬を連続的に補充
するので、免疫吸収帯域において抗原に酵素−抗リガン
ド試薬を結合させるのに必要なインキュベーション時間
は比較的短い。アツセイ装置によって所定の容量を吸収
した後、アツセイ装置を取り出し、基質溶液中に導入す
る。酵素触媒作用により、免疫吸着帯域に沈着しうる有
色生成物に基質を変換する。再度、液体吸収帯域におけ
る溶媒先端を追跡することによって免疫吸収帯域を通過
する基質溶液の容量を制御することができる。

免疫吸着帯域に存在する抗体の代わりに所定量の抗原を
含むアツセイ装置を標準アツセイ装置とすることができ
る。この標準アツセイ装置を同じ方法で処理する。

第三のプロトコルでは、抗体は分析物であり、シグナル
発系は２種の酵素を含む。シグナル標識−mip試薬は酵
素であり、その基質は免疫吸着帯域に結合した酵素の生
成物である。アツセイ装置は免疫吸着帯域にmipとして
抗体を有する。試料を所定量の酵素−抗原試薬と混合
し、酵素−抗原試薬と試料中の抗体との実質的に完全な
結合を確実にするのに充分な時間の間インキュベートす
る。次に、アツセイ装置を分析試料溶液中に導入し、溶
液を免疫吸着帯域より吸収させる、残りの未結合の酵素
−抗原を免疫吸着帯域に結合させる。

免疫吸着帯域より所定量が移動した後（液体吸収帯域に
おける溶媒先端の移動によって判る）、アツセイ装置を
取り出し、基質溶液中に入れる。基質溶液は、アツセイ
装置に結合した酵素に対する基質、及び装置に結合した
酵素の生成物である酵素−抗原試薬の基質を除く、２種
の酵素に必要な任意の付加的試薬を含む。基質溶液は酵
素−抗原：抗体複合体を全く含まない免疫吸着帯域を洗
浄するので、この方法では洗浄は通常必要ではない。所
定量の基質溶液が免疫吸着帯域より移動し、免疫吸着帯
域に有色生成物を生じる。また、洗浄が必要でない場合
には、基質溶液を試料及び酵素−抗原溶液と混合し、次
にこの混合液中にアツセイ装置を浸漬する。

最後に、複数の重複層または縦列層を有する複雑な免疫
吸着帯域を使用することもできる。分析物がハプテンで
ある場合には、溶液と最初に接触する第一層は、抗ハプ
テンを酵素−ハプテン結合体と結合させる。第三層から
第一層への化合物の移動を阻止するため中間層を設けて
もよい。第三層はこの層上にシグナル発生物質を生成さ
せる試薬を例えば酵素、抗（シグナル標識）、抗酵素等
として含む。

この場合に、第一層でのシグナル発生を防止するため
に、第三層に結合する第二の酵素を用意する。第二の酵
素は、酵素−ハプテン結合体の酵素に対する基質である
生成物を生じることを特徴とする。中間層は第二の酵素
生成物が第一層へ泳動するのを阻止する。

説明のために、第二の酵素をグルコースオキシダーゼ
で、酵素−ハプテン結合体の酵素を西洋わさびパーオキ
シダーゼ（RHP）で説明する。HRP−ハプテンを免疫吸着
帯域の第一層の抗ハプテンに結合させ、グルコースオキ
シダーゼ及び抗−HRPを第三層に共有結合させる。カタ
ラーゼは中間層に存在させるか、またはただ２つの層を
使用する必要がなく、カタラーゼを第一層に存在させて
もよい。カタラーゼは、第三層から第一層へ泳動するか
もしれない偶然の過酸化水素を破壊する作用をする。

他の層上に重ねた第一層に試料溶液を加えて、溶液を下
方に泳動させることによってアツセイを実施する。試料
中のハプテンは第一層におけるHRP−ハプテンを置換
し、HRP−ハプテンは第三層へ向って下方に泳動し、抗
−HRPによって捕促される。試料溶液をグルコース及び
染料前駆動物質を含む試薬溶液と合するか、または試料
溶液に続いてグルコース及び染料前駆物質を含む試薬溶
液と接触させる。グルコース及び染料前駆物質は第三層
に泳動し、初めの２層に非特異的に結合したHRP−ハプ
テンを第三層へ運ぶ。第三層において、グルコースは過
酸化水素を生成する作用をし、過酸化水素はHRPによる
触媒作用で染料前駆物質と反応して染料を生成する。第
三層（検出帯域）に生じた色強度は試料中のハプテンの
量に関係する。アツセイ装置は、第三層が見える背面か
ら観察される。

本発明のアツセイ装置を用いて、使用する標準を広く変
動することができる。若干の場合には、アツセイ装置に
生ずる色と比較しうる段階的色列を準備すれば充分であ
る。より定量的な結果を得るには、所定量のmipを存在
させるアツセイ装置を１個またはそれ以上使用し、その
アツセイ装置を検体と共に使用するアツセイ装置と実質
的に同じ方法で処理するのが望ましい。アツセイ装置上
のmipが分析物と同じである場合には、アツセイ装置を
同じ方法で使用することができる。アツセイ装置上のmi
pが分析物に対する対応mipである場合には、通常、標準
アツセイ装置と検体との組み合わせを回避する。

種々の免疫対からの複数のmipを有するアツセイ装置に
複数の通路を設けることによって多数の異なる分析物に
ついて同時試験を実施することができる。免疫吸着帯域
を種々のリガンドまたは種種の抗リガンドを含む複数の
領域に分ける以下は、方法及び試薬同じである。

材料 本発明に使用する構成要素はアツセイ装置、分析物、シ
グナル標識−mip結合体を含むシグナル発生系、及び適
当ならば、他方のmipの一方である。

アツセイ装置 アツセイ装置は２つの部分、即ち溶液の入口として独特
に作用する免疫吸着帯域及び免疫吸着帯域より溶液を吸
引しそして適当ならば、溶液を貯蔵する液体吸収帯域を
有する。アツセイ装置は多くの構造を有することができ
る。その１つは同一平面内に液体吸収帯域及び狭い領域
として、また好ましくは免疫吸着帯域として作用する隣
接層として長い吸収性ストリップを含む試験ストリップ
である。

試験ストリップは２つの主要部分、即ち比較的小さい免
疫吸着帯域及び比較的大きい液体吸収帯域を有する長い
装置である。免疫吸着帯域は通常その機能に釣合って出
来るだけ小さく保持する。免疫吸着帯域はその第一の特
徴としてその境界内にmip及び場合によりシグナル発生
系の１種またはそれ以上の構成員を有する。

試験ストリップの寸法は広範に変動しうるが、長さは通
常、幅より著しく大きい、即ち幅より少なくとも２倍大
きく、幅より１０倍以上大きくてよく、幅及び厚さは均
一または不均一であってよい。ストリップは、各帯域が
隣接帯と液体受理関係にある限り、単一の材料、または
複の材料から成っていてよい。材料は、通常著しい吸着
またはクロマトグラフィー効果を伴わずに、吸収によっ
て液体を吸収することができる。即ち含まれるmipを除
いて、すべての物質は比較的均一かつ自由に帯域を流れ
る。

種々の天然または合成材料を使用でき、これらは単独の
材料または材料の組合せであってよく、有機、無機また
はその組合せであってよい。１層より多くの層が含まれ
る場合には、異なる層が異なる機能のための異なる性質
を有してもよい。免疫吸着層は、液体吸収剤と比較し
て、高い液体保有能を有する必要ない。電磁線を検出す
るためには、検出帯域は不透明、または半透明または好
ましくは透明であってよい。

使用しうる材料には、多糖類、例えば紙及び酢酸セルロ
ースのようなセルロース材料、シリカ、無機物質、例え
ば不活性アルミナ、珪藻土、MgSO₄、または塩化ビニ
ル、塩化ビニル−プロピレンコポリマー及び塩化ビニル
−酢酸ビニルコポリマーのようなポリマーを用いて、多
孔性ポリマーマトリックス中に好ましくはほぼ均一に分
散された他の無機微細物質、天然繊維、例えば木綿布及
び合成繊維、例えばナイロン布、多孔性ゲル、例えばシ
リカゲル、アガロース、デキストラン及びゼラチン、ポ
リマーフィルム、例えばポリアクリルアミド等が含まれ
る。アッセイ装置材料の重要な特徴は、アッセイに使用
される溶質の移動を実質的に妨げることなく、液体、特
に水溶液を吸収しうることである。要するに、材料は吸
収性であり、多孔性で、溶液を流動させることができ、
免疫吸着層の材料は非クロマトグラフィー性であるのが
好ましい。これらは適切な強度を有するか、強度を支持
体によって与えることができ、シグナル発生体によるシ
グナルの発生を妨害しない。

液体吸収帯域を試料及び試薬溶液との直接接触から保護
する。このことは、免疫吸着帯域を試験ストリップの唯
一の露出部分として設けるか、または免疫吸着帯域の周
りの領域を閉鎖して試料または他の試薬溶液と液体吸収
帯域との接触を防止することによって達成するのが都合
よい。

免疫吸着帯域の１つの機能は、種々の溶液を接触させ、
溶液を試験ストリップに吸引させることである。免疫吸
着帯域は試験ストリップの端部であるか、または試験ス
トリップの面上の露出帯域であってよく、或いは不透過
性保護カバーを越えてのびるか、若しくは該カバーと一
列に配置するか、若しくは該カバーに対して内側に配置
する。構造上の重要なファクターは、露出面からの溶液
の流通がかなり均一であることである。

免疫吸着帯域の露出面は一般にその最小寸法で少なくと
も約１mm以上であり、通常その最小寸法で少なくとも約
１．５mm、更に普通には少なくとも約２mmである。免疫
吸着帯域は通常、その最大寸法で約２cm以下、一般にそ
の最大寸法で約０．２〜１cmである。免疫吸着帯域の厚
さは一般に約１０μ〜５mm、最も普通には５０μ〜約３
mm、好ましくは約０．２mm〜１mmである。

免疫吸着帯域は任意の形状、例えば円形、楕円形、正方
形、長方形または不規則な形であってよい。重要なファ
クターは、検出帯域の表面をシグナルに対して走査でき
ることである。表面は通常平坦または約６０゜以下の弧
を有する凹面若しくは凸面に僅かに湾曲する。

免疫吸着帯域は単一層または複数の層であってよく、免
疫吸着帯域の上部または下部（上部及び下部とは液体の
流れに対して上流及び下流を指す）にシグナルを発生し
うる。免疫吸着帯域は単一層または上層としてmipを吸
収性支持体に結合して含む。若干のプロトコルでは、シ
グナル標識−mip結合体をmip−支持体結合体と複合させ
ることができる。

多重層であり、検出帯域が別個の層である場合には、下
層は抗（シグナル標識）または吸収性支持体に非拡散性
に結合したシグナル発生系の成分を含む。下層の結合体
はシグナル標識−mip結合体またはmip−支持体結合体層
から泳動する、シグナル標識−mip結合体によって発生
した生成物を捕促する作用をする。シグナル標識及び抗
（シグナル標識）は、抗（シグナル標識）が下層におけ
るシグナルの発生をあまり妨害しないように選択する。
容易に検出可能のシグナルを発生するように試薬を選択
する。

特に、mip−支持体結合体層と下層との間に１層、また
はそれ以上の付加的層を含んでいてよい。これらの付加
的層は、下層から上層へのシグナル発生系の成分の泳動
を防止する遮断層として、またはフィルターとして或い
は流動制御のため等に役立つ。

免疫吸着帯域を通る流動は適切に均一であるべきであ
る。多くの吸収性材料は不均一であり、mipを含む入口
帯域よりの流動は領域ごとに変動してよい。免疫吸着帯
域における層の均質性を補うために、種々の複合構造を
使用することができる。

構造の１例を挙げると、第一の吸収性層にmipを結合さ
せ、この層が層を横切る方向へ著しい圧力差を生じて液
体の流通に抵抗するようにする。この層の後に流れに対
して最小の抵抗を生ずる比較的あらい層を設ける。この
第二の層は第一の層と液体吸収帯域の中間にある。

別の構造では、３層を設け、第一のmip含有層は液体の
流通に対して比較的低い抵抗を有するが、第一の層と均
一に接触する第二層によって裏打ちされており、この第
二層は液体の流通に対して著しく抵抗性である。その結
果、mip含有量の１以上の領域を通る急速な流通が妨げ
られ、第一層からの一層均一な流れが生じる。第二層に
続いて、流通に抵抗しない多孔性層を設ける。

各層を均一に一緒に圧縮して流路の形成を避ける。複合
構造体を構成するため、公知の流動特性の種々の組成物
を使用することができる。

また、流動性抗を低くするため、免疫吸着帯域の後の領
域を限定するスペーサを使用し、免疫吸着層表面に対し
て垂直及び横の方向への流動を可能にしてもよい。

低い流動抵抗のために使用しうる材料は紙、ナイロン針
金、ガラスまたはポリオレフィンメッシュまたはマッ
ト、または木綿等を含む。形を、境界層との良好な均一
接触を確保するように変動させるべきであり、形は平
担、凹面または凸面状であり、２つの対向表面は同一ま
たは異なっていてもよい。

上層及び／または下層は検出可能のシグナルを決定する
ための検出帯域として作用する。必要に応じて、検出可
能のシグナルを両層に生成させて、内部チェックを得る
ため分析物の量に関係する２つの数値を測定することが
できる。

液体吸収帯域は免疫吸着帯域と接触して液体を受理す
る。液体吸収帯域は複数の機能を生ずる。第一の機能は
免疫吸着帯域によって吸収された流体用の貯蔵容器また
は貯蔵領域として作用することである。役立ちうるが、
必要ではない第二の機能は流体が免疫吸着帯域を通過す
る速度を調節することである。液体吸収帯域が小さい寸
法を有するか、または免疫吸着帯域からの種々の物質を
含む場合に、液体吸収帯域は液体が免疫吸着帯域を通過
する速度を制御する作用をしうる。液体吸収帯域は、不
規則な寸法を有することによって、更に試料を吸収する
か、試薬溶液を吸収るかに応じて異なる速度を生じる作
用をなしうる。

液体吸収帯域の別の機能は、吸される液体の量を測定す
ることである。免疫吸着帯域から液体吸収帯域に沿って
のびる連続位置に目盛を設けることによって、溶媒の先
端が一定の位置にあるときを決定し、試験ストリップを
溶液から取り出すことができる。また、溶媒に溶解また
は溶媒先端と接触したときに発色する染料を加えて、試
験ストリップを取り出すべき明瞭なシグナルを生じるこ
とができる。例えば、ｐＨ指示薬を使用することができ
る。溶媒先端の存在を明瞭に示す任意の技術を使用する
ことができる。

試験ストリップにおいて、液体吸収帯域一般に少なくと
も約１．５cm、通常約２cmで、約３０cm以下、通常約２
０cm以下の長さを有する。幅は約０．１mm〜約３cmであ
ってよい。これらの寸法は第一に、吸収される溶液の速
度及び量の調節並びに取扱いの便利さ及び溶媒先端の観
察の容易さのためである。厚さは一般に約０．１〜５m
m、通常約０．５〜３mmである。

液体吸収帯域は、保護ケーシング、好ましくは澄明なま
たは部分的に若しくは若干の状況では全部透明なケーシ
ング中に一部分またはほぼ全部封されていてよい。液体
吸収帯域を全部封入する必要ないが、液体吸収帯域が試
料溶液と直接接触するのを防止するため、充分な部分を
被覆すべきである。ほとんどすべての場合に、均一な量
の試料溶液を免疫吸着帯域に流通することが必要であ
る。このことは、液体吸収帯域とアッセイ試料溶液との
接触を回避することによって最も良く達成することがで
きる。

使用する個々のプロトコル及び試験ストリップの構造に
応じて、封入容器は着脱可能または不可能であってよ
く、１個以上の窓を有してもよく、通常、種々の帯域を
含む吸収性材料の機械的保護を与え、アッセイの実施を
妨害しない、強靭で、不活性な不透過性材料から成る。
通常、封入容器内に空気の閉じ込みを防止するため通気
口を設ける。

次に図面に基づいて本発明を詳述する。図面において、
第１図はアッセイ装置の平面図、第２図は第１図のアッ
セイ装置の２−２線拡大断面図、第３図は試料試験スト
リップ及び標準試験ストリップを有するアッセイ装置の
平面図、第４図は第３図のアッセイ装置の４−４線断面
図、第５図は本発明の別の実施態様の部分断面正面図で
ある。

第１図及び第２図には、シャベル形吸収性ストリップ１
４を封入するプラスチック製封入容器１２を有する試験
ストリップ装置１０を示す。ストリップの接触端部１６
はプラスチック製封入容器１２の少し内側にあり、機械
的接触及び劣化から保護されている。接触端部（butt
end）１６は免疫吸着帯域として作用し、シグナル標識
によるシグナルの発生を容易に検出できるように充分な
深さに接触端部１６にmipを結合して含む。ストリップ
１４は２０及び２２のところに目盛を有し、免疫吸着帯
域１６を通過する試料溶液及び試薬溶液の容量を正確に
測定できるようになっている。ストリップ１４は、試薬
溶液の流速を調節する細長ストリップ２４を有する。ス
トリプス２４は、プラスチック製封入容器１２の開口２
６に向かってのび、この開口は溶液がストリップ１４を
上昇するに従って空気を逃出させる。封入容器１２は前
面シート３０及び背面シート３２を含み、澄明な前面シ
ート３０により吸収性ストリップ１４を通る流体の上昇
運動を観察することができる。

アッセイを実施する際には、ストリップは試料溶液中に
浸漬し、試料の浸透先端が目盛２０に達したときに取り
出しさえすればよい。試験ストリップ装置１０を試料溶
液から取り出し、試薬溶液中に導入し、溶媒の先端が目
盛２２に達するまで試薬溶液中に保持する。次に、試験
ストリップ装置を試験溶液から取り出し、十分量の洗浄
溶液が免疫吸着帯域を通過するまで（溶媒の先端が細長
ストリップ２４に沿って移動することで判る）、洗浄溶
液中に導入する。

次に免疫吸着帯域接触端部１６を、分析物が試料中に存
在することを示す検出可能のシグナルの発生について観
察することができる。

第３図及び第４図には、２個のストリップ、即ち試料試
験ストリップ５２及び標識ストリップ５４を有する試験
ストリップ装置５０を示す。開口５６及び６０はプラス
チック製封入容器６２の開口である。免疫吸着ディスク
６４は抗体（文字Ａｂで示す）を結合して有し、標準ス
トリップ５４の免疫吸着ディスク６６は抗原（文字Ａｇ
で示す）を、抗原濃度に対応するシグナルレベルを生ず
るため所定量で結合して有する。吸収性ストリップ７０
及び７２、例えばセルロースまたは紙ストリップは、そ
れぞれ免疫吸着帯域６４及び６６から封入容器６２を越
えて封入容器６２の開口７４及び７６（封入容器から空
気を逃出させる）へのびる。７０及び７２の底端は溶液
から保護されている。

免疫吸着ディスク６４及び６６はそれぞれ多孔性スペー
サ８０及び８２上に載置されている。多孔性スペーサは
不活性であり、ほぼ無抵抗に流体を流動させる。免疫吸
着帯域ディスク６４及び６６と多孔性スペーサ８０及び
８２の表面８４及び８６とを実質的に均一に接触させ
る。従って、免疫吸着帯域ディスク６４及び６６から流
出する溶液は抵抗に実質的に合うことなく流動する。

スペーサ８０及び８２は、液体吸収ストリップ７０及び
７２によって下流で境界づけられ、これらのストリップ
はそれぞれスペーサ８０及び８２から液体を吸収し、ス
ペーサが液体で満されたときに液体を排出するポンプと
して作用する。試料及び標準に関する前記構造物は、プ
ラスチックホルダー中に入れられ、このホルダーは１個
または２個以上の部材から作られ、試験ストリップの種
々の部分を一線にかつ液体受理関係に保持するように組
立てられている。

第５図には、本発明の試験ストリップ装置の別の実施態
様を示す。この実施態様には、免疫吸着帯域及び液体吸
収帯域の一部を示す。封入容器１００には窓１０２を設
ける。mipを結合して含む吸収性免疫吸着ディスク１０
４は、試料及び溶液の入口として作用する。吸収性ディ
スクその液体吸収作用において比較的均一であって、デ
ィスクを通る液体の流れに対して比較的無抵抗であるべ
きである。免疫吸着ディスク１０４のすぐ後には、吸収
性液体流動抵抗性ディスク１０６があり、このディスク
は液体流動に対して免疫吸着ディスク１０４より大きい
抵抗を有する。２個のディスク１０４及び１０６は界面
１１０で相互に均一に押し合っている。

流動抵抗ディスク１０６の後には、流動抵抗ディスク１
０６と液体吸収ストリップ１１４との間に液体を自由に
流動させるリングであるスペーサ１１２がある。

装置を試料または試薬溶液中に入れると、免疫吸着ディ
スク１０４はそのディスクを通って移動し、より抵抗性
のディスク１０６に出合う液体を迅速に吸収する。ディ
スク１０６は流速を制御する。従って、免疫吸着ディス
ク１０４に不均一部分が存在しても１個以上のホットス
ポットを通って急速な流れは生じず、免疫吸着ディスク
１０４を通る液体流動の均一さの欠除を抑制する。溶液
が流動抵抗ディスク１０６を通過した後、リング１１２
の空所１１６を通過し続け、液体吸収ストリップ１１４
によって吸収される。

分析物 本発明のリガンド分析物は、モノエピトープ性またはポ
リエピトープ性であることを特徴とする。ポリエピトー
プ性リガンド分析物は通常ポリ（アミノ酸）、即ちポリ
ペプチド及び蛋白質、多糖類、核酸及びその混合物であ
る。集合物のこのような組合せは細菌、ウイルス、染色
体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜等を含む。

本発明に使用されるポリエピトープ性リガンド分析物は
大部分、少なくとも約５，０００、更に普通には少なく
とも約１０，０００の分子量を有する。ポリ（アミノ
酸）の範ちゅうにおいて、該当するポリ（アミノ酸）は
一般に約５，０００〜５，０００，０００の分子量、更
に普通には約２０，０００〜１，０００，０００分子量
を有する。該当するホルモンの分子量は一般に約５，０
００〜６０，０００である。

同様の構造的特徴を有する蛋白質、特定の生物学的特徴
を有する蛋白質、特殊な微生物に関する蛋白質、特に病
原微生物に関する蛋白質等の族に関して広範な蛋白質が
考えられる。

下記のものは構造によって関連した蛋白質類である： プロタミン類 ヒストン類 アルブミン類 グロブリン類 硬蛋白質類 燐蛋白質類 ムコ蛋白質類 色素蛋白質類 リポプロテイン類 核蛋白質類 糖蛋白質 プロテオグリカン類 未分類蛋白質、例えばソマトトロピン、プロラクチン、
インシュリン、ペプシン。

人の血漿中に存在する多数の蛋白質は臨床的に重要であ
り、下記のものを含む： プレアルブミン アルブミン α_１−リポプロテイン α_１−酸グリコプロテイン α_１−アンチトリプシン α_１−糖蛋白質 トランスコルチン（Transcortin） ４，６Ｓ−ポストアルブミン トリプトファンに乏しいα_１−糖蛋白質 α_１χ−糖蛋白質 チロキシン−結合グロブリン インター−α_１−トリプシンインヒビター （Inter−α−trypsin−inhibitor） Ｇｃ−グロブリン （Ｇｃ １−１） （Ｇｃ ２−１） （Ｇｃ ２−２） ハプトグロビン （Ｈｐ １−１） （Ｈｐ ２−１） （Ｈｐ ２−２） セルロプラスミン コリンエステラーゼ α_２−リポプロテイン ミオグロビン Ｃ−反応性蛋白質 α_２−マクログロブリン α_２−ＨＳ−糖蛋白質 Ｚｎ−α_２−糖蛋白質 α_２−ノイラミノ−糖蛋白質 エリスロポイエチン β−リポプロテイン トランスフェリン ヘモペキシン フィブリノーゲン プラスミノーゲン β_２−糖蛋白質Ｉ β_２−糖蛋白質II イムノグロブリンＧ （ＩｇＧ）またはγＧ−グロブリン 分子式： γ_２κ_２またはγ_２λ_２ イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）またはγＡ−グロブリン 分子式： （α_２κ_２）^ｎまたは（α_２λ_２）^ｎ イムノグロブリンＭ （ＩｇＡ）またはγＭ−グロブリン 分子式： （μ_２κ_２）^５または（μ_２λ_２）^５ イムノグロブリンＤ（ＩｇＤ）またはγＤ−グロブリン （γＤ） 分子式： （δ_２κ_２）または（δ_２λ_２） イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）またはγＥ−グロブリン （γＥ） 分子式： （ε_２κ_２）または（ε_２λ_２） 遊離κ鎖及びλＬ鎖 補体因子 Ｃ′１ Ｃ′１ｑ Ｃ′１ｒ Ｃ′１ｓ Ｃ′２ Ｃ′３ β_１Ａ α_２Ｄ Ｃ′４ Ｃ′５ Ｃ′６ Ｃ′７ Ｃ′８ Ｃ′９ 重要な血液凝固因子は下記のものを包含する： ペプチド及び蛋白質ホルモン 甲状線ホルモン（パラトロモン） チロカルシトニン インシュリン グルカゴン リラクシン エリスロポイエチン メラノトロピン （黒色細胞刺激ホルモン：インターメジン） ソマトトロピン（成長ホルモン） コルチコトロピン（副賢皮質ホルモン） チロトロピン 胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン） 黄体刺激ホルモン（ルテオトロピン、プロラクチン） ゴナドトロピン（絨毛ゴナドトロピン） 組織ホルモン セクレチン ガストリン アンギオテンシンＩ及びII ブラジキニン ヒト胎盤ラクトゲン 脳下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン バソプレッシン 放出因子（ＲＦ） ＣＲＦ、ＬＲＦ、ＴＲＦ、ソマトトロピン−ＲＦ、ＧＲ
Ｆ、ＦＳＨ−ＲＦ、ＰＩＦ、ＭＩＦ 該当する他のポリマー物質はムコ多糖類及び多糖類であ
る。

微生物から誘導される詳細な抗原性多糖類は下記のとお
りである： 分析する微生物は、そのままでもよいし、溶解してもよ
いし、すりつぶしてもよいしあるいは破砕してもよい。
例えば抽出によって得られた組成物または部分を分析す
る。該当する微生物としては下記のものを挙げるとがで
きる： コリネバクテリウム属 ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae） 肺炎双球菌（Pneumococci） 肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae） 連鎖球菌 化膿連鎖球菌（Steptcoccus pyogens） 唾液連鎖球菌（Streptococcus salivarus） ブドウ球関 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus） 白色ブドウ球菌（Staphylococcus albus） ナイセリア（Neisseriae） 髄膜炎菌（Neisseria meningitidis） 淋菌（Neisseria gonorrheae） 腸内細菌科 他の腸内細菌 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa） アルカリゲネス・フェカーリス （Alcaligenes faecalis） ビブリオ・コレラ（Vubrio cholerae） ヘモフィラス−ボルデテラ（Hemophilus−Bordetella）
群 インフルエンザヘモフィラス （Hemophilus influenzae） ジュクレヘモフィラス（Ｈ．ducreyi） ヘモフィラス・ヘモフィラス （Ｈ．hemophilus） ヘモフィラス・エジプティクス （Ｈ．aegypticus） 非溶血性インフルエンザ菌 （Ｈ．parainfluenzae） 百日咳菌（Bordetella pertussis） パスツレラ属（Pasteurella） パスツレラ・ペスチス （Pasteurella pestis） パスツレラ・ツラレウシス （Pasteurella tulareusis） ブルセラ属（Brucellae） マルタ熱菌（Brucella melitensis） ウシ流産菌（Brucella abortus） ブタ流産菌（Brucella suis） 好気性芽胞形成細菌 炭疽菌（Bacillus anthracis） 枯草菌（Bacillus sibtilis） 巨大菌（Bacillus megaterium） バシラス・セレラス（Bacillus cereus） 嫌気性芽胞形成細菌 ボツリヌス菌（Clostridium botulinum） 破傷風菌（Clostridium tetani） ウェルシュ菌（Clostridium perfringens） クロストリジウム・ノビイ （Clostridium novyi） セプチック菌（Clostrium septicum） ヒストリチクス菌 （Clostridium histolyticum） クロストリジウム・テルチウム （Clostridium tertium） クロストリジウム・バイファーメンタンス （Clostridium bifermentans） スポロゲネス菌（Clostridium sporogenes） ミコバクテリウム属 結核菌（Mycobacterium tuberculosis hominis） ウシ結核菌（Mycobacterium bovis） ミコバクテリウム・アビウム （Mycobacterium avium） 癩菌（Mycobacterium leprae） パラ結核菌（Mycobacterium paratuberculosis） 放線菌（菌状細菌） アクチノマイセス・イスラエリイ （Actinomyces israelii） ウシ放線菌（Actinomyces bovis） アクチノマイセス・ネスランディイ （Actinomyces naeslundii） ノカルジア・アステロイデス （Nocardia asteroides） ノカルジア・ブラジリエンス （Nocardia brasiliensis） スペロヘータ 梅毒トレポネマ（Treponema pallidum）、トレポネマ
・パーテニュエ（Treponema pertenue）、トレポネマ
・カラテウム（Treponema carateum）、回帰熱ボレリ
ア（Borrelia recurrentis）、ワイル病菌（Leptospir
a icterohemorrhagiae）、イヌ・レプトスピラ（Lepto
spira canicola）、最小螺旋菌（Spirillum minu
s）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Strepto
bacillus moniliformis） マイコプラズマ 肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae） 他の病原菌 リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytoge
nes） 豚丹毒菌（Erysupelothrix rhusiopathiae） モニリア様連鎖状杆菌 （Streptobacillus moniliformis） ドンバニア・グラニュロマチス （Donvania granulomatis） バルトネラ・バチリホルミス （Bartonella bacilliformis） リケッチア（細菌様寄生虫） 発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazekii） リケッチア・モーセリ （Rickettsia mooseri） リケッチア・リケッティ （Rickettsia rickettsii） 地中海熱リケッチア （Rickettsia conori） リケッチア・オーストラーリス （Rickettsia australis） リケッチア・シビリクス （Rickettsia sibiricus） リケッチア・アカリ （Rickettsia akari） リケッチア・ツツガムシ （Rickettsia tsutsugamushi） リケッチア・ブルネティ （Rickettsia burnetii） リケッチア・クィンターナ （Rickettsia quintanm） クラミジア（分類不可能の寄生生物、細菌／ウィルス） クラミジア・エージェンシ（Chlamydia agents） （命名不確定） 菌類 クリプトコッカス・ネオフォルマンス （Cryptococcus neoformans） ブラストマイセス・デルマテイジス （Blastomyces dermatidis） ヒストプラスマ・カプスラーツム （Histoplasma capsulatum） コクシジオイデス・イミティス （Coccidioides immitis） パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス （Paracoccidioides brasiliensis） カンジダ・アルビカンス （Candida albicans） アスペルギラス・フミガーツス （Aspergillus fumigatus） ムコール・コリムビファー （Mucor corymbifer）〔アグシジア・コリムビフェラ
（Absidia corymbifera）〕 スポロトリクム・シェンキィ （Sporotrichum schenkii） フォンセカエ・ペドロソイ （Fonsecaea pedrosoi） フォンセカエ・コンパクタ （Fonsecaea compacta） フォンセカエ・デルマティジス （Fonsecaea dermatidis） クラドスポリウム・カリオニイ （Cladosporium carrionii） フィアロフィーラ・ヴェルコサ （Phialophora verrucosa） アスペルギルス・ニデュランス （Aspergillus nidulans） マズレラ・ミセトミ （Madurella mycetomi） マズレラ・グリセア （Madurella grisea） アンシュリア・ボイディ （Allescheria boydii） フィアロスフォーラ・ジィーンセルメイ （Phialosphora jeanselmei） 石膏状小胞子菌 （Microsporum gypseum） 毛瘡白癬菌 （Trichophyton mentagrodhytes） ケラチノマイセス・アジロイ （Keratinomyces ajelloi） イヌ小胞子菌（Microsporum canis） 紅色白癬菌（Trichophyton rubrum） ミクロスポルム・オーズィニイ （Microsporum audouini） ウィルス アデノウィルス ヘルペスウィルス 単純疱疹（Herpes simplex） 水疱（Varicella）（Chicken pox） 帯状疱疹（Herpes zoster）（Shingles） ウィルスＢ サイトメガロウィルス（Cytomegalovius） 発疹ウィルス 痘瘡（Variola）（smallpox） 牛痘（Vaccinia） ポックスウィルス・ボビス （Poxvirus bovis） 種痘疹（Paravaccinia） モルスカム・コンタギオスム （Molluscum contagiosum） ピコルナウィルス ポリオウィルス（Poliovirus） コックスサッキーウィルス （Coxsackievirus） エコーウイルス（Echovirus） リノウィルス（Rhinovirus） ミキソウィルス インフルエンザ（Ａ、Ｂ及びＣ） パラインフルエンザ（１−４） 流行性耳下腺炎ウィルス （Mumps Virus） ニューキャッスル病ウィルス 麻疹ウィルス（Measles Virus） キペストウィルス （Rinderpest Virus） 犬ジステンパーウィルス 呼吸ジンシチウムウィルス （Respiratory Syncytial Virus） 風疹ウィルス （Rubella Virus） アルボウィルス（Arboviruse） イースタン・イクイン・エンセファリチス・ウィルス
（Eastern Equine Encephalitis Virus） ウェスタン・イクイン・エンセファリチス・ウィルス
（Western Equine Encephalitis Virus） シンドビス・ウィルス（Sindbis Virus） チクグンヤ（Chikugunya）ウィルス セムリキ・フォレスト（Semliki Forest）ウィルス メヨーラ（Mayora）ウィルス セント・ルイス・エンセファリチス（St.Louis Enceph
alitis）ウィルス カリフォルニア・エンセファリチス （California Encephalitis）ウィルス コロラド・チック・フィーバー （Colorado Tick Fever）ウィルス 黄熱病ウィルス（Yellow Fever Virus） デング熱ウィルス（Pengue Virus） レオウィルス（Reovirus） レオウィルス １−３型 肝炎ウィルス 肝炎Ａウィルス 肝炎Ｂウィルス 腫瘍ウィルス ラウシャー白血病（Rauscher Leukemia）ウィルス グロス病ウィルス（Gross Virus） マロニイ白血病（Maloney Leukemia）ウィルス モノエピトープ性リガンド分析物は一般に約100〜2,000
の分子量、更に普通には125〜1,000の分析量を有する。
該当する分析物は薬剤、代謝産物、有害生物防除剤、汚
染物等を包含する。該当する薬剤にはアルカロイドが含
まれる。アルカロイドのうちには、モルフィンアルカロ
イド（モルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキストロメト
ルファン、これらの誘導体及び代謝産物を含む）：コカ
インアルカロイド（コカイン及びベンゾイルエクゴニ
ン、これらの誘導体及び代謝産物を含む）：麦角アルカ
ロイド（リセルグ酸のジェチルアミドを含む）：ステロ
イドアルカロイド：イミナゾイルアルカロイド：キナゾ
リンアルカロイド：イソキノリンアルカロイド：キノリ
ンアルカロイド（キニン及びキニジン）：ジテルペンア
ルカロイド：これらの誘導体及び代謝産物がある。

薬剤の次のグループはステロイド（エストロゲン、ゲス
トゲン、アンドロゲン、副賢皮質ステロイドを含む）、
胆汁酸、強心配糖体及びアグリコン（ジゴキシン及びジ
ゴキシゲニン、サポニン及びサポゲニンを含む）、これ
らの誘導体及び代謝産物を包含する。更に、ジエチルス
チルベストロールようなステロイド擬似物質が含まれ
る。

薬剤の次のグループは、５〜６環員を有するラクタムで
あり、これにはバルビツレート、例えばフェノバルビタ
ール及びセコバルビタール、ジフェニルヒダントニン、
ピリミドン、エトスクシイミド及びこらの代謝産物があ
る。

更に薬剤は炭素原子数２〜３個のアルキル基を有するア
ミノアルキルベンゼンであり、これにはアンフェタミ
ン、カテコールアミン（エフェドリン、Ｌ−ドーバ、エ
ピネフリンを含む）、ナルセイン、パパベリン、これら
の代謝産物及び誘導体がある。

薬剤としては更にベンズヘテロ環式化合物があり、これ
にはオキシアゼパム、クロルプロマジン、テグレトー
ル、イミプラミン、これらの誘導体及びフェノチアジン
である。

薬剤の次のグループはプリンであり、これにはテオフィ
リン、カフェイン、これらの代謝産物及び誘導体があ
る。

薬剤グループは更にマリジュアナ（marijuana）から誘
導されたものを包含し、これにはカンナビノール及びテ
トラヒドロカンナビノールがある。

薬剤グループは更にビタミン類、例えばＡ、Ｂ例えばＢ
_１２′、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＫ、葉酸、チアミンである。

薬剤グループは更に、ヒドロキシル化及び不飽和の程度
及び位置によって異なるプロスタグランジン類である。

薬剤グループは更に抗生物質であり、これにはペニシリ
ン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサ
イクリン、テトラマイシン、これらの代謝産物及び誘導
体がある。

薬剤グループは更にヌクレオシド及びヌクレオチドであ
り、これには適切な糖及びホスフェート置換基を有する
ATP、NAD、FMN、アデノシン、グアノシン、チミジン及
びシチジンがある。

薬剤グループは更に種々の個々の薬剤であり、これには
メサドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、
アミトリプチリン、ノルトリプチリン、リドカイン、プ
ロカインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラ
ノロール、グリセオフルビン、バルプロ酸（valproic
acld）、ブチロフェノン、抗ヒスタミン剤、抗コリン作
働薬、例えばアトロピン、これらの代謝産物及び誘導体
がある。

化合物グループは更にアミノ酸及び小さいペプチドであ
り、これらにはポリヨードチロニン、例えばチロキシ
ン、及びトリヨードチロニン、オキシトシン、ACTH、ア
ンギオテンシン、met−及びleu−エンケファリン、これ
らの代謝産物及び誘導体がある。

病気の状態に関係する代謝産物はスペルミン、ガラクト
ース、フエニルピルビン酸及びポルフィリン１型を包含
する。

薬剤グループは更にアミノグリコシド、例えばゲンタマ
イシン、カナマイシン、トブラマイシン及びアミカシン
である。

該当する有害生物防除剤には、ポリハロゲン化ビフエニ
ル、ホスフェートエステル、チオホスフェート、カルバ
メート、ポリハロゲン化スルフェンアミド、これらの代
謝産物及び誘導体がある。

レセプター分析物に関しては、分析量は一般に１０，０
００〜２×１０^６、更に普通には１０，０００〜１０^６
である。免疫グロブリン、IgA、IgG、IgE及びIgMに関し
ては、分析量は一般に約１６０，０００〜約１０^６であ
る。酵素の分析量は通常約１０，０００〜６，０００，
０００であろう。天然レセプターは、アビジン、チロキ
シン結合グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、
トランスコルチン等を含めて広範囲に及び、一般に少な
くとも約２５，０００の分析量を有し、１０^６またはそ
れ以上の分析量を有していてもよい。

リガンドアナローグ リガンドアナローグは、水素または官能基が、結合また
は活性官能基を有する別の分析に共有結合を形成する官
能性を有する結合基、例えばヒドロキシル基、アミノ
基、アリール基、チオ基、オレフィン基等で置換されて
いる点でリガンドとは異なり、共有結合を形成する場合
には生じる化合物は、結合する分子による水素の置換よ
り多くの点でリガンドとは異なる。結合基は通常水素以
外の原子を１〜２０個有し、水素以外の原子は炭素酸
素、硫黄、窒素及び原子番号１７〜３５のハロゲンであ
る。関係する官能基はカルボニル基、オキソ基、非オキ
ソ基、活性ハロゲン、ジアゾ基、メルカプト基、エチレ
ン基、特に活性エチレン基、アミノ基等である。異種原
子の数は一般に約０〜６個、更に普通には約１〜６個、
好ましくは約１〜４個である。結合基の説明は米国特許
第３，８１７８，３７号明細書に見られ、その開示を参
考として本発明細書に含める。

結合基は大部分脂肪族であるが、ジアゾ基を有する場合
には芳香族基が該当する。一般に、結合基は連鎖中に約
１〜１０個、更に普通には約１〜６個の原子を有する２
価の連鎖である。酸素は通常オキソまたはオキシとして
存在し、炭素及び水素に結合し、好ましくは炭素にだけ
結合するが、窒素は通常アミノ基として存在し、炭素に
だけ結合するか、またはアミド基として存し、硫黄は酸
素と同様である。

結合基と結合すべき分析との間に共有結合を形成する普
通の官能成分はアルキルアミン、アミド、アミジン、チ
オアミド、尿素、チオ尿素、グアニジン及びジアゾであ
る。

ポリペプチドに結合させる場合に特に使用される結合基
はカルボン酸を包含する基であり、これらの基はジイミ
ドと共に、または炭酸モノエステルとの混成無水物とし
て、または活性カルボン酸エステル、例えばＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド、またはｐ−ニトロフエニルとして
使用することができる。窒素アナローグはイミドエステ
ルとして使用することができる。還元性アミノ化条件下
でイミンを形成するため、例えば珊水素化物の存在でア
ルキルアミンを生成させるため、アルデヒドを使用する
ことができる。使用しうる他の非オキソカルボニル基は
イソシアネート及びイソチオシアネートである。更に、
結合ハロゲン化物、特にブロモアセチル基を使用しう
る。

多くの場合、リガンドは結合基を結合する部位として使
用しうる官能基を１個以上有する。特に、ヒドロキシ
基、アミノ基及びアリール基、特に活性アリール基が使
用される。また、オキソ官能基及びカルボキシメチル基
のような結合基に結合する部位として使用されるヒドロ
キシル基からオキシムを使用することができる。

リガンド、或いはリガンドが結合すべき化合物中に存在
する官能基、所望の結合基の性質及び長さ等に応じて、
結合基の選択広く変動する。

シグナル発生系 シグナル発生系は少なくとも１個の構成員を有し、２個
以上の構成員を有してもよい。シグナル発生系は、検出
可能のシグナルを試料中の分析物の量またはその量に関
連したレベルで生じる生成物を生成させる。シグナルは
通常固体支持体上に生じ、固体支持体から通常測定され
る。測定は、通常、電磁線の吸収または放出に関係す
る。

広範な種々のシグナル発生系を使用しうる。更に、各シ
グナル発生系に関して、シグナル発系の種々の成分を、
シグナル標識−mip結合体またはシグナル標識−支持体
結合体として使用しうる。更に、シグナル標識−mip結
合体は溶解して準備するか、またはmip−支持体結合体
に複合させることができる。

種々の結合体を共有結合または非共有結合で、直接また
は間接的に結合させることができる。共有結合する場合
には、個々の結合基は結合すべき２個の基の性質及びこ
れらの基の各作用に左右される。多数の結合基及び結合
方法が文献に開示されている。リガンドアナローグに関
する部分にかなりの数の結合基が示されている。

レセプターを使用して結合を達成することもできる。例
えば、抗原をレセプター、例えば抗原に対する抗体を介
して支持体に結合させることができる。レセプターは共
有結合または非共有結合、例えば吸着により支持体に結
合させることができる。

シグナル発生系は、任意に下記のカテゴリー、即ち色原
体、触媒反応、化学発光及び放射性標識に分けられる。

色原体 色原体は、特殊な範囲で光を吸収して色を観察できる
が、または特定の波長若しくは波長範囲の光で照射する
場合に光、例えば螢を発する化合物を包含する。

シグナル標識として光の吸収によって測定される染料を
使用しても、所望の感度は得られない。複数の吸光性官
能基を含むシグナル標識を使用することもできるが、一
般に濃度は充分なシグナルを生ずるには不充分である。
しかしながら、実質的に透明な免疫吸着帯域と共に、シ
グナル標準の免疫結合を適切な深さにし、mipに結合し
た発色官能基を充分な数にすることによって、シグナル
標識として可視範囲の光を吸収する染料を使用すること
もできる。

複数のリガンド及びシグナル標識が結合している可溶性
ハブ核を使用することによって系の感度を著しく高める
ことができる。本発明の系は免疫吸着帯域を極めて完全
に洗浄しうるので、バックグラウンド値を最小にするこ
とができる。

染料の選択は広く変動でき、第一に免疫吸着帯域支持体
による吸収の最小の強い色を生ずるように選択される。
染料の種類は例えば、キノリン染料、トリアリールメタ
ン染料、アクリジン染料、アリザリン染料、フタレイン
染料、昆虫染料、アゾ染料、アントラキノイド染料、シ
アニン染料、フェナザチオニウム染料及びフェナザオキ
ソニウム染料である。

広範な螢光物質を単独でまたは消光物質分子と共に使用
することができる。

該当する螢光物質は一次官能性化合物を含む広範なカテ
ゴリーに入る。これらの一次官能性化合物は１−及び２
−アミノナフタレン、ｐ，ｐ′−ジアミノスチルベン、
ピレン、第四級フェナントリジン塩、９−アミノアクリ
ジン、ｐ，ｐ′−ジアミノベンゾフェノンイミン、アン
トラセン、オキサカルボシアニン、メロシアニン、３−
アミノエクイレニン、ペリレン、ビス−ベンズオキサゾ
ール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−ベン
ゾフェナジン、レチノール、ビス−３−アミノピリジュ
ウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、ステロフ
ェノール、ベンズイミダゾリルフエニルアミン、２−オ
キソ−３−クロメン、インドール、キサンテン、７−ヒ
ドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチレート、ス
トロファンチジン、ポルフィリン、トリアリールメタン
及びフラビンである。

結合のための官能基を有するか、またはこのような官能
基を含むように変性しうる個々の螢光性化合物はダンシ
ルクロリド、フルオレセイン、例えば３，６−ジヒドロ
キシ−９−フエニルキサントヒドロール、ローダミンイ
ソチオシアネート、Ｎ−フエニル１−アミノ−８−スル
ホナトナフタリン、Ｎ−フエニル２−アミノ−６−スル
ホナトナフタリン、４−アセトアミド−４−イソチオシ
アナトスチルベン−２，２′−ジスルホン酸、ピレン−
３−スルホン酸、２−トルイジノナフタレン−６−スル
ホネート、Ｎ−フエニル、Ｎ−メチル２−アミノ−ナフ
タレン−６−スルホネート、エチジウムブロミド、アテ
ブリン、オーロミン−０、２−（９′−アントロイル）
パルミテート、ダンシルホスファチジルエタノールアミ
ン、Ｎ，Ｎ′−ジオクタデシルオキサカルボシアニン、
Ｎ，Ｎ′−ジヘキシルオキサカルボシアニン、メロシア
ニン、４−（３′−ピレニル）ブチレート、ｄ−３−ア
ミノデスオキシエクイレニン、１２−（９′−アントロ
イル）ステアレート、２−メチルアントラセン、９−ビ
ニルアントラセン、２，２′−（ビニレン−ｐ−フエニ
レン）−ビス−ベンゾオキサゾール、ｐ−ビス〔２−
（４−メチル−５−フエニルオキサゾリル）〕ベンゼ
ン、６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェナジン、
レチノール、ビス（３′−アミノピリジニウム）１，１
０−デカンジイルジヨ−ジド、ヘレブリゲニンのスルホ
ナフチルヒドラゾン、クロルテトラサイクリン、Ｎ−
（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−
クロメニル）マレイミド、Ｎ−〔ｐ−（２−ベンゾイミ
ダゾイル）−フエニル〕マレイミド、Ｎ−（４−フルオ
ルアンチル）マレイミド、ビス（ホモバニリン酸）、レ
サザリン、４−クロロ−７−ニトロー２，１，３−ベン
ゾオキサジアゾール、メロシアニン５４０、レソルフィ
ン、ローズベンガル及び２，４−ジフエニル−３（２
Ｈ）−フラノンである。

螢光物質は約３００ｎｍ以上、好ましくは３５０ｎｍ以
上、更に好ましくは約４００ｎｍ以上の光を吸収すべき
であり、通常、吸収した光の波長より１０ｎｍ以上高い
波長で発光するのが好ましい。免疫吸着帯域に存在する
蛋白質が干渉しないことが第一に重要なことである。

結合した染料の吸収及び発光特性が未結合であることに
注意すべきである。従って、染料の種々の波長範囲及び
特性について言及する場合には、使用した染料を示すも
のであり、結合しておらず、任意の溶媒中で特性を示す
染料ではない。

螢光物質は、単一の螢光物質がシグナルを増加しうる程
度まで吸収性染料より好ましい。光で螢光物質を照射す
ることによって複数の発光を受ることができる。従っ
て、単一のラベルが複数の測定可能の結果を生じうる。

他の種々の組合せ及びプロトコルを分析物の性質に応じ
使用することができる。

触媒作用 前記のように、酵素触媒及び非酵素触媒を使用すること
ができる。酵素触媒は屡々、一層迅速な反応及び反応の
種類における望ましい多様性を生じ、良好な特性を有す
るので、酵素触媒を使用するのが好ましい。

酵素を選択する際には、該当する反応に伴なう事の他
に、多くのことが考えられる。これらの考慮事項は酵素
の安定性、高い代謝回転率の望ましさ、物理的環境にお
ける変化に対する回転率の感受性、基質及び生成物の性
質、酵素の入手可能性及び酵素の性質に対する酵素の結
合の作用を包含する。

次に、国際生化学連盟（International Union of Bi
ochemistry）の分類により示された酵素のカテゴリイを
挙げる。

第II表 １．酸化還元酵素群 1.1 供与体のCH-OH基に働く 1.1.1 NADまたはNADPを受体とする 1.1.2 チトクロームを受体とする 1.1.3 Ｏ_２を受体とする 1.1.99 その他を受体とする 1.2 供与体のアルデヒドまたはケト基に働く 1.2.1 NADまたはNADPを受体とする 1.2.2 チトクロームを受体とする 1.2.3 Ｏ_２を受体とする 1.2.4 リポエイトを受体とする 1.2.99 その他を受体とする 1.3 供与体のCH−CH基に働く 1.3.1 NADまたはNADPを受体とする 1.3.2 チトクロームを受体とする 1.3.3 Ｏ_２を受体とする 1.3.99 その他を受体とする 1.4 供与体のCH−NH₂基に働く 1.4.1 受体としてNADまたはNADPを有する 1.4.3 受体としてＯ_２を有する 1.5 供与体のＣ−NH基に働く 1.5.1 NADまたはNADPを受体とする 1.5.3 Ｏ_２を受体とする 1.6 供与体としての還元型NADまたはNADPに働く 1.6.1 NADまたはNADPを受体とする 1.6.2 チトクロームを受体とする 1.6.4 ジスルフィド化合物を受体とする 1.6.5 キノンまたは関連化合物を受体とする 1.6.6 窒素含有基を受体とする 1.6.99 その他を受体とする 1.7 供与体としての他の窒素含有基化合物に働く 1.7.3 Ｏ_２を受体とする 1.6.99 その他を受体とする 1.8 供与体の硫黄基に働く 1.8.1 NADまたはNADPを受体とする 1.8.2 Ｏ_２を受体とする 1.8.4 ジスルフィド化合物を受体とする 1.8.5 キノンまたは関連化合物を受体とする 1.8.6 窒素含有基を受体とする 1.9 供与体のヘムに働く 1.9.3 Ｏ_２を受体とする 1.9.6 窒素含有基を受体とする 1.10 供与体としてのジフェノール及び関連物質に働く 1.10.3 Ｏ_２を受体とする 1.11 受体としてのＨ_２Ｏ_２に働く 1.12 供与体としての水素に働く 1.13 単一の供与体に働いて酸素を取り込ませる（酸素
酵素） 1.14 供与体対に働いて一方の供与体に酸素を取り込ま
せる（ヒドロキシラーゼ） 1.14.1 還元型NADまたはNADPを一方の供与体として
用いる 1.14.2 アスコルビン酸塩を一方の供与体として用い
る 1.14.3 還元型プテリジンを一方の供与体として用い
る ２．転移酵素群 2.1 −炭素基の転移 2.1.1 メチルトランスフェラーゼ 2.1.2ヒドロキシメチル−、ホルミル−及び関連のト
ランスフェラーゼ 2.1.3 カルボキシル−及びカルバモイルトランスフ
ェラーゼ 2.1.4 アミジノトランスフェラーゼ 2.2 アルデヒドまたはケトン基の転移 2.3 アシル基転移酵素 2.3.1 アシルトランスフェラーゼ 2.3.2 アミノアシルトランスフェラーゼ 2.4 グリコシル基転移酵素 2.4.1 ヘキソシルトランスフェラーゼ 2.4.2 ペントシルトランスフェラーゼ 2.5 アルキルまたは関連の基の転移 2.6 窒素含有基の転移 2.6.1 アミノトランスフェラーゼ 2.6.3 オキシミノトランスフェラーゼ 2.7 燐含有基の転移 2.7.1 アルコール基を受体とするホスホトランスフ
ェラーゼ 2.7.2 カルボキシル基を受体とするホスホトランス
フェラーゼ 2.7.3 窒素含有基を受体とするホスホトランスフェ
ラーゼ 2.7.4 ホスホ基を受体とするホスホトランスフェラ
ーゼ 2.7.5 見かけ上は分子内へのホスホトランスフェラ
ーゼ 2.7.6 ピロホスホトランスフェラーゼ 2.7.7 ヌクレオチジルトランスフェラーゼ 2.7.8 その他の置換されたホスホ基に関するトラン
スフェラーゼ 2.8 硫黄含有基の転移 2.8.1 硫黄トランスフェラーゼ 2.8.2 スルホトランスフェラーゼ 2.8.3 CoA−トランスフェラーゼ ３．加水分解酵素群 3.1 エステル結合に働く 3.1.1 カルボン酸エステルヒドロラーゼ 3.1.2 チオールエステルヒドロラーゼ 3.1.3 燐酸モノエステルヒドロラーゼ 3.1.4 燐酸ジエステルヒドロラーゼ 3.1.5 三燐酸モノエステルヒドロラーゼ 3.1.6 硫酸エステルヒドロラーゼ 3.2 グリコシル化合物に働く 3.2.1 グリコシドヒドロラーゼ 3.2.2 Ｎ−グリコシル化合物を加水分解する 3.2.3 Ｓ−グリコシル化合物を加水分解する 3.3 エーテル結合働く 3.3.1 チオエーテルヒドロラーゼ 3.4 ペプチド結合に働く（ペプチド加水分解酵素） 3.4.1 α−アミノアシル−ペプチドヒドロラーゼ 3.4.2 ペプチジル−アミノ酸ヒドロラーゼ 3.4.3 ジペプチドヒドロラーゼ 3.4.4 ペプチジル−ペプチドヒドロラーゼ 3.5 ペプチド結合以外のＣ−Ｎ結合に働く 3.5.1 直鎖アミド中 3.5.2 環状アミド中 3.5.3 直鎖アミジン中 3.5.4 環状アミジン中 3.5.5 シアン化物中 3.5.99 その他の化合物中 3.6 酸無水物結合に働く 3.6.1 ホスホリル含有無水物中 3.7 Ｃ−Ｃ結合に働く 3.7.1 ケトン物中 3.8 ハロゲン化物結合に働く 3.8.1 Ｃ−ハロゲン化物化合物中 3.8.2 Ｐ−ハロゲン化物化合物中 3.9 Ｐ−Ｎ結合に働く ４．分解酵素群 4.1 炭素−炭素分解酵素 4.1.1 カルボキシ−リアーゼ 4.1.2 アルデヒド−リアーゼ 4.1.3 ケト酸−リアーゼ 4.2 炭素−酸素分解酵素 4.2.1 ヒドロ−リアーゼ 4.2.99 その他の炭素−酸素分解酵素 4.3 炭素−窒素分解酵素 4.3.1 アンモニア−リアーゼ 4.3.2 アミジン−リアーゼ 4.4 炭素−硫黄分解酵素 4.5 炭素−ハロゲン化物分解酵素 4.99 その他の分解酵素 ５．異性体化酵素群 5.1 ラセマーゼ及びエピマーゼ 5.1.1 アミノ酸及びその誘導体に働く 5.1.2 ヒドロキシ酸及びその誘導体に働く 5.1.3 炭水化物及びその誘導体に働く 5.1.99 その他の化合物に働く 5.2 シス−トランスイソメラーゼ 5.3 分子内酸化還元酵素 5.3.1 アルドース及びケトースの相互変換 5.3.2 ケト及びエノール基の相互変換 5.3.3 Ｃ＝Ｃ結合の転位 5.4 分子内トランスフェラーゼ 5.4.1 アシル置の転移 5.4.2 ホスホリル基の転移 5.4.99 その他の基の転移 5.5 分子内リアーゼ 5.99 その他の異性体化酵素 ６．結合酵素または合成酵素 6.1 Ｃ−Ｏ結合の生成 6.1.1 アミノ酸−RNAリガーゼ 6.2 Ｃ−Ｓ結合の生成 6.2.1 酸−チオールリガーゼ 6.3 Ｃ−Ｎ結合の生成 6.3.1 酸−アンモニアリガーゼ（アミドシンテター
ゼ） 6.2.2 酸−アミノ酸リガーゼ（ペプチドシンテター
ゼ） 6.3.3 シクローリガーゼ 6.3.4 その他のＣ−Ｎリガーゼ 6.3.5 グルタミンをＮ−供与体とするＣ−Ｎリガー
ゼ 6.4 Ｃ−Ｃ結合の生成 特に重要なのはクラス１の酵素である。酸化還元酵素及
びクラス３の加水分解酵素、ならびにクラス２の酵素で
ある転移酵素、クラス４の分解酵素及びクラス５の異性
体化酵素もまた、特別な状況では重要である。

次の表に、酵素の特定のサブクラス及び特に重要なサブ
クラス内の特定の酵素を示す。酸化還元酵素の中ではNA
DもしくはNADP、酸素または過酸化水素を含むものが特
に重要であり、加水分解酵素の中ではホスフェート及び
グリコシドを含むものが特に重要である。

第III表 １．酸化還元酵素群 1.1 供給体のCH−OH基に働く 1.1.1 NADまたはNADPを受体とする １． アルコールデヒドロゲナーゼ ６． グリセロールデヒドロゲナーゼ 27. ラクテートデヒドロゲナーゼ 37. マレートデヒドロゲナーゼ 49. グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ 1.1.3 Ｏ_２を受体とする ４． グルコースオキシダーゼ ガラクトースオキシダーゼ 1.2 供与体のアルデヒドまたはケト基に働く 1.2.1 NADまたはNADPを受体とする １２． グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ 1.2.3 Ｏ_２を受体とする ２． キサンチンオキシダーゼ ルシフェラーゼ 1.4 供与体のCH−NH₂基に働く 1.4.3 Ｏ_２を受体とする ２． Ｌ−アミノ酸オキシターゼ ３． Ｌ−アミノ酸オキシターゼ 1.6 供与体としての還元型NAまたはNADPに働く 1.6.99 その他を供与体とする ジアフォラーゼ 1.7 供与体としてのその他の窒素含有化合物に働く 1.7.3 Ｏ_２を受体とする ３ 尿素分解酵素 1.11 受体としてのＨ_２Ｏ_２に働く 1.11.1 ６． カタラーゼ ７． 過酸化酵素 ２．転移酵素群 2.7 燐含有基の転移 2.7.1 CH−OHを受体とするホスホトランスフェラー
ゼ １． ヘキソキナーゼ ２． グルコキナーゼ 15. リボキナーゼ 28. トリオキナーゼ 40. ピルベートキナーゼ 2.7.5 １． ホスホグルコムターゼ ３．加水分解酵素群 3.1 エステル結合に働く 3.1.1 カルボン酸エステルヒドロラーゼ ７． コリンステラーゼ ８． 擬コリンステラーゼ 3.1.3 燐酸モノエステルヒドロラーゼ １． アルカリホスファターゼ ２． 酸ホスファターゼ ９． グルコース−６−ホスファターゼ 11. フルクトースジホスファターゼ 3.1.4 燐酸ジエステルヒドロラーゼ １． ホスホジエステラーゼ ３． ホスホリパーゼＣ 3.2 グリコシル化合物に働く 3.2.1 グリコシドヒドロラーゼ １． α−アミラーゼ ２． β−アミラーゼ ４． セルラーゼ 17. ムラミダーゼ 18. ノイラミニダーゼ 21. β−グルコシダーゼ 23. β−ガラクトシダーゼ 31. β−グルクロニダーゼ 35. ヒアルロニダーゼ 3.2.2 Ｎ−グリコシル化合物の加水分解 ５． DPNアーゼ ４．分解酵素 4.1 炭素−炭素分解酵素 4.1.2 アリデヒドリアーゼ 13. アルドリアーゼ 4.2.1 ヒドロ−リアーゼ １． 炭酸脱水素酵素 ５．異性体化酵素 5.4 分子内トランスフェラーゼ 5.4.2 ホスホリル基の転移 対の触媒、通常２種以上の酵素を使用することは本発明
に特に有利であり、その場合一方の酵素の生成物は他方
の酵素の基質として作用する。１種以上の酵素が表面に
結合するが、１種の酵素は必らずmipに結合している。
また、２種の酵素をmipに結合させ、付加的酵素を表面
に結合させることができる。

溶質は任意の１種の酵素、好ましくは表面に結合した酵
素の基質である。酵素反応は、溶質を変性して別の酵素
の基質である生成物を生じるか、または酵素基質として
作用する溶質を多量に含さない化合物を製造することが
できる。第一の状態は、グルコース−６−ホスフェート
がアルカリホスファターゼによってグルコースに触媒加
水分解されることで説明され、この場合グルコースはグ
ルコースオキシダーゼの基質である。第二の状態は、グ
ルコース−６−ホスフェートから形成したグルコースが
グルコースオキシダーゼによって酸化されて過酸化水素
が生じ、この過酸化物はシグナル発生体前駆物及び過酸
化物と酵素により反応してシグナル発生体を生じる。

対の触媒は酵素と非酵素触媒であってもよい。酵素が非
酵素触媒によって接触される反応を受ける反応体を生成
しうるか、または非酵素触媒が酵素の基質（補酵素を含
む）を生成する。例えば、G6PDHはNAD及びG6PをNADHに
変換する反応を触媒し、NADHがテトラゾリウム塩と反応
させて不溶性染料を生じる。

本発明に使用しうる広範な非酵素触媒は米国特許第４，
１６０，６４５号明細書に見られ、その適切な部分を参
考として本明細書に含める。非酵素触媒反応体として、
１位の電子移動によって反応する第一の化合物及び２位
の電子移動によって反応する第二の化合物を使用し、こ
の場合２種の反応体は触媒の不存在では反応するとして
も徐々に相互に反応しうる。

表面でシグナル発生化合物を生ずるため種々の酵素の組
合せを使用することができる。特に、不溶性シグナル発
生体を作るため、加水分解酵素の組合せを使用すること
ができる。適切な基質を使用することによって単一の加
水分解酵素を酵素対にほぼ同等に作用させることができ
る。また、加水分解酵素及び酸化還元酵素の組合せはシ
グナル発生体を生じうる。酸化還元酵素の組合せを使用
して不溶性シグナル発生を生成させることもできる。下
記の表には、表面にシグナル発化合物を優先的に生成さ
せるため使用しうる種々の組合せを示す。前記のよう
に、表面の触媒を適切に選択することによって、１つの
配合物に比較的多数の試薬を組合せうるので、通常、好
ましい触媒は表面に存在するであろう。

下記の表において、第一の酵素は表面に結合し、第二の
酵素はmipに結合させるものであるが、特別な場合には
これらの位置を逆にするのが好ましい。

前記の多数の染料を適切な溶解要件を有するか、または
本発明に対して適切な溶解要件を有するように変性しう
る他の染料で代えうることは極めて明らかであるる。更
に、局部的に高い濃度の染料を有することによって、染
料が表面に結合しやすくなることを認識すべきである。
更に、バルク溶液から表面へ拡散する染料の量が増加し
ても、表面上に沈殿する染料の量にあまり影響しない。
染料の性質に応じて、染料による光吸収または螢光の場
合には発光を測定することができる。染料の代わりに電
気活性化合物を製造し、表面における電気的性質を測定
することもできる。

検出帯域においてシグナルを発するため種々の技術を使
用することができる。例えば、表面に結合したときに、
検出可能のシグナルを生ずるように、シグナル発生体の
環境を選択的に変性することができる。例えば、エステ
ルまたはエーテルを加水分解して表面に不溶性のｐＨ感
受性染料を成させることができる。表面の局部のｐＨ
は、表面上に帯電基を有することによってバルク溶液と
は実質的に異なるものになるであろう。プロトン濃度に
感受性のシグナル発生化合物を使用することによって、
表面に結合した生成物からの観察されるシグナルは、バ
ルク溶液または液相中の生成物とは著しく異なる。螢物
質−消光物質の対を使用することもでき、この場合に溶
質が表面に結合する不溶性消光物質分子を生じる。表面
上の消光物質分子の量が増加すると、表面に結合した螢
光分子から螢が著しく減少する。

シグナル標識として酵素を使用する代わりに、シグナル
標識として基質を使用することができる。しかしなが
ら、ほとんどの場合に、基質（コーファクターを含め
て）がシグナル標識−mip結合体のシグナル標識である
場合、高度の増幅はない。それにもかかわらず、若の場
合はそれで充分である。例えば、種々の色原体、特に螢
光物質を、非螢性の生成物を生じる、酵素に不安定な官
能基によって変性することができる。例えば、フェノー
ル系螢物質、例えばウンベリフェロンまたはフルオレセ
インの燐酸エステルまたはグリコシジルエーテル（非螢
光助剤）を製造することができる。しかし、エステルま
たはエーテル結合を例えばアルカリンホスファターゼま
たはグリコシダーゼで酵素開裂すると、生じる生成物は
螢性である。この方法では、酵素はシグナル発生体化合
物を発現するため試薬溶液中に加えられる試薬である。

コファクターを使用する場合、コファクターを循環さ
せ、表面上に沈殿する色原体生成物を生成させる。この
種の反応については先に記載した。

化学発光物質 検出可能のシグナルとしての別の光原は化学発光であ
る。化学発光源は、化学反応よって電子的に励起され、
検出可能のシグナルとして作用するか、またか螢光受容
体にエネギーを供与する光を発する化合物に関する。

種々の条件下で化学発光を生ずるため種々の化合物群が
発見された。その１つの化合物群は２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオンである。最も良く知られてい
る化合物は５−アミノ化合物であるルミノールである。
この群は更に５−アミノ−６，７，８−トリメトキシ−
及びジメチルアミノ−〔ｃａ〕ベンズアナローグを含
む。こらの化合物はアルカリ性過酸化水素または次亜塩
素酸カルシウム及び塩基により発光性にされる。別の化
合物群は２，４，５−トリフェニルイミダゾール類であ
り、ロフィンは基本物質の普通名称である。化学発光ア
ナローグはパラ−ジメチルアミノ−及びメトキシ置換基
を含む。。化学発光は、塩基性条件下で酸エステル、
通常例えばｐ−ニトロフェニルのオキサリル活性エステ
ル及び過酸化物、例えば過酸化水素を用いて得ることが
できる。また、ルシフェリンはルシフェラーゼまたはル
シゲニンと共に使用することができる。

放射性ラベル 種々の放射性同位元素を通常使用する。これらはトリチ
ウム（^３Ｈ）、放射性ヨウ素（^１２５Ｉ）、放射性炭素
（^１４Ｃ）、放射性燐（^３２Ｐ）等を含む。化合物を放
射性標識で標識する方法は良く知られている。

補助的材料 本発明のアッセイには屡々、種々の補助的材料が使用さ
れる。特に、酵素基質、コファクター、活性化剤、未標
識mip等がアッセイ媒体に含まれていてよい。

更に、緩衝剤及び安定剤が通常存在する。これらの添加
剤と共に屡々、付加的蛋白質、例えばアルブミン、また
は界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、例えばポリ
アルキレングリコール等が含まれていてよい。

組成物 本発明のアッセイを実施するため、アッセイ装置及び組
成物を準備し、アッセイの感度を最高にするように選択
する。

シグナル標識−mip結合体アッセイ装置に最初に結合さ
せない場合には、試薬溶液は通常シグナル標識−mip結
合体を含む。前記の結合体の他に、必要に応じ他の物質
を含む。試薬の量を予め測定しておき、アッセイの実施
時に精確な測定を必要としないようにするのが望まし
い。

実験 下記の実施例は説明のために示すものであり、限定的な
ものはない。パーセント及び部は特に記載しない限りす
べて重量であるが、液体の混合物については容量に関す
るものである。溶媒が示されていない場合には、水を意
味する。下記の略記号を使用する； CMM−Ｏ^３−カルボキシメチルモルフィン；HRP−西洋わ
さびパーオキシダーゼ；NHS−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド；DMF−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；THF−テ
トラヒドロフラン；BSA−ウシ血清アルブミン；HIgG−
ヒト免疫グロブリンＧ；RT−室温；GO−グルコースオキ
シダーゼ；EDCI−Ｎ−エチル−Ｎ−３−ジメチルアミノ
プロピルカルボジイミド；SS−シュレジッヒャー（Schl
esicher）及びシュネル（Schnell） 例１ モルフィン−西洋わさびパーオキシダーゼ（HR
P）結合体 反応フラスコ中にＯ^３−カルボキシメチルモルフィン１
０μモル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１１μモル及
びEDCIl２μモルをDMFに溶かして合計約１．２mlの容量
にして入れた。試薬を合した後、混合物を窒素で洗浄
し、冷室で一撹拌した。５０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液
（ｐＨ９．５）中のHRP０．５ml（２mg）にDMF１５０m
l、次に前記エステル溶液３０μｌを加え、混合物を４
℃で一夜放置した。次に、反応混合物をＧ５０ゼファデ
ックスの２×３０cmのカラムに施し、０．１Ｍ燐酸塩、
ｐＨ７，６、０．１Ｍ KCl及び検査される蛋白質溶出
した。空隙中のフラクションを集めて、濃度０．２mg／
mlのフラクション５．０mlを得た。放射性トレーサーを
使用してモルフィン／HRPのモル比が１．８６でありHRP
の濃度が２００μｇ／mlであることが判った。

例２ 円形紙に結合する蛋白質 こ合例は紙支持体に蛋白質を結合させるため使用する実
験プロトコルである。ＳＳ５８９黒リボン円形紙（厚
さ０．１９３mm、直径１２．５cm）を室温で５時間０．
１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムで活性化した。水で充分に洗
浄した後、０．５５Ｍ硼酸塩、ｐＨ８．５、０．２Ｎ
NaCl中の適切な蛋白質溶液２mlを円形紙に加え、混合
物を室温で２時間放置した。次に、混合物に１mg／mlNa
BH₄溶液３．０mlを加え、混合物を室温で３時間放置
し、０．０５５Ｍ硼酸塩（ｐＨ８．５）中の円形紙を
０．２Ｍ NaClで充分に洗浄した。円形紙に結合した
蛋白質の量を放射線標識トレーサーで測定した。

円形紙に結合した蛋白質の総量は１８．２μｇ／cm²
であった。

厚さ０．８９５mm、幅約０．３２cm、長さ３．５cmのＳ
Ｓ４７０紙のストリップ及び前記のように製造し、スト
リップの一端に置いた直径０．４８cm（３／１６″）の
円形紙を使用してアッセイ装置を製造した。ストリッ
プを次に円形紙上の開口を除いてスコッチ（Scotch）
テープで被覆して溶液と接触を防止する。合成尿中に
種々の濃度のモルフィンを含む試料溶液を製造した（下
記の第Ｖ表参照）。装置を試料中に浸漬し、３０秒間そ
のままに保つと、その間に溶媒の浸透先端は３cm上昇し
た。次に装置を取り出し、０．０５Ｍグルコース１ml当
り、前記のように製造し、１：１００に希釈したHRP−
モルフィン接合体６μｌ、０．１Ｍ燐酸塩でｐＨ７．０
に緩衝した４−Ｃｌ−１−ナフトール溶液２０μｇ／m
l、EDTA及びNAClを含む発色溶液中に浸漬した。装置を
発色溶液中に３分間保つと、その間に溶媒の先端は０．
５cm上昇した。

区別しうる段階で色の範囲を生ずるため発色染料の反復
希釈により作ったカラーチャートと比較することによっ
て色を測定する。下記の第IV表にはモルフィン濃度及び
円形紙上に生じた色を示す。抗モルフィン３mg：グル
コースオキシダーゼ５mgの比を使用して紙を調整し
た。比較のため、HRP−モルフィン接合体の濃度が２５
μｌ／mlの第二の溶液を使用した。

前記の結果から、極めて短い時間で０ｎｇ／mlと１ｎｇ
／mlとの間数値で実質的に区別しうることは明らかであ
る。更に、機能的範囲はモルフィン約０ｎｇ／mlからモ
ルフィン約３００ｎｇ／mlに及ぶ。

次の研究では、免疫吸着帯域及び種々のマトリックスを
変化させながら結果を比較した。各場合に、アッセイ装
置は、モルフィンに対する抗体及びグルコースオキシダ
ーゼを種々の比で結合させた０．４８cmの円形ディスク
を長さ０．３２cm（１／８″）の高吸収性ストリップ上
に置き、このアセンブリをディスク上に０．３１cmの開
口を有する疎水性遮断壁中に収納した。HRP−モルフィ
ン接合体の量を変動させた。発色剤溶液またはシグナル
発生系溶液は４−Ｃｌ−１−ナフトール２００μｇ／m
l、グルコース０．０５Ｍ、EDTAを含むｐＨ７．０の燐
酸塩緩衝剤及びNaClを含む。試料の溶媒浸透先端は３cm
上昇したが、発色溶液の溶媒先端は更に０．５cm上昇し
た。

結果を下記の表に示す。

下記の研究では、螢光標識を使用した。幅０．４８cmの
液体吸収ストリップを含む、長さ９cmの前記の紙を使用
して試験ストリップ装置を製造した。隣接する一端に抗
モルフィンを保有する直径０．６４cm（１／４″）のデ
ィスクを置いた。ディスクは液体吸収ストリップと均一
に接触させた。アセンブリ全体を抗モルフィン含有ディ
スク上の直径０．４８cmの開口を除いて疎水性バリヤー
中に封入した。

使用したプロトコルは下記のとおりである。モルフィン
を含まないか、または５μｇ／mlを含む試料中に装置を
浸漬し、溶媒の浸透先端を２cm上昇させる。次に試料溶
液から置を取り出し、０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．
０）中のフルオレセイン−モルフィン結合体約２５μｇ
／mlの溶液中に浸漬する。装置を試薬溶液中に、溶媒の
先が更に３cm移動するまで保持する。次に、装置を試薬
溶液から取り出し、０．１Ｍ燐酸塩（ｐＨ７．０）の洗
浄液中に置き、溶媒の先端が更に４cm移動するまで洗浄
液中に保持する。次に、ディスクを短波紫外光下可視化
し、モルフィンを含まない試料とモルフィン５μｇ／ml
を含む試料との間で螢光強度の明瞭な差を肉眼で観察し
た。

次の研究では、０．３２cmの液体吸収性ストリップ及び
０．３２cmの開口を使用する以外は前記のものと本質的
に同じ装置を使用して放射性標識を使用した。２種の異
なる操作を使用した。即ち、一方は競合結合に関し、他
方は連続結合に関する。

競合結合技術では、５０ｎｇの^３Ｈ−モルフィン及び種
々の濃度（０：１００ｎｇ；及び２，０００ｎｇ）のモ
ルフィンを含む試料１ml中に装置を浸漬する。溶媒の先
端が３cm移動した後、装置を取り出し、NaCl０．２Ｍを
含む０．１Ｍ燐酸塩（ｐＨ７．０）洗浄液中に浸漬し、
溶媒の先端が４cm上昇するまで保持する。ディスクを取
り出し、０．１Ｍグリシン−HCl（ｐＨ２．２）１mlを
含む管中に入れる。３０分間振盪した後、溶液５００μ
ｌをシンチレーションカクテル１０ml中に溶かし、１分
間読む。結果はcpmで、モルフィン０について４８８６
１、モルフィン１００ｎｇについて１８４４１、モルフ
ィン２，０００μｇについては１７８１である。

連続試験では、装置を溶媒の先端がストリップを２cm上
昇するのに充分な時間試料中に浸漬する。次に、装置を
試料から取り出し、０．１％トライトン（Triton）Ｘ−
１０１及び０．２Ｍ NaClを含む０．１Ｍ燐酸塩緩衝液
（ｐＨ７．０）中に^１２５Ｉ−HRP−リガンド２０μｇ
／mlを含む溶液中に浸漬し、溶媒の先端が３cm移動する
まで維持する。次に、装置を取り出し、０．１％トライ
トンＸ−１０１及び０．２Ｍ NaClを含む０．１Ｍ燐酸
塩緩衝液（ｐＨ７．０）中に浸漬し、溶媒の先端が４cm
移動するまで保持する。装置のディスクを有する部分を
切断し、１分間ガンマ線カウンターで読む。結果は下記
のとおりであり、その第一の数値はモルフィンの濃度
（ｎｇ／ml）、第二の数値はcpmである：０、７１８
７；１００、２６９０：２，０００、１７５５。緩衝液
中にトライトンを含まないことを除いて試験を繰り返す
と、０，１００及び２，０００ｎｇ／mlに対する結果は
それぞれ６２４０；２７１７及び２０３０であった。

前記の結果から、結果を妨害することなく種々のマトリ
ックスを試験しうることは明らかである。結果は、肉眼
で、または濃度計或いはシンチレーションカウンターの
ような装置によって分析することができる。結果は迅速
に得れ、モルフィン０と１００ｎｇ／mlまたはそれ以下
の間で鮮明に区別しうる。

本発明によれば、簡単な迅速技術が提供され、これによ
りリガンド及びレセプターを種々の技術を使用して定性
的または定量的に測定しうる。１工程を含めて種々の工
程数のプロトコルを分析物の測定に使用することができ
る。更に、試薬測定数を最小にし、素人の容量に使用し
うる測定手段が得られる。

本発明を、理解を明確にするため説明及び実施例に基づ
いて詳細に記載したが、特許請求の範囲内で変化変更を
行ないうることは明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図はアッセイ装置の平面図、第２図は第１図のアッ
セイ装置の２−２線拡大断面図、第３図は試料試験スト
リップ及び標識試験ストリップを有するアッセイ装置の
平面図、第４図は第３図のアッセイ装置の４−４線断面
図、第５図は本発明の別の実施態様の部分断面正面図で
ある。 １０，５０……試験ストリップ装置、１２，１００……
封入容器、１４，７０，７２，１１４……ストリップ、
５２……試料試験ストリップ、５４……標準ストリッ
プ、６４，６６，１０４……免疫吸着帯域。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭48−37191（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−90859（ＪＰ，Ａ) 米国特許3811840（ＵＳ，Ａ)

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】吸収性支持体の少なくとも１部に非拡散性
   に結合した免疫対の一構成員（mipと称する）及び吸収
   性支持体に結合していない標識されたmipを含む免疫吸
   着部材、並びにイムノアッセイの期間中常に該免疫吸着
   部材と固定された液体受理関係にありそしてそこから横
   方向にのびる吸収性物質を含んで成る液体吸収部材を有
   し、前記免疫吸着部材の周囲で前記液体吸収部材の少な
   くとも１部が不透過性包囲容器に包まれていて、前記免
   疫吸着部材を通してでなければ各溶液と接触しないよう
   になっており、前記免疫吸着部材が前記液体吸収部材に
   比べて相対的に小さい液体保有能を有することを特徴と
   するイムノアッセイ装置。
2. 【請求項２】前記免疫吸着部材及び前記液体吸収部材が
   単一のストリップであり、前記免疫吸着部材がその単一
   ストリップの端部にある特許請求の範囲第１項記載の装
   置。
3. 【請求項３】前記免疫吸着部材が前記の液体吸収部材の
   一部の上の層である特許請求の範囲第１項記載の装置。
4. 【請求項４】前記免疫吸着部材に酵素が含まれている特
   許請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の装置。
5. 【請求項５】前記mipに対応mipの標識型が結合し、前記
   支持体に結合した前記mipの結合部を実質的に全部飽和
   する特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の
   装置。
6. 【請求項６】吸収性層に非拡散性に結合した免疫対の構
   成員（mipと称する）及び結合していない標識されたmip
   を含んで成る第一帯域と、該第一帯域と液体吸収部材と
   の間にあって前記吸収性層とは異る流動抵抗を有する第
   二帯域とを有する免疫吸着部材、並びにイムノアッセイ
   の期間中常に該免疫吸着部材と固定された液体受理関係
   にありそしてそこから横方向にのびる吸収性層から構成
   される液体吸収部材を有し、前記液体吸収部材及び前記
   免疫吸着部材が不透過性包囲容器に包まれていて、前記
   免疫吸着部材を通してでなければ液が装置に侵入しない
   ようにされており、前記免疫吸着部材が前記液体吸収部
   材に比べて相対的に小さい液体保有能を有することを特
   徴とするイムノアッセイ用装置。
7. 【請求項７】前記の第一帯域が液体の流動に対して実質
   的な抵抗を示さない特許請求の範囲第６項記載の装置。
8. 【請求項８】吸収性支持体の少なくとも１部に免疫対の
   一構成員（mipと称する）を非拡散性に結合して含む免
   疫吸着部材、及びイムノアッセイの期間中常に該免疫吸
   着部材と固定された液体受理関係にありそしてそこから
   横方向にのびる吸収性物質を含んで成る液体吸収部材を
   有し、前記免疫吸着部材の周囲で前記液体吸収部材の少
   なくとも１部が不透過性包囲容器中に封入されて、前記
   免疫吸着部材を通してでなければ各溶液と接触しないよ
   うになっており、前記免疫吸着部材が前記液体吸収部材
   に比べて相対的に小さい液体保有能を有することを特徴
   とするイムノアッセイ用装置：並びに このアッセイ装置とは別個の標識mip： を有するイムノアッセイキット。
9. 【請求項９】前記標識が酵素であり、蛍光または可視光
   を吸収する生成物を生じうる酵素基質を組合せて含む特
   許請求の範囲第８項記載のキット。
10. 【請求項１０】前記の標識mipが放射性標識mipである特
    許請求の範囲第９項記載のキット。
11. 【請求項１１】前記免疫吸着部材及び前記液体吸収部材
    が単一のストリップであり、前記免疫吸着部材がその単
    一ストリップの端部にある特許請求の範囲第８項記載の
    イムノアッセイキット。
12. 【請求項１２】前記免疫吸着部材が前記の液体吸収部材
    の一部の上の層である特許請求の範囲第８項記載のイム
    ノアッセイキット。
13. 【請求項１３】前記免疫吸着部材に酵素が含まれている
    特許請求の範囲第８項、第１１項または第１２項記載の
    イムノアッセイキット。
14. 【請求項１４】吸収性層に非拡散性に結合した免疫対の
    構成員（mipと称する）を含んで成る第一帯域と、該第
    一帯域と液体吸収部材との間にあって前記吸収性層とは
    異る流動抵抗性を有する第二帯域とを有する免疫吸着部
    材、並びにイムノアッセイの期間中常に該免疫吸着部材
    と固定された液体受理関係にありそしてそこから横方向
    にのびる吸収性層から構成される液体吸収部材を有し、
    前記液体吸収部材及び前記免疫吸着部材が不透過性包囲
    容器に包まれていて、前記免疫吸着部材を通してでなけ
    れば液が装置に侵入しないようにされており、前記免疫
    吸着部材が前記液体吸収部材に比べて相対的に小さい液
    体保有能を有することを特徴とするイムノアッセイ用装
    置：並びに このアッセイ装置とは別個の標識mipを有するイムノア
    ッセイキット。
15. 【請求項１５】前記標識が酵素であり、蛍光または可視
    光を吸収する生成物を生じうる酵素基質を組合せて含む
    特許請求の範囲第１４項記載のキット。
16. 【請求項１６】前記の標識mipが放射性標識mipである特
    許請求の範囲第１４項記載のキット。
17. 【請求項１７】前記の第一帯域が液体の流動に対して実
    質的に非抵抗性である特許請求の範囲第１４項記載のキ
    ット。