JPH01500848A - 免疫リポソ−ム定量法−方法と材料 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 免疫リポソーム定量法一方法と材料 発明の分野 本発明は膜溶解性免疫リポソーム定量法とこれに用いる特にキット形の材料とに 関する。この定量法は定量化して生物学的液体その他のサンプル中の抗原、抗体 等の因子の存在および／または濃度の測定に利用することのできるリポソームの 不安定化および溶解をもたらす抗原リポソームまたは抗体リポソームの側方相分 岨を用いる。

発明の背景 生物学的サンプル中の抗原性物質、抗体および分析物の存在の検出および定量に は、高容量スクリーニング検定法が一般に用いられている。例えば、臨床診断に は放射線免疫検定法（ＲＩＡ）が一般に用いられている。しかし、ＲＩＡ法は大 規模スクリーニングプログラムにはしばしば不適当である。放射性トレーサーは その性質によって安定性が限定されており、使用中の特別な処置、特別な廃棄問 題およびｖＬ雑な機器を必要と酵素免疫定量がある。一般に、これらの定量法は 結果を判定するため゛に濾過または遠心分離による分離段階を必要とする。これ らの分離要件は定量法を遅速にし、自動化を困難にする。

リポソームは免疫定量法の有効な要素として今までに部告されている。例えばマ ツクコンネル（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ）等の米国ａｈ第３，８８７，６９８号は電 子常ミ性共鳴（ＥＰＲ）監視免疫定量法における安定な遊※ラジカルを含むリポ ソームの使用を述べている。マントル（Ｍａｎｄｌｅ）等の米国特許第４，３７ ２，７４５号は免疫定量法に有用な、螢光体含有マイクロカプセルとしてリポソ ームの使用を述べている。この定量法はリポソームを破壊して螢光化合物を放出 するためにトリトン（ＴｒｉｔＯｎ）Ｘ−１００のような洗剤の使用を必要とす る。リポソームはまたウール１７　（Ｕｌｌｍａｎｎ）等の米国特許第４，１９ ３，９８３号が述べている免疫定量法ではマーカー担体として述べられている。

この定量法で用いられるマーカーは螢光体、酵素および化学発光化合物等である 。

キンスキー（Ｋｉｎｓｋｙ）と彼の共同研究者はパブテン化脂質含有リポソーム が抗体と結合して、その補体な固定しうることな初めて示した〔ハツクスビー（ Ｈａｘｂｙ）等のバイオケムこの結果は活性化補体要素にょろりポンームの溶解 であった。

コール（Ｃｏ１ｅ）の米国特許第４，３４２，８２６号は同訝抗体と活性補体と の存在下で免疫特異的に破壊される酵素に包まれた抗原結合リポソームな用いる 免疫定量法を述べている。この定量法は酵素マーカーを放出するために抗体と補 体との間の均一相反応を利用する。この補体仲介事象は多くの文献の焦点であっ た〔最近のレヴエーに関しては、アルヴイング（Ａｌｖｉｎｇ）とリチャード（ Ｒ１ｃｈａｒ４ｓ）　のリポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　）オス）　ｏ　（Ｏ ｓｔｒｏ）版、２０９−２８７頁、マーセルデツカ−（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋ ｅｒ）、５−ｘ−ヨーク（１９８３年）参照〕最近、幾つかの非補体仲介すボン ーム溶解性定量法が開発されている。例えば、膜溶解性蛋白質、メリチンに結合 したハプテンへの抗体の結合は、メリチンのリポソーム溶解活性を阻害盪血清中 の抗体のカルディオリピン含有リポソームへの結合は。

籾＋２イオンによるリポソームの溶解Ｙ阻止する〔ジャノフ（、Ｔａｎｏｆｆ） 等、タリン、ケム、（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、）２９巻。

１５８７頁（１９８３年）〕、これらの各定量法は補体を必要としないが、膜溶 解性分子かまたはイオンのいずれかを必要とする。

前記定量法は非常に敏感であるが、しばしば多くの段階を含んでおり、再現およ び／または自動化が時には困難である。従って、新規でより効果的な定量法が切 望されている。

発明の概要 本発明はリポソームの溶解が免疫複合体形成の直接の結果である免疫定量法に関 する。

本発明の定量法はＲエムと同程度に敏感であり、迅速な定量？可能にし、しかも 原溶解性の分子、イオンまたは活性補体な必要としない。

本発明は新規な膜溶解性免疫定量法に関する。この膜溶解性免疫定量法は次の段 階： ｌａ）　リポソーム製内に問題の分析物な有し、マーカー化合物ケ含むリポソー ムを形成する： ＋１））　問題の分析物に対するレセプタ？含む試験液体乞段階１ａ）の前記リ ポソームと、前記試験液体中に存在するレセプタによってリポソームが飽和され うるのに元方な時間混合する；および ［Ｃ）　段階（ｂ）のリポソームが放出するマーカー化合物の存在を測定する； から成る。

この定量法の１冥施態様すなわち液相支持系では、リポソーム膜に挿入するだめ のアンカーとして役立つ脂質に抗体を最初に共有結合させ、この抗原−アンカー 複合体ケ、他の場合には２！層を形成しない脂質（または脂質混合物）とともに 用いて、自己消光性螢光色素を付加的に含む安定な２重層リポソーム小胞を形成 する。この抗体／色素含有リポソームを抗原分子が付着した不活性な固体表面に 接触させると、抗体−アンカー覆合体と抗原との間で迅速な結合が生じ、リポソ ームが破壊され、色素が放出される。色素の放出は欅！ｓ溶准を用いて吸光分析 または螢光分析により定量することができる１次に既知標準中の量と比較するこ とＫよって、未知サンプル中の分ｖｒ物量を定量する。

本定量法の他の実施態様では、すなわち固相支持系では、抗原をリポソーム膜内 に挿入するためのアンカーとして役立つ脂質に最初に共有結合させ、この抗原− アンカー複合体な非２重層形成１］！質（または脂質混合物）とともに用いて、 自己消光性螢光色素を付加的に含む安定な２重層リポソーム小胞を形成する。こ の抗原／色素含有リポソーム製内体分子が付着した不活性な固体表面と接触させ ると、抗原−脂質複合体と抗体との間で迅速な結合が生じて、リポソームが破壊 され、色素が放出される。色素放出ｉ−な標本溶液を用いて定量″′ｆろ。未知 サンプル中の分析物量を既知サンプル中の量と比較して算出する。

本発明はまた、前記定量法に有用な特にキット形の材料に関する。

第１図はＤＯＰＥリポソームとＤＯＰＣリポソームとのＤＩＰ−ｃａｐ−ＰＥに よる安定化を説明する。ＤＯＰＥｔａ）リポソームとＤＯＰＣ（ｂｌリボンーム に関して音波、処理脂質の９０°光散乱？測定した； 第２図＆！ＤＯＰＥ−ｉ）ＮＰ−ｃａｐ−ＰＥ（８８：　１２　）リポソームの １．１２Ｘ１０’倍率でのネガティブ染色電子顕微鏡写真である： 第３図はガラススライドに付着した抗体によるＤＯＰＥリポソーム溶解の免疫’ ＩＩＸ性を説明する：第４図はガラススライドに付着した抗体によってＤＯＰＣ リボンームが溶解しないことを説明する；第５図はＤ　ＯＰ　Ｅ　＋Ｊボンーム 溶解に対する付着抗体濃度の効果を説明する。明示されている濃度の抗ＤＮＰ　 ＩｇＧ（ｃｌまたは正常工ｇＧ　ｌｄｌを用いてガラススライドを被侵し、ＤＯ ＰＥリポソーム溶解をカルセイン（ｃａｌｃｏｉｎ）放出によって測定した。

第６図は遊離ハプテンによるＤＯＰｇリポソーム溶解の阻害を説明する。ガラス スライド上の付着抗ＤＮＰ　工ｇＧにリポソーム製内加する前に、各濃度のＤ　 Ｎ　Ｐ　ＧＪｙｌｅ）またはＧｌｙ　（ｆｌを加えた。

第７図は遊離抗、体によるＤＯＰＥリポソーム溶解の阻害？説明する。リポソー ムはガラススライド上の付着抗体に添加する前に、各′ａ夏の遊離抗ＤＮＰ　工 ｇＧ［９）　または正常工ｇＧ［ｈ）とともにプレインキュベートシタ。

第８図は同相免役リポソーム定量法を図解説明しまたものである。

Ｗｌ、９図はりガンｒ−アンカーな製造するための最適パルミチン＠／工９Ｇ　 結合比（〜と、安定な免疫リポソームを製造するための最適バルミトイルＩ、Ｇ ／ＤＯＰＥ　比［ＢＪとを説明する。リポソームの安定性はカルセフン封入と螢 光消光にとの両方によって測定した。

第１０図は捕捉カルセインの放出によって測定した単純ヘルイスウィルス誘導性 リポソーム溶解を説明する。他のインジケーターウィルスは溶解ｔｗｊ導しない 。

第」１図はリボン−・ムが単純ヘルイスウィルスによって溶解したときのリポソ ームの色の変化を説明する。右側の試験管は完全なリポソームを含み、左側の試 験管は溶解したリポソームな含む。

第１２図は単純ヘルイスウィルスに遊離抗体（ａｎｔｉ−Ｈ８Ｖ−ｇＤ）　ｆｔ 加えてプレインキュベートするとリポソーム溶解の阻害が生ずるが、無関係な抗 体（ａｎｔｉＨ３Ｙ−ｇＢ）またはＢＳＡによって生じないことを説明する。

第１３図は本発明の液相免疫リポソーム定量法の実Ｉ＠態様を図解説明する。

リポソームは閉じた脂質２重管から成る値視的小胞である。

（１９７８年）参照、リポソームはその比較的簡単な組成と。

化学的、物理的および免疫学的熱電に対するその柔軟性とのために、膜溶解性定 量法にとりて好ましい材料である。

膜溶解性免疫定量法の使用には、他の免疫定量法に比べて次のよ５な幾つかの利 点： （１）　単独の溶解事象によって多くのシグナル分子が放出されるので、シグナ ルが高度に増幅される、 （２）免疫複合体を遊離の抗体または抗原から分離する必要がめったにないので 、一般に均−相定貴注である：また（３）比色法および螢光定量法のような光学 的測定法を用いることができるので、放射性同位元素使用の必要性がないが存在 する。これらの理由から、ｊｌ−近の免疫定量法の開発の中で膜溶解性定量法が 大きく注目されている。

本発明の免疫リポソーム定量法を特定の存在すなわち抗原の定量に関して説明す ることにする。ここで抗原の定量に関して述べる一般的原理と方法は例えば抗体 、ハプテン等のような他の種にも適用できるものである。

本発明の理解な助けるために、本明細薔ならび請求の範囲で用いる次の用語は下 記の意味を有する：「分析物」−測定すべき化合物または組成物であり１例えば 抗原、ハプテンまたは抗体のようなりガントであってよい０例かである。

「リガンド」−それに対する免役学的レセプタが天然に存在するまたは製造する ことができる化合物ないう。リガンドが抗体である場合には、免疫学的レセプタ は抗原または抗−抗体でありうる。

「リガンド−アンカー複合体」−問題の分析物とこの定量法のためのリポソーム の形ぼ（用いる脂質ｌＣ適合しうる疎水性組成物とを含む共有結合ｆＡ、小胞形 成のための脂質２重１−を安定化丁不ために間暁のリガンＩ−＃を直接用いろこ とができない場合には、慣習的な結合化σ塾、・用いて適当な脂質、疎水性−・ ・！プヂドまたけ蛋白質にリガンド１矛初に結合さぜ）ｊ、けｌは１工らない１ 、固相定貴法ケ用いた実施態様れ′おける抗すガンｒと不活性固体担体との間の 結合に関して４、同様な結合化学ｒ以下で説明ゴー７５．。

本発明のアンカー複合体に有用な脂質は（＞０１０）・脂肪酸、リン脂質、　（ ＞０１．）炭化水素、大きい環式炭化水素、多環式炭化水素おＪび当業者が容易 に選択可能なその他の脂質である。

合成的１ｃ−１なわち組換え体ＤＮＡ方法を用いて製造した疎水性イプチドと蛋 白質もアンカーとして用いることができる。リガンド−アンカー複合体を用いて まだ不安定なリポソーム組放物を安定化する。

好ましい実施態様では、すなわち液相定量法では、脂肪酸に共有結合した抗体？ 用いて、主として（９９，９５モル％）ホスファチジルエタノールアミンから形 成されるリポソームを安定化丁す。

「マーカー化合物」−放射性トレーサー以外の容易に検出可能な化合物、酵Ｘ％ 化学発光体、発色物質および螢光物質のようなマーカーが特に有用である。最も 好ましいマーカー化合物は自己消光性螢光色素である。これらの化合物には、例 えはカルボキシフルオレツセインおよびカルセフインの裏５なフルオレツセイン の水溶性誘導体があり、他の適当なマーカーは例えば８−アミノーナフｆレニ／ −１，３，６−トリスＡ・ホン酸のような水溶性発螢光団（ｆｌｕＯｒｏｐｈｏ ｒｓ）とｐ−キシレンビス（ピリジ−ラム）ゾロミドの、見、ププエ水溶住消光 物質との組合）ＪであＱ６、ａ；。

累／消光物ｊ質の組合・秋がリポソームの溶解時Ｕｉ′：すｙｆ′＋’ンー・ム カ・ら放出されｂ〆りで、希釈によって発螢光曲の説、消光（ａｅｑｕｅｎｃｈ ｉｎＨ）と検出が可能に１へ例、そば、ヱレン（ＥＪｌｅｎｅ）等のバイオケム （Ｂ１．ｏｅｈｅｉ）　２３巻、１５３２頁（１９８４年）参照。

「し＋ブタ」−他の分子の特定の空間的および極性組成６・認識でき２＞化合物 または組成物。天然レセプタに＆ｊ：抗体、酵素、レクチン等がある。特定のリ ガント！１．：、対−ｆるレセプタは−・鮫に抗リガンド（ａｎｔｉ−”Ｌｉｇ ｆｌ、ｎｄ）と叶ばれる。これらの用語は環十更に依存して互換性であり、ある 場合のしく私シタが他の場合のリガ：／ドになりうる。例えば好ましい実施態様 では、抗原のレセプタは抗体であΦが、抗体のし化ブタは仇−抗体かまたは好ま しくは抗体の対応抗原のいずれかである。

「系」−・通常は緩衝剤、塩、安定剤等のような補助試薬？加えて処方された分 析物、リガンドおよび／またはｌ／セプタ試薬の組合せであり、一般に定量キッ トとして個別の容器に入れて供給される。例えば、本発明の定量法による抗原の 存在および／または濃度を検出する系は。

１１１　１Ｊｄ”ンーム換内の抗体またはその化学的−導体；＋２１　ｆｌ＞の リポソーム内に封入さｎた螢光物質またはその他の適当なマーカー；および （３）既知色素放出と未知色素放出との比較曲線を作製するだめの既知濃度の抗 原標準試薬、または予め形成された比較曲線と対照としての１種類の標本試薬； ？入れた適当な容器から成る。

本発明の好ましい芙施態様では、抗原の定量は抗原−脂質複合体または抗体−８ ｄ質複合体から形成されたリポソームの側方相分離によって、リポソームの不安 定化と例えば螢光色素のようなマーカー化合物の放出とが生ずることを含むと考 えられる。

緩和な条件下例えば生理的条件下で可逆的な六方晶相な形成しうる脂質は、天然 脂質であれ合成脂質であれ、本発明の実施に有用なリポソームの形成に用いるこ とができる。このような適切な脂質の１例は不飽和ホスファチジルエタノールア ミン（ＰＥ）（例えば卵ＰＥまたはジオレイルＰＥ）である。不飽和ＰＥ？、！ けでは室温、中性−において安定なリポソームを形成しない。リガンド−アンカ ー複合体を加えることによりて安定な２重層リポソームが形成される。リガンド −アンカー複合体の添加によって安定化される、ＰＥ以外の脂質にはカルディオ 脂質とホスファチジン酸がある。これらの脂質はＣ，２＋のような２価陽イオン の存在下で大方晶（Ｈ■）相を形成する。グルコシルジグリセリドも生理的条件 下で六方晶相な形成することができる。その他の天然脂質は、温度および塩濃度 の生理的条件下でＨ■相を形成するとは報告されていない。しかし、Ｈｌ　形成 脂質構造の一般的要件は、比較的大きい疎水性部分に結合した比較的小さい疏水 性基（全体の分子形状は円錐形状）もＨＨ相を示し、リガンド−アンカー複合体 とともにリポソーム形成に有用であることである。

さらに、上の形と相補的な形状の脂質、糖蛋白質およびその他、すなわち逆円錐 形を有する分子も本発明のリンガント−アンカー複合体として用いることができ る。これらの分子は小さい疎水性部分に結合した大きい親水性基を含む、抗原ま たは抗体のような水溶性リガンドと充分な疎水性乞有する脂質との共役複合体を 逆円錐形の分子形状を有することが当業者に明らかであろう。従って、このタイ プのりガント−アンカー複合体は不安定なリポソーム２］を層の安定化に有効で ある。キエリス巻、３９９頁（１９７９年）参照。

液相定量法では１例えば抗体−脂肪酸複合体のようなりガンＰ−アンカー複合体 および不飽和ＢＥのような大方晶相形放脂質の存在下で、安定な免疫リポソーム が音波処理、透析またはその他の慣習的な方法によりて製造され、このリポソー ムの中に自己消光性螢光色素のようなマーカー化合物が捕捉される。

抗体含有リポソームが試験液体中の例えばウィルス、細菌またはその他の病原体 のよ５な多価抗原と接触すると、抗体−脂肪酸複合体が側方に移動して抗原と結 合する。リポソームのこの側方相分離によって２重層から六方晶相への迅速な転 移が生じ。

捕捉マーカーが放出される。このようにして、例えば螢光シグナルが放出され、 多価抗原から試薬またはその他の物質を分離ｊる必要なく測定される。試ｗｋｔ Ｌ体中のマーカー放出量を既知抗原温度の標準溶液中のマーカー放出量と比較す ることによりて、試験液体中の抗原量？定量することができる。従って、液相定 量法は多価抗原の直接定量法である。

固相定量法で述べた抗原−アンカー複合体含有ＩＪ　ホブームな多価抗体の直接 定量法でも用いることができる。例えば、疎水性アンカーに結合した自己免疫抗 原含有リポソームは、プラスチックまたはガラス表面のような固体担体に予め吸 着させた自己免疫患者からの試験血清に接触すると破壊ｊる。

液相定量法で述べた抗体−アンカー複合体含有すポンームは。

遊離抗体力価の阻害検定法にも用いることができる。例えば。

患者の血清またはその過当な希釈物中の抗体は、標準化多価抗原に加えてインキ ュベートｊると、抗原の結合部位を飽和ｊることができる。このため、次に加え るリポソームの溶解は阻止さｎる。

本発明の定量法は水性媒質中、例えば中性−のような中等度の…において、最適 定量感度に一般に近い感度で、定量要素または定量材料を分離する必要な〈実施 するのが好ましい。分析物を測定するための検定帯は適当な水溶液、通常は予備 処置を行った未知サンプルな含む緩衝液％！Ｊ’ソームー分析物−螢光物質試薬 、検出可能なシグナルな発生する補助物質、ならびに適当な場合には、修助レセ プタまたは非修飾レセプタを用いて形成することができる。

生物学的サンプル中の分析物としてのリガンドまたは抗リガンドの濃度は液相定 量法における免疫り承ンームと抗原との間の結合度に影響し、また、検出可能な シグナルの発生に影響？与える。

定量法を実施する場合には、水性媒質が通常用いられる。他の極性溶媒も用いる ことができ、通常はアルコール、エーテル等を含む炭素数１〜６、より一般的に は炭素数１〜４の酸素原子含有有機溶媒が用いられる。これらの共浴奸は通常約 ４０容量％未溝の量で、さらに一般的には約２０容量％未溝の量で存在する。

媒質のｐＨは通常的４〜１０．より一般的には約５〜９、好ましくは約５．５〜 ８．５の範囲内である。シグナル発生の効率を最適化しながらレセプタによる有 意なレベルの特異的結合を維持するように、ｆｌ！ｌを選択する。ある場合には 、王妃２つの要因の間で妥協が必要となる。種々の緩衝剤を用いて好ましいｐＨ ？得、測定中この−を維持することができる。典型的な緩衝剤には、ホウ酸基、 リン酸塩、炭酸塩、トリス、トリスＦｉＣ１，バルビタール等がある。本発明罠 とって如何なる緩衝剤？用いるかは重要ではないが、個々の定量では特定の緩衝 剤が他の緩衝剤よりも好ましい場合もあり５ろ。

定量の実施には中等度の温度が通常用いられ、定量期間中は一定温度が通常維持 される。定量温度は一般的には約１０℃〜５０℃、好ましくは約１５℃〜４０℃ 、さらに好ましくは適用可能である場合に約２２℃の範囲である。

定量丁べき分析物の濃度は、一般に約１０−４〜１ｏ−１５モルの範囲、さらに 一般的には約１０””’−・１０−１３モルの範囲である。測定が定性的、半だ ｔ的または定量的であるかどうかとい５、Ｊ：５な考察、個々の検出方法および 問題の分析物の予想濃度によりて、他の試薬の濃度が決定されうる。

種々の試薬の濃度は一般には問題の分析物の予想＃度範囲に、Ｃりて決定される が、各試薬の鍍終濃度は問題の範囲にわたって定量の感度な最適に′″ｆ′ｂよ うに経験的に決定される。

リポソームの製造法とＬ７では多くの方法が存在ｊ′る。これらの方法の幾つか は小ａｃａ＜ｏ、０５μ？Ｆｌ）の形成に用いられ、また幾つかは大きい小胞（ １５，＞０．０５μ７＋１）の形成に用いられる。幾つかの方法は多重層小胞の 形成に用いられ、また幾つかの方法は単層小胞の形成に用いられる。本発明では 、膜上での溶解事象は小胞全体の溶解を意味するので単層小胞が好ましい。

１、かじ、多重層小胞も効率は低下すると思われるが使用可能である。リポソー ム製造方法は、例えばツオーカ（Ｓｚｏｋａ）　とパ９巻、４６７頁（１９８０ 翠）；ディーｖ　−（Ｄｅａｍａｒ）とウスストａ　（Ｍ、Ｊ、　０ｓｔｒｏ） 　＠集、マーセルデフカー、二！　−：ｉ！　−り、１９８３年、２７〜５１頁 のような幾つかのレヴエー文献アゾ４　、Ｘ　（Ｇ＋Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ） ｉｊ４集、シーアールシープレス（ＣＲＣＰｒｅｓｓ）、ボカレイトｙ　（Ｂｏ ｃａ　Ｒａｔｏｎ）も特に第１巻において最新の情＠乞含んでいる。

本発明の定置−法と材狛な次の７かＱ例１に関連し、て、さらに説明するいこれ らの実施例は本発明の理解？助けるものであるが、請求の範囲に述べた本発明の 範囲を限定′ｆるものど解釈丁べ、きではない、実施例中に述べる％は全て、他 に指示しないかぎり。

モル％を意味ｊる。比は全て、他に指示１７ないかぎり５モル比を意味する。温 度は全て摂氏度で表現され゛〔いる（但し、温度の補正は行われていない）。

リポソーム製造 ＤＯＰＥまたはＤＯＰＣ（８、ｇμｍｏ：Ｌｓ）、ＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥ（１， ２μｍｏ１ｅ）および痕跡量のヘキサデシル（”Ｈ）コレスタニルエーテル（＃ 終曲比活性５．７　Ｘ　１０’　ｅｐｍ／ｍｏｌ）を混合して、、Ｈ２ガス流に よりて溶媒を蒸発させて除去した。乾燥脂質な少な（とも３０分間真窒乾燥した 。カルセイン４μｍｏ’ｘｅを含むＰＢＳ　１００μｔ　（ｐＨ７，４）Ｙ加え た。音数処理槽（ｂａｔｈ　ａｏｎｉｅａｔｏｒ）　（ラボラトリ−サブライス 社（Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　５ｕｐｐｌｉｅｓ、Ｉｎｃ、）、二ｓ−−ヨーク 州ヒツクスビル〕内、室温において、均一な半透明なリポソーム懸濁液が得られ るまで、この混合物を２０分間音波処理した。次にリポソーム懸濁液をバイオゲ ｋ　（ｂｉｏｇｅｌ）　ｋ　５　Ｑ　Ｍカラム上でクロマトグラフィ精製して、 補捉されなかったカルセインを除去した。空隙分画内にＰＢＳによって溶離した リポソーム１ｆｔ３Ｈ放射能の計量に裏って検出し、プールし、４℃において貯 蔵した。

ノモル）なガラススライド上の予めＩｇＧ　で被情したスポットに雇えた。湿ｆ ＠呈内、覧温における２０分間のインキエベーシ理ン後に、ガラススライドをＰ ＢＳ　２ｗｔですすぎ洗いして。

リポソーム？石英セル中に完全に移りまた４、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ 　ｈａｍｍｏｒ）　ＬＳ　５　分光螢光光度計によってラムダ（Ｈ−４９０ｎｍ とラムダ、ｍ−５２０ｍｍにおいて螢光す御」定した。デオキシコール酸ナトリ ウム？最終濃度０．１２％になるまで加えた後に、リポソーム中の廟カルセイン 螢光？測定した９、色素放出％は次のように定義Ｙ’ｏ： 〔式中、ＦｏとＦはそれぞれ、固定化抗体と相互作用する前ど相互作用した後の リポソームサンプルのカルセイン螢光であるｏＦｔはデオキシコール酸塩に訳っ て放出した後の総カルセイン螢光量である。〕 色素放出を抑制−ｆ′るために、添加リポソームと抗体ケ混合する前にガラスス ライド Ｙ加え、室温において２０分間インキ譚ベート（，７た、これはガラススライド に加える前に室温において２０分間プレ・インキュリボソーム形成？調・べｂた めに、音波処理した脂質＝ｌＰＥＳ中でｉ　ｏ　ｏｓ＜希釈し、たｅＰ９０’光 散乱をパーキンエルマーＬ３５分光螢光光度第１゛に工ってラムダ８ｘ−ラムダ 、ｍｍ−６６０ｎにおいてスリット幅３ｎｍで測定し、た。

電子顕微鏡検査 リボソー・ム（０，７Ｆｚｙｍｏｌｅ／ｍ）　ｖｏ、５％酢坂ウラニル水溶液に よってネガティブ染色し、７５ＫＶで作動する日立６００１１ｉ子顕砿鋼で観察 した。リボソー・ムの大きさは拡大し７た顕微鋼写声゛上で測定した。

実力例１ 安定なリポソームの形成を６６０　ｎｍ　ｉｃおける９０°光散乱によって監視 した。ＤＯＰＥ２重層を安定化”ｆるためのＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＦＪ、　ｌｊガ ント−アンカ・−・僅合体の最低量な：知すために１種々な量のＤＮＩ”−ｃａ ｐ−ＰＥ＋１ＤＯＰＥまたはＤ　Ｏｉ）　Ｃと混合し、溶媒ケ含まない脂質混合 物ＹＩＪン酸緩＠剤添加食塩水中で音波処理して、光散乱ケ測定した。安定な音 波処理リポソームが形成されると、９Ａ濁液の濁度は低下するので、低い光散乱 が測定された。

第１図に示すように、、１２％より８濃反のＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥＫよつて安定 なりＯＰＥリポソームが形成された。６〜１１％の濃度では、リポソーム懸濁液 は非常に混濁しているため、高レベルの光散乱な示し５た。６％より低濃ツでは 、１ｊ言質の大きな凝集が認められ、光散乱は再び低下した。純粋なり０ＰＥ（ リガント゛−アンカー複合体を含まない）は長時間の音波処理後も大きな凝集塊 ？形成するに１゛ぎない。これとは対照的に。

ＤＯＰＣはＤＮＰ　−ｃａｐ−ＰＥのあらゆるＪｌ　罠ＩＣｂ　イて安定で低光 散乱性のリポソームを・形成しに２安定Δ、Ｊ）　ＯＰ　Ｅ　ＩＪボンーム形成 には最低１２％のＤＮＰ−ｅａｐ−ＰＥが必斐であると結論争れた。この組成物 は実施例２〜７に用いた。

ＤＯＰＥ：ＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＫ（８８：　１２）から構成された音波処理リポ ソーム（以下ではＤＯ１’ＥＩＪポソームと呼ぶ）は、ネガティブ染色寛子顕倣 鋭検量によると隼層であり、比較的均一な大きさであった（第２図）、リポソー ムの平均直径は９０８±１３４Ａであった。

実施例３ リポソームの捕捉量 ＤＯＰＩＥリポソームの平均直径から、リポソームの捕捉量ま７６巻、１４５頁 （１９７９年）に従って算出すると、２．６６μｌ／脂質μｍｏｌｅであった。

また、ゲル濾過によって非捕捉カル七イン？除去した後のリポソーム内の捕捉カ ルセインｔｖ測定することによって、捕捉量乞直接算出した。これは螢光強度対 カルセイン濃度（０〜０．５μｍｏｘｅ）　の標準曲線を作成し、脂質量？測定 するために、ヘキサデシル〔３Ｈ〕コレスタニルエーテルの痕跡ｔｖさらに含む リポソーム懸濁液中の３Ｈ−ｃｐｍを測定することによつて行った。リポソーム 内のカルセイン濃度が４０ｍｍｏｌｅであること？考えると、捕捉量は２．０８ μｅ／脂質μｍｏｌｅであると算出された。これはリポソームの犬ぎさから算出 した値と一致した。ＤＯＰＣ：　ＤＮＰ−ｃａｐ−ＰＥ（８８：１２）リポソー ム（以下ではＤＯＰＣリポソームと呼ぶ）の捕捉量は０．５４μｅ／μｍ　Ｏ１ ，ｅであり、このことはこれらのリポソームの大きさが非常に小さいこと？水製 している。カルセインを含むＤＯＰＥまたはＤＯＰＣリポソームは有意な色素漏 出？示さずに、４℃において少なくとも１月間安定に保存リボンーム溶解を調べ るためＩＣ，カルセインを４０ｍｍｏｌｅ濃度でリポソーム内に捕捉させた。こ のａ度においてカルセインの螢光は自己消光する。リポソームから色素が漏出す ると。

螢光が大きく増強する〔アレン（Ａｘｌｓｎ）　等、バイオキム、バイオフィズ 、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｅ、　Ａｅｔａ、）。

５９７巻、４１８頁（１９８０年）〕、漬々なタイプの蛋白質で被覆したガラス 表面な用いて、リポソームからのカルセイン放出誘発力？測定した。筒３図から れかるよ５に、裸のガラス表面とＢＳＡ被覆ガラス表面とはリポソーム漏出？誘 発できなかった。しかし、ＤＯＰＥが抗ＤＮＰ　工ｇＧ　被覆ガラス表面に接触 すると、捕捉カルセイ；／の全てが放出された。正常Ｉ、Ｇ被覆ガラス表面は若 干の影ｊｌｌを示したが、その大きさは抗ＤＮＰ工ｇ（イ）影響力の大きさには るかに及ばなかった。ガラス表面を遊離ハプテン、ＤＩＰ−Ｇ／７　Ｋよりて前 処理すること忙よつて、またはリポソームｆｔ遊離抗−ＤＮＰ　工ｇＧ　ととも にプレインキーベートすることによって色素放出は遮断されたが、遊離の正常工 ｔＧ　またはＢＳＡによりては色素放出は遮断されなかった。これらの結果はＤ ＯＰＥリポソームからの色素放出がガラス表面における抗体−ハブテン結合の直 接の結果であること？示唆している。１）ＯＰＣリポソームは非常に安定であり 、試験したどのタイプのガラス表面も色素放出を誘発しなかった。

実施例５ ガラス表面の被覆に用いるＩｇＧ　溶液の濃度も変化させた。

第５図は色素放出がガラス表面の抗体濃度に依存ｊることな示す。１μｇ／ＷＪ より高濃度の抗ＤＮＰ　ＩｇＧ　泌液で被覆したガラス表面では、殆んど全ての 放出が観察された。この濃度」メ下では放出が徐々に低下するのが認められた。

高濃度（１０μ９／ｄ、にり高濃度）では、正常な工ｇＧ　もリポソーム溶解に 対して非特異的効果を示し、だが、その程度は抗ＤＮＰ　ＩｇＧによる効果に比 べてはるかに低かった。

次の実験の下記実施例６では、ガラス表面の被検に１０μ９７ｄの工ｇＧ濃度を 用いた。

実施例６ 遊離ハプテンによる色素放出の阻害 リポソーム溶解に対″ｆる遊離ハプテンのＭ害効果も調べた。第６図かられかる ように１、Ｄ　Ｎ　Ｐ　−Ｇ４７はＤＯＰＥリポソームからの色素放出を効果的 に阻害することができた。

５０％阻害を生じた遊離ハプテンの濃度は０．３５μ！１ｌ１０１８であると算 出されたが、これはプレインキコン媒質中厘ン媒質中１４ｐｉｃｏｍｏ１ｅ／　 ４０　ｍＡに等しかった。非ハプテン同涙体のＧ／ｙは１　ｍｍｏｌｅ　９度に おいても色素放出に効果を示さなかった。

実施例７ 抗体による色素放出の阻害 遊１ｉＡ’ＦＣ−Ｄ　Ｎ　Ｐ　Ｉ　ｇＧはｌ０Ｉｉｖ／ｌ１７！ｉｃおいても色 素放出？生じなかった。しかし、遊離抗ＤＮＰ　工ｇＧｆリボンームとともにプ レインキーベートした場合には、ＤＯＰＥまたはＤＯＰＣ型のリポソームの明白 な凝集が観桜された。ＤＯＰＥリポソームを正常ＩｇＧではな（遊離抗ＤＮＰ　 ＩｇＧ　とともにプレインキーベートすると、色素放出の阻害が生じた（第７図 ）。遊離抗体濃度０．５１７９／ｌｉ４においては５０％の阻害が生じ、これは ５μｅのプレインキスベージ賞ン量中２．５μ９に等しかった。

ＤＯＰＥはアヴ７ンチ　ポーラ−リピド社（ＡｖａｎｔｉＰｏコａｒ　Ｌｉｐｉ ｄｓ、Ｉｎｃ、）　（アラパ？　ｆｄ　、バーミンガム）カら購入した。カルセ イ／とＢＳＡはシグマ　ケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）（ ミズーリ州、セントルイス）から購入した。

他の試薬は分析等級であった。

抗体 単純ヘルイス抗原９ＤＩＣ対′１−ｂマウ゛スモノクローナル抗体は酸水液から 単離さ１ｔたものであり、スチーグ・ノルレイ（ＳｔｅｗｓＮｏｒｌｅｙ）博士 の好意Ｖこよって提供さね六−３腹水＃ハ・らＩ、Ｇは蛋［Ａ−セファロ−・ス 　アフィニティクロマトグラフィを行い、次にＤｇＡＥ−セファデックスＧ２５ イオン交換クロマトグラフイを行って精製した。精製抗体γ−２０℃においてＰ Ｈ３中に保存した。必要に応じて、工ｇＧｆクロラミンＴによりて、ｌＸ１０３ 〜５Ｘ１０５　ｃｐｒｎ／ｌｔ９の比放射能まで１２５工放射能標識した。

ビューアング（Ｈｕａｎｇ）等のジエイ・パイオル・ケム・（Ｊ。

に従って１５ルミチン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨ８Ｐ） ＹＩｇＧ　に結合させた。簡単に説明すると、″５工標識ＩｇＧ　乞、最終のデ オキシコール酸塩（ＤＯＣ）ａ度が２％になるように、ＰＢＳ中の（３）ｉ）Ｎ Ｈ８ＰまたはＮＨ８ＰＫ加えた。この結合反応は３７℃において１２時間実施し た０反応混合物中のＮＨ３Ｐの加水分解生成物であるパルミチン酸なセファデッ クス０７５カラムを用いて誘導体化工ｇＧ　から分離し、既述したように０．１ ６％ＤＯＣ含有ＰＢＳによって解離した（ヒエ−アンプ等、１９８０年）、精製 ｌ−誘導体化りまた工９Ｇをセントリジオン（Ｃｅｎｔｒｉｅｉｏｎ）　３０マ イクロａ組装置（アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ。、マサチコセツツ州）によ って凝縮し。

次に０．１５％ＤＯＣ含有ＰＢＳに対して透析し、ｔ−。バルミトイルＩ　ｇ　 Ｇ　（Ｐ　Ｉ　ｇ　Ｇ　）　（７：）結合活性ｒ１２５ニー？工ｇＧ　？用いる 放射性免疫定量法によってテストした。簡単に説明する乙ＰＢＳ５０　ｔｘｌｌ 　（ｐｉ４７．６　）中４Ｘ１０６ｐｆｕＪ）Ｈ８Ｖ’　＞イムロンリム−・バ ラ３−．Ｉ！／　（工ｍｍｕｌｏｎ　Ｒｅｍｏｖａｖｅ１］、）〔ダイｔテクク 　ラグウェルなＰＢＳ中５％ヤギ血清５０μｉとともに１時間インキュベートし て非特異性結合部位を遮断しＩｎ、次に、洗浄後に４０７Ｊｌｌにつき種々な量 （Ｏｏ１〜１０　ｔｔｇ／ａｔ　）の”５Ｉ　−ＰＩ９Ｇ乞加えた。Ｐ　Ｉ　ｇ 　Ｇの結合反応は４℃において１時間実施した。

ＰＢＳ（…７．４）で洗浄した後、リムーバウェルの孔に吸着されたＨＳＶに結 合した１２５ニ−Ｐ工ｇＧＹ計量した。全ての測定は２連で実施した。スキャク チャード（Ｓｃｈａｔｃｈａｒｄ）分析に５１巻、６６０頁（１９４９年）〕。

リポソームの製造 ＤＯＰＥ（１〜４　μｍｏ１ｓ）　とｇ跡ｉＴｈのへ＄ｆデシｙ（’Ｈ）能全脂 質１　ｍｏｌｅにつｆｆ４〜１１　Ｘ　１０１２　Ｃｐｍ）　ｆｔ４合し、緩和 なＮ２ガス流によって溶媒を蒸発させた。乾燥脂質ｆｔ最低３０分間真空乾燥ｌ −だ。種々な量の誘導体化工ｇＧ、５０ｍＭカルセイ：／、０．０９％ｌ）Ｏａ ｙ含むＰ　ＢＳ　２　Ｏ０μｌｌ　（ｐＨｓ、ｏ　）ゲ加えて、、脂質を水和し た。混合物を槽型音波処理器（ラボラトリ　サブライス社、；、ニーヨー・り州 、ヒックスビル）内、璽温において３０分間の静止朋間ケはさんだ５分間サイク ル２回によって音波処理した。次にリポソーム危濁液馨バイオゲルＡ−Ｑ、５Ｍ カラム上でりｔＪマドグラフィして、非捕捉力Ａ・セインならびに洗剤ＤＯＣケ 除去した。Ｐ　ＢＳ　（ｐ！４８．０　）によって空隙量部分に溶離した。リポ ソーム？佃−放射能の計量によって検出した。これらの分画ゲプールし、４℃に おいて保存した。

ウィルスによる免疫リポソームの８％ ノぞルミトイル抗ＨＳ　ｖ−ｇ　Ｄ−］：　ｇＧ　ｋ含有する（２μｊ中０．８ １　ｎｍｏｌｅ）ＤＯＰＥ免疫リポソームなＶ底マイクロタイタープレート内の 精製ウィルス５μｌに加え、室温において２０分間インキ−−’ニー１だ。遊離 抗体？用いる阻害定量法では、免役り永ソーム？加える前にウィルスを遊離抗体 とともに室温において２０分間プレインキュベートした。ＰＢＳ　（ｐ１４８． ０）によりて２ｄに希釈した後に、リポソーム溶解な上述のような捕捉カルセイ ン放出によって螢光測定法により測定１〜だ。

し２μい。し、かじ、卸、純へ・ルベスダイ！・ス（ＨＳＶ）ｐ面抗原砧蛋白質 Ｄ（ｇＤ）に対するモノクロ−・プ゛ルエｇＧ　なパルミチン酸のＮ−ヒドロキ シスクシンイミドエステルによって誘導体化゛すると、この抗体の疎水性が強化 さｒ、るｔ゛め、抗体の脂質２重ノー内への導入が可能ン（“なった。ｆりて、 バルミ）　イル抗ａＳＶ−３Ｄはリガント１−ブンカー・複合体である。／Ｑ刀 イミドイル抗体、中性−においマニそれ自ｑ−ｒ：は、２重層を形成、しないジ オレオイルホス７アチジルエタ、ノーｎ・アミンの２重層を安定化し、うろこと がＩ＋明している。パルミトイル抗ＨＳ　Ｖ　−ｇＤ　Ｉ　９ＧとＤＯＰＥの１ 　：　４０００モル比における混合は、５０ｍＭ自己消光性色素（カルセイン） の捕捉から判定すると、音波処理によって安定なリポソームを形成するために充 分であった。抗体安定化ＤＯＰＥ免疫リボンすムを完全なＨＳＶとともにインキ ュベートすると、リポソームの長両抗原溶解が生じ、カルセイン＠元の増強によ って検出されるように媒質中にカルセインが放出される。センダイ（Ｓｅｎｄａ ｉ）、セムリキホレスト（Ｓｅｍ１．１ｋｌＦｏｒｅｓｔ）およびシンビビス（ Ｓｉｎｄｂｉｓ　）のような他のダイＪ・スでは溶解活性がみられなかったので 、この直接の欣相定貴注はＨＳＶにとって特異的である。理論に束縛されるもの ではないが、リポソーム溶解の考えらｎる機俗は、ウィルスとリポソームとの接 ７！ｉ！部位における多重免役松合体形成による抗体の凝集である（第１３図） 、免疫リポソーム！の側方相分離の結呆、ｐｏ、ｐａは２重ｊ→へ一六方晶相転 移な硅て、捕捉色素を放出する１、さらに、ＨＳＶ特其性リポソーム溶解は遊離 抗体によって阻害されるが、他のＩｇＧ抗体によつ）ズは阻害されなかった。こ の原理を用いて、。Ｊの新油、な液相免疫リボン・〜ム分町はＨＳＶの５０．０ ００プラニク形成即位に対して感受性でごあり、阻害定量法はインキューて・シ 晴ン媒質５μＩ中の遊ｈ・抗体のナノ、ダプム警に対して感受＋′４：″Ｃ階） る・′°と／μヤｊ明）−１′〔い・ど−メ流側８ ）Ｅ：七〜力十〜±１９ニｙ二ｇ、、、、Ｉ）ＨＬｇ　、、９ご２戸１タブ±、 １ヒ’！’ミチー／酸’）　Ｉ　ｇ”　ＩＦ一対’ｉ”、ｒ結合１４ｉ　ヲ（３ Ｒ）　Ｎ　Ｈ８Ｐ　７（”１２５１）工９（ンの仁・プッｌ−モル比なＯ・・− ／、１４に！えて調べた。

パルミチン酸／’　Ｉ　ｇ　Ｇの最終的モル比は、ヒ〉Ｔアデツクス０７５カラ ムのブー　ルされたＩｇＧ　分画（空隙分画）から７１６巻、１４０頁（１９８ ２年）〕。プブーされたブンプルは誘導体化抗体と非誘導体化抗体の両方を含む ので、これらの値は平均の比を表す。

第１表は共有結合したパルチミン酸にょろりがンドーアンカー複合体すなわちパ ルミトイル抗Ｈ８■−ｇＤ−１ｇＧ（’］ＩＪ造データを示す。結合抗体の解離 定数も示″ｆ−１繁１表 インプットモル比　結合の化学８値　ＫａＮＧＳＰ／Ｔ：ｇＧ　パルミチン酸／ 工９Ｇ　（ＸＩＯ”Ｍ）１４　２、Ｉ　ＮＤ ２０　２．２　１１７ ２５　５．１Ａ　ＮＤ ３０　６．６６　ＮＤ ４４　１４．６　１．９０ （ａｌ　天然の抗ＨＳ　Ｖ　−９Ｄ−工９ＧのＫａは０．４８Ｘ１０　Ｍ ｔｂ）　測定せず 第１表に示すよう［、ＮＨ３Ｐ／工ｇＧのインプットモル比が増加すると、工ｇ Ｇ１分子に結合するパルミチン酸が１加したが、抗体のＷ４雌定数Ｋａによる画 定によると抗原結合親和性の有意な変化は生じなかった。従って、結合条件は充 分に緩和であり、結合の化学を論はインプットＮＨ３Ｐ７１９０モル比を変える ことによって制御することができる。

実施例９ 安定なリポソームの形成を、リポソームが自己消光性螢光色素、カルセインを包 含しうるか否かによって監視した。５０ｍｍｏ”ｌｅ　ａＫでは、カルセイン螢 光げ７０％以上自己消光性でありプこ１色素がリバＣ）〜人から放出さ１じ〔金 沢されると、螢光は非常に増強された。ＤＯＰＥＩＪボノーム形成のため［８適 のパルミチン咳／工ｇＧ結合化学量論χ決定するために、各ｐＩｇＧ　製造のパ ルミトイルエ９Ｇ（１）ＩｇＧ）／ＤＯＰＥ比を変化させた（結合化学量論傳、 パルミチン咳／工ｇＧ−０〜ｉ　４．６　＞。

蛋白質と脂質の混合物は５０ｍＭカルセインの存在下で上枝処理した。クロマト グラフィによりて非捕捉色素を除去した後、ＤＯＰＥ単位置高位置に包含された カル七イン全Ｉｌｔ分析することによりてリポソーム形成を検出した（耳９図） 、力Ａ・セイン包含を東証するために、大刃・セイン螢光の消光も第９図に示し た。さらに、一連の直巌勾配（５〜ｂ行りて、ＤＯＰＥリポソームへのＰＩｇＧ 　導入度を定量した。

２．２〜５．１のノ署ルミチン酸／工ｇＧ結合化学葉陰値に′：関しては。

この範囲内では実際に全てのＰＩｇＧがｐＩｇＧ／ＤＯＰＥ比１：４０００によ りて製造したリポソーム内に導入さｒることか判明した（第９Ａ図）、この範囲 外では、ＰＩｇＧは　Ｄ　ＯＰ　Ｅ　Ｉ７ボソームに対する安定化活性を有さな かりた。ある一定の結合化学量論値のｐＩｇＧ　のみがＤ　ＯＰ　Ｋ　１３ポソ ームを安定化するためのりガント−アンカー複合体として使用可能であることを この結果は明らかに示してｔ・る。

実施例１Ｏ 最適ｐ工ｇＧ／ＤＯＰＥ比を決定するために、ｐｍ、Ｇ／ＤＯＰＥ比を変化させ て％ＤＯＰｇ免疫リポソームのカルセイｙ包含と消光％とを分析した。この実験 で、パルミチン敏／工ｇＧ　の結合化学量論値は２．２であった。第９Ｂ図に示 すように％最適ｐＩｇＧ／ＤＯＰＥ比は２．５−４．２Ｘ１０１　であることが 判明した。この範囲内でＤＯＰｇ単位量あたりのカルセイン螢尤の最高消光量（ ７０％まで）が検出された；この範囲外にこの比乞増減すると、カルセイン総包 含量はｍ視できる量にまで減少した。２．５Ｘ１０’″４未満のＰＩｇＧ、／’ ＤＯＰＥ比では、カル七イン包含又の急激な低下がνめら第１だが、消光〆は有 意に減少しなかった。これはリポソーム母集団が不均一であるとともＣ起因した 。母集団中の若干のｐＩｇ、Ｇ　安定化リボン−・ムは高度なカル七イン消光度 を示した。４．２　Ｘ　１０−’より高いｐ工ｓｉ　Ｇ／１）ＯＰ　Ｅ比では、 過剰なｐ　Ｉ　９　Ｇ　は自己凝集した。

ｐ　Ｉ　ｇ　Ｇ　カＤ　ＯＰ　Ｅ　ＩＪボンームを安定化１゛るためには、ノセ ルミチン酸／工ｇＧの最低結合化学に論値２．２が必要でｋ）りＬ・、（第９Ａ 図）、さらに、最低ｐ工ｇＧ、’ＤＯＰＥ比は２．’３　Ｘ　１０″″４である ことが判明した。この組合せを用いて次の２つの実施例（実角例１１と１２）の ためのＤＯＰＥ免疫リポソームを製造した。この条件下でリポソームの平均直径 は５００Ａであることから判断すると、ＤＯ，ＰＥ免ブク・リアドソーム１＠に つ＄ｐ１ｇＧ分子推定５個が存在することが判明した。

実施例１１ ＤＯＰＥ免ヴリボソー・ムのライＡ・ス仲介溶解ｎ製ウィルスの濃度な質えて、 −ｇルミトイル抗−Ｈ３Ｖ＋ｇＤ−工９Ｇ含有ＤＯＰＥ免疫リゼソ・−ムの溶解 を媒質中のカルセイン放出を検ｉ州ｙ：ることによりて調べた。第１０図に示す ように、ａＳＶのみが１５８μｇ／ｄのウィルス蛋白質濃度においてカルセイン の完全放出を生じた。他のウィルス（七ンダイ。

セムリキホレストのよびシンビス）は、広範囲な試験濃度範囲にわた・りて有意 な溶解量Ｙ生ずることができ′なかった。ケ２て。

１ｉＳＶＫ関するこの定量法はウィルス特異性である。６．３μｉ／ｄのｋｉｓ ｓ濃度に２いて５０％放出が生じた。この濃度は５μｊインキエベーシ胃ン量中 のウィルス蛋白質的３２ｎ９　または約５０，００Ｏｐｆｕ　Ｋ相当するや第１ １図はリポソームがウィルスによって溶解する場合の明白な色の７化を示す、高 ａ度のカルセイン乞捕捉した完全なリポソームは螢光性でけなく、＠橙色のみが みられるにすぎない、リポソームがダイノ・スによつて溶解するど、カルセイン は放出され、螢光カー大きく増強される。色は規則的な蛍光灯照明下で明黄緑色 になる１、このリポソームはｌ１ＳＶ感染細胞、によりて参解し、たが、正常細 胞によっては溶解しなかった。

実施例１２ 遊離抗体による免疫リポソーム溶解の阻害遊離症Ｈ８Ｖ−ｇＤ−ＩｇＧをａＳＶ とともにプレインキュベートブると、ＤＯＰＥ免疫りｌソームのＪ（Ｓ　Ｗ結合 は阻止された、その結果、免疫リポソームの溶解は阻害された。第１２図に示す ゛ように、ａＳＶを抗体とともにインキュベートすることによって生ずる阻害は 抗ＸｉＳｖ−ｇＤ・ＩｇＧＫ対し７°て特異的であり、缶受に関連−！′る抗体 であ・る抗Ｈ８Ｖ’−ｇ、Ｅ−１９Ｇ　もＢＳＡも阻害を′示さな力・った。従 ・こて、この定を法ケ甲いて試験酸液中の遊離の抗ＨＳ　Ｖ抗体力価を分析する ことができろ１、５０％百害を示した抗体のａ＋は２μ鍾／−またはプレインキ ュベージ曹ン媒質５μｇ　中１０ｎｇ　テｔｖつだ。

本発明の方法は広範囲な分析物に対して適用可能である。標準の免疫学的方法を 用いて非常に多くの分析物に対するポリクローナルおよびモノクローナルいずれ の抗体も形成することができる。この他の膜溶解性方法も本発明の方法に含まれ １例えば本発明の固相定量法を用いた酵素または酵素基質の検出が上記の抗原ま たは抗体の検出と同様な方法で実施される。一般に、適当な疎水性アンカーに結 合した（必要な場合に）酵素基質を用いて５例えば螢光色部のようなマーカー？ 含む安定なリポソームを形成し、このようなリポソームと固体担体に結合した適 当な酵素との相互作用によりてリポソームを溶解さ・せ、螢光色部を放出するこ とができる。色素放出の横倉線作成は、標準の酵素または基質の濃度を用いて実 厖し、生物学的試験サンプル中の未知量の酵素または基質による色素放出の阻害 を容易に測定し、標準プロットから製置を算出することかできる。

本発明の分析法によって検出可能な酵素として、例えばアルコール脱水素酵素、 グリセロール脱水素酵素、グリオキシレート還元酵素、Ｌ−ラクテート還元酵素 、マレート還元鉢部、グルコース６ホスフエート脱水＃酵素、マンニトール１− ホスフェート脱水素酵素、Ｌ−ラクテート脱水素酵素、グルコース酸化酵素、ガ ラクトース酸化酵素、Ｌ−ア電ノ醒峻化酵素、Ｄ−アミノ酸酸化酵素、ポリフェ ノール酸化酵素、アスコルイート酸化酵素、カタラーゼ、イルオキシダーゼのよ うな酸化還元酵素；例えばカルボン酸エステル加水分解酵素、コリンエステラー ゼ、リン酸モノエステル加水分解＃累、アルカリホスファターゼ、リンはジエス テル加水分解き索、ホスホリパーゼＣ（脂質がリン脂質でない場合）のような加 水分解酵素：α−アミラーゼ、セルラーゼ、リゾチーム、／−ガラクトシダーゼ 、アミログルコシダーゼ、７′−グルクロニダーゼを含むメリコシド加水分解鉢 素；イプチジルーアξノ区加水分解ｔｌｐ素、カルボキシペプチダーゼＡ、イブ チジルーペプチド加水分解酵素、α−り。

ロモトリプシン、パパイン、ウレアーゼ、無機ピロホス７アターゼ：例えばアル ドラーゼ等のアルデヒドリアーゼ、のよ５な炭素−炭素リアーゼ、例えばカルボ ニックアン上１ラーゼ等のヒドロリアーゼのような炭素−酸素リアーゼ：例えば ヒスチダーぜ等のアンモニアリアーゼのような炭素−窒素リアーゼを含むリアー ゼな挙けることができるが、これらに限定されるわけではない、これらの酵素を 予めリポソーム内に包含させてから、免疫定量法のタグ（ｔａｇ）に対するマー カーとして用いる。米国特許第４．３４２，８２５号（この開示はここに参考文 献として関係する）参照。

本発明の定量法は生物学的サンプル中の復環ホルモンの検出と濃度算出に用いる ことかできる。これらのホルモンに対゛する抗体は標準免疫学的方法（よって調 製することができる。このようなホルモンには、チロキシン、トリヨー・ドチロ ニン、副甲状腺ホルモンおよびカルシトニンのような甲状腺ホルモン；インシネ リン、プロインシュリンおよびグルカゴンのよ５な膵臓ホルモン；プロラクチン 、副腎皮質刺激ホルモン、チロトロピン、オキシトシンおよびバソプレンのよう な下垂体ホルモン；コリオニックチロトロピン、胎盤ラクトゲン、コリオニック チロトロピンおよびリラキシンのような子宮／胎盤ホルモン；エストラジオール 、エステロン、エストリオール、ｆＸ）ステロンおよびジヒドロテストステロン ゼ含むステロイ１ホルモン；例えばウロガストロン、神経成長因子およびソマト メジンのような成長因子がある。

同様に、本発明の方法は細胞内メツセンジャー、環状ヌクレオチド　イノシトー ルポリホスフェートおよびプロスタグランジンに有利に通用されうる。

本発明の方法は同様に５例えば心臓グリコシド、：）ｉキシン、ジギトキシン、 抗けいれん薬、ジフェニルヒダントイン、メサントイン、フエノパルビタール、 およびメフオバルビタールのような治療薬の循環しｇルのスクリーニングに適用 可能である。

狭い治療指数を有する薬物、ｊなわち治療効果をうるにはある最低循環レベルが 必要であるが、これよりやや高レベルになると嵩性または有害な反応が刺激され るような薬物が特に重要である。

この方法はまた５例えばペニシリン、セファロスポリン、チェナマイシ７％クラ バラン５　（ｃｌａｖａｌａｎｉｃ　ａｃｉｄ、）、モノバクタム、ストレプト マイシン、およびテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサ イクリン、およびテトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン 、カナマイシン、ポリミキシンＢのような抗生物質に対してまたはこれらの抗生 物質自体に形成さｎた抗体の検出にも適用されろ。

好気性グラム陰性菌感染症の治療に用いられろアミノグリコクｒ抗生物質のゲン タマイシン、アミカシン、トブラマイシン、カナマイシンおよびネオマイシ／は 本発明の方法によって好都合に分析される。

本発明の方法は同様に、例えば阿片−モルヒネ、ヘロイン、メイリジンおよびメ タトンのような濫用される薬物；例えばリゼルグ酸ジエチルアミドのような麦角 アルカロイド；マリワナ；パルピッレートおよびコカインとその誘導体の検出と 定量にも適用される。

この方法は小分子に限定されない、ＤＮＡを含めた巨大分子物質および卵アルブ ミンのような大きい抗原を直接に、または適当な疎水性アンカーに結合させた後 に安定な２Ｍ層リポソーム小胞中に導入することができろ。従って、本発明の方 法は例えば大き−・抗原、血＃蛋白質、肝炎関連性抗原、組織適合性゛７−カー 等のような巨大分子物質の検出にも通用される。

液相定量法は例えば血清のような生物学的液体中の病原体の検出に特に適してい る。例えばエイズ、肝炎、ヘルイス、インフルエンザ、狂犬病のようなウィルス およびヒト、動物、Ｍ物を感染させる多くの他のウィルスに対する検定法乞構成 することができる。Ｍ！Ａ菌、マイコバクテリア、真菌、原生動物ならびにヒト 、動物および植物の他の病原体も本発明によって分析すること′ができる。非病 原体も同様に本発明の定量法を用−・て検出することができる。

本発明のＲｉ！施は非常に操作が簀単であり、不安定なまたは有害な試薬χ用い た（・ので、この定量法は典型的な診断用検査室はど充分な設備のない１手軽な 環境においても利用可能である。

例えば、この定量法は食物および環境青票のスクリーニングに適用可能である。

食物スクリーニングでは、重要な抗原はマイニドキシンと天然窃索である。この 分野は例えばアフラトキシン、オフ２トキシン、パツリｙ、４５シリン酸、ゼア レロノンおよびトリコセセン（ｔｒｉｅｏｔｈｅｅθｎａ）＄１素のような主要 嵩素。

ならびに食物中に自然花生ずるトポミーアメロン（ｉｐｏｍｅａｍθ−ｒｏコ８ ）のよ５な毒性代詣産ａｍヶ含む。天然壽吻の他に、広範囲な環境汚染物があり 、その存在が食物中では痕跡量であるとしても人類にかなりの脅威を与えている 。これらには、産業副産物または例えば多塩素化ビフェニル、垣素化ジベンゾー ｐ−ジオキシン、塩素化ジベンゾフラン、ヘプタクロルエポキシｈＺジエルト９ リンおよびＤＤＴ、１．１”（２，２，２−トリクロローエチ’Ｊデノ）−ビス （４−クロロベンゼン）のような殺虫剤がある。

本発明ｔその好ましい５ｉｉ１態様を含めて詳細に説明した０本発明の開示乞検 討するならば当業者が本発明の変更および改良を実施することができ、このよう な変更および改良が請釆の範囲に述べるような本発明の範囲と精神から逸脱しな −・ことは理解されるであろう。

浄書（内容に変更なし） ＤＮＰ　−ｃａＰ−ＰＥ　ａモｌし％−ユミイｔ：＋：Ｊ−６Ｄｏｐｅ　ｋｏｏ ｐｃ４−ＲｔＡ室定＋ｔ−ｔ＝　Ｌｔ軟Ｆｉｑ、１ ＦＩＧ。２ ＤＯＰＥ小Ｆ２　ＣＤ０ＰＥ　ＥＪ８　？／、：ＤＮＰ−ＣＯＰ−ＰＥ　１２％ ）／７／Ｌｔ／ｌン　４ｏｒｎＭ：ｒＫｔＬＷ［ｊ￥＃＊用し０−８７　ｍｏｌ ｅ Ｆｉｇ、３ ＤＯＰＣ小７！！！　（ＤＯＰＣ８８％：　ＤＮＰ−ｃｏｐ−ＰＥ　１２　％　 ）＊ｔｚｉルｔ１ン　４０１ｎＭ （ル頁侯Ｆ１４ｆｉ　＝１，９２　ｎ　ｍｏｌｅ）圓刀！抗体の１１貰失イヒ ＭｔＫ（すｑ本１１１ｇ／Ｉｎｌン　（γラスス１う１′に二１τ国カミンＦｔ ｇ、５ ５０％ａｍ■（ＤＮＰ−ＧＬＹ）　ｍ　０１ｓｓ　ｘ　ｒｃ；’ａ　Ｈ，１９ｐ 　ＭＯＬＸ Ｆｉｎ　ｃ： 壬ＲＸＤＮＰ−１ｇＧ１．Ｊｈ４ｊ！！ｔｔ′＃ｃ　（坑イ＠、ｍＱ／ｍｌ）　 （ＤＯＰＥ　ｒｊｉｆニー７７−１ａｔＦ−ＩテＭン午工、ヘエ、−トンＩ！１ ２　ｘ　ＤＮＰ−Ｋ＊量−４ｏｐｌ　（０，１２ｍｃｔ７ｍｌ）５０ｚ’＠答■ （ｘＤＮＰ−１ｇσ）　−０，５０ｍｇ７ｍ　ｌ　（ＭＷ　−’　１５ＱＯＯＯ ）Ｆｉ９．７ Ｆｉｇ、　８ （」ｉ匂ｔｘ　ｉｏリ　Ｉｉ　＼’　悼’５ｖＳｊ　Ｈ灯数〔７４ルスＪ　Ｃ） ’Ｑ／ｍＬ） Ｆｉｇ、　１０ Ｆｉｇ。１１ 灯数〔仄４３　（ｍｇ　／　ｍ　Ｌ　）Ｆｉｇ、　１２ ＦＩＧ、　＋３ 手続補正書 昭和６２年１１月ｔ′Ｌ日

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の段階： （ａ）リポソーム膜内に問題の分析物の安定量を有し、マーカー化合物を含むリ ボン−ムを形成する；（ｂ）段階（ａ）のリボン−ムに問題の分析物に対する多 価レセプタを、リボン−ムが前記レセプタによって飽和されるほど充分な時間接 触させる；および （ｃ）段階（ｂ）のリボン−ムが放出するマーカー化合物の存在を測定する； から成る膜溶解性免疫定量法。
2. （２）段階（ａ）と（ｂ）の間に、問題の分析物を含む試験液体を段階（ｂ）で 用いる多価レセプタと、多価レセプタを飽和するほど充分な時間接触させる段階 （ａ１）を含む請求の範囲第１項記載の免疫定量法。
3. （３）多価レセプタを不活性担体に付着させる請求の範囲第２項記載の免疫定量 法。
4. （４）段階（ａ１）の試験液体中の問題の分析物の存在によって、リボン−ムが 放出するマーカー化合物畳が低下する請求の範囲第２項記載の免疫定量法。
5. （５）多価レセプタを化学的手段によって製造する請求の範囲第１項記載の免疫 定量法。
6. （６）多価レセプタを生物学的手段によって製造する請求の範囲第１項記載の免 疫定量法。
7. （７）段階（ｂ）の多価レセプタが試験液体中に存在する請求の範囲第１項記載 の免疫定量法。
8. （８）段階（ｃ）がマーカー化合物放出量の定量をさらに含む請求の範囲第１項 記載の免疫定量法。
9. （９）試験液体中の問題の分析物に対する多価レセプタの存在によって、リボン −ムによるマーカー化合物放出量が増加する請求の範囲第８項記載の免疫定量法 。
10. （１０）リボン−ムがリボン−ム膜内に少なくとも１種類の脂質を含み、前記脂 質がｐＨ、温度および塩濃度の緩和な条件下で過剰な水中で六方晶相を形成する 請求の範囲第１項記載の免疫定量法。
11. （１１）脂質を天然に生成する脂質、合成によって製造する脂質、またはこれら の混合物から選択する請求の範囲第１０項記載の免疫定量法。
12. （１２）前記問題の分析物がリガンドーアンカー複合体である請求の範囲第２項 記載の免疫定量法。
13. （１３）リガンドーアンカー複合体のリガンドが抗原である請求の範囲第１２項 記載の免疫定量法。
14. （１４）前記抗原の多価レセプタが抗体である請求の範囲第１３項記載の免疫定 量法。
15. （１５）抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である請求の範囲 第１４項記載の免疫定量法。
16. （１６）前記抗原を蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、リポ蛋白質、ハプテン、核酸 、多糖類、および脂質から成る群から選択する請求の範囲第１３項記載の免疫定 量法。
17. （１７）リガンドーアンカー複合体のアンカーが疎水性分子である請求の範囲１ ２項記載の免疫定量法。
18. （１８）疎水性分子を脂質、脂肪酸、ステロイド、疎水性ペプチド、および疎水 性蛋白質から成る群から選択する請求の範囲第１７項記載の免疫定量法。
19. （１９）リガンドーアンカー複合体が化学的に結合したものである請求の範囲第 １２項記載の免疫定量法。
20. （２０）リガンドーアンカー複合体が細胞内で生物学的に製造される請求の範囲 第１２項記載の免疫定量法。
21. （２１）リガンドーアンカー複合体を組み換え体ＤＮＡ法によって製造する請求 の範囲第２０項記載の免疫定量法。
22. （２２）リガンドーアンカー複合体のリガンドを抗体、核酸、および酵素から成 る群から選択する請求の範囲第１２項記載の免疫定量法。
23. （２３）リガンドーアンカー複合体のリガンドに対するレセプタを抗原、核酸の 相補的ストランド、および酵素レセプタから成る群から選択する請求の範囲第２ ２項記載の免疫定量法。
24. （２４）問題の分析物がリガンドーアンカー複合体である請求の範囲第１項記載 の免疫定量法。
25. （２５）リガンドーアンカー複合体のリガンドが抗体である請求の範囲第２４項 記載の免疫定量法。
26. （２６）抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２５項記載の免疫定量法 。
27. （２７）モノクローナル抗体が実質的に純粋である請求の範囲第２６項記載の免 疫定量法。
28. （２８）抗体がＩｇＧ抗体またはそのフラグメントである請求の範囲第２７項記 載の免疫定量法。
29. （２９）リガンドーアンカー複合体のアンカーが疎水性分子である請求の範囲第 ２４項記載の免疫定量法。
30. （３０）疎水性分子を脂質、脂肪酸、ステロイド、疏水性ペプチド、および疎水 性蛋白質から成る群から選択する請求の範囲第２９項記載の免疫定量法。
31. （３１）リガンドーアンカー複合体が化学約に結合したものである毒請求の範囲 第２４項記載の免疫定量法。
32. （３２）リガンドーアンカー複合体が細胞内で生物学的に製造される請求の範囲 第２４項記載の免疫定量法。
33. （３３）リガンドーアンカー複合体を組み換え体ＤＮＡ法を用いて製造する請求 の範囲第３２項記載の免疫定量法。
34. （３４）リガンドーアンカー複合体のリガンドを抗体、核酸、および酵素から成 る群から選択する請求の範囲第２４項記載の免疫定量法。
35. （３５）リガンドーアンカー複合体のリガンドに対するレセプタを抗原、核酸の 相補的ストランド、および酵素レセプタから成る群から選択する請求の範囲第３ ４項記載の免疫定量法。
36. （３６）多価レセプタが抗原である請求の範囲第７項記載の免疫定置法。
37. （３７）抗原を生物体またはそのフラグメントから選択する請求の範囲第３６項 記載の免疫定量法。
38. （３８）前記生物体またはそのフラグメントを生存材料、死亡材料、および加工 材料から成る群から選択する請求の範囲第３７項記載の免疫定量法。
39. （３９）生物体をウィルス、細菌、真菌、原生動物、寄生体（ｐａｒａｓｉｔｅ ｓ）、および高等生物の細胞から成る群から選択する請求の範囲第３８項記載の 免疫定量法。
40. （４０）高等生物の細胞を動物細胞、動物細胞、およびヒト細胞から成る群から 選択すあ請求の範囲第３９項記載の免疫定量法。
41. （４１）細胞を癌細胞またに正常細胞から選択する請求の範囲第４０項記載の免 疫定量法。
42. （４２）生物体またはそのフラグメントが病原性である請求の範囲第３８項記載 の免疫定量法。
43. （４３）生物体またはそのフラグメントが非病原性である請求の範囲第３８項記 載の免疫定量法。