JPS6150923A - ヒト癌壊死因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はヒト打壊死因子に関する。 ｉＫ　ｌｉ死囚−１’−（丁ｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｔ
ｓ　Ｆａｃｔｏｒ）は１１１１１胞を遍す２１ＫＪにｆ
Ｌｓ害する生ＰＩ！活性因子として、１９７５年Ｃａｒ
ｓａｃ　ｌ　＋らにより発見された。それ以来、この様
ｔｉ囚ｌ−を浣かλ剤として臨床に応用すべく、その生
Ｆにノｊ７ｊｉ　、精製方法や切部化−７−ｎ諸性πに
関し広ｉＪＬな＆１［究か枕けられている。しかしｒｌ
がら、これまでの厚壊死因子の生産力ｒＬは、−■乳Ｕ
Ｉ　Ｍ　ニアらかじめｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａ１ｓｃｔ
ｔｃ−Ｇｕｃｒｉｎ（１３ＣＧ；）又はＰｒｏｐｉＯｎ
ｉｂａＣ＋ｅｌ”ｉＵｌ　ａｃｎ（！Ｓを投与し、サラ
に工／ドトキンノ等を投与するという方ｌｒ：であった
。従って、ウサギやマウス等を用いた研究は進められて
きたが、ヒトではこの生産方法は医用できず、ｂトｃｔ
＋＊のＥ壊死因子をｉＵることは極めて対しい伏、兄で
あった。 一方、ヒトマクロファーン由来のＥ圃ね傷害因子として
、＋ＪａＮｈｅ＊ｓにより報告された、正′ｉ１１゛人
の宋悄！１１球細胞あるいは骨Ｍ　Ｉ’ｌ：　！１１　
［！：ｆｆロ血病細胞が産生ずる因子（＾ｎｔ；−ｔｕ
ｔｏｒ　ｃｙｔｏｔｏｘ；、ｎ）［Ｉｍｓｕｎｏｌｏｇ
ｙ。 ↓↓、１：１５（１９８＋）］、及びＲａａｄらにより
報告された、ヒト末Ｗ１血中の培養器ｑ（す石細胞が産
生ずる因子（＾ｄｈｅｒｅｎｔ　　ｃｅｌｌ　　ｔｏｘ
；ｎ）［Ｊ、Ｉｍｍｕ口ｏ１．．１１５．３９５（１９
７５）１などが川られている。また、　Ｗｉｌｌｉａｘ
ｓｏｎらは、ヒ）　１１１１１胞樹立抹から産生される
分子ム１約７万ゲルト／の物質をヒト打壊死因子として
報告している［１’ｒｏｃ、Ｎａｕ　、＾ｃａｄ、ｓｃ
ｉ、Ｕｓ＾、１１０．５３０７（１４１８：］）］、　
Ｌかし、いずれの１易合もその物質としての実体は全く
不明であった。 そこで、本５乙明にらはｊ伝子、ｔｌｌろ換え技術に首
・　ロし、ヒ）＆伍壊死因子の微生物による生産力ｒｒ
、について＆ＪＦ究を１１１ね、ヒ）　ｅ　１．１１死
囚子をコード１−るＣ　Ｄ　Ｎ　Ａのクローン化に成功
しく特願昭５９−４．ｌＧ＋７号明ｔＩ［ｌ書参照）、
さらにこのクローン化ＤＮＡを、徂ろ込んだ形質２現ベ
クターで形質転換された微生市中でヒトと５壊死因子を
生産させることに成功した（持Ｃ（＋　Ｎ１５！１−１
１２０５：１′：Ｊ１′！Ｉｆ細書参照）。 さらに、本発明名らはＳＪ：Ｌ旧ＩＴ究を１ねた枯葉、
この様にして生産されたしトロ壊死囚子含イｆ主ｉｕ物
から、不純１ｉを丈π的に９まないヒト癌壊死囚子１！
リベプチドを１５）ることに成功し、本発明を完成した
。 本発明は、さらに；’ｐｔ、＜は、下記のアミノ酸配列
をｆ［するヒト路壊死囚子１：リベプヂド及びその活性
部分の一部又は全部を仔するポリペプチドに関する。 Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｃｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒａ　Ｓ
ｅｒ　ＡｚＰ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。 Ｖ、ＬＩＡＩ：ＬＩｌｉｓＶａｌＶａｌＡ＋３、Ａｓｎ
ＰｒｏＧｌｎＡｌｈＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｎ　ＴｒｐＬｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒ＝＼ｒＩ！Ａｌｌ
＋〜５ｎＡｌａＬｃｕＬｃｕＡｌａＡｓｎＧｌｙＶａｔ
ＧｌｕＬＣｕＡｒｔｚＡｓｐＡｓｎＧｉｎＬＣｕＶａｌ
Ｖａ宜ＰｒｏＳｃｒＧｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｌｕ１ｌ　　
Ｔｙｒ　　Ｌａｕ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　
Ｇｌｎ　　ＶａｌＬｅｕ　　ＰｈＣＬｙｓ　　Ｇｌｙ　
　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ　　Ｉ”ｒｏ　　Ｓｃｒ
　　Ｔｈｒｌｌｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ
　Ｈｌｉ　Ｔｈｒ　Ｉｌｃ　Ｓｅｒ　Ａｒｇｌｌａ　　
Ａｌｚ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｎ　　
Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎしｅｕ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｓｃｒ　　Ａｌａ　　Ｉｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｐｒｏ　　Ｃｙｓ　　ＧｉｎＡｒｇ　　Ｇｌｕ　
　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　
　Ｇｌｕ　　Ａｌｚ　　ＬｙｔＰｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ
　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　口ｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇ
ｌｙＶａｔ　　Ｐｈｃ　　１ｃｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ａｒｇ　　Ｌｅ
ｕＳｃｒ　　Ａｌａ　　Ｇ；ｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｎ
　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　　Ｌｃｕ
ＡＳＰ　　Ｐｈｃ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｓｃｒ　　
Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｔ　　丁ｙｒ　　ＰｈｅＧｌ
ｙ　　ｌｉｅ　　ｌｉｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　　　
　　　Ｃ１］アミノ酸配列Ｃｌｌで示されるヒトＥ、壊
死因子Ｉ！リベプチド（以下単にポリペプチド［］と記
すこともある。）の活性５分を一部又は全部を（ｒする
ポリペプチドには次の様を工窃青む包合されるとｐｐ解
されるべきである。 ｌ′リペプチドＣＩ］の対立ｎ　（Ｅ子変兄体ポリペプ
チド及びそのＮ末端又はＣ宋ｒ−７にアミノ酸又はペプ
チド（Ａ゛リゴは−１！リベプチド）が結合している。 ＋テリペプチドであって、σ壊死因子の生理活性を示す
物質、ポリペプチドＣＩ］又はその対立這伝子変５′ｅ
体１！リベプチドのアミノ酸配ダＩのうち一部のアミノ
酸が欠失しているが癌壊死因子の生馬！活性を汀するポ
リペプチド、例えばポリペプチドＣＩ］のＮ末端部分の
アミノ酸が４１１！！欠失している一１＝リベブチド、
上コこのポリペプチドの鎖上の側鎖官１ｉ！：Ｊλ、Ｎ
末端のアミ７基又はＣ末１４２のカル１？　トンル）Ｊ
＋を利用して形成されるＪ　’＝体、例えばカル！？キ
シル基と脂肪族アルコールとのエステル頚、万−級もし
くは男二級アミンとの酸アミド頒。 アミツノλのＮ−アンル訝４体又はヒトａキンル基の０
−アンル誘Ｊ汀体、さらには、上記のポリペプチドのカ
ル−１τ↑・ノル基又はアミ７基７とで形成される塩、
例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アル１？二
ノ、カフェイン、プロカイ／、塩歯。 グルフ／酸了との塩。 また、上述の１でリベプチドは０ｌ量体又はその集合体
としてａ在しうる場合もあり、この様な集合体も本発明
の物πに”：５　ＰＡ　２よれる。 以上の物質をｔ！称して本発明物質とコごすことらある
。 １−８、本明細書でいうヒト１１．ＩＩ死囚子とはヒト
細胞に山来し、（１）ｉｎｖｉｔｒｏでマ・クスし細胞
をＵ’Ｕし、（２１ｉｎ　ｖｉｖｏで５ａｃｔｈ−＾肉
胚を壊死させる化２１活性を有する狗ｉを０味する。 本発明ｎ　質、ＩＧにポリペプチド［■］は次の様にし
て譚こ単離される。 、１′リベプチド〔！］及びその前駆体をコードするＤ
ＮＡの！１１．殖は、特願昭５９−４１０Ｉ７号明細占
に記αの方ｌｒ：に従って行われる１表１にヒト匹壊死
囚子ｉ：１駆体をフードするＤＮＡの塩基間９＋１及び
塩基間９＋１から１１し測されるアミノ酸配列を示す、
２２１中。 〔〕で凹んだ部分がポリペプチド［１］をコードする領
域である。 （以下余日） ＪＪ　ｌ　　ヒ）　ｌＩＩＩＩＩＭ；ＩＪＩ　ｒ％　：
ｙ　−ｆｔ４ＰＪＪ、（配Ｐ’１及び塩Ｊλ配りｑから
１道謂されるアニノｍ配剌（零本本１１ｊｐＨコ１トノ
を示ず。 塩４１に；；１〜６凹呂はｈト目壊死因子Ｒ駆体をコー
ドする０７１城を、〔〕で叩んだＦＺ５）Ｌ！ａ！リベ
プチド

【！〕をコードするｃｎ域を示す。 （以下余日） ＋＝リベプチト［■］をフードするＤＮＡ塩基配列の５
′宋喘にじ；１始コドンＡＴＧを付加し、かつ３′本喘
に終止コドンを含む塩基Ａ！列を仔するＤＮＡ断片を作
製し、これをＭ’Ａなプロモーター及びンヤイ７・グル
ガー／（ＳＯ）配列に続いて結合させ、ベクターに４１
１ろ込むことにより、非融合をの＝ｉＪ物π生筺ｍの形
質発現ベクターを得ることができる。 マタ、宿主中で発現しｆＯるオペミノのｔ＋Ｗ　ｍ　１
１ｆｆ伝子の翻訳領域の途中に読み枠をあわせて、ポリ
ペプチド〔ＩＪをコードするｆ、Ｉｔ域及び終止ニド／
を含む塩基配列を含むＤＮＡ断片をｔ＝ｐ人すれば、融
合型の該物質生産用の形質発現ベクターを得ることもで
きる。 プロモーターとしては、例えばＩａｃ、　ｔｒｐ、　ｔ
ａｃ。 ｐｈｏｓ、ｐｈｏ＾、　　ＰＬ、　　ＳＶ４０初期プロ
そ一クー等が挙げられる。ベクターとしては、形質転換
させる宿主中で増殖するものはすべて用いることができ
る。 例えば、プラスミド（ｐＢＲ３２２簀）、ファージ（λ
）７一ジ語４体等）　、　ウィルス（ＳＶ４０？Ｆ）が
挙げられる。また、ランナウェイ　プラスミドも佇ｎ１
である。 これらの形質発現ベクターをΔづな２工、例えば大腸菌
などに％例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ。 Ｎａ目、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、υＳ＾Ｊ９．２＋１０（＋
９７２）］により４人することにより形質転換体を得て
、次いで諺形費転換体を培養することによりポリペプチ
ド［ＩＪ又はそのＮ末端にメチオニ／が付加されたポリ
ペプチドをｎ゛生さＬることができる。該生産物は使用
したプロモーターと形Ｍ　５ａ　ＩＪ、ベクターのｈｔ
　＝１により、宿主中の＄８１ね質的又は細胞質外のい
ずれにも落積させることができる。細胞質外に分泌させ
るには、例えばアルカリホスファターゼの購遣ａ伝子（
ｐｈｏ、＾）やリン波結合壬白の構造ａ伝子（ｐｈｏｓ
）を用い、それらリングナルペプチドをコードする領域
に続いてポリペプチドＣＩ］をコードするＩ）ＮＡ　８
　Ｊ、’ｉ合させた形質２現ベクターをＩｎ玉すればよ
い。 このようにしてｉ！）られた形質転換体を、それぞれの
形質ｆ；、換ｆトにに；じたシボな培ム条件下で、口的
のポリペプチドｌ”！］が十分にＲｉ生されるよで培谷
したのら、培養物からポリペプチド［１１を抽出する。 産生したポリペプチド［Ｉ］が細胞質中に３積される１
９合は、倒えば、リゾチームＩｎ化と凍結融解や超音波
破砕、フレンチプレス等により店主細胞を破壊したのち
、ａ心分離又はＩ）２過にて抽出液を集める。また、ベ
リプラスムにＭ　Ｌｌされる場合は、例えば°＃１ｌｌ
ｓｋｙらの方法［Ｊ、［ｔａｃｔｅｒｉｏｌ、。 １２７．５９５（１９７Ｇ＞１に従って抽出することが
できる。 このようにして得られた粗製のポリペプチド［１１は一
般的な蛋白のｆ＋’ｉ　’Ａ　ｊ）：、倒えば限外６過
。 透（斤、イオノ交換クロマトグラフィー、ゲルｄ過。 電気泳動、アフィニティクａマドグラフィー等の組み合
わせによりＴ＋ｊ　’Ａすることができ、ポリペプチド
［Ｉ］を実質的に純品として得ることができる。 にリベプチドＣＩ］及びそのＮ末端にメチオニ／が付加
された１τリペプチド以外の本発明物質は、上二この方
γＬに草じ、或いは後述の方法（トリプシ／処Ｆｌり、
或いは公用の方法を４宜Ａｌｌみ合わせて実施すること
により製造することかできる。 本発明の１！リベブチド［１１の特性について以下に二
Ｔ述する。 （１）　物理化学的並びに化学的特性 分子ユ 実施例で１１１られたポリペプチド［］の０分子を、Ｔ
ＳＫ−ｇｃ　ｌ　　Ｇ３０００ＳＷカラム（７，５Ｘ　
ＧＱＯｍｍ。 東ＦｐＩｎＩ達工業）を用い、ゲルＥ２過法により測定
した。溶謀としては、０．２Ｍす７酸１２！衝液（ｐＨ
７）及び８Ｍ尿、÷２のみ又は８Ｍ　Ｗｃ　ｍと０．５
％β−メルカプトエタノールを含仔する同可衝液を用い
た１分子量ホ用のにべｆ（り７バクとして、ラン血１ｎ
アルブミ／（ＭＷ　Ｇ、ｎＸ　１０　’　）　、　　ウ
サギ　トリオースネスフェート　　イソメラーゼ（ＭＷ
　５．３ｘ　ｌｏ″）、第１Ｃ７ルフＥ　７　（ＭＷ４
．５Ｘ　１０″）、ブク　ベプン／（Ｍ〜Ｖ　：１．２
７Ｘ　＋ｏ′＞　、　大豆トリプ／ノインヒヒター（Ｍ
Ｗ２．０５Ｘ　１０　’　）　、　　ウマ　ミオグミビ
ン（ＭＷ　１．７８Ｘ　１０　’　）　、　ウマ　チト
クロームＣ（八＋’ｈＶ　Ｉ　、２ＬＸ　１０　’　）
　４：　Ｊｌｌ　イｔ：　。 その結果、ポリペプチドＣＩＩの分子量は尿素非？７在
下では↓ｓ、ｏｏｏ±ｓ、ｏｏｏダルドア、尿素存在下
では１８．０００±３．０００グルトノと求められた。 ′実施例１項に示した形質発現プラスミドｐＨＴＲ９１
に組み込まれた・ｊでリベプチドＣＩ］をコードするＤ
ＮＡから翻訳されるアミノ酸５５基数は＋５５’ｉＪ＋
基である。その配列から推定される分子量は１７，０９
７グルトンである（ただし、間姶フドンＡＴＧに由来す
るメチオニ７を除り）、尿素存在下でのゲルｄ２過分析
で求められたポリペプチド［Ｉ］の見かけの分子量はこ
の推定性子息とほぼ一致した。 この結末は、ポリペプチド［［］はサブユニット檜追を
とり、尿素存在下では解離し！１１量体となるが、これ
ら解離剤の非存在下では、すなわち口然伏ミでは集合体
を形成していることを示すらのである。 等電点 ポリペプチド［■コの可電点をｐＨ籟囲↓、０〜Ｇ、５
の７フルマライト（フフルマ／７社）と５％ポリアクリ
ルアミドを含むフラットゲルを用いた等電、り（電気泳
動Ｉ）二にて測定した。その結果、ポリペプチド［！］
の等電、Ｃχは５．９±０．３であった。 泳動社５ワット、３時間で行った。クーマシーＯブリリ
アント寺ブルーを用いる染色で蛋白の位置を、又ゲルを
口■間隔に切り出し、　２０ｍＭ）リス−１００）緩衝
液（ｐｌ＋７．ｌｌ）で油出し、Ｌ−Ｍ細胞傷害活性を
測定した。蛋白の染色位＝に一致して強い細胞傷害活性
を認めた。尚、活性の測定法は後記生物活性の項のＪこ
桟に従って行った。 アミ／醋組成 ポリペプチド［１３を寸法に従って塩酸加水分解した後
、オルトフタルアルデヒドを用いた蛍光法による微はア
ミノ酸分析ンステム（ＱｒＩｔ　＆Ｊ　作ｍ　）により
各アミノ酸を定Ｃ【シ、アミ゛ノ酸組成を求めた。 ポリペプチド［ｆ　］　５０μｇを６Ｎ塩酸中、１１０
°Ｃで、２４．　、！８．７２時間加ハし、加水分解し
た。各アミノ酸の含Ｑ　ｌｓ’ｉは３　Ｑ４ｊ点の加水
分ＰｒＩ物での平均値及び補正ｆ−１よりη出した。な
お、シスチン（又は／ステイノ）は過ギ醋酸化により／
ステイノ酸として夏作し、トリプト７アノは蛍光法［Ｐ
λＪｏｔ、Ｐ、。 Ｅｕｒ、Ｊ、！１１ｉｏｃｈｅｍ、、Ｇ３，２０３（１
９７Ｇ＞］にて］決した。 その結末を表３に示す、その分析値は、ポリペプチド［
１］をコードするＤＮＡの塩基配列から１ｌｌｊＩＩさ
れたアミノ酸組成とよく一敗した。 （以下余日） 表３　　＋１１１　ヘプＰ　トＣＩコｆ）’ｒ　ｉ　／
　Ｐｆ：、！ｌ＋＋！ア：／ｍ　　　　　　５＞析イ＋
Ｔ（ｍｏｌ）　　　　　Ｎノ、ｔ／ｉ！列より求めたＴ
ｈｒ　　　　　　　　　　５．５　　　　　　　　　　
　　　１３Ｓｅｒ　　　　　　　　　１２．４　　　　
　　　　　　　　１３Ｐｒｏ　　　　　　　　　ＩＱ、
３　　　　　　　　　　　　１０にｌｙ　　　　　　　
　　ｌｏ、Ｇ　　　　　　　　　　　　　ＩＩＡｌａ　
　　　　　　　　１３．０　　　　　　　　　　　　１
３１／２Ｃｙｓ　　　　　　　　　　１．５　　　　　
　　　　　　　　２Ｖａｌ　　　　　　　　　　１２．
１　　　　　　　　　　　　１２Ｎｌｅｔ　　　　　　
　　　　　＜０．１　　　　　　　　　　　　　　　０
１ｉｅ　　　　　　　　　　８．０　　　　　　　　　
　　　　８Ｌｃｕ　　　　　　　　　１７．７　　　　
　　　　　　　　　＋８Ｔｙｒ　　　　　　　　　　Ｇ
、８　　　　　　　　　　　　　７Ｐｈｅ　　　　　　
　　　　３．９　　　　　　　　　　　　　４旧ｇ　　
　　２８　　　　３ Ｌｙｓ　　　　　　　　　　６．　　ｌ　　　　　　　
　　　　　　　ＧＡｚｒ　　　　　　　　　　７．５　
　　　　　　　　　　　　８二Ｌ−２に一！ｉ　こ′　
ｌ゛　　ア　　ニ　　ノ　　　　　　ｌ９１１°リベブ
チド［１］のＮ末端部分のアミノ酸量ダ１はニドマノ分
解法［＾ｒｃｈ、１１ｉｏｃｈｃｍ、［１ｉｏｐｈｙｓ
、、２２゜↓７５（１９４！］）］により決定した。 １′リベプチド［１３約１４０μｇを７エニルイノチオ
／アネートとカフプリフグ反応させ、次いでＮ末ル゛１
アミノ酸をチアゾリノ／誘導体として切断し、さらにフ
ェニルチオヒグントインーアミノ酸に変換し、これをＴ
ＳＫ−ｇｃｌ　０ＤＳ−１２０八カラム（４，Ｇｘ　２
５０ｍｍ、東洋σ達工］）を用いた高ｄ液体クロマトグ
ラフィーにより同定し、Ｎ末端部分のアミノ酸をｌ決定
した。さらに、この［４１乍を４１次謀り題すことによ
り、Ｎ末端部分の７ミノ酸量列を決定した。 その拮采、’１！リペプチド［ｌ］のＮ宋ル°一部分の
アミノ酸配列は、Ｓｅｒ−５ｃｒ−Ｓｃｒ−Ａｒｇ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｓｐ−−−−であった。 逍伝子′紺み換え技シミ１によりＩ：リベプチドを生産
した口１！、翻訳の開始ニド：／　ＡＴＧに山；１コす
るメチオニ７か目的とするＩでリペプチＶのＮ末端に付
加されている揚、）・ノ）あることか一般的に加られて
いるが、実施例にｂｔって生ｔＵ　Ｌ　、ｆ＋’ｉ　Ｆ
Ｊした一１＝リベゾチド［ｔｌの１４合は、そのＮ末端
にメチオニ７は検出されなかった。 Ｃ末端部分アミノ酸組成リ ポリベプー！−ド［ｒ］のＣ末端部分のアミノ歯間４り
はカルｔτキンベブチグーゼを用いる＋’ｌＦ索法によ
り決定した。 ポリペブーｙ・ド［＋］約１５μｇにカルボキノペプチ
ダーゼ、＼（ングマ辻）及びＹ（才す二／タルへＦ、　
Ｑ社）を作用さ仕、反応開始後２分から１８０分間にわ
たり１１時ＹＪにＫｔ　２３１して（るアミノ酸を分（
斤した。 その結：Ｉ！、ポリペプチドＣ１］のＣ末端部分のアミ
ノ歯間＋１１は、−−−−Ｔｙｒ−ｒ’ｈｃ−Ｇｌｙ−
１１ｃ−１１ｃｍＡｌａ−Ｌｃｕであった・ トリプンノ処理 １′リペプチト　〔ｒコ　５００μｇにＴ　Ｉ”　ＣＫ
処理ト　リブ／）　（ング７１Ｌ、　　ｔｙｐｃＸＩＩ
り　　２０ｔＨＨを５ｍへ１ト　リス−Ｉ１．ｉＹ２　
ｒ、’ｃ　［＋ｒｔｃｉ　（ｐｌ＋　７．８）　中、室
Ａ　テ５　時間反Ｇ　８　ｕた。この反応液を実施例２
項に示したのと同じ条（・１にてユ°コ製用ゴ電Ｃ°、
（電気・７に切にＩ＝ｔ　シた。　ｂｋ動柊了出、クー
マンーーブリリア／ト・ブル−による蛋白染色と、３■
巾で切り出したゲル片からのれ口出Ｉｊ　　（２０ｍＭ
　）　　リス−塩１［）衝液、　　ｐＨ７，８にて抽出
）中のし−Ｍ細胞ル１害活性の測定を待った。その結果
、ポリペプチド［［］の泳動位δ（ｐＨ５，９Ｉ、Ｆ近
）よりｐＨが約０．３程酸性側の位置に蛋白のバ／ドと
一致するＬ−Ｍ細胞傷害活性をＺめた。 ｌ＋’＋ｌ、活性のＤ１定法は後記生物活性の項の記α
に従って行なった、 この物７ゴ（分解産物という）について、Ｎ末端部分及
びＣ末端３分のアミノ酸量フ１１をそれぞれエト７７分
Ｐｌ’ｆ、　ｒｒ：とカルホキ／ペプチダーゼを用いる
／７１ｒ−にてＡ７折した。 その１．Ｉ、末、この分１１５産物のＮ末端部分及びＣ
宋４°一部分のアミノ酸配列は、それぞれＴｈｒ−Ｐｒ
。−５ｃｒ−、Ａｓ１）−−−−、及び−−−−１ｉｅ
−八ｌ　ａ−Ｌｅｕであ、た、すなわち、この分解１１
−物はポリペプチド［１１のＮ末端ｕＣ分の５ｃｒ−Ｓ
ｃｒ−５ｃｒ−八「ｇの４残基が欠失したアミ／酸量？
１１をらつ１′リベブチドである。 この分ＭＹ　ｆｌｉ　１’４が１．−Ｍ細胞傷τ１３匹
をイ「することから、１′リベゾチド［Ｉコのアミノ酸
配列のうち、少くともＮ末端側の４５５基のアミノ酸は
、そのｔｍ胞傷マー活Ｖ１に必ずしも必須ではないとい
える。 伐）　生物活性 ＋コリペプチド［ｒ］の生物活性はｉｌ’ｌ　ｖｉｔｒ
ｏにおけるＬ−１細胞傷害話ｖＬと、１ｌｌＶｉＶｏで
のＡｌｅｔｈ−へ肉圧に対する抗ルＦｌｉｌｌ活性で＝
ｒ価した。 ポリペプチド［１］のＬ−Ｎ＋細胞傷τ活性の比ｉ１　
ｅｌ：は、２Ｘ　１０　′ｑｔ位／１ｇ以上であった。 そのａｌｌ定１ｒ：はＲｕ（ｒの方法［Ｊ、ｌ＊＊ｕｎ
ｏ１．、１２［ｉ、２３５（＋！１８１）］に〜ｔじ、
改良した方法を用いた。すなわら、１：リベプチド［（
］を４１次培地で希釈した試料０１１とＬ−ＬｌｌＩＩ
Ｉ胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬｌ、２）　　のｌＸｌ０’個／
１のセ濁液（１，ｌｓｌを９６穴のｉ■は培養用マイク
ロプレート（〕Ｉ＋　−喝うにラトリー社）に１５口え
た。 培Ｊｌはｌ　ｖ／ｖ％のつ／１１ζ；　ｇＱ　２　：：
Ｉを含むイーグルのミニマム・エフヒ／シシル培ｊｔ！
Ｉ（その組成は、（？Ｉ、ｔ。 ば、「組品培＋９　Ｊ中〕ｒべＣ１之助他編集、’Ｋｌ
ｌ　Ｏ書Ｍ、１！ＩＩ’；？’にに、己ｆ上されている
）を用いた。マイク０７レートを５％の炭酸ガスを含む
空気中、３７℃で↓８ｊｌｆ間培δした。培養終了後、
グルグルアルデヒド２０μ２を加え、生き残った細胞を
固定した。固定後、マイクロプレートを洗１↑、乾均し
て、　０．０５％メチレ／ブル−ｚ８液を０．１璽１加
え、固定された細化−！：染色した。余分なメチジ／ブ
ルーをｉｌい流シ、乾すｈした後、固定された細胞にＩ
ｔ　０したメチレ／ブル−をＯ，：］ＧＸｊｌ−酸で抽
出し、そのＧ（ｉ５ｎ璽における吸光度をクイクーテフ
クーマルチス＋＋７　（７０−・うにラトリーは）で測
定した。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。 Ｌ−１細胞の５０％を殺すために必要な生理活性量を！
単位／冒１と定義し、：ｉ料を加えない対且１の吸光：
の５０％の！＋’＋に相当する試料の帝釈率を、グラフ
あるいは計りによって求め、そのπ釈率のａ数を試料の
生理活性量（！１１位／ｍｌで表コこする）とした。 尚、蛋白０度はＬｏｗｒｙ法［ＪＩＨｏｌ、Ｃｈａｍ、
、１０：１．２Ｇ５（１１５＋）］によりＤＩ定した。 次に１τリベプチド［１１をへ１ａｔｈ−Ａ肉ハ・１（
り厚マウスに役！ｉ　（、、その抗旺瘍効渠をみた。 ＢへＬ　１１　／　ｃマウス（体重的２３ｇ）の蝮部皮
内に２×１０”昏・１の一１ａＬｔド＾薦■１胞を（多
植し、７０後に６〜７１雪径の腫瘍が形成されたマウス
を選び、１群５匹で実験した。本物質の投与ユはマウス
当りｌＸｌ０’単位、３Ｘ　１０　Ｊ！＋１、位及びｌ
Ｘｌ０’単位とし、：、Ｉｅｔｈ−Ａ　ｔ！’Ｉ　Ｎ移
植後７０「Ｉに１静脈内又は腫瘍内に１回投与した。 なお、本（１品中のエントドキン７含舟はＩＸ　１０″
単位当りＯ，０Ｉｎｑ以下であった。 腫瘍内段与Ｉ！Ｔでは、ｌＸｌ０’単位、３ＸＩＯ３単
位。 ｌＸｌ０’単（ηの各投与量で投与後２Ｉ時間以内に金
側にルＩｔ　Ｌｉ　％Ｌ位の壊死反応を認め、完治した
マウスは５例中それぞれ３例、５例、５例であった０本
物質を没与しなかった対照詳では壊死反応及び完治例と
６に全く認められなかった。 一方、５１脈ｌ’４　Ｄ　！？　Ａ丁テハ、３Ｘ　１０
’　１１’−Ｑ＆　ヒｌｘ１θ″単位の段５　、’ａで
金側に壊死反応を認め、完治例は５例中それぞれ３　Ｐ
ｊｌｌと４例であった。 （３）　　免疫゛２的１’ｌｔ’？ 精製抗ウーｌ７１４　Ｋ＜　１４死因子血Ｉｎを用い、
−Ｉ！リベプチドＣＩＩとウサ１！歴壊死因子との免疫
ニア、的交差性を試験した。精製抗つサギ癌壊死囚子血
清（そルそフト血ｔｎ　）の作′！Ａ法は４１願昭５９
一番３６１７号明細書の記αに従い行った。 この抗血７ｎの約１．０００倍希釈液はウナギＨ壊死因
子のＬ−Ｍｔｌｌｌ胞偏τ活性５０単位を完全に中和す
る能力を佇する。 本物質の１００単位／１溶液を抗血１ｎの１００（ａ希
釈液と等８全混合し、３７℃で２１７間反応させた後、
Ｌ−Ｍ細化に対する細胞但′ＪＪ活性を測定した。 子の拮１、本物質の活性は浣つサギｆｒ壊死囚子［ｌ１
１７１′７により中和されなかった。 従って、ポリペプチド［１はつ、サギＥ壊死囚子とは免
疫学的に区別し得る１？リベプチドである。 本発明物質の製剤化にあたっては、溶液及び凍結免外品
のいずれでも良いが、長期安定性の点から凍結・πが品
が望ましい、その凍結□７ｉ燥にあたっては、賦形剤や
安定化剤を添加するのが好ましい。 安定化剤としては、例えばアルプミ／、グロプリノ、ゲ
ラチ／、プ１＋クミノ、プロクミ／塩、グルコース、ガ
ラクトース、キノローズ、マンニット。 グルタ０７％、）レバロース、デキストラノ、ヒドクキ
シエチルデノプノ、非イオン界面活性剤（１：リオキシ
エグレ７詣肪ｍエステル、ポリオキシエチレールル士−
ルエーテル、ポリオキンエチレンアルキルフェニルエー
テル、ポリオキ／エチレノノルビクン脂肪酸エステル、
ポリオキ／エチレングリセリフ指紡醒エステル、ポリオ
キノエチレンＩ２Ｉ！化ヒマ／浦、１？リオキンエチレ
ンヒマン池。 ポリオキンエチレ／ポリオキンプクピレ７アル牟ルエー
テル、ポリオトシエチレ７ポリオキ／プロビレｌブロッ
ク、Ｉ：リマー、ンルビク７　Ｍａ　Ｉ７７　ａ　＝　
Ｘｔル、ン２亀苛Ｉｆ？鳳ｆｉ最エステル、グリセリフ
罵丘坊酢ニス戸ル）７が挙げられる。 本光明物賛は抗Ｄｊ　ＩＣＩ剤として任用である。持に
Ｉ：リベプチド［１１はヒトに対し同＋［ｆ臼であり抗
訂１１の血からもとりわけ好ましい物質である。 没）方ｉｈとしては非ＸＩ口投与又は口舌投与がある。 本発明物質は粁塙細胞を這沢的に偏害する特注を汀する
ことから、身ｆ　ＩＱ　ｔｉｔりが広ｉｉｉ囲に拡がっ
ている場合や転移している場合、さらに転移予１／ｊ等
を目的とし、靜脈内投与や筋肉的投与の非ＩＩ口投与が
用いられる。また、局在するｉｌｉ　ＪｇＡｌｌ　ｒ’
！に対しては、ＩＬ［ぽ的なＳｉ麻円内投与望ましい、
投与葺は庇１社の匝笛、大きさ、症状及び投与方法によ
り異なるが通常１回当りｌＸｌ０’〜ｌＸｌ０’単位／
ｋｇ、好ましくはｌＸｌ０”〜ｌＸｌ０’ｌｔ’−位／
ｋｇである。 以下に実施例を挙げて更に１体的に説明するが、本発明
はこれらにより限定されるものではない。 実施例 １．１！リペプチドＣ１ｌの生産 ポリペプチドＣＩ］生産用の形質発現ベクターとしてｔ
ｒｐプロモーター及びＳＤ配列の下流にＣ；１姶コドン
（ＡＴＧ　）に続いてポリペプチド〔！］をフードする
ＤＮＡ　（終止ニド／を含む）を結合し、これをプラス
ミドＰ［１Ｒ３２２にトＦ人したＩ１１７４換え体プラ
スミドｐＨＴＲ０１を大腸菌１１１１１０１に４人し形
質転換体を得た。尚、構ミ方法の：Ｔ、細は特願昭５９
−ａｚｃｓ３ｚ明！０１　ｉｆに足任の方ｚＬに従った
。 この形質転換（ドをテトラサイクリ：’（１２，５μｇ
／ｌ）を含むＬ１１ブロス（Ｉｎ成＝１１当り、トリ１
）７１０ｇ、酵母工↑−ス５ｃ、ＮｈＣＩＩＯｃ：ｐＨ
７，５）に−夜培霞し、この培谷液を１０倍皿の改ＱＭ
９培Ｉ（！（組成”０．１％　ＮユｚｌｌｌシＯｓ　＠
１２ｔｈｏ、　０．３％Ｋｔ１２ｒ’０４゜０．０５％
　Ｎ：ＬＣｌ、　　Ｏ，１％　　ＮｌＩ４Ｃ１，２雪ｇ
／ｌ　　ビタ　ミ　〕Ｂ、。 ０．４５Ｓ力ザミノＭ、１ｍＭ　ＭＨ３Ｏ４，０，１ｍ
Ｍ　Ｃ，１ＬＣ２＝。 ０．５工プド・ン鮎、　　１２．５／ｌζ／−１テＦラ
サイクリ／）に接種し、３７℃で１１１１１間培養し、
次いでインドール−３−アクリル酸８Ｑ柊Ω度２０μｇ
／ＩＩになるように加え、更に４０？間培養を継続した
のち、ａ心分埴によりＣＨＩ体を集めた。菌体を培地容
全の１／ｌＯ容量１７）Ｏ，１％リゾチームと３０ｍＭ
　ＮａＣｊ’を含む５０ｍＭ　）リス−１−止緩衝液（
ｐＨ８，０）に懸濁させ、０℃で３０分間、■こした。 更にドライアイス／エタノール浴での凍結と３７℃での
融解を謹り以した後、ａ心分殖により°菌体５５　ｉＸ
ｉを除いた上清液をｍ　ｌｌｌ１　：ｌ：　：ｅｉ　ト
Ｌ　タ。 ２；゛リベブチド〔Ｋ〕の精製 次いで、このｆｌ′ＩｈＩ＋出液から以下に示す工程に
て、ポリペプチド［１３を精製した。 ＣＩＩＩオノ交換クロマトグラフィー］２０ｍＭ）リス
ー塩薗暖衝液（ｐｔｌ　７．１１）であらかじめ平衡化
した□ｆ：Ａ（−５ｅｐｈｚｒｏｓａ　　ＣＬ−ＧＢ（
ファルマシ７？土）のカラム（Ｓ、ＯＸ　２０ｃ電）に
、上３この粗Ｉ′１１１出戚１０：ｌＯｍ　ｌを付し、
次いで、３１の同ψ衝液でカラムを沈１１１シた後、溶
出＋８ぼの食塩０度をＯから０．３へ１１でｄ枕的に上
昇させ、流速１３３ｍ１／時で芯出した。１８出液は１
Ｏ−１ずつに分画し、各両分のし−１細ね信７活性を測
定し、活性を任する百分Ｐ、ｒ：、取した。この工程で
の活性回収率は５３ｚ。 ｆ＋７　’Ａ　Ｃ１！　ｊｆｉ”３９１３１’　アッタ
−〔調製用等電点電気詠動コ 上記の工ｔ′ｊでｉヒられた活性画分の一部３０１１を
分画分子量１０，０００の分子４０（ＹＭＩＯアミコア
社）をセフした限外−過器を用いて、脱塩後、約３１に
７二石１１シた。このＣバ１．（にを二ｌＪ製用ゲル了
丁ｕ！°ξ電気泳動に！１　した。口くＢ１のイモビラ
イアを用いて、ｐＨＳ、ＧからｐＨ１１，ｌの固定化ｐ
　Ｈ勾配をもつゲル平板（２，０！ｍＸ　ｌ（１ｃｍＸ
　ＩＱｃｍ）を作５’ｌｌ、、Ｗｉ　ＣＮｉ　１ｆｆ１
１．０１をこのゲル嘔板上にのせた。電気泳動は１５”
Ｃ，２４００Ｖｔ’、＋１１１７１ｉｉｌ　行ｑ　な−
７４’ｆａ　終了（ｕ、’ｆ　ル１Ｖ！板上のし一１細
胞傷τ活性を汀する１０のバンドに相肖する位置（ｐ’
８５．９付近）を中心にして１０ｍｍ中でゲル断片を切
り出し、オ物質を２０ｍ〜１のトリＸ　−ＩＱ　ｆｆｉ
緩南ｉＦＥ　（ｐＨ７，８）で油出した。この調製用７
１点ｍ−ｔ　７に動を３回υり返し、抽出液を巣め、限
外−２過でｉＱ　＄１７ｉ　Ｌ次いで旧ｏ−Ｇｅ１　Ｐ
−６（バイオラフトン土）のノＪラム（０，７ｘ　２５
ｃｍ）でゲル慮通し脱塩した。これをｔｙ　ｔｂポリペ
プチド［Ｉ）　とした。 このようにしてＴｎ　”Ａ　したポリペプチド〔Ｉ〕に
ついてＱ、Ｉ’（５１）Ｓ　８　ｆｆむツごリアクリル
アミドゲル電気泳動で分（バした。電気泳動後、クー？
）−・ブリリアント・ブルーで蛋白染色すると！ｎ−の
バンドを示した。また日条陣で電気、／に動を行い、泳
動後、ゲルを３１：′７ＩＩＩ　Ｇｍで切り出し、各ゲ
ルからの抽出液について、Ｌ−ん１細胞傷τ活性を測定
したｊ：ｉ果、そのｌｌ！ｌ１１の最大を示すゲル位置
は、蛋白染色バンドの位置と一致した。 このＲ？　’Ａ　Ｌ、たボリベプチードＣＩ３は１０責
ｌＩｇあたり、２ＸＩＯ’単位のＬ−Ｍ細胞傷害活性を
（「シていた。 ６７製工Ｆ？にお＋、する生物活性は、Ｈ記生物活性の
項の２残に従って行なった。１過０度はＬｏｗｒｙ法に
より測定した。 ＃”ｒ　％本明細Ｓではｊ２我の口略化のために以下の
略号−を使用した。 Ａ　　　　　７デニ７ Ｃントシン Ｇ　　　　　グアニア Ｔチミ７ へ１ユ　　　　　アラニ／ Ａｒｇ　　　　　アルギニ７ Ａｓｎ　　　　　　アスパラ↑！ン Ａｓρ　　　　　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　　　　　システィン Ｇｌｎ　　　　　　グルタミノ Ｇｌｕ　　　　　　グルタミン酸 Ｇｌｙグリ７７ ＩＩ　ｉ　！＋　　　　　ヒスチジン ｆｌｃ　　　　　　インロイシ／ Ｌｃｕ　　　　　　＋＋・ｒシｙ Ｌｙｓリジ７ ＭｃＬ　　　　　　メチオニ７ Ｐｈａ　　　　　　フェニルアラニン ＰｒｏｌＵす７ Ｓｅｔ　　　　　セリン Ｔｈｒ　　　　　　スレオニン Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　）　　リ　プ　ト　
７　ア　ンＴｙｒ　　　　　チロシ／ ＶユＩ　　　　バリン ＤＮＡ　　　　　　デ；ｆ本シリボ該酸ＳＤＳ　　　　
　ドデンルＭｅナトリウムＴ　Ｉ）　ＣＫ　　　　　Ｎ
−トシル−し−２ェニルアラニルクロａメチルケト／ 特許出願人　　大日本製桑株式会社 代　　理　　人　　　　坪　　井　　イｒｌ！９　　　
部手続補正書（ｃ′Ｉ発） 昭和６０年６月６日 特許庁良官　志　貞　　　学　殿　　　　　　　　　　
　　＼くＶニ １、７１１件の表示 昭和５９年特許願第１７２３０７号 ２発明の名称 ヒト癌壊死囚子 ３、訂正をする者 Ｉｊ【件とのｒｉＪ係　　　　１．？許出願人住所大阪
市東区道修町３丁目２５番地 名称２９１　　犬日本製晃株式会社 （（表取縛役　ｒｒ！ｉ　　原　コ′　男ｌ１代理人　
〒５６４ ｆ１所大阪府吹田市江の不可３：Ｊｉｆｉ９↓号大日本
製薬体式会社　総合研究所内 ５浦正の内容 明細、Ｉ；の「発明の：′ｒ細な説明」のＩｌｉ及び「
図面の簡ｒａｔな説明Ｊの似、　ｌＩＣ１面６浦正の内
容 （１）　第１１５４及び７２図を追加する。 （２）　　明１１　ｉ’：の茅９頁万１１〜１２行にお
いて、「・・・・１１月ｔｍ　ｉ！：にｊＬ！桟の／７
７ノ；に従って行われる。」とのＪ己桟を奮・・・・明
＄１１１　ｉ’：に足任の方ｉノ、（例えば参考例１の
）ｌ法）にＵＬって行われる。ＪとＪｒ正する。 １３１　　明＄１ｌＩＬＩ７の第２０頁表３の左冊にお
けるアミノ酸ｒ　ｌ／　２Ｃｙｓ　Ｊとの２１　社をｒ
　Ｃｙｓ　Ｊと訂正する。 Ｃ４＋　　明細１！；の第２７頁第１１行において、「
・・・・のシこ４Ｉにυｔい行った。」との記載を「・
・・・の記Ｊｊ　（′Ｉｊ考例５の方１）：）に従い行
った。」と：［正する。 （５）　　明ＩＵＩ　；Ｔ　（１）第３０頁第′１行ニ
ｊｊ　１．１　で、「・・・・明ｆ［ｌ＋、１７に２桟
の）ｉ　ｉｌに従った。」との２桟を１゛・・・・明ｔ
ｍ書に：こ桟の方Ｉに（参考例２，３の）ｉ　ｒＪ：　
）に従った。」と、訂正する。 （６）　　明ｔａｌ　：、Ｉ：の１３５頁第１行の後に
以下のｕｉｉ　桟をｔ’ｌｉ人する。 ｃｌ）ＮＡ　　　　相補１）ＮＡ １ぐＮＡす１：偵＾フ ｍ　ＲＮ　Ａ　　　　　　　（ム令ＲＮへｐｏ＋ｙ（Ａ
）ｍＲＮΔ　Ｉ：す７デニ”　ｍ　！Ｈ令ＲＮＡｄ　Ａ
　Ｔ　Ｉ）　　　　　デオ↑・ノアデ／ン／三り／ｍｄ
ｃＴＩ’　　　　　デＡ↑・ンンチン／三り／酸ｄＧＴ
Ｉ’　　　　　７’　４ｈ／グア／／／三り／酸ｄＴＴ
ｌ’　　　　　　ノ°゛（ｈ／チミ）／三す／ｌ′５オ
リゴ（（Ｉ　Ｃ）　　　＋１リゴデオキン／チ／ル配オ
リゴ（（Ｉ　Ｇ　）　　　Ａリゴデオヤ／グアニルＵオ
リゴ（ｄＴ）　　　　；ｌ　　リゴデオ士、／チミ／ル
酸−１！す（Ａ　）　　　　：＋′リアデニル酸・トリ
　（Ｕ　）　　　　　　　　　　　；ｌ′　　リ　・ン
　リ　７　ル　１隻ポリ（ｄＡ）　　　　１ゞリデオ＋
／アデニル勺ポリ（（Ｉ　Ｃ）　　　　１！すｉオキン
シチジル酸゛１！す（（Ｉ　Ｇ　）　　　　１’リゾす
午ングアニＩし酸ポリ（（ＩＴ）　　　　　＋！リゾ；
櫂↑・ンチミジル酸ＡＴ＋）　　　　　ア７’　／　／
７三す／酸Ｅ　Ｔ）Ｔ　Ａ　　　　　　　　　　　　丁
　１　し　／　ン　ア　ミ　７　　’ｉＲＩ’１ｊｌｔ
ｉ２ｋ　　Ｌ）　ｐ　　　　　　　　　　　　　　　、
、ｌ・　Ｉｌ　ｊｌｉ　人（対′ｔ）号　Ａｌｌ　　１ １１Ｆ願昭５１１−２２８７９０号に開示されている方
法（参考例、１の方法）に従って、ウサ、１！祿壊死因
子をコー）　−７−ルｙ　＋＋　−：／　化１）ＮＡ　
ヲｉ！Ｊ　タ、　コ（Ｊ）　１）ＮＡ　’；：　：Ｉ：
’Ｉ　Ｉ’ｌＪ酵、※；１ｌａｃ１１及び＋＋ｖａｌを
用いてυＪり出し、それぞれ下３３〜１２０番の８８　
ｂｐから収るＤＮＡ断片と工２８５〜５８３番の２！１
９　ｂｐから成るＤＮＡ断片’ｘ　（Ｕな、；し１限酵
１：　４ｖａ　ｌ　テ切り出した２９９　ｂｐのＤＮＡ
断片はつ４ｒギ１＋、ｚ壊死因子をコードする領域であ
り、１ｌａａ■で切り出しな８８　ｂｐの［）　Ｎ　Ａ
断片はウサギＥ壊死因子前駆体をコードする６ｎ城に相
当する部分である。 この２杯のＩ）ＮＡ断片を当１でＣ１して、ヒ）　ｌ：
４１２＋ヒ因子ＣＩ）　Ｎ　Ａの２０−ニノグのための
プローブとし、＋ｓ＋　１ｎで使用した、 ！２１　ヒ）　ｉＩｌｊ　ＦＪ　”　り’　７　ｒ−７
う）らのｍＲＮＡｌｉｌｉｉ分の中沼「 ヒ）　：１Ｉｌｉからり／酸居出化生Ｆｉｌ介ｌム液を
用いて肺″　宿マクロフ１−ジをＧ、：］Ｘ　１０’個
採取した。この肺胞？　りｕ　７１−ノ８１０１’（牛
胎児１１１１１’ｉ　Ｏｆｒｆ）　ＲＩ”ｉｌ　ｌ−１
Ｇ、＋ｏ培池に９濁さＢてベトリディフ７　：Ｌ（ｎ’
ｔ　ｉｆ：８ｃ１）に１枚当たり：）　Ｘ　１０’個と
なるように１．５き、３７℃で５＋Ａ炭酸ノｆス釡（丁
空気中、１９度９０〜＋００ンζで前項δした。１時間
の１１；１培谷の後、五／トド１−／／（大月し１１７
ｆ由来のりｌ：〕゛リリダ°プｈライトＴｒ’Ａ　（・
１．ル１τ−ルー１２−ミ　リステート−１３−アセ１
−ト）及び／り【Ｉ・＼１／ミドをそれぞれ最終ｃ度か
ＩＯμｇ／ｍｌ、　ＩＯＢハ１ノ及びＩ：ｉＩ；／ｍｌ
となるように添ノ用混和し、更にＩご１９をｉ（Ｆ杖し
た。１〜４５２１間後（通算５−５　、５１１ＩＩｌ：
：Ｉ　）　ニ１．”：　ａ　＋ｔｋ　’ｃ　”１　引除
去Ｌ、ティノ／ユ上に残ったマク（１）７−ジをＯ，Ｇ
　％う・ンａイルサルコ７ノ自費゛ｌトリ・ン１．と６
ｍ〜１クエ／配ナトリウムを含む５〜１グＹニンルチＡ
ンアネート、戊でＩｉ’ｉ解し、１．モンリ゛（ズした
。この１．モ）ネートを０１Ｍ　ｌ：ＤＴＡ　Ｃイｌ’
５．７ＮＩＩ−化ビンラム水ｌδ戚上に一１人：１し、
超Ｌ・ス心分刊！１　（Ｒ１’５２７−２　”　−９−
、Ｉコ１γ、製作所）企用い２Ｉ：　、　！ｉ　０Ｑ　
’　Ｐ　”で２０”？　（：：Ｉ　ｊｌ心し、全ＲＮ　
１画分をベレツトとしてｉ’Ｊた。これ８０．１５λ＋
　Ｎ：ＬＣｌ。 ２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ及び：！ＯｍＭ　ｌ＞　Ｄ　Ｔ
八を含む７　Ｍ　ｌｆｆ１　：ｆｒ　ｌｉの少：、；に
活解し、℃クノール沈殿としで回収した。 全ＲＮ　ＡとしてＩ５！１μｇか得られた。 この全１？ＮΔ画分をｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　４：２むｌ
ｏｍＭＴｒ　ｉ　ｓ　−１１ｃ　ＩｉＡ　＆ｉ　我（ｐ
Ｈ７，４＞（以下Ｔ［：漬という）１１に：ｒ：　Ａ７
Ｌ、６５°Ｃで５分間加ハした。これにＮユＣ１１ａ漬
を０５へ１となるように加えた後、あらかじめ０．５Ｍ
　Ｎ　ａ　ＣＩ　’：２むＴｌ：、１２で平衡化したＡ
リボ（ｄＴ）セルロースカラムに１．ｉ　Ｌ　、吸Ｃし
たｐｏｌｙ（＾）　ｍ　ＲＮ　Ａ　をＴＥ、＋にで溶出
することにより、８　ｕｙのｐｏｌｙ（＾）　ｍ　ＲＮ
　Ａ’ｒ　：ｌ　タ、コノｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮΔを１
．り　ｎ（／ｎｌのＣｅで＜７４　留水に＆ｒ　％？、
　Ｌ、　、これをアフリｈノメガエルの卵ｌ上ｔ＋１＋
ね１個当たり５０ｎ１ずつ注入し、１１；１述の方法に
従って、卵ｒ’）　ｔｉｌｌ胞中で！ｔｌ訳された蛋白
質の［、−り２９１１１１胞傷害活８１１：を測定した
。その結果、１０個の卵す籾１胞の１七）；６−ト０．
１　ｉＩ中に６．６甲１位ハＩの１占Ｉ！Ｌを認め、こ
のｐｏｌｙ（＾）　ｍ　ＲＮ　Ａユ°Ｊ製品中にヒト島
壊死因子のｍ　ＲＮへｈ（／％よれていることをＧｉｉ
′認した。 （３１ｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａの合成 １２１　Ｊｎてｉ）られたｐｏｌｙ（：へ）　ｍ　ＲＮ
　Ａをυｉへ１としてグブラー（（：ｕｂｌｃｒ）らの
ブｉ　ｉｒ：［Ｇｃｒ＋ａ、２５．２１；：１（１！ｌ
Ｌ’ｌ）］にｆＺ、てｃｌ）ＮＡ＋合１＋Ｗ　シｆ、、
　。 反応液丘：、ＬＯｔｔ１ ５０ｍへＩ　　Ｔｒ　　ｉ　　ｓ　　−１１ＣＩｉ？＞
　　ｉＩｉ　　：Ｉｉ　　（ｐＨ８，：］）；　　１０
０ｍＭ　％ＩＩＴＣＩ＝：１０ｍＭ）チ５櫂“友レイト
ール：　ｔＩｍＭピｉ　ｒ、Ｘ　７　ｚ−ト　す　ト　
リ　ラム　：　　１．２５ｍへＩ　ｄＧＴＰ、　　ｄへ
Ｔｒ’、　　ｄＴＴＰ：０．５ｍＭ　ｄｃＴＩ”：１１
．ＩＧ７μｓＩ　ａ　−”Ｉ’−ｄｃＴＰ（比活性３０
００Ｃｉハ嘗ｏｌａ）：　　・１　μＳ：Ａ　　リ　フ
゛ＣｄＴ＞＋：〜＋ｓ；　　Ｇ　　ｔｔｇｐｏｌｙ（八
）ｍ　ＲＮＡ；　１２０１１１１．’／　ｌ−リ廿Ｕ　
ＰＩＩｉｆｆ１病ウィルス山来ｄ転写へｒ　：４’ｉ　
ａ じ°Ｃで３０分間反応さけｋ　Ｌ＆、ＥＤＴ／〜を加え
て反応を停止１−させ、７エ／−ルークロロｒルム混液
（１：ｌ）で曲出し、その水層に菌１゛αノ°／モニウ
ムを最終濃度２．５Ｍにｒ：るように加え、エクノー／
＋、＋ニ、ｌす反ｋＪ、生＋１ｔｔ４　（’Ｉ’、ｆｌ
’１ｃＤＮＡ　−ＲＮＡＮｕｆ、ｔ：）を沈殿さ仕た。 このＩｌｊ鎖Ｃ１’）Ｎ、Ａ−１２ＮＡＮ合体を下記１
１１成の反応１．妥南我１００Ｉｚノに：Ｆｉ　Ｆ１７
した。 反ｉ　！、’；、　ｉｔ　１１　ＩＩＩ成゛２０ｍＭ　
Ｔｒ　ｉ　Ｓ−１１Ｃｌｉ、ｃ　ｉｔ　、ｅｉ　（ｐＨ
７，５）　：　５　ｍＭ　Ｎ＋Ｈｒｃ　ｌ＝：ＩＯｍへ
４（ＮＩＬ）２．’；ＯＨ：ｌ００ｍへ４ＫＣｉ：Ｏ，
１５ｍＭβ−二）チ／アミド　アｊ″二／　ノスクレオ
ヂド：　５０ｕｙ／ｍ＋・ン／面１１゛−γルフ゛ミ７
　；　４０＋ｚＭ　（ＩＧＴＩ’、　（ｌＡＴ＋’、　
＋ＩＴＴＩ’。 （ＩＣＴＩ’　：　０．！Ｉずｌｊ　Ｉ＋７大腸１゛ｉ
１すＩでヌクレアーゼＩＩ　：　２１！Ｆ荀大腸菌ＤＮ
Ａ；＋！リメラーゼＩ。 １２°Ｃで６０分間、続いて２２℃で６０分間反応させ
た後、　Ｅｒ）ＴＡを加えて反応を１’７　＋１：させ
、上Ｊこと同＋、Ｋに７エ／−ルークロａ１．ルムｔｕ
　ｔｅ＜で抽出し、エフフールにより沈殿させて二車５
ＩｉｃＤＮΔ・２得た。 （４）Ａ　リボ（ｄＣ）テール１ｒ加ｃＤＮＡのユ１裂
（３）　Ｊｌｌで得られた二重鎖ｃｌ）Ｎ八に次の組成
の反応ｉて出液１００μｌを加え、３７℃で３０分間反
応させ、二！ｒＬ鎖ｃ　ＤＮＡにオリゴ（ｄＣ）テール
を付加させた。 反応ば衝我。 ２　ｍＭ　ＣｏＣ＋２．０．２ｍＭジヂオスレ・イトー
ル、０１ｍへＩ　ａ−”ｒ’−ｄｃＴｒ’（比活性３　
Ｃｉ／ｇｓｏｌｅ）及びＩＯ単位クりミ・Ｊ′ルデＡキ
ンヌクレオチジルトラ／スフェシーセをＣ（１゛する１
００ｍへ１ノノコンル酌ナトリ・ンム（ｐＨ７，２）。 反紀、はＩ：ＤＴＡ／に６液をｌＳ加して（＋７市させ
、フェノール−クロｏ　：Ｆ、ルム混液で抽出し、オリ
ゴ（ｄＣ）テール１ｒ加ｃＤＮΔをエク／−ルにより沈
殿させ回収した。１−れ丁・１０ｍへ＋　Ｔ　ｒ　ｉ　
Ｃ−１１Ｃｌｉ、！；　山：ｌｋ　（ｐＨ？、ｔ＞。 １ｍへ１１：Ｉ）ＴＡ及び１００ｍＭ　ＮａＣＩを含む
水Ｌ７ｊ　＋１Ｍに１１１当たり２ｔＨｔの（リボ（ｄ
Ｃ）テール付ノアｒｌｃＤＮΔをＣむように！；ｉ　Ｒ
Ｉした。 ６）オリゴ（ｄＧ）ｔ−ル付加プラスミドｐ口Ｒ３２２
ＤＮＡ　　の　ユ°１５フ ２０ｍ〜Ｉ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−１１Ｃ１ｉＪ２　ｉｆｉ
　ＩＩ！ｉ　（ｐｌ！７．４＞、１０ｍＭ　ＭＨＣｌｚ
。 ５０ｍＭ　（ＮＩ＋４）　２ｓＯａ及び１１当たり０．
１鴫のつ／血Ｔｒｉ　７　ルゾミ／ヲ含む水ｉＢ　ｉｆ
　１００μｉ＋ニＩ）ＩＩＲ３２２ヲ１０μｇ溶Ａ子し
、ル１限酵＋＋；ｒ’ｓｔ１工／ドヌクレアーゼ１５１
１、位を加え、３７°ＣでＩ　ｎ！ｊ間反応させた１反
応終了後、反応液を７、ノールーフ０ｃＩホルム混液で
曲出し、水Ａ号から１クノール沈殿によってＤＮＡを回
収した。得られたＩ）　Ｎ　Ａを前述のオリゴ（ｄＣ）
テールトを加に用イタ水ｔｒｉ　４　（ｒ’！　シ”Ｐ
　−ｄｃＴｒ’）代ｈ　リニ’ＩＩ−ｄＧＴ＋’を含む
）２００μｌに溶４７　Ｌ、クーミナルデオ＋／ヌクレ
１チンルトラ／スフェラーゼ８０１１’１位を用いて３
７°Ｃで２０分間反紀：させ、’１．ＪＩＯ〜１５個の
ｄＧ残基を取り込りせた６反（液を７８／−ルークロｏ
　′１．ルムーｌシ液で抽出し、水居からエタノール沈
殿によってオリゴ（ｄＣ）テール（、Ｆ加プラスミドｐ
ＢＲ３２２ＤＮＡを回収した。これをオリゴ（ｄＣ）テ
ール１ｒｃｌ）ＮＡ＋７）揚台と同様の４所液に１１当
たり２０Ｆｇのオリゴ（ｄＧ）テール（４加プラスミド
ｐｔｌＲ３２２ＤＮＡをＣむように溶解した。 ｉｌｌ；ｌ　、ｉｌｌろ換え体プラスミドの作製＋４１
１１Ｉで社）られたオリゴ（ｄＣ）テール（重加ｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａ　ｔｒｉ、山１２０μＩを、！５］　ＪＪＩで
得られたオリゴ（ｄｃ）テール１ｒ加ｐｎ１２３２２　
ＤＮＡ　ｉ８　、＆　１２０μＩト；１２合し、Ｇ５°
Ｃｔ’５分間、５７°Ｃで１２０分間インキュベートし
てアニーリ／グを行い、組み換え体プラスミド溶液を調
製した。 １７）形質転換体の逆捩 （６＋　ｓｒ＋で１１１られた組み換え体プラスミド溶
液を用イ、　Ｅ、ｃｏｌｉ　χ１７７６株を形質転換さ
仕た。即ち、１：、ｃｏｌｉχ１７７Ｇ株を、ノアミノ
ピメリン酸１００μＨ／ｍｌ及びチミン７↓０μｇ／ｌ
をｈ「ったＬ−プロス２０１中。 ３７°Ｃで吸光度（（ｉｏ［１ｎ■）が０，５となる丈
で培δし、菌体を１１°Ｃで一部して臭め、５０ｍＭ　
Ｃ、Ｌｃ　ｌ　２：Ｈイｉ’ｌｏｍｉ＼４Ｔｒｉｓ−Ｉ
ＩＣ１１２：耐液（ｐｌ！７．３）　Ｉｏｌｌに分散し
、４℃で再度ｄ心してｉ：ｌ：　ｋ）さけた、集めた１
■体を同じ１工衝液２鳳１にう）敗し、０°Ｃで５分１
：１靜古した。このう）散＋ｌｋ０．２ｍｌに（６１項
で１１Ｆられな組み換え体プラスミド溶液０．１　ｍｌ
を添加混合し、０℃で１５分間Ｉ静題し。 更に４２°Ｃで２分間保（°ｌした後、府の１ご谷で用
いたノド同一１；し戊のＬ−ブａス０．５　Ｎを加えて
Ｉ　”ｒ　！”１賑１１］培香を行った。この培δ液の
一部を取り、ｎ；１゜述の成分の仙にラトラサイクリ７
１５μｇ／ｍｌを介むＬ−ブロス寒天８１′仮に広げ、
３７°ＣでｖＪ１２１７間ｌ８ｉ１１−し、１トラづ・
イクリノｆｉＪ性−を逆捩してｃＤＮＡライブラリーを
作製した。 （８）りＩＪ−ニノグ （７１ＪｊＴでｉ−１られたｃＤＮＡライブラリーにつ
いて、ヒト癌壊死因了をコードするｃＤＮＡを含むプラ
スミドをｒｌｔつ形り’ｔ’　ｉｌｌ　Ｌ’９体をスク
リー二／グするため、ｆｌ）８°ｌで得られたつづ１！
癌壊死囚子をフードするＤＮＡの制限酵謹：＾ｖａｌで
切り出した断片（２！１１９　ｂｐ）の”Ｐ　ｒ！：１
ｔｉｌｌをプ１ノ−ブとし、コロニー・バイア’　ＩＪ
グイＣ−７，ン試験をハナハノ（ｌｌａｎユｈａｎ）ら
の方１ノ：　［Ｇｃｎｃ、　１０．ｆｉｌ（ｌｊ１１１
０）］に従ッて行った。、％Ｊ２ｎ個のコＩ７二−から
、この（ゴ！１プローブとｆｉ　＜　Ｊ、’ｉ合する１
５入（配列をＣむ第１１み換え体プラスミドをｔ′ｔつ
Ｉじ７１転換体ｉ３夕（を遥び出した。 更に、こり４３個のコロニーについて、　：ｔｑ限酵；
＋１１１ａｃ［＋で切り出した９サギにグ壊死囚子フー
ド領域の上流に相当するｌ）Ｎ　Ａ断片（８８ｂｐ）の
１′Ｐ標識物をプローブとし、二次スクリー二／グを行
い、このプｌｆｆ−ブと・浄＜ハイブリダイズする６個
のコロニーを選び出した。この２回のスクリー二／グに
より、つ４Ｊ１！硼壊死因子をコードするＤＮＡＩｕＪ
λ配シ１１及びその上７友部分と相同性の高い４拭配列
をｂむＤＮＡを１１Ｊだ。 （’）ｌ　Ｉｌ、Ｓ丁１発現 （８）項でとばれた６個のプローブ（プラスミド番号ｐ
ＨＴＮＦ−１，−ｄ、　−５，−１３、−２２，−２Ｇ
　）から、それぞれのＭｌみ換え体プラスミドを取り出
し、Ｅ、ｃｏｌｉ１１旧０１　ｔ！を１・１主として形
質転換体を得た。それぞれの１し暦転換体について、ナ
ガク（ＮａＣｌ（為）らの方法［Ｎａｔｕｒａ４Ｒ４，
：ＪＩＧ（１９８０＞］にべＩｒじて５（ｌａＮ：ｉ！
ｔを行（うた、培地にはＬｕブロスを用いた。＠光度（
ＧＯＯｎｍ）かＷ、ＪＯ，Ｒニｒ、；るして培養し、Ｗ
Ｉ　３−５　Ｘ　１０”　＆４の１１１体を集めた。０
．１％リゾチームを含む５０ｍ〜ＩＴｒｉＳ−１１ＣＨ
Ｃｔｒｉ　；ｌ＋ｔ（ｐＨ＋！、０）と１０ｍＡ＋　Ｎ
ａＣ＋より成る溶液のｌ■１に１°ｉ’ｉ（トを９濁さ
せ、氷水中で３０分間１つ５ニした後、凍Ｌ’ｉ　ｉａ
　Ａ７を〔；回禄返して菌体−＆：破壊し、遠心分殖し
て１１゛Ｉ体曲出液を得た。それぞれの形質転換体から
１１ｉられた抽出液について、Ｌ−０２！１３細胞傷τ
活性を測定した結果、プラスミドＰ１１７ＮＦ　−１３
による１１５青転公休の抽出液にＩ　８０　、　＋　１
１１位１１の活性を認めた。 Ｏｌり１．１−７化１）Ｎへの塩Ｊλ配列の決定（９）
項で選択された組み換え体プラスミドＰ　Ｉ−Ｉ　Ｔ　
Ｎ　Ｆ−＋３による＋１５　’：　ｆｒ：換体をＬｎプ
ａスで培養してｎ体を得た。この１゛ｖ体をウィルキー
（’＃１ｌｋｉＧ）らの方１ノ４［Ｎｕｃｌｃｉｃ＾ｔ
：１ｄｓ　Ｒｃｓ、、７．８５！ＩＩ（１９７９）］に
従、て処Ｆｌ！　Ｌ、シン、人ミド１）ＮＡ　’？：　
ｉ！また。このプラスミド１）　Ｎ　Ａを；Ｌｌｌ　ｌ
ｔＪ酊、４，１瞥ｓｔ［で分月子し、分’ｔｌ　ｔｒｉ
　ｒＪしてりｕ−７化１）ＮＡをｉ−μた。このり【Ｉ
−ノ化ＤＮＡ断片を種々の制限前、＋：で分解し、Ｈｃ
　Ｊ・Ｋの制限酵、７ｃ：斯片について、そｔＬぞれの
塩ノ、（配列をマキサム−１′ルパート（＋Ｊａｘ＋１
ｓ−Ｇｉｌｂｃｒｔ）７Ｊ：により脱り／酸化、″Ｐに
よる末端漂識、塩ＩＡ持異ｒＪ化ζ２分Ｍ’１反応、ゲ
ル市気詠動及びオートラジオグラフィーを行い決定した
。 その塩Ｊ、（配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミ
／醇配ツ１１は表１の通りである。ヒトＥ壊死囚了の１
！リベプー１−ドをコードする領域は、表４に示したつ
Ｉｒ１コ炙・５１力死因子をフードする塩基配列との＋
ＩＩ　＋；１１　ＩｌｌにＪ、（づいてＩｌｌ定した。 即ち、ヒト路壊死囚ｒポリペプチドは、表１の茅２３５
〜２３７番のＴＣＡのニド７（Ｓｃｒに対応）から始ま
り、第０９７〜Ｇ０９番のＣＴＧ　（Ｌｃｕに対応）で
終わり、１５５残バのアミノ酸から成っている。Ｃ末端
のロイシンのコトノに続いてＴＧＡの終止ニド／がある
。塩基配列ｉ１〜２３４ＭはヒトＥ壊死因子の前駆体を
コードするために必°ムな配タリと考えられる。 参考例２ （１）ヒト厚！大死因子をフードするＩ）　Ｎ　Ａのユ
’１５’Ｊ特願昭５９−４３Ｇ１７号１す目１１１；Ｉ
７に開示された方法（芯７例１！のｌｊ法）に従って得
た。ヒトｆｆｌ＋＃死因子前駆体をコート−４るＩ）Ｎ
Ａを組ろゐんだｔｌｌみ換え体プラスミド１）ＩＩＴＮ
Ｆ　−１３により形７１転換させたＥ、ｃｏｌｉ１１旧
０１からＩｉまたプラスミドＤＮＡから、；Ｌり限へＦ
　、’（’ｉ　Ｉ’ｓｔＩで七トＥ壊死因子ｆｉｒ駆体
をコートする領域を会むりＵ−７化１）ＮＡを切り出し
、更に非し！訳領域の一部を制限八ツ、÷ニド”ＣＯド
ｒで分解し、約１．１　ｋｂｐの断片をｉ′、Ｊた。こ
れをプラスミドｐ　ＩＩ　Ｒ３２２のｌ’５ｔｌ−Ｅｃ
ｏＲｒＫＩｉ片（約：１．ｌ；　ｋｔ＋ｐ）に、ｔｌｌ
み込むことによりμｍ９　ｒ＋　−＝　：／グし、この
ブうスミド全ｐＨＴ１　＋３と名づけだ。 ＩｃプＩＪモーター　ベクターｐＤＲ５４０ＣＲｕ５ｓ
ｅｌｌ。 Ｄ、Ｒ，、ａｔ　ａｌ、、Ｇｔ：ｎｃ、２０，２３１（
１４１８２）：　ｒ’−Ｌバイオケミ１ｉ　ルスン１：
　（Ａ：　１１１）　、ｋ　’）　ＡＭ人］　ｔｖ　３
００　ｕ　（Ｈニ：ｌ；’Ｉ　ｒｕ　ｈＰ　Ｊ：Ｅｃｏ
ＲＩ　（４８００’Ｆ、　！１°７．　）及び口ａｉｌ
ｌ　Ｉ　（２０００１’−位）を含む２ｍｌの反応ｒｔ
　ｔｒｉ　：ｌＶ　［ｌ０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−１１Ｃ
Ｉ　’Ｑｉ衝岐（ｐＨ７，５）、　５０＋ｎＭ　ＮａＣ
ｌ　、　６ｍＭ〜１ｇＣＩｚ、　Ｇ　ｍ〜１２−メル／
Ｊプトエク／−ル］を加え、３７°Ｃで６０分間反応さ
せた−　４Ｙ　ｋａ　ＩＱ：　Ｏ，：１ん１になるよう
にＮユＣ１を加え、史に２倍簀のエタノールを加え、　
ＤＮ、Ｎｌｆｌｉ片をエタノール、：ｔ）Ｃ＞とじて回
収した＃５％Ｉ′リアクリルアミドゲル、Ｕ気泳切によ
りＬａｃプ「Ｊそ一クー領域を２　ｔ；　３８１ｂｐ（
Ｄ断片を約８．３ｆｆ　Ｉ？　＋５　だ、　ｔ：　）Ｉ
）ＮＡ　ｌｆｉ　片に、トリｌスフルｌノ、で化−；；
：合成した、開始ニドノ、ＡＴＧとヒト厚壊死囚子（１
が逓田伝子の一部を含み、・との両ル゛Ｊがそれぞれ；
Ｌり限酵Ａ’；　ｌｌａｍｌｌｊとｒｌｖａＥの認、＝
配ツリをｆ「する、次の式 ％式％ で示されるオリゴヌクレオヂド　アダプターをＴＡＤＮ
Ａ’７ガーゼを用いて結合させた。ここに得られたＤ　
Ｎ　Ａ断片を、以下ｔａｃプロモーター・アダプター１
「１１という。 −）＋１第（１）項でｔＵたヒト分、５１力死因子をコ
ードする１）ＮＡの組み込まれたプラスミドｐＨＴＩＩ
：１の３００Ｈ１ｇに、制限酵、Ｑ　１ｉｉｎｄｌｌ＋
　（＋２００中侍）七２＼ｖａＩ　（１２００中荀）を
」二足と同じ反応暖南液中で３７°Ｃ，ＣＯ分間１′１
川させた後、Ｉ）　Ｎ　Ａ断片をエタノール沈殿として
回収した。５％ポリアクリルアミドゲル、Ｌ気ｂｉ　９
により、ヒト旅Ｉガル因子の翻訳領域の大部分を舎む５
１Ｒｂ（＋０）　ＤＮＡ１り（ＩＸ（以）’ＩＩＴＮＩ
’町片という）を分ＩＩ精製し、約２１Ｚ　Ｉ：　ｉす
た。 別δに、ブプスミ　Ｖ　ｐＨＲ３２２の５０μｇに制限
ｊ？、＋；　　月二ｄ１１（１：！１１０甲１＋７）　
　としｃｏＲＩ　（２５００弔位）を」二二こト同シ反
応ｔ、Ｑ　ｉ＋＋　＋１１７　中テ：＋７°Ｃ、１２０
’ｔ＞　Ｉｉｌ　作ＩＩＩ　サＱ　Ｉ’、：後、エタノ
ール沈殿させ、次いで０．７％低融点アガロースゲル１
１ン気泳動により、ア／ピシリ／耐性ｌＯ伝Ｙ４：含む
６＜１４．１ｋｂｐのＤ　Ｎ　Ａ断片（以下９口Ｒ３２
２−Ａｍｐ’断片という）を１１’ＪｌＯμｇ得た。 ｐ［３Ｒ３２２−へｎｌｐ’断片ｆ３ｕｇとＨＴＮＦ断
片１ｕ、７を６．６ｍ〜ＩＭｒｒＣＩｚを倉ｒ「する６
６ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣＩ　ｉｎｎ液液ｐ１１
？、ｆｌ）に１８外１し、５５“Ｃで１０分間ツノ■二
した後、Ｕ　二で１０分間１＆　Ｗ’；　シ、次いでＩ
ｍ〜１八Ｔｒ’、　ＩＯｍＮ＋　７チｔ　ｙ、　レイ）
　−１１／　（ｉ（Ｃ下ニＴａ　ＤＮＡ　’Ｉ　！ｆ−
セ１６ｇｊＩｔｆひを１６加し、２２°Ｃで１２０分間
反応させた後、フェノール抽出によりＩ）ＮＡ　’ｘ’
Ｊｔｌｕ　ｇを回収した。 このＤＮＡｌｌｌ１片ｎ、ＲｔｔＩｒとｔａｃプロそ一
クー・アダプター用１片０．：ｌ　Ｉｌｌ！を」、記と
同様の反応ミ件（４（’１し、Ｔａ　Ｉ）ＮＡリノｆ−
ゼは１；３単位用いる）で２２°Ｃ９１２０分間反ｋ、
させた後、蒸留水でｂ　Ｌ’ｉ　／ｉ＋釈し、ド記Ｒｕ
５ｓｅｌｌ、Ｄ、Ｒ，，ｅｔ　ａｌ、、Ｇｃｎｅ、２０
．２３［１１８２）］（１’−Ｌバイオケミカルス社よ
り閘人）を）容ｒｌｔ　ｉＨｉ加した。 これを氷水中で２０分間、↓２″Ｃで１分間、亨温で１
０分間イノキュベートした後、しログ【Ｊスを加え、；
１７°Ｃで６０分間振！ｆ；ｌ　した、その１■体９濁
液の一部を２５　ｔｔ　ｙ　／　＊　ｌのア／ビ／リノ
を含むＬ口寒天乎仮に１．Ｓご、３７°Ｃで一佼培ｉ？
シた後、ア／ピ／す／耐性株をピリジして形７１転換体
を得た。ここでｉ【ｌたヒト銘Ｉ力死因子生ｉｒ用形負
発現グラスミドｔ　ｐｕｒｒ２６、そＩＬ　ニよるＪ　
＋、＋　Ｉ　０３株の形質転換体をＥ、ｃｏｌｉ　ＪＡ
Ｉ１０３／ｐＨＴＴ２６と名づけだ。 ）ｃｏｌｉ　Ｊへ１１０コ（のカル／ラム処Ｉ’ｌ！　
ｉ）２は次の通りであ’＋、、ＪｒＩＩＩ０１体を１．
ブ「＋　Ｘ　（Ａｌ１成　Ｉｆｆ当タリ、ト　　リ　ゾ
　ト　７１０１：、　　　酵　１・上　工　↑・　ス　
５　　Ｉ：、　　　ＮａＣ１５ｇ。 ブト・ン１．’？　Ｉ　、、　；　ｐＨ７，２）の５１
に［と（・トし、３７°Ｃで一イン培谷した。その１７
１体９濁、臣の１＠１を１００１の１、〕゛１１スに■
（・トシ、濁度（吸光ばＩｉ５＋）ｎｍ）か０．０にな
るよで３７°ＣでＩｊτ６した。氷水中て；１０分間、
９．７１′後、！１′１体を遠心分ンＩＩにより集め、
これ８５０Ｈの５０　ｍ　ＮｊＣユＣ１２にセ濁し、０
°Ｃで６０分間５＞　ｕｌ　Ｌ／た。欠いで、α心分離
により菌体を果め、２０％ゲリセリ／をＣむ５０ｍ〜ｌ
ＣａＣｌ２の１０１に再１濁し、これ・９メＪルノウム
処ＰＩ！　）’、、ｃｏｌ　ｉ　ＪＮＩＯ：ｌとした。 （３）非融合へ１ヒト１：’　１４死因子の生Ｉ′ｒｚ
　（２１ｓｎてｉ：ｌた１じ賃耘換Ｃ本Ｅ、ｃｏｌ；　
Ｊ＋、ｌｌ１ｌｌ／　ｐＨＴＴ２ＧをＬ　１１ブ「１４
中；１７°Ｃで一夜系旧培谷した。その１・１体９濁、
１′ｔの（１，！’１　ｔ１勺５１の＋１０ブ（１］に
【ζＦｌｊ　シ、３７°Ｃでｌ　１ｌｌｒ　ｌ１ｉｌ　
’８　Ａ　ｌ、’ｊ％　ｉｌｊ　Ｃｌ　ｍへ１になるよ
うに（ｌプＩ＋ピル−β−Ｄ−チＡガラクトピー／／　
／Ｙ％、ム加し、更に、１時間給へした。菌体をα心外
：ｔｔにより集めｉ先ン子したｉｕ、ｏ、１％リゾチー
ムを含む５０ｍ１〜．ＩＴｒｉｓ−１１ＣＩＣｔｔｒｉ
１１’＜（ｌｌｌｌａ、ｏ＞−３０ｍＭさＪａＣＩ、ｌ
！ｊの１１１に再Ｃご濁し、　＋１　’Ｃ：で；１０分
間１１９イした後、ドライアイ７／エタ／−ル、？−で
の凍結と３７°Ｃてのｒ’４　Ｆ＋？、　’−：　０色
１ｆｉモリ１シした。次いで、ａ６分；ｔＩにより［°
１１体浅７．゛。 を除き、１ＩＩＩｌσｔ、ζｌ’、　ｉ１’ｌ　＋ｌｋ
を１１１な。 コノ上ｊｉ’＋’　ｆｌｙ　中Ｊ）　ヒ）　ＩＡ＜　Ｉ
大死因７’　ｚＪｒ　ｌ’ｌ　（Ｌ−０２：１細胞傷’
ｌ’ｉ　＋＋ζ１゛１）は！Ｌ！ＩＸ　１０’中！台／
３１であった。 ２　之　Ｃ９１３ ニブＣ１（−−クーをｎｌいて、ヒト厚ＩＪ死因子生ｉ
ｒ用１に　ｒτ９．現プラスミドそり・’ｔミした。１
．’ＩＩν酵素によるν）断及びＴ　、＋　Ｄ　Ｎ　Ａ
リガーゼによる結合の反応条件は、２ク例２の下（２項
とほぼ同じである。 （１）ニブ【１そ一り−ｆ１°き形質発現プラスミドρ
）ＩＴＲ９１の６１下（プ１及び２図参ｌｉｄ　）参考
例２の第（１１項で得たプラスミドｐｔｌＴＩＩ３に制
限酵Ｑ：＾ｖａｌと５ａｌｒをｆ乍用させることにより
、３Ｉ・【のＤＮｒへ断片（それぞれ約０．８ｋｂｐ、
　１．：］ｋｂｐ及び２．６ｋｂｐ）が生じた。これら
の断片のうち１、ヒトＩＬ：５ｉ大死因子をコードする
領域の大部分とプラスミドｐ　１１　Ｒ３２２のテトラ
サイクリン耐性旧伝子の一部を２ム’ｆＪｉ３ｋｂｐｆ
）　ＤＮＡ’Ｅｒ片’Ｅ：分子：ｔｔ＋？’ＡＬ、　タ
、　コ０）Ｋｉｔｌｉに、次の式 で示される合Ｉ戊オリゴヌクレオチト　アゲ１クー’：
　Ｔａ　Ｉ）ＮΔリガーゼを用いて１，１１合させた。 ここに１１工られたＤＮＡ断片を、以下１１７Ｎ＋−’
−アグプクー断片という（第１Ｌイｌ　’Ｇ　１１・Ｉ
）。 一方、土プｌＩｒニークー　ペクタ−ｐ　ｌ）　Ｒ７２
０（Ｒｕｓｓｃｌｌ、Ｄ、Ｒ，、＋・＋　ｈｌ、、Ｇａ
ｎｃ、２０．２３＋（１りＪ１２）；　Ｉ’−Ｊ、パイ
ＡケミノＪルス７１よりル°・１人］に；閾限酊素Ｅｃ
ｏＲＥと１ｌｐａｌを作１１１さ１１、ユプロモーター
６ｎ域の一部を含ｔｊ　１）ＮＡ　！＋ｉハ（：ｌＳＬ
＋Ｐ）　ヲ’Ｊｊり出し、コレニ次ノ式％式％ で示される合１戊４リゴヌクレオヂド　アグプクーをＴ
４１）ＮＡリノｔ　−ヒを用いて結合させた。ここに１
１１られたＤＮＡｌｌｉ　Ｉ″ｌを、以下ｔｒｐプｏ　
（−一ター断片という。 別δに、プラスミドｐ　Ｉｌ＜　３２２に制限耐滑Ｅｃ
ｏＲ１と５ａｌｒを作用させ、大きなＤＮＡ断片＜１７
３．７ｋｂｐンをｖｌり出した。これに、先に調製した
ｌｉＴ＞ＩＦ−アグプクーガｃ片とｔｒｐブ（Ｊそ一ク
ー断片をＴ　４Ｄ　Ｎ　Ａリガーピを用いて１，１５合
さ仕、ヒトＥ壊死囚子完視プラスニドをＩＭ？黛し、参
考イタ１２の范■Ｉｆｆと同様にして形７１転換体をｉ
ｔＩだ、（口し、宿主として　Ｅ、ｃｏｌｌｌｌｏｌｏ
ｌを用い、形７１転換体のと択はテトラすイクリ７　（
１２，５／ｌｌ：　／ｍｌ）　５目！Ｉで行った。ここ
でｉすたｊじ７１発便シラスミドをｐＨＴｌン０１．そ
れに上るｊじ質転換（トをＥ、ｃｏｌ；　Ｉｌ［１ＩＯ
Ｉ／　ｐＨＴｌ２Ｏ１と名づけな。 第２図は月！、プロそ一クー（＝ｒき形質発現ゲラスミ
ｙ　ｐＨＴＲ０Ｉの描王工程を示す。 （以下余白） Ｉｊ　ｙＪ’　ｌ！／ｌ　ｔＩ （１）つ（ｒ１′シ１−飽マク１７７７−ンからのｍＲ
ごＩＡ分画の＋ｒ′、繋１１＋’ｉ　”Ａ つＪ１’　Ｉ　ｌトー１’ｉ約２．５ｈｇ）にブＵピオ
二／Ｍ　りｆ　ＩＪウム　アクネス（１’ｒｏｐｉｏｎ
ｉｂａｃｔｃｒＩｕｓ　ａｃｎｃｓ）死菌体を１羽当り
１００昨の投与作で靜脈内にＩ上人し、８日後に屠殺し
た。直ちにじ：１胸気Ｓ切開し、気π内ニｒ・Ｆ人しタ
チ、−プヲｆｒ　Ｌ　テ’）　：’　Ｉ′ｉ２　ｉｆ　
Ｊｌ　化生Ｆ！！　Ｉｊ塩、１に８用い１ψ、゛へ、庁
をｉｆ返し、肺胞マクロファー７を採取しｔこ、　１２
月の・ンづ１ごよりＦｔ３ｘ＋Ｏ’作°シのＲ小胞７り
【」フ、−）が得られた。この肺胞マク【Ｊファ−’）
　’ｒ　１ｏｓｓ　牛脂’Ｊｌ！　Ｉ［ｌｌ　＋＋’＋
含ｒｒ　（Ｄ　ＲＰＭ　Ｉ　−Ｉ　Ｇ　４０１Ｆ’、　
４１３４に？濁させてベトリディブンユ（直径８ｃ、）
に１枚当り２　Ｘ　１０７個となるように１番き、３７
°Ｃで５％１Ａｆ６ガス介仔／！−１気中、ｌυ度ΩＯ
−１００％　’ｉ：’　ｊｒ（’　１９６　した　ｌ　
［１！ｆ間の前’＋’Ｘ１９の後、工／ドトキ／／（大
腸Ｉ￥１山来のり１で１′リーリフカライド）、　　Ｔ
Ｉ’Ａ　（＋＋ル）で−ルー１２−ミ　リス１−トー１
３−アセＴ−ト）及びンク「オ・＼側ンミトクそれぞれ
Ｑ今γシ度がｌ０１１ｇ／ｚｌ。 ｌ０ｎ（Ｈ／ｍｌ及びＩ＃ｇ／ｓｒとなるように７公ツ
ノＩｆ　ｉ１シ１１シ、史に倍長を北枕した。↓〜４　
、５１１！ｊ間後（’ｍ　’５７５〜５．５Ｊ′１間）
　ニ１：５Ｉｓｉ＆　＠　吸引Ｄ　去Ｌ　、　７’　／
　フｌｘ　−１：　ニｉＭ　ッたマクロ７７−ンを０．
６にラウロイｌレナルコン／配り゛　ト　リ　・７　ム
　と　６　ｍ〜１り　エ　ン酸り゛　ト　リ　ウ　ムを
含ｆｒする５Ｍグアニジルヂオシアネート１夜で溶解し
、ｉそ／す“イズした。この、１．モンネートをＯ，Ｉ
Ｍ　ＥＤＴ八含へｆ　５．７　Ｍ塩化セシウム水＋８．
Ｏｉ上にｉｔ層し、超遠心分子ｉｔ　Ｇｌ　（ＲＩ’５
２７−２ｏ−ター、日立製作所）ヲ用い２Ｇ、５００ｒ
ｐ礪で２０時間遠心し全ＲＮＡ画分をベレットとしてｉ
；−た、これを０．３５Ｍ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　Ｔｒ
　ｉ　ｓ及び２０ｍＭ　ＥＤＴＡＪｃ含む７Ｍ尿素液の
少量に溶解し、エタノール沈殿として回収した。１２羽
のウサドより全ＲＮＡとして５．２鴫が得られ売。 この全ＲＮＡ画分を１　ｍＭ　ＥＣＴ八を含むｌ０ｍＭ
　Ｔｒ　ｉ　ｓ−！ＩＣＢ、ｔ：衝、［ｋ（ＰＩ１７．
４）　（攻ＴＴＥ液という）２１に１１．解し、６５°
Ｃで５分間加熱した。これにＮａＣｌ溶液８１１．５Ｎ
ｌとなるように加えた後、あらかじめ０　、５　ＭＮａ
ＣｌをＯむＴＩ：液で平谷？化した；４゛リゴ（ｄＴ）
セルｒｔ　−スメＪラムにＩｔ　Ｌ、吸ζｉしたｐｏｌ
ｙ（＾）ｍＲＮＡ８　ＴＩＥ　Ｊで８出することにより
、３１４μｇのｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを＋Ｕだ、ここ
で得／、＝ｐｏｌｙ（＾）　ｍ　ＲＮ　Ａの２００μｇ
を７メｆロースゲル電気泳動（ゲル心度１％、６Ｎ１尿
索存在下。 ｒｌｌ４）に１４’Ｌ、’ｒの分子サイズに従、て７つ
の百分に分け、ゲルを融１！７．（７０°０．１０分間
）させた後、水飽和フ、ノールによる抽出とクロｒｆｆ
１．ル１１による抽出ののら、エタノールにより沈殿さ
せて各画分ヨｔ）　ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを回収した
。各画分のｐｏｌｙ（八）ｍ　１２　Ｎ　Ａについてア
フリカッメガエルのｌ　ｌ？）　ｔｉｌｌ　ＦＪを用い
る１ｊｌｌ：でつづ・１！厚壊死ｖ４子ｍ　ＲＮＡ量を
測定し、分子力”イズとして１．Ｇ〜２．７ｋｂに相当
する両分にウサギ路壊死囚子ｍ　ＲＮＡを四〇ばに回収
した。 この精製ｐｏｌｙ（＾）　ｍ　ＲＮへの比活性は約１．
２３０１１’−位／μ（：ＲＮＡであり、未ｆ１７製ｐ
ｏｌｙ（＾）ＩＴＩＲＮ、Ｘ調シ品の比１工ｔｉ：　Ｗ
−」３２０　Ｉｌ′Ｉ（ｉン／＋ｔｇＲＮΔに比べて約
４イｇにＣ詣１された。 ここで１１）られたＴ＋７５Ｊ　ｐｏ　Ｉｙ（＾）　ｍ
　ＲＮ　八を以下の実験に用いた。 Ｃ２１ｃＤＮＡの合成 精製ｐｏｌｙ（＾）　ｍ　１２　Ｎ　Ａ・１Ｊｇを用い
以下に示す条件でｃＤＮＡを合成した。 反（・潰ｊ、ｉ−；　＋ＯＯμ！ ５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣＨＪ　ＩＩ　ｉｌＭ
　（ｐＨ８，１）：ｌ０ｍＭ　ＭｇＣＩｔ；７０ｍＮＩ
　ＫＣＩ　：　ｌ　ｍ〜１ジチオスレイトール；　０．
５ｍＭｄＴＴ＋’、　　ｄｃＴｒ’、　　ｄＡＴＰ、　
　ｄＧＴｌ）（但しｄＣＴＰは１″Ｐで（↑１．比ｉＪ
　？１：４．４ｘ　ｌ（１’　ｃｐｓ／　ｎａｏｌｃ）
　：　３　ａｙオリゴ（ｄＴ）　＋２−＋１．８０１＋
’−位トリ骨Ｍ性ロ１０Ｉ病ウィルス山釆二乙す””；
／ＩＦＪ二ｍ １３°Ｃで９０分間反応させた後、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ水ｊ
８Ａｌで反Ｉｊ；　ＪＬ１７１Ｌさ仕た。フェノ−ルー
フａ　ｒＩ；ｉ、　ルＡ　＋ｕ　ｌ＆（１：ｌ）により
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　−ｍ　ＲＮ　Ａ　Ｎ合体°を１１＋１
出し。 Ｘ、り／−ルにより沈殿させ回収した。史に、アルカリ
加、ａ処ＰＩ！−４’ることによりｍ　Ｉｔ　ＮＡを分
Ｍ除去した後、合成された！Ｐ、Ｓｒ［ｃＤＮＡをエク
、／−ルにより沈殿させＩ！Ｉ収した。 この：ｐ、鎖ｅ　ｒ）ＮＡの沈殿を下記組成の反応緩衝
液！０μｌに溶解した。 反応４衝＋！ｋ　； ０．５ｍＭ　ｄＡＴ！’、　　ｄＴＴＩ’、　　ｄＧＴ
Ｉ’、　　ｄｃＴｒ’；　５　ｍＭ八へｃＩ□：　７０
ｍへＩ　ＫＣＩ　；　Ｉ　、５ｍＭβ−／　Ｊレカプト
工タノール；　８　Ｉｔ１　（ｅ大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼ［（ラージフラグメノト）をＣ＋（ｒする０、１Ｍ
ヘペス（Ｉｌｃｐｃｓ＞１３コ衝、１ｋ（ｐＨ６゜１１
）。 １５℃テ２０ｇＩｆ　ｌＸＸ１　反応すＱ　二ｆｆｆ　
ｊｎ　ｃ　ＤＮＡ　８合成シタ。 反応液にドデンルＷｉ　ｆｌｕｌトナ・クム水溶液を加
えて反応を’？７＋１−さＵ、二市爪ｃＤＮへを７工ノ
ールークａロ１．ルム！Ｍ　ａｖで抽出し、エク／−ル
により沈殿させ回収した。 ｊ！Ｉられた二ｔｒｉ　２ｎＣＩ）Ｎ　Ａの沈殿を、Ｓ
Ｏｍ八１へ酌り・トリク７ｉ（ｒｌｌ、１．５）、１ｍ
ＭＺｎＳＯ４，２００ｍＭＮ：ＬＣ！、０．５％グリセ
１１−ル及び３１ｙＬクレアーゼＯ、Ｓ　ｊＩｔ位をＣ
ｆ丁する水Ｉｔ１伐１０Ｏｕｔに溶解し、３７°Ｃで２
０分間反応させてヘアビア　１．？、　ＩｉＪを開裂さ
せた０反応は！ζＤＴ、〜水ｔｒｉ　ｉｔを１５ノア１
１１．てイ’ン＋Ｉ：させ、７　、　／　−ｔｋ−り（
Ｊ　ｒＪれルム混、Ｉｋで抽出し、更にエーテルで河抽
出した債、エタノールにより沈殿させｃＤＮＡを回収し
た。 （３）オリゴ（ｄＣ）プール付＋ｌ１ｌｃＤＮΔのユ１
　？Ｊ上記により得られた二重鎖ｃＤＮＡに次のｉｌＭ
成の反応’ｔ　８ｉ　＋＋に’　Ｉ　００　ｌｔ　Ｉを
加え３７℃で２０分分層；反応さくｊ。 二１ｒＩｊｎ　ｃ　Ｉ）ＮＡに〜４リイ（ｄｃ）テール
をｈ　ｊ：ｕさ仕た５反応社ζυ１液。 １ｍへ＋　ＣＯＣ１２，０，１ｍＭジチオスレイトール
、０．２μ（Ｈ：Ｉ　　リ　（＾）、　　　Ｏ，１ｍ〜
１　　’ＩＩ　　−ｄｃＴＩ’（比　ｉ舌　ｔ’ｋ　５
４００ｃｐｍ／ｐｗｏｌ）及びｌ０ＬＩ’４位ターミナ
ルデオキ／ヌクレオチ／ルトラ／ス７エラーゼを含仔す
る１３０ｍＭカフジルｍナトリウｔ−−３０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−１１ＣＩ　ｕ８ｉ、Ｉｆ（ｐＨ１’ｉ、ｌｌ）。 反応はＩ：ＤＴΔ水溶液をｌｆｉ加して停止ヒさせ、フ
エ／−ルークロロホルムｉＨ液で抽出し、更にエーテル
で再ｈｌ＋出した後、オリゴ（ｄｃ）テールは加ｃ　Ｄ
ＮＡをエク／−ルにより沈殿させ回収した。これを１０
ｎ＋Ｍ　Ｔｒ　ｉ　５−１１ＣＨｅ衝Ｌし（ｐＨ７，４
）、　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１００ｍＮ１Ｎ、ＬＣＩ
を含む水Ｍ　１ｆｆｌに１１通り０．２ｕｒｒのオリゴ
（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡを含むよ、うに溶解した。 Ｃ４ｊ　：ｔ　’Ｉ　コ（ｄＧ）　ｆ　−ルｆｒ１＋１
１プラＸ　Ｅ　ｌ’　ｐＯＲ３２２１）Ｎ、〜の　ユ゛
Ｊ　ラフ ２０ｍＮＩ　Ｔｒｉｓ−ＩＩｃｌｆｊ衝ｎ（ＰＩ＋７．
↓）、ｌ０ｍＭ　Ｍｆ：Ｃ１２゜５０ｍＬＩ　（Ｎｌ１
４）　ｚｓＯａ及び１ｍｌ当り０１．のラン血１１１ｊ
アルブミ／をＳむ水Ｄ３液１００μｌにｐｎＲ３２２を
１０μｇ溶ｌｌＩシ、Ｖｌｌｕ酵に　ｆ’ｓＬ　Ｉ　”
　７　Ｆ　Ｘ　９　し７一ゼ１５単位を加え、３７°Ｃ
でｌ　ｆｉ１７間反応させた０反応終了後、反応、ｅｔ
全７．ｌｌ−ルｈｂ出し、水層から２り／　−，１し沈
殿によってｌ）Ｎ八を回収した。得られ、たＩ）Ｎ　、
Ａを１１１述のオリゴ（ｄｃ）−３−／Ｉ／　（ｊ加に
ＩＩＩ　イｆ、、水１δ哉（＋！’ｉ、シ’Ｉ−１−　
ｄｃＴＩ’の代りに’ＩＩ　−ｄＧＴＩ’を含む）２０
０μｌにｗ＋　ＭＶ　Ｌ　、ターミリルデオキシヌクレ
オチジルトラノスフェラーゼ１１０１１ｔｌ−γを用い
て３７℃で２０分間反応させ、ル′ＪＩｏ〜＋　５１１
’４のｄＧ残Ｊ、（を取り込ませた０反心底を水飽和フ
ェノール−クロロホルム混液で抽出し、水層からエタノ
ール沈殿によってオリゴ（ｄＣ）テール（Ｊ加プラスミ
ドｐｎＩン３２２ＤＮＡを回収した。 これをＡリボ（ｄｃ）　ｆ−ル付加ｃＤＮＡの場合と同
様の暖神１戚に１會１当り２ｄｇのオリゴ（＋Ｃ）テー
ルイｒ加プラスミドｐＨＲ３２２ＤＮＡ！含むように溶
解した。 ６＋　、ｔｌ＋４換え体シラスミドの作製」リイ（ｄＣ
）　ｊ−ル１７加ｃＤＮＡｉｄ液５ｏｕｌをＡリコ（ｄ
Ｇ）−ｊ−ルｌｌ加ｐ１１Ｒ３２２ＤＮＡ溶液５Ｑｕｌ
と、２台し。 ６５°Ｃで１０分間、５７°Ｃで１２０分間、！５℃で
６０分間、：＋５°Ｃでに０分間及び゛＜：　ＩＬでＧ
Ｏ分間イノヤユヘートしてアニーリ／グを７１い、　Ｕ
ｌみ換え体プラスミド応、戊をユ’Ｊ製した。 （６）形丁１転換体の選択 上＝こで得られたＸｌ【み換え体プラスミド溶液を用い
、Ｅ、ｃｏｌｉ　１１７７６株を形質転換させた。即ち
、Ｅ、ｃｏｌｉχ１７７Ｇ株を、ノアミ　ノピメリノＭ
Ｉ００μｇ／１１及びチミンノ４０μｇ／ｌを捕ったし
一ブａス２０１１中、３７°Ｃで吸光度（ｌｌｉｏｏｎ
ｉ）が０．５となるまで培へし、菌体をｌ令却器Ｃ′４
ｄ心分汀【はで集め、５０ｍＭＣａＣ１ｚ合　仔　１０
ｍ〜Ｉ　　Ｔｒ　　ｉ　　ｓ　−１１Ｃｌｋｃ　　南＋
ｅｉ　（ｐＨ７，１）ｌＯｗｌに分散し、０°Ｃで再度
ｄ心して沈殿させた。果めた」９体を同じホ８ｉ液２閤
１に分散し、０℃で５分間晶１１噛りした。この分散ｒ
＆０．２纏１に」−＝こ！Ｉｌみ換え体プラスミド心底
０．１１を添加混合し、Ｏ’Ｃで１５分間静置し、更に
４２°Ｃで２分間保ｔ、’ｊＬ　ｔ−後、市の項五で用
いたのと同−ＭＩ成のＬ−ブロス０．５１を加えてｌ　
Ｉ＋！！間振！ｈ培δを行った。この培ｉε泊の一部を
取り、＋’＋Ｔ述の成分の他にテトラサイクリ／１５μ
ｇ／ｌを含むし一ブロス寒天乎仮に広げ３７°Ｃで約１
２１１’ｊｔｅｌ　Ｉ８養し、テトラ４ｒイクリ／酎性
菌を逆沢してＣＩ）　Ｎ　Ａライブラリーを作製した。 前２このｃＤＮＡ’、ノイブラリーについて、ウサ↑？
　ＦＡ壊死因子をフードするｃ　ＤＮＡを含むプラスミ
ドをｊ′１つＩ［ｇ　ＴＦ　ｆ＋：操体をスクリー二ノ
グするためｆｆｆｆ　Ｐ標２　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡプＵ−ブ
を用いるフロニー・ハイブリグイゼーンＩ／試験をハリ
°ハフ　（１ｌａｎａｈａｎ）らの方法［Ｇｃｎｃ、　
ＩＩｌ、Ｉｉ：ｌ（１！＋８０）］に従って行った＊　
　”　Ｐ　ｔ’！　２　ｃｌ）ＮＡブ＋＋　−、／は、
誘４プラス及びマイナス■胞マクＩ＋　−１７−７より
ｔ記（１）項の方法でｉシｌなｍ　ＲＮ　Ａ　”υｉ５
２として、＋２１　Ｊｊ’ｉ　０）ノｊ？にで合成した
。但し、”１）−ｄｃＴＩ’は高放り１能比活性の６の
を用い、高Ｃ度に標λした。この；、（験により語）Ω
プラスのプローブと強く結合し、誘ノσマイナスのプロ
ーブとはハイブリダイズしない塩基配列を含む、繁ｕ換
え体プラスミ）をｒ「する１じ質転操体を選別した。＊
Ｊ２万個のコ１１ニーから！’１０１１’ｌの：Ｉロニ
ーが選び出された。 次いで、これらの選択された菌株についてハイグリグイ
ビーン−Ｉかトラ／スレー７７ノ試験を“モレ、ト、ラ
ー　り１−二／グ”　〔へＩａｎ＋ａｔｊｓ、丁、。 Ｃｔ　ｘ＋、、（ｃｄ）　　”　！＋Ｉｏｌｅｅｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　、：１２９（１０８０）。 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、）に
ｊｄ　４’５の方１ノ、にｋってｉｉｌ、た、それぞれ
の形質転換体よりプラスミド１）＼ＩＡ’ｉ；　１ｌｌ
ｌ　出Ｌ　、ニドミセルロースフィルクー」二に加熱変
性ご仕たのち固定し、これに上記（１＋項で得たウサ１
′％壊死囚子ｍ　ＲＮ　Ａ　’：　Ｇむｐｏｌｙ（へ）
ｍＲＮＡＩＩＴ１１分−＝　Ｉ：ｏえ、５０℃で１８０
分間反に；させ、ハイプリグイ七−／１ノを行った。粘
合したｍ　ＲＮ　Ａを溶出回収したよアフリカ７メガエ
ルの卵Ｇ）　＜Ｉｆｆ胞によ人し。 回収されたｍ　ＲＮ　Ａがつすド癌１カ死囚子ｍ１≧Ｎ
八であるか否かを検定した。この試験により、」−９足
でだ訳された２０個の形質転換体よりウサギ癌１カ死囚
子ｍＲＮ　Ａと強くハイブリダイズするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
を会むプラスミドを「ｌｔつ菌体３個を見いだした。そ
のうら最らＬ：、いｃＤＮＡ（約７５０ｂｐ）を（「す
るプラスミドより、制御コ酊、４：　０ｄｃｒでＤＮＡ
断片を切り出し、二次スクリー二／グ用のプローブとし
た。このＤＮＡ断片を１７１＋て仁７°８コし、上：こ
（６）項で得たｃＤＮＡライブラリーについて百度コロ
ニー・ハｆブリク４　ｔ’　−７，：／二、（験を行い
、（ニア１．４ブロー２″と・崩く１５１２合するｃＤ
ＮＡ・訃合むプラスＥ）をｔ＋ｔつ形７１．：楔体を逆
んた。ＣＩ）　Ｎ　Ａライブラリーの約６万個のコロニ
ーのうち９８伊４かＮ４　ｊ’ｌ−Ｉ　Ｉ−ニーであっ
た。これらからｃｉ）ＮＡを制限＾Ｆ　ｉｉ’；　Ｉ’
ｓ　Ｌ　ＩでνＪり出し、そのサイズをボＪアクリルア
ミ１ゲル市気詠動で調べ、１ｋｂｐ以上の→Ｊ゛イズを
イ「する１７個のクロー７を遍び出したつこれらのうち
ｆｌｕら人き％ｃＤさＪ八をＣむ形質転換体（一体ｉ！
；　’；’、Ｒ’ｌ’ＮＦ３０２．　り”　　　：／　
化ＤＮ八番’ｊ　：ｐＩセＴＮＦＩ（０２）について、
クロー／化ＤＮＡをｑ１刊し、次の方ｌノ、て１０入（
配列を決定した。 （８）り【Ｉ−ノ化１）ＮＡの塩ノ、（配に１１の決定
ｆ７１　’ｆｆ　テ＋’ｊ　ｔＲサレタｌ￥１抹（ＲＴ
ＮＦ８０２）　ヲ’）　７　ミノピメリ７ｍ及びＰミ／
７を１６加したし一ブロスで１ごべして菌１本を１１１
た。この菌体をウィルキー（’＃１ｌｋｉＯ）らの１１
’　ｊノＩ　［Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃｓ、
、７．８５９（１９７り）］に従って処Ｐ１１シ、プラ
スミドＤＮＡを１ひた。このプラスミドＤＮｌ〜を：Ｃ
ＩＩ　ＩＵ酵ぶｌ’ｓｔｌで分ペアし、精製外；１ｔ　
してり（１−／化Ｄ　Ｎ　Ａを得た。このりｒ＋　　７
　化Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌｉｉ　片ヲトＩｉ　・ｒ　）：Ｃ’
ｌ　ｍ　Ａ？　ｌ；　テ分解し、１Ｎ肖な：ｉｉ’ｌ限
酵ぶＩｔ１１昌についてそれぞれの４入（配ン＋ｊ　・
ニマトサムードルバート（５ｌａｘａａ−Ｇｉｌｂｃｒ
ｔ　）　法に上り脱す７ｍ化　Ｉｆｆ　１１による末端
（、’：’、　２　、　ＩＵ　Ｊλ特５”シメｊ化２分
ＡＶ反応、ゲル電気泳動及びオートラジオグシフイーか
ら決定した。 との１−）人配列は次の８４の通りである。 （以下金ｅ） 参考　１シ１（５ ウ−Ｉ）・１ご旅壊化因１′の甲以積製ツー’Ｉ′ｌ’
　（（本市２５〜：１．Ｏｋｇ）にプロピオニバクチリ
ウム　アク？、　ｙ−（ｌ’ｒｏｐ：０ｎｒｌ＋ａｃｔ
ｃｒ１ｕｍ　ａｃｎｃｓ）死：１体５０．＜を１１晶ρ
；頂より７１：Ｉｌｔシた。３日後に工／トド　　ト　
／ノ（大　肛１　　ｔ’＋°１　山　Ｃ１コ　　の　リ
　　１′１τ　リ　Ｔ　　ｙ　　ｈ　　ラ　イ　　Ｙ　
　）１００ｚｚ　ｇヲ１１　＋’＋１１！Ｆ、　ヨり汁
！！、＋　１．．２　ＩＩＩＺ間後ニ心臓より全採血Ｌ
り、　ｔ−＜Ｉ［７Ｌ、り１ＩｌｌＪニｌＯ０１１’ｌ
　’）　１００単位のヘパリフす゛トリウｌ、を加えた
後、５，０００ｒｐ−で３０分間冷却ｄ心！’Ｙ＋　（
’ｌを行い、血球ルび不１ｃｉβ１形物を除去した。　
４００：＋１のつづ！１！より：ｌｌ、０００！Ｉ’位
！−１の力価をｆ「するｆｉｌｌ蓋２↓ｉ　ｈｉ　ｉ！
＃られな。 コノｔｎｌ　’Ａ　２４　？　ｉ：　Ｉ：ＤＴＡ２４　
ｇ及びセライ）２４０Ｈを加え１時間！ス１１゛シた後
、孔径３μ、１μ及び０２μのプイルクーで順次ｄハし
た。 ＋ｌ’ｉ　、ｌン２に／に０．０４Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　５
−１１ＣＩｉ、Ｃ’！！　、伐Ｃｒ＋ｌ１７．１Ｉ）１
２；を加えたよ、Ｉｌ、　ＩＭ　Ｎ；ＬＣＩを含む００
４λＩ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣｌｉＡ衝液（ｐＨ７，
８）’Ｔ″！−分にｆｆ化したｌ）　ｉ：　Ａ　Ｉニー
セフ！ロースＣＬ−１０１（）７ルマ、′アン１）のカ
ラム（２７Ｘ４５ｃｍ）に徐々に１１シた。次いて４フ
ラム１１衡化番、ζゾ１ａ７５／及び０．　ＩｓＭ　Ｎ
ＩＬＣｌを含む０．０４Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＩＩＣ
Ｉし；ｉ「、戊（ｐＨ７，８）５０１で順次ン先ｉｉｉ
後、Ｏ，Ｉ８ＭＮユＣ１をＣむ０．０４１％ｊ　Ｔｒ　
ｉ　５−１１ＣＩ　緩衝液（ｐＨ７，２）を用いて１８
出した。溶出液は８１ずつ分画してＬＡ汁両分を婁めた
。この活性画分に同容舟の０．０４へＩ　Ｔｒ　ｉ　５
−１１ＣＩｉ孟士液（ｐｌ＋７．８＞を加えて希釈した
後、ＤＣＡＣ−セフ１０−スＣＬ−６Ｂのカラム（ＩＯ
Ｘ　１３ｃｍ　）にｆ、Ｉ’　した０次いでＯ，ＩＭＮ
ａＣＩを含む０．０４ＮＩＴ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＩＩＣＩ
　緩衝液（ｐＨ？、８）　ｌ　１を用いて；尤；子した
後、０．１８Ｎ＋　Ｎ、ＬＣｌ庖含む０．０４Ｎ＋　Ｔ
　ｒ　ｉ　ｓ　−１１ＣＩｉＺ　＆ｉ液（ｐ（１１，２
）５１　’ｅ用いてｉ／ｉ出した。溶出液は２５０　ｓ
ｌずつ分画して活性画分庖集めた。 次にこの溶出液を容器に移し７０°Ｃの湯浴中に侵し、
撹ｔ↑しながら１８出戚の一度か６０℃になるまで加！
へシた。その後６０°Ｃの別のＩＱ　ｔ＋’ｌに移し、
３０分間ｌＮ熱処理した後、速やかに４°Ｃにコノ（１
した。加／Ａ処即した培液は、限外−〇によ１？宿した
。 ０１〜ｊＮａｃＩを含む０．００５Ｍリノ酸；ガ＆Ｉ　
＋Ｉｋ（ｐＨ７↓）で十分に平衡化した七フ７クリルＳ
−２００（フフルマ／ア社）のノＪラム（５Ｘ　８０ｃ
＋＋　）に上、、ｄ　＝’：　ｈｉ　液を＋１シ、同’
ｉ、ｃ　ｉｌＩ液で＋（Ｈ：ｌｉ　（−た、４０１ずつ
分？！＋７　して、１−Ｐ１両分を採１シし、限外波ハ
によりＳ　；’ｉ：　した。 ゲル、心易によ、、て１１．）られた活ＩＬＬ♂（呵分
の＊：　ｊ−１１：液をＺｎ”“１．レートセファ０−
ス力ラムに（［シた。１′ラス（１”ｏｒａｔｈ）らの
／Ｊ法（Ｎａｔｕｒｃ、２５８．５！１８（１！１７５
））で得られｆ：　）　レートＪｔ　７７　ｎ−ス（イ
ミ”　Ａｌ：　ｌ’ｌ：固定化（二１指）４　Ｊｌ’、
　ｌｉｉ　シたカラム（１、ｆ？Ｘ　２０ｃｍ　）に、
ｌ翻く／１のＩ−化ＩＩＩＩ釘）ＩＫ＾°；１役１２０
１を：ｋ　した。次いて０　、　Ｉ　ＮＩ　Ｎ　ａ　Ｃ
Ｉ　タ：　７む０．０５ｉ＼１リノｎ’ｌ　’＋ｒＱ　
ｊ＋Ｉ　、ｌｙ　（ｐＨ７↓）で十分に・１′ｉ９＋化
した（（、萌工程でｉｌ）られた’ｈｉ　賃ｉ　＋ｔｋ
を（１し、１・−１ｉ’、ζ＋＋＋　、ｌｙ　７ｒ；ｉ
出した非戦（′Ｉ画分を採取した。活Ｖ１はこの両分に
ほとんどが回収された。 前Ｖ１７製工Ｅ′Ｊでｉｌられた活性画分をシ縮し、０
，１５Ｍ　ＮａＣｌ’ｃ　コｔ：　ｏ、ｏｏｓ　Ｍ　’
Ｊ　Ｚ　ｃｔ衝液（ｐＨ７，４）で’、−分に４′衡化
した）　Ｊ＋バールＩＩＷ−５５（…洋ソーグ抹式会？
１）の！ｊ−）ム（ｌ　５Ｘ　ｎｏｃ閤）に（−１した
。同Ｊ衝油でＩＦ７出しｉ、ｑ　ｌ’ｌ内分を採取した
。仝Ｌ’ｉ譚工）’、’り迎しての活ｉ′１゛の回収（
（は〔；０ンクｔ、７製度は？、５ＸＩＯ’（２てあっ
ｔ、：、このようにしてｉＩ′Ｉられｔ、：τ古譚・シ
リ１壊死状死囚１”Ｊ　比ｉ１’）　Ｉ’ｌハｃ、ｏｘ
　Ｉｏ’コ１１位／　ａｚ　ａｉ白７１テＡ　ッｋ　（
ｒｌｒｌＰＩ中位）定；−は１７間昭ｓ８−＋７ｔ：＋
：’ｔｏ　７；のそれと同じである）、また、マウスに
移殖したＭａｌｈ　Ａ肉腫を用いる生’ａｓｖ価におい
て、１匹当り１　、０００〜５　、０００　！Ｉｔ　６
７を、７７脈内に役ｉｉ、　した場合の７ス性は（＋）
以上であった。 参考（ζＩＧ 抗つサ１！厚壊死囚子抗体の作製 参考例５でｉ！）られた精製つ４Ｊ′ぜ癌壊死囚子１．
９ＸＩＯ’！ｌ”ｉ位を含む溶液を等？の７０インドの
完全７９ユバ／トで乳濁化し、それをそルそフトの背部
皮″Ｆ：奴カ所に注Ｑ？　した。その後、ｌ、３及び６
週後に向を工の方法で免疫した。更に３週後に、同ち１
の精製つ４ｆ　′ｒ：　７ｉ　壊死因子を水酸化アルミ
ニウムゲルとともに腹ｉ内にＩ仁Ｑｔ　ｌ、た、縁辺の
免疫から９凸よに心ル】より全採血し、遠心分沼により
＋ｈ＋清を公刊することによって抗ウリ１コ癌１カ死因
子し一体をＣむＩｊＬｆｉｌｌ　；ｎ　ヲｒ”Ｊ　タ。 この抗＋１１１　ｉ：ｉを、正゛雇りナギ血７１′ｉ成
分を吸Ｃさ仕タセフ１【１−ス４１Ｅ（７ｙルマンノア
）カラムに３ｉ１口ｆＩ）イしてメ＋ｌ　ｉ凸、＼１１
ることにより、ｌ１１１ｔソシ的を抗体を除去し、つ４
Ｊ１゛煕壊死因子に対する１°ｔ５°Ｉ！院体のろ８３
む精製［Ｉ“ｉ：　１１１１　：＋”ｒを得た。この抗
１ｍ　ｉ＋’＋は、免疫電気泳動７）、及びゲル内二ｍ
拡散法によりｒ＋７製つ寸１？厚１ｉ死因ｉ−，！：の
間にのみ！１１−の沈降腺を形成した。

【図面の簡単な説明】

ｍ１図は参考例３のＨＴＮＦ−アダプター断片の描王、
工片を示し、第２図は参考例３のｔｒｐプロそ一り−付
形費２現プラスミドｐＨＴＲ０１の（１が築工程を示す
ものである。　　　　　　　　　　　　　　」算１回 ＨＴＮＦ　　　　　　Ｔｅｔ’″ ＨＴＮＦ−７７”７γ−町 第２図

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のアミノ酸配列を有するヒト癌壊死因子ポリ
   ペプチド又はその活性部分の一部若しくは全部を有する
   ポリペプチド 【アミノ酸配列があります】
2. （２）下記のアミノ酸配列を有するヒト癌壊死因子ポリ
   ペプチド 【アミノ酸配列があります】
3. （３）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド【アミ
   ノ酸配列があります】
4. （４）特許請求の範囲第２項又は第３項のポリペプチド
   のＮ末端にメチオニンが付加してなるポリペプチド
5. （５）特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポ
   リペプチドを基本構成単位としてなる集合体
6. （６）特許請求の範囲第２項記載のポリペプチドの３分
   子集合体
7. （７）特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の物
   質を有効成分としてなる抗腫瘍剤
8. （８）特許請求の範囲第２項又は第６項記載の物質を有
   効成分としてなる抗腫瘍剤