JPS61500686A - 酵素活性検出用指示薬の安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素活性検出用指示薬の安定化 発明の背景 本発明は、−ｉ的にはパーオキシダーゼまたはその他のパーオキシド活性物質の 存在についての生化学分析の分野に関するものである。更に詳しくは、パーオキ シダーゼ活性構出のための、その後の使用に供する指示薬を、安定化ならびに可 溶化するためにを用な安定剤に関する。

酵素パーオキシダーゼは、水素供与体から水素受容体への酸化還元水素転移反応 を触媒する作用を有する。水素供与体すなわち指示薬は、酸化状態において発色 する色素原であってもよく、それ故パーオキシダーゼ活性は色の変化を監視する ことにより検出できる。別法として、水素供与体を、酸化状態において発光また はその他の検出可能な特長を示す一群の指示薬から選ぶことができる。水素受容 体は、典型的には過酸化水素、またはメチルヒドロパーオキシド、エチルヒドロ パーオキシドの様な類縁化合物である。

パーオキシダーゼおよびパーオキシダーゼ類偵活性の検定は各種医薬関連分野に 有用である。細胞化学の領域に於て、例えばそのような活性の検定は、ある種の 細胞の種類を同定するため、及び監視するために使用することができる。パーオ キシド活性物質は、骨髄性の白血球を包含する制限された一組の細胞のタイプ、 顆粒球、赤血球、及びある種の神経単位及び分泌細胞中に存在する。有糸分裂細 胞はまた、パーオキシダーゼ類億活性を示す、パーオキシダーゼ活性に敏怒な分 析法は、細胞学的条件を基礎とするある種の医薬上の判断に用いることができる 。

更に、パーオキシダーゼ活性に基く最近の険定法は、免疫化学分野二二強力な手 段を提供するものであり、その結果例えばある種の蛋白質の検定に役立つ、パー オキシダーゼは、西洋わさびの根から容易に抽出可能であり、かつ多量に入手可 能である。特定蛋白質に特異性の抗体は、抽出されたパーオキシダーゼに接合す る。

抗体と蛋白質抗原との反応を行なった後、蛋白質−抗体−パーオキシダーゼ複合 体は、適当な水素供与体及び水素受容体を与え、かつ酸化還元反応を監視するこ とによって１素足することができる。

そのような方法は、蛋白質類、ペプチド類、炭水化物類ならびにその他の免疫学 的に活性な物質を包含する広範な各種リガンドの検定用に用いられてきた。

そのようなアプローチの一つにおいて、抗核抗体はパーオキシダーゼ酸化還元反 応の使用を通じて人間血清中に検出できる。

ＨＥＰ−２細胞はスライド上に固定され、ついで該細胞は抗核抗体を含んでいる ような血清と接触される。もし該血清中に抗核抗体が存在すると、該抗核抗体は ＨＥＰ−２細胞と反応する。過剰の血清を洗い出した後抗核抗体と結合している Ｈ　Ｅ　Ｐ　−２細胞はさらにパーオキシダーゼ酵素が接合している抗人１ｇＧ 抗体を含む溶液と反応させる。抗人１ｇＧ抗体は、ＨＥＰ−２細胞に結合してい るいかなる抗核抗体に対しても特異性を存し、それ故パーオキシダーゼ薄素は、 もし抗核抗体が血清中に存在する場合だけ過剰溶液を洗い去った後、スライド上 に存在する。

最後に、スライド上に固定され反応した細胞は、過酸化水素も含有するような緩 衝水性溶液中において色素原指示薬と接触され、それ故パーオキシグーゼー触媒 ・酸化還元反応が起こる。この手法により、ＨＥＰ−２細胞は、抗核抗体が、該 ＨＥＰ−２細胞と反応している血清中に存在している限度においてのみ着色する 。

スライドの調製及び付着細胞についての比較的少ない変形でもって、例えばＤＮ Ａあるいはクリミジャ（ｃｌｉ＋ｎ１ｄｉａ）に対するような、他の抗原反応が 検知されるがもじれない。

他の全く別異の技術において、“浸漬及び読みとり”型試薬帯同片が、パーオキ シダーゼ活性を検定するため用いられる。該片は、まず適当な水素供与体及び受 容体で含浸し、ついで乾燥させた多孔性・不溶性マトリックス片からなる。パー オキシダーゼを含有する溶液中に浸された時、指示薬は酸化され、典型的には変 色する。咳“浸漬及び読みとり”技術は、その用法が籠華であるという利点を存 する。しがし顕微鏡スライド上におけるｊ２　’１７１化学作用による細胞の着 色を包含するテストには用いることができない。

湿潤化学作用によるアプローチ及び“浸漬及び読みとり”片によるアプローチの 両方に対するパーオキシダーゼ法の、ひき続いての問題は、指示薬の緩徐な自動 酸化である。カミる劣化は、水性媒体あるいは過酸化水素含有媒体において、よ り起り易い。この劣化は迅速なため、試薬溶液は使用前約１日前に新しいものを 調製する必要がある。しかしながら試薬の各バッチの總べてを、利用しないと、 貴重な調製時間ならびに高価な試薬の過度の浪費を招く。

加うるに、汎用されかつ望ましい指示薬、とりわけ４−クロロ−１−ナフトール 及び３−アミノ−９−エチルカルバゾールは水に不溶である。従って、この種の 化合物は、水性媒体とさらに混合する前に、指示薬の可溶化のためアルコールあ るいはジメチルスルホキシドの如き有機溶媒にまず溶解しなければならない、ま た之等の溶液は、指示薬が放置中に沈析するがもじれないので、その使用前に直 ちに調製しなければならない。

浸漬及び読み取り片上の指示薬の自動酸化を阻止する方法が開発されている。例 えば、試薬の物理的離隔により劣化を遅らセることが可能である。かかる離隔は 、試験片を指示薬溶液、ポリビニルメタクリルアミド溶液及びパーオキシド溶液 で逐次含浸せしめることによってなすことが可能であり、この際各工程の間では 乾燥が行なわれる。ポリビニルメタクリルアミドは、保護コロイドを生成し、２ 種の試薬を物理的壁又はバリアーによって効果的に離隔する。同様に、パーオキ シドは、物理的バリアーとしても作用するゼラチンのようなコロイド物質内に封 入することもできる。指示薬だけが結合している浸漬及び読み取り片において、 ある種の低級アルキルもしくはアルキレン誘導体又はモノアルコールには、指示 薬の安定性を増す作用がある。

浸漬及び読み取り方法に適用可能であるとはいえ、かかる物理的バリアーによる 安定化手段が湿式化学的方法で使用するのに不適当であることは明らかである。

試薬の不安定性及び不溶性が、湿式化学的パーオキシダーゼ関連検定法の便利さ 及び望ましさに関する現在の重大な限界へと続いている。

上記限界は、上記抗核抗体試験のような試験が医者の診療室で又；よフィールド クリニック（ｆｉｅｌｄ　ｃｌｉｎｉｃ）で又は比較的熟練していない者によっ て行なわれるべき場合、特に明らかである。試験の要求が非常に低く、１日にた った１回又は２〜３回の試験が行なわれるにすぎない場所で上記試験を行なうべ き場合、高価な指示薬の試薬液の大部分は、該薬液が短い保存期間後に自動酸化 により信転できないようになってしまうが故に、廃棄されるであろう、比較的未 熟な者が該試験に従事している場合、水溶液と混合するに先立って行なう有８！ 液体中に指示薬を溶解する必要があるが、これはかなり複雑でありかつ試験手順 を無効にする可能性のある混合エラーを生じ得る。さらに、指示薬溶液がパーオ キシダーゼの存在下不安定であるが故に、使用時にパーオキシダーゼを添加しな ければならない場合、さろに混合エラーが生し得る。かくして、水溶液に易溶で ありかつパーオキシダーゼの存在下においてさえ一定期間安定である指示薬を用 いることががなり望ましい、かかる溶液は、個人により調製され、次いで分析用 試験体を調製する専門家によってさらに修正されることなく使用することができ る。

従って、水に可溶な安定な試薬から調製することのできる安定化した指示薬／パ ーオキシド溶液の要求がある。理論上、ががる溶液は、パーオキシドが存在して いても長期間安定である。本発明は、この要求を満すものであり、また関連する 利益を与える。

又里ｐ鳳ヱ 本発明は、パーオキシダーゼ活性検出用の、自動酸化を阻止する改良粉末指示薬 を提供する。本発明の別の面は、指示薬が、水性媒体中に容易に溶解しかつパー オキシドが存在していても数週間安定のままでいるということである。該試薬は 、実験室において乾燥粉末として長期間にわたって保持された後、パーオキシド を含んでいてもよい水ｉｓＺ中に溶解せしめることが可能である。

？８液は保存中安定であり、その後使用しても新たに調製した溶液に匹敵しうる 結果が得られる。かくして、余分な溶液を顧緊に廃棄することが必要でなくなる ので、高価な試薬または従業者時間の不必要な浪費が回避される。

本発明によれば、指示薬を安定化剤物質と組合せて、安定化指示薬粉末を製造す る。好ましい安定化剤は固形の水溶性ポリマーである。この指示薬粉末は、室温 で乾燥状態で保持してもよいしまたは水性媒体中に溶解じてもよい、所望ならば 、すぐ使用できる安定化溶液とするために、パーオキシドのような酸化剤を溶液 に添加してもよい。パーオキシドＯ添加に対してさえ、ｉ８液は少なくとも数週 間安定である。溶液とパーオキシダーゼとの接触により反応が触媒されて、指示 薬が酸化され、変色のような検出可能な変化が生じる。試験は、数週間保持され た安定化溶液を用いて得られた結果が、新たに造った溶液を使用して得た結果に 比べてもひげを取らずかつパーオキシダーゼ活性の受容できる指標を与えること を示していた。

好ましい実施Ｂ様においては、固形の色素産生指示薬と固形の水溶性ポリマーと を、パドルを用いて混合し、次いで乳鉢と乳棒とを用いて、またはより代表的に はボールミルを用いて粉砕せしめる。好ましくは、色素産生指示薬は４−クロロ −１−ナフトールでありまたポリマーはポリエチレングリコールである。指示薬 対ポリマーの比は臨界的ではないが、約１〜２５０重量部の範囲が好ましい、得 られた粉末は、乾燥状態で少なくとも数ケ月の期間安定である。

パーオキシダーゼ検定用指示薬？８液を調製するには、安定化粉末を水性媒体に 加え、撹拌して溶解せしめる。約３ｇの粉末を１００ｍｌの水性媒体中に溶解せ しめるのが好ましいが、この比も臨界的ではない。得られた溶液は、効力が有意 に低下することなく、そのまま保存することもできるし、または使用前少なくと も数遇間バーオキシドを添加した状態で保存することもできる。

上記から、本発明が検定手順の分野において意義のある進歩を構成することが認 められる０本発明の方法によれば、試薬が調製されかつ長期間保持されることを 可能にし、有価物質および労力の節約がもたらされる。さらに、指示薬の可溶化 をも促進することによって、安定化剤は、調製時のエラーの機会を減しかつ調製 時間をも滅し、また溶液からの指示薬の析出を防止する。数ケ月の間安定な粉末 試薬は、世界中に容易に輸送することが可能である。分析実験室では、その棚上 に反応性化合物を保持することが可能である。さらに、安定化？８液は、毎日よ りもむしろ、２〜３週毎に調製する必要があるにすぎず、かくして費用は滅しか つ能率は増大する。

本発明の他の特徴および利点は、本発明の木質を例として説明している以下の詳 細な記述から明らかになる。

好ましい１１一様の詳細な８゛明 当業界で公知の多種類の指示薬が、パーオキシド及びパーオキシダーゼまたはパ ーオキシダーゼ様物質の存在下に着色形態に酸化される。しばしば使用される化 合物の中にベンジジン、ジメチルベンジジン、０−フェニレンジアミン、ｐ−フ ェニレンジアミン、４−クロロ−１−ナフトール及び３−アミノ−９−エチルカ ルバゾールがある。これら全ての化合物は水性溶液中瞬時の酸化を受け易く、通 常使用直前に各溶液を調製する必要がある。

従来の方法に於いては、指示薬が水性溶液に添加、混合される。

収挿の指示薬、とりわけ４−クロロ−１−ナフトール及び３−アミノ−９−エチ ルカルバゾールは水に５可溶性ではない、これらはまずアルコールまたはジメチ ルスルホキシドの如き有機溶媒に溶解され、ついで水性溶液に溶解される。一旦 、充分に溶解された溶液が調製されると、その溶液はほぼ１日以内に分析操作に 使用しなければならない、さもないと瞬時の酸化が？８液の効力を残少させ分析 結果を凝しくする。パーオキシドは使用直前に上記溶液に添加される。

本発明に従って、パーオキシダーゼ活性の検出にひき続き使用するための安定化 指示薬粉末が指示薬と安定化剤とを組合せることにより調製される。ついで生成 ’ｌ！ｉｆｆ質を水溶媒体に溶解するが、この媒体−よパーオキシドを含有して もよくまた含有しなくともよい。

安定化指示薬粉末を調製するため、多旨示薬をポリエチレングリコール、ポエチ レンオキシドまたはポリビニルピロリドン及びこれらの誘導体の如き水溶性ポリ マーと混合、粉砕することにより組合せる。安定化指示薬粉末を調製するため、 上記の二つの化合物をまず櫂で混合し、ついで冷却状態（４〜８℃）でモーター 駆動乳棒あるいはボールミルのいずれかで３０分間粉砕する。安定化剤と組合せ る指示薬の量はしｎ異的ではないが、安定化剤約２５０重量部当り指示薬約１重 量部の割合が有効であるとわかった。

上記の固体指示約と安定化剤とは特に多量混合する場合に一様に混合しないこと がしばしば認められる。上記指示薬をまず塩化ナトリウムの如き塩と混合しつい でこの混合物を前記安定化剤と組合せることにより均質な分布を得ることができ る。塩化ナトリウムは指示薬１部に対し塩約１２部の重量比で使用することが好 ましい、何となれば、塩水が分析操作に広く利用されるからである。この方法に よる操作は上記指示薬と塩とを混合しついでモーター駆動乳棒巾約１０分間ある いはボールミル中約３０分粉砕することである。ついで固体生成物を安定化剤と 混合し前記の如く粉砕する。上記の最終安定化指示薬粉末は塩を使用しない粉末 と同キヱに使用し得る。

分子量８．０００〜１００，０００ダルトンの範囲を有する安定化剤について許 容し得る結果が得られたが、より高分子量のものでもまたより低分子量のもので も許容し得る結果をもたらすものと考えられる。ポリエチレングリコールが安定 化剤として特に有効であることがわかった。

分析操作用指示薬溶液の調製に於いて、安定化指示薬粉末；ま水性媒体に溶解さ れる。上記粉末約３ｇを所望の水性媒体約１００１１に添加し溶解するまで攪拌 する。この溶液を数鍔間まで貯蔵するか、あるいは直ちに使用する。ついで適当 量のパーオキシドを添加することにより、上記溶液を使用のため用意する。また 、上記指示薬溶液を最初に調製する時にパーオキシドを添加してもよい。パーオ キシドの添加でさえも、上記溶液はパーオキシダーゼに関するその活性を少くと も数遇間保持する。

安定化され粉末化された試薬が？８解される水性媒体は純粋な水あるいは予め調 製された溶液のいずれであってもよい。溶液は例えばくえん酸塩またはリン酸塩 緩衝液を含をして上記溶液のｐｉｆを維持してもよいが、ｐｉｆは所望の結果を 得るのに重要ではないことがわかった。ゾニル（Ｚｏｎｙｌ）　Ｆ　Ｓ　Ａ、ゾ ンルＦＳＣまたはゾニルＦＳＮ（デュポン社製品）の如きアニオン性、カチオン 性または非イオン性界面活性剤を上記水性媒体に含ませ上記溶液をパーオキシダ ーゼと接触させた後のサスペンション中の酸化生成物の維持を補助しでもよい、 上記水性媒体を最初に調製し、安定化され粉末にされた試薬を添加した直後の時 に、あるいは上記溶液をパーオキシダーゼと接触させる前のしばるく経過した時 のいずれかに適当量のパーオキシドを添加し得る。パーオキシドの量は重要では ないが、約０．８ｍ！１の過酸化水素以外で許容し得る結果かえられた。更に、 例えばメチルハイドロパーオキシドまたはエチルハイドロパーオキシドを含む、 過酸化水素以外の水素受容体を利用してもよい。

本発明の現在量も好ましい態様に於いて、４−クロロ−１−ナフトールが安定化 すべき発色性指示薬として選ばれる。この指示薬の酸化により青色を呈するから である。その他の最も通常の指示薬は赤色、赤褐色または茶色を呈するが、これ らの色は人間の目が検知し判定するのに一層困珪である。４−クロロ−１−ナフ トール１部を分子１ｓ、　ｏ　ｏ　ｏダルトンのポリエチレングリコール２５０ 部と櫂を用いて混合する。この混合物をジャーに入れ、セラミックボールを添加 する。ジャーとその内容物を約４〜８℃に冷却し、ついで４〜８℃で稼動するボ ールミル上に約３０分問直いて安定化指示薬粉末を生成する。ついで上記粉末約 ３ｇを必要により緩衝液、界面活性剤、またはパーオキシドを含有する水性媒体 約１００＋ｗｔ’中で混合することにより指示薬？ｆｊ液を調製する。

この溶液はパーオキシダーゼ分析操作に於ける効力を１員なうことなく実験室貯 蔵所の透明容器中に少くとも２週間貯蔵し得る。

以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を 何ら限定するものではない。

実施例　１ ポリエチレングリコール（分子ｉｔ８，０００）５０ｇに４−クロロ−１−ナフ トール２００■を加えた。この２種の化合物を先ずスパチュラを使って混合し、 次に約４〜８℃に冷却し、ボールミルに移して約４〜８℃で３０分間粉砕し、安 定化された指示薬粉末をつくった。

実施例　２ ポリエチレングリコール（分子４１８，０００）ＩＯｇに３−アミノ−９−エチ ルカルバゾール６６＊を加えた。この２つの化合物を先ずスパチュラを使って混 合し、次に乳鉢と乳棒を使って室温で１０分間粉砕し、安定化された指示薬粉末 をつくった。

実施例　３ ポリエチレングリコール（分子１２０，０００）１０ｇに４−クロロ−１−ナフ トール５０■を加えた。この２つの化合物を実施例２と同様に混合し安定化され た指示薬粉末をつくった。

実施例　４ ポリビニルピロリドン（分子ｆｔ４０．ｏ　ＯＯ）　１０　ｇに４−クロロ−１ −ナフトール５０■を加えた。この２つの化合物を実施例２と同様に混合し安定 化された指示薬粉末をつくった。

実施例　５ ポリエチレンオキシド（分子１１ｏｏ、ｏｏｏ＞　１０ｇに４−クロロ−１−ナ フトール５０■を加えた。この２つの化合物を実ｂト例２と同様に混合し安定化 された指示薬粉末をつくった。

実施例　６ ポリエチレングリコール（分子量８．００（１）Ｌｏｇにテトラメチルベンジジ ン６６■を加えた。この２つの化合物を実施例２と同様に混合し安定化された指 示薬粉末をつくった。

実施例１〜６は本発明の安定化された指示薬粉末の調製を示している。

実施例　７ 実施例１の安定化された指示薬粉末を透明プラスチック容器に入れ３７℃で３週 間保存した。保存後、この指示薬粉末３ｇを、３％ｉ！１５酸化水素０．１ｍｆ ｆを含む水性媒体１００＋ＩＩｌに溶解した。次にこの指示薬？８液を透明容器 中で室温においてさらに１遇間保存した。保存の前、保存中もしくは保存後に保 存溶液の自動酸化あるいは色の変化は認められなかった。保存後、この溶液の効 力を実施例１５に記載の方法で測定した。この溶液はパーオキシダーゼ検定法に おいて許容される結果を与えることがわかった。

実施例　８ ４−クロロ−１−ナフトールは実施例７に記載したような水性媒体に熔解しない ことがわかった。水性溶液に４−クロロ−１−ナフトールを？８解するために４ −クロロ−１−ナフトール０．８ｇをエチルアルコール１００ｍｆｆに溶解−１ この）蓄液２−１を実施例７に記載した水性媒体５０＋＋１と混合した。この溶 液を室温で１遇間保存した。この１週間の保存期間中に、濁りおよび沈殿の発生 ならびに青褐色となることによって明らかなように、著しく酸化されることが視 覚的に観察された。ｌ遇間の保存後、この溶液のサンプルを実施例１５の方法に より試験した。この試験結果は、パーオキシダーゼ活性の著しい低下によりほと んど色表示がなくなることから、許容できないものであった。わずかな量の沈殿 物が試験したスライドグラス上に存在し、色分析は不可能であった。

実施例７および８はいずれも、不安定な４−クロロ−１−ナフトール指示薬ｉ８ 液が１週間の保存試験において許容できない結果をもたらすこと、しかしながら 本発明により安定化された４−クロロ−１−ナフトールから調製された指示薬溶 液はこの保存試験において許容できる結果をもたらすことを示している。

実施例　９ 実施例２の安定化された指示薬粉末３ｇＧｐ）１７．４の０．０１Ｍクエン酸緩 衝液を含む水性媒体１００ａｉ４！に溶解した。この溶液を透明な容器中にｌ菌 量保存した。保存後この溶液は透明であり自動酸化が全く起こっていないことを 示していた。

実施例　ＩＯ 実施例３０安定化された指示薬粉末３ｇをｐＨ５，３の０．０１Ｍクエン酸緩衝 液を含む水性媒体１０　Ｑｗ＋ｆｆｉに溶解した。この溶液を透明容器中に１遇 間保存した。保存後、この溶液は透明であり、自動酸化が全く起こっていないこ とを示していた。

実施例　１１ 実施例４０安定化された指示薬粉末３ａをｐｌ（７，０の０．０１４）リス緩衝 液を含む水性媒体１００ｔａｌに溶解した。この溶液を透明容器中、１週間保存 した。保存後、このン蓄液は透明であり、自動酸化が全（起こっていないことを 示していた。

実施例　１２ 実施例５０安定化された指示薬粉末３ｇを０．１％ゾニルＦＳＡ、アニオン性界 面活性剤を含む水性媒体１００ｍ６に溶解した。この？８′ａ、を透明容器中、 １週間保存した。保存後、この溶液は透明であり、自動酸化が全く起こっていな いことを示していた。

実施例　１３ 実施例６の安定化された指示薬粉末３ｇを０．１％ゾニルＦＳＣ、カチオン性界 面活性剤を含む水性媒体１００ｍｆｆＬ：、？８解した。この溶液を透明容器中 、１週間保存した。保存後、この溶液は透明であり、自動酸化が全く起こってい ないことを示していた。

実施例　１４ 実施例６の安定化された指示薬粉末３ｇを０．１％ゾニルＦＳＮ、非イオン性界 面活性剤を含む水性媒体１００ｖａｎに溶解した。この溶液を透明容器中、１週 間保存した。保存後、この溶液は透明であり、自動酸化が全く起こっていないこ とを示していた。

実悔例　１５ パーオキシダーゼ活性の検定において種々の溶液の効力をテストするための４’ ３ｔＪ操作を定めた。この操作において、ＨＥＰ−２細胞をガラススライドに固 定し、大抗核抗体を含むことが知られている血清と接触させた。過剰の血清をリ ン酸塩で緩衝された塩水でスライドかみ洗い流した。パーオキシダーゼと結合し た抗人ＩｇＧの１滴をＨＥＰ−２細胞に３０分間接触させ、過剰量をリン酸塩で 緩衝された塩水で流した。次にテスト用指示薬？８液（例えば、安定化していな い（８液又は本発明により調製した安定ｌ８液）にそのスライドを浸漬した。過 剰量をリン酸塩で緩衝された塩水で流し去り、スライドにカバースリ、ブをがふ せた。次にＨＥＰ−２細胞を４００倍の光学顕微鏡で観察し、パーオキシダーゼ 反応を示す色の発生を調べた。この観察は、発明者及び経験をつんだ薬学実験の 専門家によって行なった。

実施例　１６ 対照として、この技術分野において以前用いられていた指示薬を用いて実施例１ ５の操作を行なったが、本発明に対応するような安定化は得られなかった。４− クロロ−１−ナフトール０．８ｇを１００＋ｗｆｆのアルコールに溶解し、次い でこの溶液の２鋼ｌをｐＨ７，４のトリス緩衝液を含む水性媒体１００ｓ７！と 混合した。この溶液について、直ちに実施例１５の操作によってテストした。顕 微鏡で調べたところ、陽性の結果を示す青色が現われていた。対照の操作の別の ものとして、この実施例の前の部分で述べたようにして４−クロロ−１−ナフト ール溶液を調製し、室温で１週間保存したところ、？８液は徐々に青−褐色にな り、自動酸化を示す沈殿物の生成が観察された。１週間後、実施例１５の操作に 従いこの溶液をテストしたところ、パーオキシダーゼの存在を示すのに効果がな いことがわかった。

実施例　１７ 実施例９の溶液をｌ通量保存した後で実施例】５の方法によって試験し、パーオ キシダーゼの満足すべき徴候を示すことがわかった。

実施例　１８ 実施例１０の溶液を１週間保存した後で実施例１５の方法によって試験し、パー オキシダーゼの満足すべき徴候を示すことがわかった。

実施例　１９ 実施例１１の溶液を１個間保存した後で実施例１５の方法によって試験し、パー オキシダーゼの満足すべき徴候を示すことがわかった。

実施例　２０ 実施例１２の溶液を１週間保存した後で実施例１５の方法によって試験し、パー オキシダーゼの満足すべき徴候を示すことがわかった。

実施例　２１ 実施例１３の溶液を１週間保存した後で実施例１５の方法によって試験し、パー オキシダーゼの満足すべき徴候を示すことがわかった。

実施例９〜１４は安定化した指示薬粉末の指示薬水溶液は容易につくることがで きること、およびそのようなｉ８液は少くとも１週間の間にわたり自動酸化に対 して安定であることを示す。実施例１７〜２１はそのような溶液が１週間の貯蔵 後パーオキシダーゼ分析法において満足すべき結果を生ずることを示す、これと は刻時的に、実施例１６の対照試験は安定化していない粉末試薬からつくった？ ８ａは不安定であり、また１週間の貯蔵後満足すべき結果を生しないことを示す 。

実施例　２２ 指示薬との均一な混合を促進するために先ず塩を指示薬と一緒に混合することに よって安定化した指示薬粉末をつくった。４−クロロ−１−ナフトールの１．５ ｇを塩化ナトリウムの１８．４　ｇと混合し、混合物を乳鉢と乳棒で１０分間に わたって摩砕した。この混合物を約４〜８℃に冷却されているポリエチレングリ コール（分子量８，０００）の１９０ｇと混合し、ボールミル中で約４〜８℃に おいて１時間にわたり摩砕した。最終生成物の３ｇを１００ｍｊｉの水の中に溶 解し、実施例１５の方法によって試験した。この安定化した指示薬粉末はパーオ キシダーゼ活性の満足すべき徴候を示した。

本発明の使用はそれほど限定されないが、安定化の利用への一つの重要な近接法 および本発明の溶解の特徴は血清の成分の存在を試験するためのテストキットを 通すことである。好ましい態様においては、抗核抗体を試験するためのテストキ ットはガラススライドに固定されたＨ　Ｅ　Ｐ　−２ｉ胞をもつガラススライド 、パーオキシダーゼ酵素と結合した抗人１ｇＧ抗体の容器、本発明によってつく られた安定化した指示薬粉末の容器および所望による過酸化水素（？Ｊ液の容器 および水性媒体の容器を含む、（過酸化水素は普通には容易に入手し得るので、 キット中における過酸化水素溶液は任意である。）テストキットを用いるには、 指示薬粉末を水または水性媒体にイ容解し、過酸化水素を加えて指示薬溶液をつ くる。

試験血７ＲをＨＥＰ−２細胞に接触し、過剰分は洗い流す。つぎにパーオキシダ ーゼ結合抗人１ｇＧをスライドに接触し、過剰分は洗い流す。最後に指示薬溶液 をスライドに接触し、顕微鏡観察のためにカバースリップをスライドの上に置く 。色の存在は血ｌｎ中の抗核抗体を示す。例えば他の血清成分を積出するために ＨＥＰ−２細胞が他の型の細胞で置きかえられるようなテストスキットにおいて 、この同し原理にしたがうことができる。それぞれの場合において、本発明の安 定化した指示薬粉末の存在は指示薬？＠液木本発明分析法においてパーオキシダ ーゼの存在を示す溶液をつくるのに使用するための安定な指示薬粉末をもたらす ということがわかる。この安定化じた指示薬粉末は容易に包装して出荷すること ができ、またこの粉末は水に溶解する。かくして使用者は、水との混合に先立っ て粉末試薬を溶解するための特別な有機溶媒の準備に関係する必要がなく、誤差 の機会は減少する。水性媒体中に安定化した粉末試薬を混合することによってつ くった溶液は少くとも１週間の間にわたって自動酸化に対して安定であり、分析 法においてパーオキシダーゼの存在を示すために有効に使用することができる。

溶液が安定であるということは毎日の基準で新鮮な溶液をつくる必要性を取り除 き、これによって時間の不必要な消耗および自然に酸化されて信頼できなくなっ た為に？８ｆｊ、の過剰分が捨てられる場合の貴重な化学薬品の浪費を回避する 。

説明の目的で、本発明の特定の態様を詳細に説明したが、種々のＢ様を本発明の 精神および範囲から逸脱することな〈実施することが可能である。したがって本 発明は書き加えられた請求の範囲によって認められるように限定されるべきでは ない。

手　続　補　正　書（方式） ％式％ ２、発明の名称　酵素活性検出用指示薬の安定化３、補正をする者 事件との関係　出願人 氏　名　（５９９５）弁理士　中　村　稔　、７−′５、補正命令の日付　昭和 ６０年１２月２４日国際調査報告 暑、ｌ＋＋＋ｕｍｍ＋ａｌＡｅｏ１．ｃａｂｏ＊ｔｉａ、２ＣＭ／−：ｃＯ４Ｏ ２Ｏ３゛！ヂマ２

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．分析操作において使用するための安定化された指示薬粉末の製造方法であっ て、次の工程： 過酸化物的活性物質の存在下で水素受容体によって酸化される指示薬化合物を調 製する工程、及び 安定化化合物を前記指示薬化合物と組合させて安定な固形状指示薬粉体をつくる 工程、 とを含む該安定化された指示薬粉末の製造方法。
2. ２．安定化化合物が、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビ ニルピロリドン及びこれらの水溶性誘導体の群から選ばれる請求の範囲第１項記 載の方法。
3. ３．安定化化合物の分子量が、約８．０００〜約１０００，０００ダルトンの範 囲にある請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．指示薬化合物が、フェノール、アミノフェノール、ロイコダイ及びインドフ ェノールの群から選ばれる請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．指示薬化合物が、４−クロロ−Ｉ−ナフトール、３−アミノ−９−メチルカ ルバゾール及び３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンの群から選ばれる 請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．指示薬化合物を調製する前記工程と安定化化合物と結合させる前記工程との 間に、さらに指示薬化合物を塩と結合させて塩結合指示薬化合物をつくる工程を 含む請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．請求の範囲第１項に従って製造された、安定化された指示薬粉末。
8. ８．請求の範囲第６項に従って製造された、安定化された指示薬粉末。
9. ９．分析操作において使用するための安定化された指示薬水溶液の製造方法であ って、次の工程： 過酸化物的活性物質の存在下で水素受容体によって酸化される指示薬化合物を調 製する工程、 安定化化合物を前記指示薬化合物と組合せて安定な固形状指示薬粉体をつくる工 程、及び 前記指示薬粉末を水性媒体に溶解して安定な指示薬水溶液をつくる工程、 とを含む該安定化された指示薬水溶液の製造方法。
10. １０．安定化化合物が、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリ ビニルピロリドン及びこれらの水溶性誘導体の群から選ばれる請求の範囲第９項 記載の方法。
11. １１．指示薬化合物が、フェノール、アミノフェノール、ロイコダイ及びインド フェノールの群から選ばれる請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．指示薬化合物が、４−クロロ−１−ナフトール、３−アミノ−９−メチル カルバゾール及び３．３′，５，５′−テトラメチルベンジジンの群から選ばれ る請求の範囲第９項記載の方法。
13. １３．指示薬化合物を調製する前記工程と安定化化合物と組合せる前記工程との 間に、さらに指示薬化合物を塩と結合させて塩結合指示薬化合物をつくる工程を 含む請求の範囲第９項記載の方法。
14. １４．前記水溶液がバーオキシドを含む請求の範囲第９項記載の方法。
15. １５．請求の範囲第９項に従って製造された、安定化された指示薬水溶液。
16. １６．請求の範囲第１３項に従って製造された、安定化された指示薬水溶液。
17. １７．分析操作において使用するための安定化された指示薬水溶液の製造方法で あって、次の工程： 過酸化物的活性物質の存在下で水素受容体によって酸化される指示薬化合物を調 製する工程、 安定化化合物を前記指示薬化合物と結合させて安定な固形状指示薬粉体をつくる 工程、 前記指示薬粉末を水性媒体に溶解して安定な指示薬水溶液をつくる工程、及び 前記指示薬水溶液にバーオキシドを加える工程、とを含む該安定化された指示薬 水溶液の製造方法。
18. １８．請求の範囲第１７項に従って製造された、安定化された指示薬水溶液。
19. １９．過酸化物様の活性物質の存在を検知する方法であって、次の工程： バーオキシダーゼ活性を有すると思われるサンプルを調製する工程； バーオキシドと溶解した安定化された指示薬とを含む指示薬溶液を調製する工程 、ここで前記指示薬は、指示薬化合物を安定化化合物と組合せる工程を含む方法 で製造されたものである；及び 前記サンプルに指示薬溶液を接触させる工程、及び指示薬が酸化されたことを示 す変化を得るためにそのサンプルを放置する工程、 とを含む該検知方法。
20. ２０．成分の存在を検出するためのテストキットであって、その成分と特異的に 結合する第１の物質を付着したテストスライド；その成分と特異的に結合する第 ２の物質の溶液、ここで該第２の物質はバーオキシダーゼ活性を示す物質と結合 している；バーオキシダーゼの存在下で酸化される安定化された指示薬化合物と バーオキシドのいくらかの量、ここで前記安定化された指示薬粉末はバーオキシ ダーゼ指示薬と安定化物質とを組合せる工程を含む製法によって製造されたもの である、を含む該テストキット。
21. ２１．安定化されている指示薬化合物が固形粉末で存在する請求の範囲第２０項 記載のテストキット。
22. ２２．指示薬粉末と混合して試薬溶液を形成するための緩衝された水性媒体をさ らに含む請求の範囲第２０項記載のテストキット。
23. ２３．第１の特異的結合物質がＨＥＰ−２細胞である請求の範囲第２０項記載の テストキット。
24. ２４．第２の特異的結合物質が抗人１ｇＧであり、バーオキシダーゼ活性を示す 物質がバーオキシダーゼである請求の範囲第２０項記載のテストキット。