JPS61502700A - 免疫リポソ−ム検定法およびそのための製品 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 免疫リポソーム検定法およびそのための製品発明の分野 本発明は均一な固体免疫リポソーム検定法およびその検定において使用する製品 （特にキットの形をした製品）に関する。

上記検定はリポソームの不安定化および溶解をもたらす抗原リポソームの側面の 相分離を利用するものであり、定量化することができ、そして抗原、抗体および 生物学的液体中の類似の物質の存在および／または濃度を測定するために使用さ れる。

発明の背景 高容量スクリーニング検定は一般に抗原物質、抗体および生物学的試料中の被分 析体の存在を検出し且つ定量的に測定するために利用される。例えば、ラジオイ ムノアッセイ（ＲＩＡ）法は通常臨床診断の隙に使用される。しかしながら、Ｒ ＩＡ法は往々にして大規模スクリーニングプログラムにとって不適当である。放 射性トレーサーはそれら自体の本性ゆえに安定性に限界があり、またそれらは使 用中の特別の取扱い、特別の廃棄技術および高度に複雑な装置を必要とする。

現在利用し得るその他の免疫検定法には螢光法および酵素法が含まれる。一般に 、これらの検定は解明するために濾過または遠心分離による分離工程を必要とす る。これらの分離操作の必要性は、これらの検定法を長びかせ且つ自動化するの を難しくして（・る。

リポソームは以前免疫検定法に有用な成分であるとして報告された。例えば、マ ツコネル（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ）もの米国特許第３８８７６９８号は、電子常磁 性共Ｑ１６（ＥＰＲ）により監視される免疫検定法における安定な遊離基を含む ＩＪ　ｆｅンームの使用を開示している。マン）パル（Ｍａｎｄｌｅ）らの米国 特許第４３７２７４５号は、免疫検定法において有用な螢光体を含有するマイク ロカプセルとしてのリポソームを開示している。この検定法はリポソームを破壊 して螢光化合物を放出させるために、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）ｘ　−１００ のような界面活性剤の使用を必要とする。リポソームはまたウールマン（Ｕｌｌ ｍａｎ）らの米国特許第４１９３９８３号に記載される免疫検定法においてマー カーキャリアーとして使用された。この検定で使用されたマーカーには螢光体、 酵素および化学ルミネッセンス化合物が含まれていた。

キンスキー（Ｋ１ｎ５ｋｙ）および彼の共同研究者は、ノ・ブテン化脂質を含む リポソームが抗体と結合してその補体を付着させ得ることを初めて発見した。〔 ハツクスビー（Ｈａｘｂｙ　）らのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ−３ｃｉ、Ｕ ＳＡ、　６１　３００（１９６８）；　アルピング（Ａ’ｌｖｉｎｇ）らのＢｉ ｏｃｈｅｕ、３　１５８２（１９６９）；　キンスキーらのＢｉｏｃｈｅｍ、、 　８　４１４９（１９６９）を参照された（・〕。その結果は活性化補体成分に ょろりボンームの溶解であった。

コール（Ｃｏ１５）らの米国特許第４３４２８２６号は、抗原が付着し且つ酵素 を封入したリポソームを利用する免疫検定法を開示しており、前記リポソームは 同族抗体および活性補体の存在下で免疫特異的に破壊される。この検定法は酵素 マーカーを放出させるために抗体と補体との間の均一相反応を利用している。こ の補体によって媒介される現象は多数の文献の関心の的になって（・る［、最近 の文献として、アルピングおよびリチャーズのリボンーム、オストロ（○５ｔｒ ｏ　）編集、２０９〜２８７゜マーセル・テンカー（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅ ｒ）　、ニューヨーク。

】９８３を参照された（・〕。

近年、数種の補体以外のものによって媒介されるＩＪ、ｄソーム溶解検定法が開 発された。例えは、膜溶解タンパク質のメリチンへ結合したハプテンに抗体が結 合すると、メリチンのリポソーム溶解作用が阻止される〔フレイタッグ（Ｆｒθ ｙｔａｇ　）らのＢｉｏｐｈｙｓ、Ｊ、、４５　３６０（ａ）　（１９８４）を 参照〕。狼倚血ｍ（Ｌｕｐｕｓ　ｓｅｒｕｍ）中の抗体がカルシオリビン含有リ ボンームに結合すると、リポソームの溶解はＭｇ＋２イオンによって妨げられる 〔ジャノツフ（Ｊａｎｏｆｆ）らの０１１ｎ、Ｃｈｅｍ、、２９　１５８７（１ ９８３）を参照〕。これらの検定は補体を必要としないが、膜溶解分子またはイ オンのいずれかを必要トスル。

前述した検定法は非常に感度のよいものであるが、しはしば多数の工程を要し、 時には再現化および／または自動化するのが困難である。従って、もつと効率の よい新しい検定法が望ま本発明は免疫複合体の形成の直接的結果としてリポソー ムが溶解される免疫検定法に関する。本発明の検定法はＲＩＡと同程度に感度が よく、迅速な測定を提供し、しかし膜溶解分子、イオンまたは活性補体の存在を 必要としない。

本発明は新規な膜溶解免疫検定法に関する。従って、その膜溶解免疫検定法は次 の諸工程： （ａ）　分析対象の被分析体およびマーカー化合物を含むリポソームを調製する 工程； （ｂ）被分析体のための受容体を付着させた固相不活性支持体を準備する工程； （Ｃ）　工程（ｂ）の受容体−固相支持体と試験液体とを十分な時間混合して、 該受容体に試験液体中に存在する全ての被分析体を結合させる工程； （ｄ）　工程（ａ）において調製したリポソームと工程（Ｃ）からの結合させた 受容体−固相支持体とを混合する工程；（、）　工程（ｄ）においてリポソーム から放出されたマーカー化合物の存在を測定する工程；から成っている。

この検定法の１つの実施態様において、最初に抗原を脂質に共有結合させ、そし てこの抗原−脂質複合体と非二重層形成性脂質または脂質混合物とを使用して、 自己消光性螢光色素をさらに含有する安定な二重層リポソーム小胞を調製する。

抗原および色素を含有するこのリポソームと、抗体を付着させた不活性固体表面 とを接触させると、すみやかな結合が抗原−脂質複合体と抗体との間に起こり、 リポソームが破壊されて色素を放出する。色素の放出は標準螢光定量法を用いて 定量化することができる。試験試料中の抗原の量を検定するためには、採取した ままの試料または希釈した試料をまず第一に不活性固体表面に添加して付着抗体 に結合させる。従って、続いて行われるリポソームの結合および色素の放出は減 少する。その後、未知試料中の抗原量を既矧標品中の抗原量と比較することＫよ り決定する。本発明はまた前記検定法において使用する特にキットの形をした製 品に関する。

図面の簡単な説明 第１図はＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥを使用することによるＤＯＰＥおよびＤＯＰＣＩ ７ポソームの安定化を示す。超音波処理した脂質の９０°光散乱をＤＯＰ耳（ａ ）およびＤＯＰＣ（ｂ）リポソームについて測定した。

第２図はＤＯＰＥ−ＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥ（８８：１２）　リポソームの倍率１ ．１２Ｘ１０６でのネガティブ染色法による電子顕微鏡写真である。

第３図はスライドガラスに付着させた抗体によるＤＯＰＥリポソーム溶解の免疫 特異性を示す。

第４図はスライドガラスに付着させた抗体によるＤＯＰＣリポソーム溶解の免疫 特異性を示す。

第５図はＤ　ＯＰ　Ｅ　ＩＪポソーム溶解に際しての付着抗体濃度の影響を示す 。表示濃度の抗ＤＮＰ−Ｉｇｑｃ）　または正常ＩｇＧ（ａ）を用いてスライド ガラスを被徨し、ＤＯＰＥリポソーム溶解をカルセイン放出によって測定した。

第６図は遊離ハプテンによるＤ　ＯＰ　Ｅ　＋）　ｙＮソーム溶解の阻害を示す 。リポソームの添加前に、スライドガラス上の付着抗ＤＮＰ−工ｇＧ　へ表示濃 度のＤＮＰ−Ｇｌｙ（ｅ）またはＧ　１　ｙ　（ｆ）を加えた。

第７図は遊離抗体によるＤＯＰＥ＋Ｊ、ｎソーム溶解の阻害を示す。リポソーム はスライドガラス上の付着抗体へ加える前に表示濃度の遊離抗ＤＮＰ−ＩｇＧ（ ｇ）または正常Ｉ　ｇＧ　（ｈ）と予めインキュベートした。

第８図は本発明の固体免疫リポソーム検定法の略図を表わす。

詳細な説明 リポソームは閉鎖された脂質二重層から構成される微細小胞である。パパハジョ ポーラス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）のΔ＝二Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、　３０８　１　（１９７８）を参照されたい。それらの比較的単純な 組成と化学的、物理的および免疫学的操作に対するそれらの柔軟性ゆえに、膜溶 解検定法にとってリポソームは好適な材料である。

他の免疫検定法と比較した場合に、膜溶解免疫検定法の使用にはいくつかの利点 がある：（１）単一溶解現象は多くのシグナル分子の放出へと導き、それ故に高 度のシグナル増幅が存在しうる；（２）免疫複合体を遊離の抗体または抗原から 分離する必要がほとんどな（、従って一般に均一系検定法である；および（３） 比色定量法や螢光定量法のような光学測定を使用することができ、従ってラジオ アイソトープの使用に必要な諸条件を全て排除できる。これらの理由のために、 膜溶解検定法は免疫検定法における最近の開発においてますます注目を浴びてい る。

本発明の免疫リポソーム検定法は、１つの特定物質（例えば抗原）の検定法につ いて説明することにより例示されるであろう。抗原検定法についてここに記載さ れる一般原理および技術は、例えば抗体やハプテンのような他の物質様の検定法 に応用することができる。

本発明の理解を助けるために、本明細書において用ｔ・る次の用語は以下のよう な意味を有する。

被分析体−測定されるべき化合物または物質であって、それは抗原、ハプテンま たは抗体のようなりガントであり得る。例えば、好適な実施態様において被分析 体は抗原または抗体のいずれかであり得る。

リガンド−化合物のための免疫学的受容体が自然界に存在するかまたは作られう る該化合物。リガンドが抗体であるときに、その免疫学的受容体は抗原または抗 −抗体でありうる。

リガンド−脂質複合体−分析対象の被分析体と、本発明検定法用のリポソームを 形成するための脂質または脂質混合物と相溶性である脂質と、からなる共有結合 された物質。対象のリガンドが小胞形成用の脂質二重層を安定化するために直接 使用できな（・場合、そのリガンドは最初に慣用のカップリング反応を使って適 当な脂質にカップリングされねばならない。類似のカップリング反応が抗リガン ドと不活性固体支持体との間のカップリングのために以下に記載される。この種 のカップリングに使用する脂質は脂肪酸（＞０１ｏ）、リン脂質、炭化水素（〉 Ｃ１ｏ）、大環式炭化水素、多環式炭化水素および当業者により容易に選択され うる他の脂質である。リガンド−脂質複合体は不安定なリポソームの組成を安定 化するために用いられる。例えば、１つの態様において、ホスファチジルエタノ ールアミン誘導体（Ｎ−カプロイル）に共有結合させた抗原を用いて、主として （８８モルチ）ホスファチジルエタノールアミンから作られたリポソームを安定 化することができた。

マーカー化合物−簡単に検出することができる放射性トレーサー以外の化合物。

本発明において特に有用なものは酵素（コールらの米国特許第４３４２８２５号 を参照）、化学ルミネッセント物質、発色体および螢光体のようなマーカーであ る。最適なマーカー化合物は自己消光性螢光色素である、これらの化合物にはカ ルボキシフルオレセインおよびカルセインのようなフルオレセインの水溶性誘導 体が含まれる。他の適当なマーカーは水溶性螢光色素（例えば８−アミノ−ナフ タレン−Ｌ３．６−トリスルホン酸）と水溶性消光剤（例えばｐ−キシレンビス （ピリジニウム）プロミド）との組合せである。色素／消光剤の組合せが溶解の 際にリポソームから放出されるとき、希釈すると螢光の低下を防ぐことができ、 その結果螢光の検出が可能になる。例えばエレンス（Ｅｌｌｅｎｓ　）らのＢｉ ｏｃｈｅｍ、　２３１５３２（１９８４）を参照されたい。

受容体−他の分子の特定の空間的および極性的機構を認識することができる化合 物または物質。天然の受容体には抗体、酵素、レクチンなどが含まれる。特異リ ガンドに対して、その受容体は一般に抗リガンドと称される。情況に応じて、こ れらの用語は交互に入れかわり、すなわちある場合の受容体が他の場合のリガン ドになりうる。例えば、好適な実施態様において、抗原のための受容体は抗体で あり、一方抗体のための受容体は抗−抗体または好ましくはその抗体の同族抗原 である。

システム−被分析体、リガンドおよび／または受容体試薬の組合せであって、通 常緩衝剤、塩類、安定化剤などの補助試薬に供給されるもの。例えば、抗原の存 在および／または濃度を検出するシステムは適当な容器内にｍｌ、Ｉポンーム膜 中の抗原またはその化学的誘導体；　（２）（１）のリポソームに封入された螢 光体または他の適当なマーカー；（３）固体支持体に付着させたその抗原のだめ の抗体；および（４）既知色素放出と未知色素放出との比較用曲線を作成するた めの既知濃度の抗原標品、または予め定められた比較曲線および１つの対照用標 品；を含むであろう。

また、そのキットは単に（１）リガンド−脂質複合体を製造するための適当な試 薬：（２）必要に応じて、その他のＩＪ　ホソーム調製用成分；（３）マーカー 化合物：（４）被分析体標品；および（５）受容体標品；を含むだけでよい。使 用者はいつでも使えるようにそれぞれの検定条件に応じて特異試薬類を容易に配 合することができる。検定手段はシステムの一部として提供されるが、一般にそ の必要はない。

本発明の１つの実施態様において、抗原検定法は抗原−脂質複合体から形成され たリポソームの側面の相分離を含み、このような分離はリポソームの不安定化お よび螢光色素のようなマーカー化合物の放出をもたらす。

ヘキサゴナル（Ｈｌ、）相を形成し得る脂質はどれも本発明の実施に際して使用 することができる。この種の適当な脂質の１つは、卵黄ＰＥまたはジオレイルＰ Ｅのような不飽和ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である。不飽和ＰＥ それだけでは室温および中性ｐＨにおいて安定なリポソームを形成しない。

ＰＥのほかにＨ１□相を形成することができる脂質にはカルジオリピビおよびホ スファチジン酸が含まれる。これらの脂質はＣａ２＋のような２価陽イオンの存 在下にＨＩＴ相を形成する。他の天然脂質はどれも温度および塩濃度の生理学的 条件下でＨｒＩ相を形成しないと報告された。しかしながら、ＨＩＴ形成性脂質 の構造の一般的必要条件は、比較的かさ高の疎水性部分に結合した比較的小さな 親水性基が存在すると（・うことである（全体的な分子形状は円錐形である）。

従って、適当な分子形状（円錐形）のもとでＨｒＩ相を示し、且つ本発明の実施 に使用できる合成脂質が容易に製造される。

さらに、相補的形状（すなわち逆円錐形）を有づ−る脂質分子は、前記のＨＩＩ 形成性脂質と一緒になって安定な二重層リポソームを形成することができると推 定された。これらの脂質分子は小さな疎水性部分に結合したかさ高の親水性基を 含むであろう。水溶性リガンド（例えば抗原）と十分な疎水性質を有する脂質と の複合体が逆円錐の分子形状を有するであろうことは、当業者にとって明白であ る。従って、この型のりガンビー脂質複合体はＨＩＴ形成性脂質から成る不安定 なリポソーム二重層を安定化するのに役立つであろう。クリス（Ｃｕ１１ｉｓ） およびダクライフ（Ｄｅｋｒｕｉｊｆｆ）のＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、　Ａｃｔａ、５５９３９９（１９７９）を参照されたい（この文献の記載内容 は参照によりここに引用される）。

ＨＩＩＩ形成性脂質およびリガンド−脂質複合体（例えば抗原−脂質複合体）を 使って、超音波処理、透析または他の慣用技術により安定なリポソームを調製し 、そしてそのリポソームの内部に自己消光性螢光色素のようなマーカー化合物を 封入することができる。抗原含有リポソームが、抗原を認識ある（・はそれと反 応する適当な抗体分子を付着させた不活性固体表面と接触すると、抗原−脂質複 合体が側面に移動して抗体と結合する。

リポソームのこの側面の相分離は二重層からヘキサゴナル相への速やかな転移を 生じさせ、閉じ込められたマーカーの放出へと導く。こうして、例えば螢光シグ ナルが放出され、このシグナルは不活性固体表面から試薬または他の物質を分離 する必要なしに容易に測定することができる。

血清のような生物学的液体中の遊離抗原を検定する場合、最初にその血清を不活 性固体表面に付着させた抗体へ添加し、それによって抗原を付着抗体に結合させ る。こうして、リポソームの結合能力が阻害されて色素の放出量が減少する。遊 離抗体を検定する場合は最初に血清がリポソームに添加される。遊離抗体は多価 でないので、リポソームの相分離は起こらない。その代わりに、抗原−脂質複合 体の結合部位が遊離抗体で満たされ、この場合も固定化抗体へのリポソームの結 合能力が低下する。

本発明の検定法は水性媒質中適度のｐＨ（例えば中性）で、一般には最適検定感 度に近づけて、検定用成分または生成物を分離することな〈実施される。被分析 体を測定する検定帯域は未知試料（予備処理したものでもよい）、リホンームー 被分析体−螢光体試薬、検出可能なシグナルの発生に関連した補助物質、ならび に適切な場合、不活性固体支持体に結合させた修飾または未修飾受容体を含有す る適当な水溶液（通常緩衝化される）を用いることにより得られる。

生物学的試料中の被分析体としてのリガンドまたは抗リガンドの濃度は、固体支 持体に付着した受容体と免疫リポソーム複合体との間の結合度に影響を与え、そ して検出可能なシグナルの発生にも影響するだろう。

本検定法を実施する場合、普通は水性媒質が使用されるであろう。その他の極性 溶媒も使用でき、好ましくは炭素原子数１〜６、より好ましくは１〜４のアルコ ールやエーテルなどの酸素化有機溶媒が使用される。通常、これらの補助溶剤は 約４０容量チ以下、好ましくは約２０容量チ以下で存在するだろう。

媒質のｐＨは通常約４〜１０の範囲、好ましくは約５〜９の範囲、より好ましく は約５．５〜８５の範囲であるだろう。ｐＨはシグナルの発生を最適化しつつ、 受容体による特異的結合を有意なレベルに保つように選ばれる。いくつかの場合 には、これらの２つの条件の間で妥協点が見出されるであろう。所望ｐＨを得て そのｐＨを測定の間中維持するために、各種の緩衝剤が使用される。緩衝剤の例 としてはホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、トリスＨＣｌ、バルビタールな どが含まれる。本発明にとって使用する緩衝剤は特に限定的ではないが、それぞ れの検定において、ある緩衝剤が他の緩衝剤よりも好適であるということはあり 得る。

本検定法を実施する場合、通常適度の温度において行われ、好ましくは一定温度 が検定期間中維持される。測定温度は一般に約１０〜５０°Ｃの範囲、好ましく は約１５〜４０℃、より好ましくは約２２℃であるだろう。

検定しようとする被分析体の濃度は一般に約１０−４〜１０−１５モル、好まし くは約１０〜１０　モルの範囲であるだろう。

検定技術および被分析体の予期される濃度により決定されるだろう。

一般に、各種試薬の濃度は被分析体の予期される濃度範囲によって決定されるが 、各試薬の最終濃度は通常被分析体の濃度範囲よりも検定の感度を最大とするよ うに経験的に決定されるだろう。

不活性固体表面への受容体の付着は、当業者に利用可能な技術を使用することに より達成される。この種の技術には吸着、吸収、イオン結合、共有結合、水素結 合などが含まれるが、これらに限定されない。一般に、ガラスおよび水不溶性ポ リマー類が受容体用支持体として使用される。支持体はどんな形状または形体の ものであってもよい。例えば、スライドガラス、ポリマーディスクまたはポリマ ー帯片のような平らな物体、試験管の壁、あるいは広（入手可能なビーズ類が本 発明の支持体として利用できる。受容体と支持体との間の結合は、その結合が普 通の洗浄法または試験血清を含めた水溶液との接触により破壊されないように十 分強くなければならない。

１つの適当な化学的結合は、固体支持体と受容体との間に共有的性質の架橋を与 えることである。この目的のために、固体支持体はそれが適当な反応性官能基（ 例えばアミン基、ヒドロキシル基およびカルボキシル基）を含むかまたはそれら の基を付与され得るように選択され、それにより受容体と固体支持体とを容易に 結合させることができる。共有的性質の化学結合を有する受容体と固体支持体と の間の架橋が特に有用である。

不活性支持体と受容体との間の架橋基として一般に有用な官能基は以下のもの： 受容体−ＮＨ−Ｃ８−ＮＨ−支持体 受容体−ＮＨ−Ｃｏ−ＮＨ−支持体 受容体−Ｎ＝Ｎ−支持体 受容体−〇−Ｃ〇−支持体 受容体−ＮＨ−Ｇｏ−支持体 受容体−Ｇｏ−ＮＨ−支持体 受容体−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−０−支持体受容体−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−支 持体から一般に選択される。受容体と支持体との間の架橋は本発明検定法の限定 的部分ではない。架橋はどんなタイプのものであってもよく、またいろいろなタ イプの組合せであってもよ（・。

その唯一の条件は受容体が支持体から洗いおとされな（・とｔ・うことである。

架橋は通常親水性であって、リガンビー受容体の結合に対して不活性である。

本発明の不活性固体支持体としては三次元網状構造を有するポリマー類が有用で ある。この種のポリマーは水または水溶液中で膨潤性であってもよいが、完全に 不溶性であって、一般には不活性であると考えられる。適当なポリマーの例とし ては拶数のヒドロキシル基を含む物質（例えばデキストラン、澱粉、デキストリ ンおよび他の多糖類のような炭水化物および糖アルコール類、ならびにポリビニ ルアルコール類）と二官能性物質（例えば式Ｘ−Ｒ−Ｚの物質、式中Ｘおよび２ は例えば）・ロゲンまたはエポキシ基であり、Ｒは二官能性物質の残基であって 通常炭素原子数３〜１０の脂肪族炭素鎖である）とを架橋結合させることにより 得られる共重合体が含まれる。

受容体は不活性ポリマーに温和な条件のもとで結合され、それにより受容体の免 疫化学反応性を認めうる程度に低下させないようにする。

本検定法において特に有用な支持体はガラス（スライド、ビーズなど）、ラテッ クス、および水膨潤性ゲル（セファデックス、ポリアクリルアミドなど）である 。この支持体は好ましくは大きな接触面積が得られるような形で使用され、粒子 またはビーズの形体が最も好ましい。

本発明検定法は最適には均一系検定である。従って、固体支持体のサイズおよび ／または密度はマーカー化合物に対して最小のバックグラウンド妨害（例えば光 散乱）を与えるように選択されるべきである。もし妨害に会うときは、粒子が検 定用試験管の底に数分で沈降するように大きな粒子および／または高密度粒子を 使用すべきであり、それによりマーカー化合物の検出可能性を有する全ての妨害 を排除する。この遅れは、試薬類の混合と検定の読み取りとの間にほんの一時（ １〜２分）の遅れを入れることにより、自動検定システム内に簡単に組み入れる ことができる。

本発明検定法は以下に述べるように１つの実施態様のための免疫リポソームの調 製に関連して例示される。その他の実施態様のための免疫リポソームは類似の方 法で調製できる。

ＩＪ　、ｔ−６ンームの調製方法は多数存在する。そのうちのあるものは小さな 小胞（ｄ＜０．０５μ７７Ｌ）を作るために使用され、あるものは大きな７４％ 胞（ｄ＞０．０５μｍ）を作るために使用される。ま小胞を作を作るために使用 される。本発明にとって、膜上の清適である。しかし、多重ラメラ小胞を使用し てもよく、この場合は恐らく効率が低下するだろう。リポソームの調製方法は、 例えばシーカ（Ｓｚｏｋａ　）およびパパハジョポーラス（Ｐａｐａｈａ−ｄｊ ｏｐｏｕ１０日）のＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｅ、　Ｂｉｏｅｎｇ＋、 　９　４６７（１９８０）およびディーマー（Ｄθａｍθｒ）およびアスター（ Ｕｓｔｅｒ）のリポソーム、　Ｍ、　Ｊ、オストロ編集、マーセル・デツカ−、 ニューヨーク、１９８３．２７〜５１頁のようないくつかの文献に余すところな く記載されている。また、最近発行された論文リポソームテクノロジー、Ｇ、ダ レボリアジス（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）、　ＣＲＣプレス、ボヵラトｙ　（Ｂ ｏｃａ　Ｒａｔｏｎ　）は特にその１巻に最新情報を含んでいる。

ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は室温および中性ｐＨ で安定な二重層ＩＪ　ホソームケ形成しない。しかしながら、ＤＯＰＥを少なく とも１２％のノ・ゾテン化脂質、Ｎ−（ジニトロフェニルアミノカプロイル）− ホス７アチシルエタノールアミン（ＤＮＰ　−ｃａｐ−ＰＥ　）と混合すると、 安定な単ラメラリポソームが形成される。カルセインのような自己消光性螢光色 素を含むこれらのリポソームを、ガラス表面に吸着させたウサギ抗ＤＮＰ　Ｉｇ Ｇと接触させると、リポソームの溶解が起こり、自己消光性螢光色素が媒質中に 放出される。正常のウサギエｇＧはほとんど効力を持たな（・。遊離のツサギ抗 ＤＮＰＩｇＧ＋ｉｌＪポソームの凝集を誘発するだけで、色素を放出させない。

ジオレイルホスファチジルコリントＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥ　トから作られたＩＪ 　ホソームは、ウサギ抗ＤＮＰ　ＩｇＧまたは正常ウサギ１ｇＧを被覆させたガ ラス表面と接触させたとき溶解しない。なぜなら、ホスファチジルコリンがＨＩ Ｉ相を形成しな（・からである。

先に述べたよ°うに、本検定法の構想は不飽和ＰＥが生理学的条件のもとで安定 な二重層リポソームを形成し得ないことに基づいていた〔レイスーハツソン（Ｒ ａ１θ５−Ｈｕｓｓｏｎ　）　Ｉ）　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、２５　３６３　（１９６７）；ラント４（Ｒａｎｄ　）らのＣｈｅ ｍ。

Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ、　６　３３３　（１９７１）　；カリス（Ｃａ１ｌ ｉｓ　）らのＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｅ、Ａｃｔａ、、　５５９　３９ ９　（１９７９）を参照〕。

ＤＯＰＥ二重層リポソームを安定化するのに要するＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＲの最小 量は、二重層中のリガンド−脂質複合体の有効濃度が小さな摂動（ｐｅｒｔｕｒ ｂａｔｉｏｎ　）によって減少し、その結果二重層の不安定化を起こすように決 定された。摂動原因はリガンド−脂質複合体と固定化された多価抗リガンドとの 結合であると考えられた。この最小量は温度、ｐＨおよび本検定法において使用 する個々のりガントまたは抗リガンドにより変化するであろう。しかしながら、 当技術分野における当業者は本明細書および利用し得る文献に記載の原理に基づ いて、日常の試験からその適量を容易に決定することができる。

特定の理論に縛られることを望まないが、本発明検定法の原理についての１つの 説明は、リン脂質の側面の相分離を包含する。第８図に示すように、リガンド− 脂質複合体は流動性脂質二重層の平面内を約Ｉ　Ｘ　１０−８ｃｒｎ”／秒の拡 散係数ですみやかに拡散する〔ピーターズ（Ｐｅｔｅｒｓ）のＣｅｌ’ｌ　Ｂｉ ｏＬ　Ｉｎｔｅｒｎ。

Ｒｐｔａ、、５　７３３　（１９８１）を参照〕。このことは、リガントゝ−脂 質複合体がリポソームとガラス表面に結合した抗リガント８との間の接触領域へ 拡散するのにほんの１秒しかかからないことを意味している。免疫複合体の形成 は、リガンド−脂質複合体が接触後の表面からランダムに拡散するのを妨げる。

こうして、リガンド−脂質複合体は接触領域に速やかに捕捉される。

このような側面の相分離はリポソーム二重層中のリガンド−脂質複合体濃度を効 果的に減少させ、そしてＩＪ　ホンームの不安定化へと導く。全過程は室温でほ んの数秒またはそれ以下を要するのみと推定される。このメカニズムは純理論的 であるが、遊離の二価抗体がリポソームの漏れを誘発しないという観察と一致す る。二価抗体のリガンド−脂質複合体への結合は広範囲の相分離を引き起こすこ とができない。実際に、二価抗体によって架橋結合されたリポソームの凝集が観 察できた。

本発明の検定法および製品は以下の実施例に関連してさらに例示されるが、これ らの実施例は本発明の理解に役立つものであって、添付の請求の範囲で説明され る本発明の範囲を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。ここに記 載の全ての百分率は特に指定しない限りモルチを表わす。全ての温度は℃を表わ し、未補正である。

実施例］　：　ＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥによるＤＯＰＥリポソームの安定化安定な りホンームの形成は６６０　ｎｍでの９０’光散乱によって監視した。ＤＯＰＥ 二重層を安定化するＤＮＰ　−ｃａｐ　−ＰＥの最小量を決定するために、いろ いろな量のＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥをＤＯＰＥまたはＤＯＰＣと混合し、この脂質 混合物を２０分間超音波処理し、その後光散乱を測定した。安定な超音波処理リ ポソームが形成されると懸濁液の濁り度が低くなり、従って低い光散乱が検出さ れた。第１図に示すように、ＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥの濃度が１２％以上になると 安定なり’０ＰＥＩＪポソームが生成した。６〜１１％の間では、ＩＪ　、ｄソ ーム懸濁液がかなり濁っており、それ故に高い光散乱を示した。６％以下である と大きな脂質凝集体が見られ、光散乱は再び低くなった。純粋なり０ＰＥ（１， １ガント−脂質複合体を含まない）は長期の超音波処理後でさえ大きな凝集体を 形成するのみであった。これとは対照的に、ＤＯＰＣはＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥの あらゆる濃度で安定な、低光散乱性リポソームを形成した。安定なりＯＰＥすｙ ｔ？ンームの形成にとって少なくとも１２％のＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥが必要であ ると決定された。この組成は以後の全ての実験に対して使用した。

実施例２：リポソームのサイズ ＤＯＰＥ／ＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥ（８８：１２）から作られた超音波処理リポソ ーム（以後ＤＯＰＥリポソームと呼ぶ）は単ラメ２小胞であり、ネガティブ染色 法による電子顕微鏡で調べたときサイズが比較的均一であった（第２図参照）。

リポソームの平均直径は９０８±１３４オングストロームであった。

実施例３：リポソームの保持容量 Ｄ　ＯＰ　Ｅ　ＩＪポンームの平均直径から、リポソームの保持容量または封入 容量はイーノック（Ｅｎｏｃｈ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６　１４５（１９７９）に従って、２６６マイクロリツトル ／マイクロモル（脂質）であると計算された。また、リポソームの保持容量は、 保持されないカルセインをゲル濾過にヨリ除いた後リポソーム内に保持されたカ ルセインの量を測定することにより、直接的に推定した。このことは螢光強度対 カルセイン濃度（０−０，５マイクロモル）の標準曲線を作成することにより； および微量のヘキサデシル〔３Ｈ〕コレスタニルエーテルをさらに含むリポソー ム懸濁液中の３８−ｃｐｍ　を測定して脂質量を決定することにより行われた。

リポソーム内部のカルセイン濃度が４０ミリモルであると仮定すると、保持容量 は２．０８マイクロリツトル／マイクロモル（脂質）であると決定された。これ はりボンームのサイズから計算した値と一致した。

ＤＯＰＣ／ＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥ（８８二１２）リポソーム（以後ＤＯＰＣリポ ソームと呼ぶ）の保持容量は０．５４マイクロリツトル／マイクロモルであり、 このことはこれらのリポソームのサイズがかなり小さいことを示している。カル セインを含むＤＯＰＥま？、＝ｌ！Ｄｏ　Ｐ　ＣＩＪ　、ｌ＃ソームは、有意な 色素の漏出なしに４℃で少なくとも１週間安定して保存できた。

実施例４：リポソーム−抗体相互作用の際の色素放出リポソーム溶解を測定する ために、リポソームの内部にカルセインを４０マイクロモルの濃度で保持させた 。この濃度においてカルセイン螢光は自己消光される。色素がＩＪ　ホンームの 外に漏れ出ると螢光は非常に増強される〔アレン（Ａ１１ｅｎ　）らのＢｉｏｃ ｈｉｍ、　Ｂｉｏ　ｈｙｓ、　Ａｃｔａ、５９ユ４１８（１９８０）を参照〕。

いろいろな種類のタンパク質で被覆したガラス表ｍｌを使って、リポソームから のカルセイン放出を誘発する能力について試験した。第３図から明らかなように 、被覆のないガラス面およびＢＳＡで被覆したガラス面はリポソーム漏出を誘発 できなかった。しかしながら、ＤＯＰＥリポソームを抗ＤＮＰ　ＩｇＧで被覆し たガラス面と接触させた場合、保持力ルセインが全部放出された。正常ＩｇＧで 被覆したガラス面はいくらかの効力を有していたが、その強度は抗ＤＮＰ　工ｇ （：、よりもかなり劣っていた。色素の放出はガラス面を遊離ハプテン（ＤＮＰ −（，１７）で予備処理することにより、あるいはリポソームを遊離抗ＤＮＰ工 ｇＧと共にプレインキュイードすることにより阻害されるが、遊離正常工ｇＧま たはＢＳＡによっては阻害されなかった。これらの結果は、ＤＯＰＥリポソーム からの色素放出がガラス面での抗体−ハブテン結合の直接的結果であるというこ とを強く示唆している。Ｄ　ＯＰ　Ｇ　ＩＪポソームは非常に安定であり、試験 したガラス面はどのタイプも色素の放出を誘発できなかった（第４図参照）。

実施例５：　色素放出に対する固定化抗体の影響ガラス面の被覆に際して、使用 した工ｇＧ溶液の濃度を変化さすた。第５図は色素の放出がガラス面上の抗体濃 度により影響を受けることを示している。濃度が１μ９／ｒａｔ以上の抗ＤＮＰ ＩｇＧ　ｆｉｌ液で被罎したガラス面については、はとんど全部の色素放出が覗 祭された。この濃度以下であると、徐々に色素放出が低下することが見出された 。正常工ｇＧも高濃度（１０μｇ／ゴ以上）においてリポソーム溶解に非特異的 作用を示したが、その強度は抗ＤＮＰ　工ｇＧによって生じたものよりかなり劣 っていた。以後の実験（実施例６）では、１０μ９７ｍ１の工ｇＧ　濃度を使用 してガラス面を被覆した。

リポソーム溶解に対する遊離ハプテンの阻害作用について試験した。第６図に示 すように、遊離ハプテンであるＤＮＰ−Ｇ１７はＤＯＰＥ　リ４ンームからの色 素放出を効果的に阻害することができた。５０チ阻讐を起こす遊離ハプテンの濃 度は０，３５マイクｏ−ｅｆｉｖであると計算され、これはプレインキュベーシ ョ：ｙ用媒質４０マイクロリットル中の１．４　Ｘコモルに相等した。非ハプテ ン類似体のＧｌｙは１ミリモル濃度でさえ色素放出に対して何ら影響を及ぼさな かった。

遊離抗ＤＮＰ　工ｇＧは１０　ｍＬｉ／ｍｌでさえ色素の放出を誘発しな観察さ れた。ＤＯＰＥ　リポソームと遊離抗ＤＮＰ　よりＧ　とのブレインキュベーシ ョンは色素放出を氾害したが、正常１ｇＧ　は阻害しなかった（第７図参照）。

’１５ｍ９／ｍｅの遊離抗体濃度で５０％阻害が起こり、これはブレインキュベ ーション容量５μρ中の２．５μ９に相等した。

材料 ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレイルホスファ チジルコリン（ＤＯＰＣ）およびＮ−（ジニトロフェニルアミノカプロイル）− ホスファチジルエタノールアミｙ　（ＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥ）はアバフチ・ポー ラ−・リピド社（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒ　ＬｉｐｉｄＥ＋、工ｎＣ，バーミン ガム、アラバマ州）よシ購入した。カルセイン、Ｎ−（ジニトロフェニル）−Ｉ Ｉ）シン（ＤＩＰ−Ｇｌｙ）およびグリシンはシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈθｍ１ｃａｌ　Ｃｏ、、セントルイス、ミズリー州）より購入した。

その他の試薬類は分析級のものを使用した。

抗ＤＮＰ　ｔｎ清はＤＮＰ−誘導ウシ血清アルノミン（ＢＳＡ）で免疫化したウ サギより調製され〔アイゼン（Ｅｉｓｅｎ）らのＭθｔｈ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、、１．　３５１　（，１９６７）を 参照〕、ステ７アｙ−ケネル博士（Ｄｒ、５ｔｅｐｈｅｎ　Ｋｅｎｎｅｌ）から 贈られたものであった。プロティ／−Ａアフィニティーカラムクロマトグラフィ ーによってその血清から１６０画分を精製し〔ワーマーカロニス（Ｍａｒｃｈａ ｌｏｎｉｓ）　およびワール編集、５９〜９６、ジョンウィリー・アンド・サン ズ、ニューヨーク（１９８２）を参照〕、そして−２０℃で燐酸瑳衝溶１（ＰＢ Ｓ）中に保存した。

種々の濃度のＩｇＧ　ｍ液４０μ！を直径１．５　ｃｍの点として清浄スライド ガラス上に加えることにより、抗体をガラス面に付着さ、！た。室温で２０分後 、このスライドガラスをＰＥ８６〜８ａｅで十分に洗浄し、上記の点以外のとこ ろを吸い取って乾かし、そして次の実験にすぐ使用した。

通常の実験により、ＤＯＰＥまたはＤＯＰＣ（８，８マイクロモル）、ＤＮＰ− ｃａｐ−ＰＥ　（１，２マイクロモル）およびａｔのヘキサデシル〔３Ｈ〕　コ レスタニル　エーテル（最終比活性５．７　Ｘ　１０９　ｃｐｍ１モル）を混合 し、そしてＮ２　ガス流を用いて溶媒を蒸発させ加えた。この混合物を、均質な 半透明リポソーム懸濁液が得ら（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｕｐｐ１ｉｅｅ、Ｉ ｎｃ、）　、ヒツクスビル、ニューヨーク州〕を使って室温で２０分間超音波処 理した。次に、このリポソーム懸濁液をバイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ａ３０Ｍ カラムによるクロートゲラフにかけて保持されなかったカルセインを除≦した。

リポソームはボイドボリューム（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍθ）画分中にＰＢＳを用 いて溶離し、３Ｈ放射能を計数することにより険出し、プールし、そして４℃で 保存した。

リポソーム−抗体相互作用 リポソーム懸濁液（５〜４５μρ中の脂質０９〜１．９ナノモル）を、予めＩｇ Ｇで被覆したスライドガラス上の点へ加えた。

湿り室内において室温で２０分インキュベーション後、スライドガラスをＰＢＳ 　２ｍｌで洗ってリポソームを浅い石英製容器の中に定量的に移した。パーキン ・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍθｒ）Ｌ８５　分光螢光定量計を使ってλ８ Ｘ−４９０ｎｍおよびλ。ｒｎ−５２０ｎｍにおける螢光を測定した。リポソー ムの全カルセイ／螢光はデオキシコール酸ナトリウムを添加して最終濃度ｔｏ、 １２チとした後に測定した。色素放出のパーセントは次の式：（式中、Ｆ′。お よびＦはそれぞれ固定化抗体との相互作用前および相互作用後のリポソーム試料 のカルセイン螢光であＩＩ、ｎ’ｔはデオキシコール酸塩により放出させた後の 全カル上イン螢光である）によって定められる。

色素放出の阻害については、４０μｕ中の遊離ハプテンをスライドガラス上の固 定化抗体に加え、そして・す雷２ンームの添加に先立って室温で２０分インキュ ベートした。遊離抗体による阻害の場合は、等容量のリポソームと抗体全混合し 、室温で２０分プレインキユベートシ、その後スライドガラスへ添加した。

リポソームの９０°光散乱 リポソームの形成について試験するために、超音波処理した脂質をＰＢＳで１０ ０倍に希釈した。パーキン・エルマーＬ３５分光螢光定量計を使ってλ、３ｘ＝ λｅ（１１−６６０ｎｍ、スリット幅３ｎｍにおいて９０’光散乱を測定した。

リポソーム（０７５μＭ／旨）は０５チ酢酸ウラニル水溶液でネガティブ染色し 、そして７５　ＫＶの日立６００心子頒微鏡で観察した。リポソームのサイズは 拡大顕微鏡写真でＴｈ１ｌ定した。

本発明方法は各種の被分析体に対して応用できる。標準免疫学的方法°を使って 、多数の被分析体に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生 ずることができる。その他の膜溶解法も本発明に包含され、例えば本発明検定法 を使用する酵素または酵素基質の検出は、先に述べた抗原または抗体の検出と類 似した方法を使って実施することができる。

一般に、酵素基質（必要に応じて適当な脂質にカップリングする）’１ＤＯＰＥ のようなＨ■形成性脂質と混合して、螢光色素などのマーカーを含有する安定な リポソームを調製する。これらのリポソームと固体支持体に結合した適当な酵素 とが相互作用するとリポソームの溶解が起こり、それにより螢光色素が放出され る。標準の酵素または基質の種々濃度を用いて色素放出全測定し、そして生物学 的試料中の未知量の酵素または基質による色素放出の阻害全測定して、標準プロ ットからその濃度全計算する。

本発明検定法により検出可能な酵素としてはオキシビレダクターゼ（酸化還元酵 素）、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、クリセロールデヒト９０ゲナーゼ、 グリオキシレートレダクターゼ、Ｌ−ラクテートレダクターゼ、マレートレダク ターゼ、グルコース６−ホス７エー１−７”ヒドロゲナーゼ、マンニトールｌ− ホスフェートデヒドロゲナーゼ、Ｌ−ラクテートデヒドロゲナーゼ、グルコース オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸素リア−ゼ、Ｄ−アミ ノ酸素リア−ゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、アスコルベートオキ／ダーゼ、 カタラーゼ、ペルオキシダーゼ；ヒドロラーゼ（加水分解酵素）、例えばカルボ ン酸エステルヒドロラーゼ、コリ／エステラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラ ーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、リン酸ジエステルヒドロラーゼ、ホスホリパ ーゼＣ（リポソーム形成に用いる脂質がリン脂質でない場合）；グリコシドヒド ロラーゼ βーガラクトシグーゼ、アミログルコシダーゼ、βーグルクロニグーゼ；ペプチ ジル−アミノ酸ヒドロ２−ゼ、カルボキシ２ブチダーゼＡ１ペプチジル−ペプチ ドヒト９０ラーゼ、α−キモトリプシン、パパイン、ウレアーゼ、無機ピロホス ファターゼ：リアーゼ、例えば炭素−炭素リアーゼ（例えばアルド９ラーゼのよ うなアルデヒドリアーゼ）、炭素−酸素リアーゼ（例えばカルボン酸アンヒトゞ ラーゼのようなヒドロラーゼ）、炭素−窒素リアーゼ（例えばヒスチダーゼのよ うなアンモニアリアーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明検定法は生物学的試料中の循環ホルモンの検出および濃度測定に利用でき る。これらのホルモンに対する抗体は標準免疫学的方法を使って産生じ得る。不 活性固体支持体へ結合した抗体は、ＨＩ形成性脂質とホルモン−脂質複合体から 調製されたリポソームの溶解音引き起こす。マーカー化合物として色素または酵 素をリポソームの中に封入することができる。これらのホルモンには甲状腺ホル モン、例えばチロキシン、トリョーヒチロニン、パラチロイドホルモンおよびカ ルシトニン；膵臓ホルモン、ψりえばインシュリン、ブロイ／シュリンおよびグ ルカコ゛ン；下垂体ホルモン、例えばプロラクチン、アドレノコルチコトロピッ クホルモン、チロトロｅン、オキシトシンおよびバンプレシン；子宮および胎盤 ホルモン、例えば絨毛性ゴナドトロピン、胎盤性ラクトゲン、絨毛性チロトロピ ンおよびリンキシン；ステロイドホルモン、例えばエストラジオール、エストロ ン、エストリオール、テストステロンおよびジヒト１０テストステロン；成長ホ ルモン、例えばウロガストロン、神経成長因子およびソマトメジンが含まれる。

同様に、本発明方法は細胞内メツセンジャー、環状ヌクレオチドおよびプロスタ クランジンにも適用できる。

本発明はまた治療用薬剤、例えばジゴキシン、ジャトキシンのような強心配糖体 ；ジフェニルヒダントイン、メサントイ／、フエノバルビタール、メホバルビタ ールのような抗けいれん薬の循環濃度のスクリーニングにも応用できる。特に、 狭い治療指数をもつ薬剤、すなわち適度に高い循環濃度では毒性または有害反応 が起こるので一定の最低循環濃度を治療効能のために必要とする薬剤が対象とな る。

本発明方法はまた抗生物質に対して産生される抗体のスクリーニング、または抗 生物質それ自体、例えばペニシリン、セファロスポリン、チェナマイシン、クジ ビュラン酸（ｃｌａｙｕｌａｎｉｃａｃｌ（１）、モノバクタム、ストレプトマ イシン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリ／、オキシテトラサイクリン 、クコラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン　、ｆ：Ｉ）ミキシ ンＢにも適用できる。好気性グラム陰性杆菌感染症の治療に利用されるアミノグ リコシビ抗生物質のゲンタマイシン、アミカ７ノ、トブラマイシン、カナマイシ ンおよびネオマイシンも本発明によって都合よく検定できる。

同様に、本発明方法はモルヒネ、ヘロイン、メイリジンおよびメタト９ンのよう なアヘン剤；リゼルグ酸ジエチルアミドのような麦角アルカロイド；マリファナ ；バルビッール酸類およびコカインとその誘導体；などの濫用性薬物の検出と定 量に使用できる。

本発明方法は小さな分子に制限されない。ＤＮＡおよび卵アルブミンのような大 型抗原を含めた巨大分子を直接に使用して、または適当な脂質と結合させた後に 使用して、Ｈ■形成性脂質と共に安定な二重層リポンーム小胞金形成することが できる。

従って、本発明はまた大聖抗原、血漿タンパク質、肝炎に関連した抗原、組織適 合性マーカーなどの巨大分子種の検出に応用できる。

本発明は実施するのが非常に簡単であり、しかも不安定な試薬や危険な試薬を使 用しないので、一般的な診断用実験室よりも設備が十分でなく且つ高度なもので ない環境においても使用可能である。゛例えば、本検定法は食品および環境毎の スクリーニングに応用される。良品のスクリーニングにおいて、重要な抗原はマ イコトキシンと天然毒物であるだろう。この領域にはアフラトキシン、オキシト シン、パラリン、はニジリン酸、ゼアレロメンのような主要な毒物；およびトリ コテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｓｃｅｎｅ）毒物；ならびに自然界で食品に発生する イボメアメ０ン（ｉｐｏｍｅａｍｅｒｏｎｅ）のような毒性代謝物が含まれる。

天然毒物のほか（（各種の環１３ｉ　、Ｅｉ染物が存在し、これが食品中（でほ んの微量存在しても人類に対して著しい脅威ケ与える。これらは工場副産物また は殺虫剤、例え、げ、ポリ塩化ビフェニル、塩化ジベンゾ−ｐ−ジオキシン、塩 化ジベンゾフラン、ヘプタクロルエボキシトゝ、ディシト８リンおよびＤＤＴ　 のＬ１２−（’２２２−ト１）クロルエチリデン）−ヒス（４−クロルばンゼン ）でありうる。

本発明はその好適な実施、態様を含めて詳細に記述した。しかしながら、本明細 書の記載を考慮して、当業者が本発明に修飾および改良全はどこし得ることは明 らかであり、これらも次の請求の範囲に説明される本発明の精神および範囲に含 まれるものである。

浄書（内容を二宏叉なし） ９化１ｔ（＋Ｊしｙ：）＋ＩＩ　ＤＮＰ−ｃｏ−ｐ−ＰＥ　ｌ　ａｉミオ　Ｄｏ ＰＥ　ｉｈ−！ｏｏｐｃ　’）ホ１ソームの史之・ト生ＦＩＧ、１ ＦＩｏ、　２ ＦＩＧ、　３ ＤＯＰＣｌ）ｔ’７−ム（４ＱＭＭｎ４Ｗ、％　力、ｖｔ−ｆ　ン％’＆ｔｌｊ ａ％ＤＯＰＣ，／２％Ｄｒｙ−ｅ＠ｐ−ＦＥ）ＦＩＧ、４ 回友化杭鐸、４及６化 司３／ｍｈ＃薮　（疋ライドがラス上１２固文化しｔ；句を七トン週晩Ｘ　ＤＮ Ｐ　−１＞Ｇはる随π Ｋｉ定’＋ｔ　×ＤＮＰ−Ｘ＞Ｇの％−ａｏｐ）　（Ｏ，Ｉ２ｍ５／ｒｎυＦＩ Ｇ、　７ １　続　袖　ｊｌ　−ｉ　（）゛Ｊ−１０２１発明の名称 免疫リポソーム検定法およびそのための製品３、補正をする者 小イ′１との関係　出　願　人 住所 名　称　ユニバーシティ・オブ・テネシー・リサーチ・：１−ボレーシコン ４、代理人 住　所　東京都千代１Ｂ区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６＠室 国際調査報告

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）分析対象の被分析体およびマーカー化合物を含有するりポソームを 調製し； （ｂ）被分析体のための受容体を付着させた固相不活性支持体を準備し； （ｃ）工程（ｂ）からの受容体−固相支持体と試験液体とを十分な時間混合して 、上記受容体に試験液体中に存在する全ての被分析体を結合させ； （ｄ）工程（ａ）において調製したリポソームと工程（ｃ）からの結合させた受 容体−固相支持体とを混合し；（ｅ）工程（ｄ）においてリポソームから放出さ れたマーカー化合物の存在について測定する； ことから成る試験液体中の生物学的被分析体を検出または定量するための免疫検 定法。
2. （２）工程（ｅ）が放出されたマーカー化合物を定量化し、そして試験液体中に 存在する被分析体の量を測定することをさらに含む、請求の範囲第１項記載の免 疫検定法。
3. （３）被分析体が抗原である請求の範囲第１項記載の免疫検定法。
4. （４）被分析体が酵素である請求の範囲第１項記載の免疫検定法。
5. （５）被分析体が薬物である請求の範囲第１項記載の免疫検定法。
6. （６）リポソームがＨＩＩ（ヘキサゴナルＩＩ構造）形成性脂質と被分析体−脂 質複合体との混合物から調製される、請求の範囲第１項記載の免疫検定法。
7. （７）固相不活性支持体がガラスである請求の範囲第１項記載の免疫検定法。
8. （８）ガラス支持体がビーズの形である請求の範囲第７項記載の免疫検定法。
9. （９）固相支持体がポリマーである請求の範囲第１項記載の免疫検定法。
10. （１０）ポリマーがラテツクスである請求の範囲第９項記載の免疫検定法。
11. （１１）ラテツクスがビーズの形である請求の範囲第１０項記載の免疫検定法。
12. （１２）マーカー化合物が自己消光性螢光色素である請求の範囲第１項記載の免 疫検定法。
13. （１３）自己消光性螢光色素がカルセインである請求の範囲第１２項記載の免疫 検定法。
14. （１４）混合工程（ｄ）がリポソーム膜の溶解を引き起こす請求の範囲第１項記 載の免疫検定法。
15. （１５）（ａ）分析対象の生物学的受容体に対応するリガンドおよびマーカー化 合物を含有するリポソームを調製し；（ｂ）前記の生物学的受容体を付着させた 固相不活性支持体を準備し； （ｃ）工程（ａ）からのリポソームと試験液体とを十分な時間混合して、リポソ ーム上の結合部位と試験液体中に存在する全ての受容体とを反応させ； （ｄ）工程（ｃ）からの反応させたリポソームと工程（ｂ）からの固相支持体に 付着させた受容体とを混合し；（ｅ）工程（ｄ）においてリポソームから放出さ れたマーカー化合物の存在について測定する； ことから成る試験液体中の生物学的受容体を検出または定量するための免疫検定 法。
16. （１６）工程（ｅ）が放出されたマーカー化合物を定量化し、そして試験液体中 に存在する受容体の量を測定することをさらに含む、請求の範囲第１５項記載の 免疫検定法。
17. （１７）受容体が抗体である請求の範囲第１５項記載の免疫検定法。
18. （１８）リガンドが抗原である請求の範囲第１７項記載の免疫検定法。
19. （１９）リポソームがＨＩＩ形成性脂質と、受容体または受容体−脂質複合体と の混合物から調製される請求の範囲第１５項記載の免疫検定法。
20. （２０）固相支持体がガラスである請求の範囲第１５項記載の免疫検定法。
21. （２１）固相支持体がポリマーである請求の範囲第１５項記載の免疫検定法。
22. （２２）マーカー化合物が自己消光性螢光色素である請求の範囲第１５項記載の 免疫検定法。
23. （２３）自己消光性螢光色素がカルセインである請求の範囲第２２項記載の免疫 検定法。
24. （２４）混合工程（ｄ）がリポソーム膜の溶解を引き起こす請求の範囲第１５項 記載の免疫検定法。
25. （２５）ＨＩＩ形成性脂質がホスフアチジルエタノールアミンまたはその誘導体 である請求の範囲第６または１９項記載の免疫検定法。
26. （２６）ホスフアチジルエタノールアミンの誘導体がジオレイルホスフアチジル エタノールアミンおよび卵黄ホスフアチジルエタノールアミンから選択される、 請求の範囲第２５項記載の免疫検定法。
27. （２７）（ａ）リーポソーム内に封入された螢光物質および被分析体；および （ｂ）固相支持体に結合させた上記被分析体のための受容体；から成る生物学的 被分析体の検出システム。
28. （２８）被分析体が抗原である請求の範囲第２７項記載のシステム。
29. （２９）受容体が前記抗原のための抗体である請求の範囲第２８項記載のシステ ム。
30. （３０）リポソームがジオレイルホスフアチジルエタノールアミンと抗原−脂質 複合体から調製される、請求の範囲第２７項記載のシステム。
31. （３１）固相支持体がガラスである請求の範囲第２７項記載のシステム。
32. （３２）ガラス支持体がビーズの形である請求の範囲第３１項記載のシステム。
33. （３３）一定量のマーカー化合物および（ａ）予め決められたリガンドー脂質複 合体；（ｂ）前記複合体と前記マーカー化合物を含有する安定なリポソーム；（ ｃ）被分析体標品；および（ｄ）受容体標品；を調製するのに適した一定量の試 薬類から成る免疫検定用キツト。
34. （３４）（ａ）マーカー化合物および被分析体リガンドを含有する安定なリポソ ーム；（ｂ）前記リガンドのための抗リガンド受容体を結合させた固体支持体； および（ｃ）既知量の前記被分析体からなる対照；から成る試験試料中の被分析 体リガンドの存在を検出するための免疫検定用キツト。
35. （３５）（ａ）マーカー化合物および被分析体抗リガンドのための同族リガンド を含有する安定なリポソーム；（ｂ）前記抗リガンドを結合させた固体支持体； および（ｃ）既知量の前記抗リガンドからなる対照；から成る試験試料中の被分 析体抗リガンドの存在を検出するための免疫検定用キツト。