JPS6151878B2 - - Google Patents
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- JPS6151878B2 JPS6151878B2 JP58177167A JP17716783A JPS6151878B2 JP S6151878 B2 JPS6151878 B2 JP S6151878B2 JP 58177167 A JP58177167 A JP 58177167A JP 17716783 A JP17716783 A JP 17716783A JP S6151878 B2 JPS6151878 B2 JP S6151878B2
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- JP
- Japan
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- protease
- nutrient medium
- flavobacterium
- microorganism
- enzyme
- Prior art date
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/85—Flavobacterium
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
微生物のプロテアーゼは理論的にもまた実用的
にもかなりの興味がもたれている。プロテアーゼ
はしばしば細胞外の物質であり、消費された培地
の濾液から活性型で単離することができる。 蛋白質分解酵素は一般にその至適PH、ジイソプ
ロピルフオスフオフルオリデート（DFP）に対
する感度、及び活性の金属依存性を基準として、
４種の群に分けられる。即ち、 (1) 酸性プロテアーゼ； (2) DFP感受性プロテアーゼ（セリン・アルカ
リ性プロテアーゼ）； (3) 金属キレーター・感受性プロテアーゼ； (4) チオール・プロテアーゼ に区別される。 第一の群には、微生物のレンニンのような酵素
が含まれ、牛乳の凝固（clotting）及びチーズの
熟成（ripening）のような酵農工業において価値
をもつている。酸性プロテアーゼは大部分カビ類
が原料である。 本発明のプロテアーゼがその範囲に入る第二の
群は多数の公知のプロテアーゼから成り、最も広
い分類学上の分布をもつている。最も良く知られ
ている特徴はバシルス・エスピー（Bacillus sp.
）により生産される細胞外生成物であるスブチリ
シン類、及びグラム陽性バクテリア［例えばスト
レプトマイセス（Streptomyces）、アルトロバク
テル（Arthrobacter）］及びカビ類［例えばアス
ペルギルス（Aspergillus）、サツカロマイセス
（Saccharomyces）］によりつくられる数種の他の
酵素である。洗剤用の酵素はこれらのプロテアー
ゼに対する大きな工業的用途である。驚くべきこ
とには、グラム陰性バクテリアでは極く僅かな種
類だけしかこの種のプロテアーゼを生産しないこ
とが見出だされた。これらは米国ニユーヨークの
アカデミツク・プレス（Academic Press）社
1971年発行、ピー・デイー・ボイヤー（P.D.
Boyer）編集、「酵素（Enzymes）」第３版第３
巻、721〜795頁のマツバラ等の論文に記載されて
いる。この文献の792〜794頁が特に適切である。 金属キレーター感受性のプロテアーゼはいわゆ
る天然プロテアーゼの群を形成している。これら
の酵素は通常その活性及び安定性が亜鉛及びカル
シウムに依存している。このプロテアーゼのある
ものはビール工業に用いられている。 微生物源のプロテアーゼの最も小さい群はチオ
ール・プロテアーゼの群である。このようなプロ
テアーゼは二三しか同定されておらず、例えばス
トレプトコツカス・ラクテイス（Strptococcus
lactis）及びクロストリデイウム・ヒストリテイ
クム（Clostridium hisyolyticum）から得られる
プロテアーゼがある。これらの酵素には工業的用
途が知られていない。 本発明は土嬢微生物であるフラヴオバクテリウ
ム・アルボレツセンス（Flavobacterium
arborescens）から得られる細胞外のアルカリ性
セリン・プロテアーゼの分離、同定、及び使用に
関する。これらの微生物を用いて他の酵素、即ち
グルコース・イソメラーゼを製造する方法はシ
ー・ケー・リー（C.K.Lee）の米国特許第
4061539号に記載されている。本発明によれば、
グルコース・イソメラーゼの製造に適したものと
してこの特許に開示されているフラヴオバクテリ
ウム・アルボレツセンスの２種の菌株、即ち、
NRRL Ｂ−11022及びATCC 4358はプロテアー
ゼの製造にも良く適していることが見出だされ
た。上記米国特許第4061539号にはこの種の微生
物が微生物のアルカリ性プロテアーゼの製造にも
有用であることは指摘されていない。 本発明の方法は微生物のアルカリ性プロテアー
ゼの製造方法に関する。本発明によれば適当な栄
養分を含む水性栄養媒質中において回収可能な量
の酵素を生成するのに十分な時間、フラヴオバク
テリウム・アルボレツセンス種からの微生物を培
養することを特徴とする微生物のアルカリ性プロ
テアーゼの製造方法が提供される。 プロテアーゼの生産中にフラヴオバクテリウ
ム・アルボレツセンスを培養するのに種々の生育
培地を用いることができる。例えば水性の培地は
0.05〜0.2％の酵母エキス、0.5〜2.0％のキシロー
ス、５〜10％のコーンステイープリカー、及び
0.5〜1.0％の燐酸カリウムを含むことができる。
ここですべての割合は重量／容積（ｗ／ｖ）基準
である。PHは約6.8〜7.2のレベルに調節すること
が好ましい。 使用できる他の培地は１％の酵母エキス、また
は炭素源を含みまたは含まない栄養汁を含んでい
る。典型的には、細胞は選ばれた媒質中におい
て、29〜32℃の温度で16〜24時間の間、通常撹拌
して生育させる。培養した後、例えば遠心分離に
より細胞を取り除き、プロテアーゼを含む透明な
上澄液を残留させ、これから当業界で公知の精製
方法によりプロテアーゼを回収することができ
る。例えば、プロテアーゼは硫酸アンモニウムを
加え、沈澱させ濃縮した後ジエチルアミノエチル
（DEAE）セルロース上でクロマトクフイーにか
け、蔗糖の勾配遠心分離によつて精製し均一化す
る。収率は１当り4000〜16000単位の範囲にあ
り、ここで１単位は温度50℃、PH9.0でカゼイン
を基質として毎分10ノナモルのチロシンを遊離す
る酵素の量と同等である。 プロテアーゼ活性は全容積2.6mlで試験され
る。反応混合物は0.7％のカゼインを0.05Mのト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−HCl緩
衝液中に含み、PH９で酵素及び緩衝液を用いて全
容積を２mlにしたものである。反応は等容量の
1.8%(w/v)のトリクロロ酢酸を加え、遠心分離に
より沈澱した蛋白質を除去することによ終結させ
る。可溶性フラクシヨン中に放出されたチロシン
として活性が測定される。チロシンの量は反応混
合物及びブランク（時間０で停止させた反応混合
物）の275nｍにおける吸光係数の差として計算
される。 フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスによ
りつくられた酵素は、分子量が19000であり、且
つ変性条件下でポリアクリルアミド・ゲルの電気
泳動法で測定すると単一のポリペプチド鎖から成
つていることがわかる。 本発明を実施する方法をさらに下記実施例によ
り例示する。 実施例 １ 下記の方法により微生物のアルアリ性プロテア
ーゼをつくつた。 フラヴオバクテリウム・アルボレツセンス
NRRL Ｂ−11022及びATCC 4358の両方を別々
に、蒸留水中に酵母エキスを１%(w/v)含む溶液
の中で培養した。夫々の場合、重量／容積基準で
0.15％の酵母エキス、0.5％の燐酸カリウム、7.0
％コーンステイープリカー、及び１％のキシロー
スを蒸路水中に含む培地50mlに細胞を加える。こ
の培地は最初細胞密度が２×107個／ml、PH7.0で
あり、これを24時間30℃において、300mlフラス
コ中で、偏心率１インチの250rpmで振盪機にか
けて培養する。24時間培養した後、細胞を遠心分
離で除去する（10000×ｇで５分）。透明な上澄液
には粗製のプロテアーゼが含まれ、副生するグル
コース・イソメラーゼは細胞中に保存される。 実施例 ２ NRRL Ｂ−11022から実施例１によつてつくら
れたプロテアーゼを、下記のように５段階で精製
した。 細胞を除去した一回使用した培養基（透明な上
澄液）を粗製酵素と名付ける（フラクシヨン
）。この物質中の蛋白質は硫酸アンモニウムを
70％の飽和度で加えて沈澱させることにより濃縮
した。23000×ｇで30分間遠心分離により沈澱を
集め、70％飽和度の硫酸アンモニウム溶液（PH
7.4）で一回洗浄し、PH8.0で0.02MのNaClを含む
トリス−HCl 0.05M溶液に加える。この非常に濃
い暗褐色の蛋白質を、NaClを含まない緩衝液に
対して透析を行い、40000×ｇで30分間遠心分離
にかけ、不溶性物質の残りを除去する。この透析
した物質（フラクシヨン）を上記の緩衝液中に
0.02MのNaClを含む液と平衡させたDEAE−セル
ロース・カラムにかける。このカラムを、流出液
のA280がほとんど０になるまで平衡緩衝液で洗浄
し、0.05Mのトリス−HCl緩衝液中にNaCl（0.02
〜1.00M）を含むPH8.0の溶液で勾配をつけて展
開する。活性物質の大部分は吸着されず、明褐色
の溶液として緩衝液と共に流出した。流出した酵
素をアミコン（Amicon）社の限外瀘過装置で、
UM−10の膜（分子量10000以上を排除）を用い
て濃縮する。これをフラクシヨンと名付ける。 DEAEセルロースによる精製段階をフラクシヨ
ンについて繰返し、フラクシヨンを得た（ま
だ明褐色）。これをPH７の0.01Mの燐酸カリウム
と平衡させたヒドロキシアパタイトのカラムにか
ける。この場合も大部分の活性物質は平衡緩衝液
と共に溶出したが、褐色の不純物はほとんどカラ
ムの中に捕捉された。このプロテアーゼの淡黄色
の溶液（フラクシヨン）を限外瀘過により濃縮
し、0.25MのNaClを含むPH8.0の0.05Mトリス−
HCl緩衝液中で５〜30%(w/v)の勾配をもたせた
蔗糖（36ml）で展開する。これを70時間
28000rpmでベツクマン（Beckman）社のSW28
ローターを用いて遠心分離にかける。一定の活性
をもつたこのフラクシヨンを一緒にし（フラクシ
ヨン）、瀘過して滅菌し、４℃で貯蔵する。 変性条件下で電気泳動により測定すると、分子
量19050の単一の蛋白質バンドが存在することが
わかる。この値は、上記蔗糖による勾配の実験と
平衡して行われたキモトリプシノーゲン
（25000）及び卵白アルブミン（43000）マーカー
蛋白質の沈降速度の比較から計算された分子量
19400と非常に良く一致している。 プロテアーゼ活性は、全く精製をしない前、及
び各精製段階の後で決定した。この実験の結果を
第１表に示す。
にもかなりの興味がもたれている。プロテアーゼ
はしばしば細胞外の物質であり、消費された培地
の濾液から活性型で単離することができる。 蛋白質分解酵素は一般にその至適PH、ジイソプ
ロピルフオスフオフルオリデート（DFP）に対
する感度、及び活性の金属依存性を基準として、
４種の群に分けられる。即ち、 (1) 酸性プロテアーゼ； (2) DFP感受性プロテアーゼ（セリン・アルカ
リ性プロテアーゼ）； (3) 金属キレーター・感受性プロテアーゼ； (4) チオール・プロテアーゼ に区別される。 第一の群には、微生物のレンニンのような酵素
が含まれ、牛乳の凝固（clotting）及びチーズの
熟成（ripening）のような酵農工業において価値
をもつている。酸性プロテアーゼは大部分カビ類
が原料である。 本発明のプロテアーゼがその範囲に入る第二の
群は多数の公知のプロテアーゼから成り、最も広
い分類学上の分布をもつている。最も良く知られ
ている特徴はバシルス・エスピー（Bacillus sp.
）により生産される細胞外生成物であるスブチリ
シン類、及びグラム陽性バクテリア［例えばスト
レプトマイセス（Streptomyces）、アルトロバク
テル（Arthrobacter）］及びカビ類［例えばアス
ペルギルス（Aspergillus）、サツカロマイセス
（Saccharomyces）］によりつくられる数種の他の
酵素である。洗剤用の酵素はこれらのプロテアー
ゼに対する大きな工業的用途である。驚くべきこ
とには、グラム陰性バクテリアでは極く僅かな種
類だけしかこの種のプロテアーゼを生産しないこ
とが見出だされた。これらは米国ニユーヨークの
アカデミツク・プレス（Academic Press）社
1971年発行、ピー・デイー・ボイヤー（P.D.
Boyer）編集、「酵素（Enzymes）」第３版第３
巻、721〜795頁のマツバラ等の論文に記載されて
いる。この文献の792〜794頁が特に適切である。 金属キレーター感受性のプロテアーゼはいわゆ
る天然プロテアーゼの群を形成している。これら
の酵素は通常その活性及び安定性が亜鉛及びカル
シウムに依存している。このプロテアーゼのある
ものはビール工業に用いられている。 微生物源のプロテアーゼの最も小さい群はチオ
ール・プロテアーゼの群である。このようなプロ
テアーゼは二三しか同定されておらず、例えばス
トレプトコツカス・ラクテイス（Strptococcus
lactis）及びクロストリデイウム・ヒストリテイ
クム（Clostridium hisyolyticum）から得られる
プロテアーゼがある。これらの酵素には工業的用
途が知られていない。 本発明は土嬢微生物であるフラヴオバクテリウ
ム・アルボレツセンス（Flavobacterium
arborescens）から得られる細胞外のアルカリ性
セリン・プロテアーゼの分離、同定、及び使用に
関する。これらの微生物を用いて他の酵素、即ち
グルコース・イソメラーゼを製造する方法はシ
ー・ケー・リー（C.K.Lee）の米国特許第
4061539号に記載されている。本発明によれば、
グルコース・イソメラーゼの製造に適したものと
してこの特許に開示されているフラヴオバクテリ
ウム・アルボレツセンスの２種の菌株、即ち、
NRRL Ｂ−11022及びATCC 4358はプロテアー
ゼの製造にも良く適していることが見出だされ
た。上記米国特許第4061539号にはこの種の微生
物が微生物のアルカリ性プロテアーゼの製造にも
有用であることは指摘されていない。 本発明の方法は微生物のアルカリ性プロテアー
ゼの製造方法に関する。本発明によれば適当な栄
養分を含む水性栄養媒質中において回収可能な量
の酵素を生成するのに十分な時間、フラヴオバク
テリウム・アルボレツセンス種からの微生物を培
養することを特徴とする微生物のアルカリ性プロ
テアーゼの製造方法が提供される。 プロテアーゼの生産中にフラヴオバクテリウ
ム・アルボレツセンスを培養するのに種々の生育
培地を用いることができる。例えば水性の培地は
0.05〜0.2％の酵母エキス、0.5〜2.0％のキシロー
ス、５〜10％のコーンステイープリカー、及び
0.5〜1.0％の燐酸カリウムを含むことができる。
ここですべての割合は重量／容積（ｗ／ｖ）基準
である。PHは約6.8〜7.2のレベルに調節すること
が好ましい。 使用できる他の培地は１％の酵母エキス、また
は炭素源を含みまたは含まない栄養汁を含んでい
る。典型的には、細胞は選ばれた媒質中におい
て、29〜32℃の温度で16〜24時間の間、通常撹拌
して生育させる。培養した後、例えば遠心分離に
より細胞を取り除き、プロテアーゼを含む透明な
上澄液を残留させ、これから当業界で公知の精製
方法によりプロテアーゼを回収することができ
る。例えば、プロテアーゼは硫酸アンモニウムを
加え、沈澱させ濃縮した後ジエチルアミノエチル
（DEAE）セルロース上でクロマトクフイーにか
け、蔗糖の勾配遠心分離によつて精製し均一化す
る。収率は１当り4000〜16000単位の範囲にあ
り、ここで１単位は温度50℃、PH9.0でカゼイン
を基質として毎分10ノナモルのチロシンを遊離す
る酵素の量と同等である。 プロテアーゼ活性は全容積2.6mlで試験され
る。反応混合物は0.7％のカゼインを0.05Mのト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−HCl緩
衝液中に含み、PH９で酵素及び緩衝液を用いて全
容積を２mlにしたものである。反応は等容量の
1.8%(w/v)のトリクロロ酢酸を加え、遠心分離に
より沈澱した蛋白質を除去することによ終結させ
る。可溶性フラクシヨン中に放出されたチロシン
として活性が測定される。チロシンの量は反応混
合物及びブランク（時間０で停止させた反応混合
物）の275nｍにおける吸光係数の差として計算
される。 フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスによ
りつくられた酵素は、分子量が19000であり、且
つ変性条件下でポリアクリルアミド・ゲルの電気
泳動法で測定すると単一のポリペプチド鎖から成
つていることがわかる。 本発明を実施する方法をさらに下記実施例によ
り例示する。 実施例 １ 下記の方法により微生物のアルアリ性プロテア
ーゼをつくつた。 フラヴオバクテリウム・アルボレツセンス
NRRL Ｂ−11022及びATCC 4358の両方を別々
に、蒸留水中に酵母エキスを１%(w/v)含む溶液
の中で培養した。夫々の場合、重量／容積基準で
0.15％の酵母エキス、0.5％の燐酸カリウム、7.0
％コーンステイープリカー、及び１％のキシロー
スを蒸路水中に含む培地50mlに細胞を加える。こ
の培地は最初細胞密度が２×107個／ml、PH7.0で
あり、これを24時間30℃において、300mlフラス
コ中で、偏心率１インチの250rpmで振盪機にか
けて培養する。24時間培養した後、細胞を遠心分
離で除去する（10000×ｇで５分）。透明な上澄液
には粗製のプロテアーゼが含まれ、副生するグル
コース・イソメラーゼは細胞中に保存される。 実施例 ２ NRRL Ｂ−11022から実施例１によつてつくら
れたプロテアーゼを、下記のように５段階で精製
した。 細胞を除去した一回使用した培養基（透明な上
澄液）を粗製酵素と名付ける（フラクシヨン
）。この物質中の蛋白質は硫酸アンモニウムを
70％の飽和度で加えて沈澱させることにより濃縮
した。23000×ｇで30分間遠心分離により沈澱を
集め、70％飽和度の硫酸アンモニウム溶液（PH
7.4）で一回洗浄し、PH8.0で0.02MのNaClを含む
トリス−HCl 0.05M溶液に加える。この非常に濃
い暗褐色の蛋白質を、NaClを含まない緩衝液に
対して透析を行い、40000×ｇで30分間遠心分離
にかけ、不溶性物質の残りを除去する。この透析
した物質（フラクシヨン）を上記の緩衝液中に
0.02MのNaClを含む液と平衡させたDEAE−セル
ロース・カラムにかける。このカラムを、流出液
のA280がほとんど０になるまで平衡緩衝液で洗浄
し、0.05Mのトリス−HCl緩衝液中にNaCl（0.02
〜1.00M）を含むPH8.0の溶液で勾配をつけて展
開する。活性物質の大部分は吸着されず、明褐色
の溶液として緩衝液と共に流出した。流出した酵
素をアミコン（Amicon）社の限外瀘過装置で、
UM−10の膜（分子量10000以上を排除）を用い
て濃縮する。これをフラクシヨンと名付ける。 DEAEセルロースによる精製段階をフラクシヨ
ンについて繰返し、フラクシヨンを得た（ま
だ明褐色）。これをPH７の0.01Mの燐酸カリウム
と平衡させたヒドロキシアパタイトのカラムにか
ける。この場合も大部分の活性物質は平衡緩衝液
と共に溶出したが、褐色の不純物はほとんどカラ
ムの中に捕捉された。このプロテアーゼの淡黄色
の溶液（フラクシヨン）を限外瀘過により濃縮
し、0.25MのNaClを含むPH8.0の0.05Mトリス−
HCl緩衝液中で５〜30%(w/v)の勾配をもたせた
蔗糖（36ml）で展開する。これを70時間
28000rpmでベツクマン（Beckman）社のSW28
ローターを用いて遠心分離にかける。一定の活性
をもつたこのフラクシヨンを一緒にし（フラクシ
ヨン）、瀘過して滅菌し、４℃で貯蔵する。 変性条件下で電気泳動により測定すると、分子
量19050の単一の蛋白質バンドが存在することが
わかる。この値は、上記蔗糖による勾配の実験と
平衡して行われたキモトリプシノーゲン
（25000）及び卵白アルブミン（43000）マーカー
蛋白質の沈降速度の比較から計算された分子量
19400と非常に良く一致している。 プロテアーゼ活性は、全く精製をしない前、及
び各精製段階の後で決定した。この実験の結果を
第１表に示す。
【表】
第１表はプロテアーゼは二三の簡単な段階を経
て、許容できる収率で精製し得ることを示してい
る。 実施例 ３ この実験は温度の関数としてフラヴオバクテリ
ウム・アルボレツセンスの活性と安定性を決定す
るために行われた。 表記の温度においてプロテアーゼ活性を測定し
た。安定性は15または30分間或る与えられた温度
で酵素を加熱した後、37℃で評価を行うことによ
り試験した。フラクシヨン（第１表）を使用し
た。この実験の結果を第２表に示す。
て、許容できる収率で精製し得ることを示してい
る。 実施例 ３ この実験は温度の関数としてフラヴオバクテリ
ウム・アルボレツセンスの活性と安定性を決定す
るために行われた。 表記の温度においてプロテアーゼ活性を測定し
た。安定性は15または30分間或る与えられた温度
で酵素を加熱した後、37℃で評価を行うことによ
り試験した。フラクシヨン（第１表）を使用し
た。この実験の結果を第２表に示す。
【表】
実施例 ４
フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスの活
性をPH及び温度の関数として前記の方法で決定し
た。 この実験の結果を第３表に示す。
性をPH及び温度の関数として前記の方法で決定し
た。 この実験の結果を第３表に示す。
【表】
温度が上昇すると最適PH値が低い方に移動す
る。酵素は広い範囲のPH（5.5〜10.5）で活性を
もつている。フラクシヨン（2.54μｇ）をこの
アツセイに使用した。 実施例 ５ フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスの活
性に対する種々の抑制剤の効果を決定する実験を
行つた。フラクシヨン及び（第１表）を第４
表記載のように使用した。
る。酵素は広い範囲のPH（5.5〜10.5）で活性を
もつている。フラクシヨン（2.54μｇ）をこの
アツセイに使用した。 実施例 ５ フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスの活
性に対する種々の抑制剤の効果を決定する実験を
行つた。フラクシヨン及び（第１表）を第４
表記載のように使用した。
【表】
【表】
プロテアーゼが活性を示すためには金属イオン
を必要としないが、スブチリシン抑制剤及び
DFPにより強く抑制される。驚くべきことに
は、PMSFは何の効果も示さない。DFP感度と
PMSF感度とは通常一緒に現れるため、このこと
は異常なことである。 実施例 ６ 本実施例は第１表のフラクシヨンを試験酵素
として使用し、洗濯用添加剤としてのフラヴオバ
クテリウム・アルボレツセンス・アルカリ性プロ
テアーゼの効果を例示する。 この酵素の染み抜き能力はエイドゲネシツセ−
マテリアループリユーフングス−アンシユタルト
（ENPA）（Eidogenoessische−Material−
Pruefungs−Anstalt）−116、血液、牛乳、及び
墨汁で均一に汚れた維繊布の試験法（Test
Fabrics、Inc.、New York）により測定した。
使用した方法は米国インデイアナ州、エルクハル
ト（Elkhart、indiana）マイルズ・ラボラトリー
ズ（Miles Laboratories）社酵素製造部門の技術
サービス部（Technical Services Departmenh
of the Enzyme Products Division）発行の「染
み抜き試験法」（“Stain Removal Test”）
（Assay No.35095、p.99.1）である。この方法は
テイー・コイル（T.Coyle）記載の方法（J.Am.
Oil Chem.Soc.、46、515、（1969））と類似して
いる。 原料の洗剤基質はアメリカン・ホーム・アプラ
イアンス・マニユフアクチヤーズ・アソシエーシ
ヨン（AHAM）（American Home Appliance
Manufactures Association）の標準燐酸塩含有
洗剤組成物であつた。ガードナー（Gardner）
XL−20トリスチムラス（Tristimulus）色度計
（Gardner Laboratories、inc.、Bethesda、
Maryland）を測定に用い、活性はブランクに対
する適当な補正をした後、酵素の濃度の関数とし
ての反射率の変化で測定される。結果を第５表に
示す。 第５表 酵素（単位／） 反射率変化 1313 1.5 2625 2.5 5250 5.3 これらの結果によれば、反射率の変化（染み抜
きの程度）は試験系のアルカリ性プロテアーゼの
濃度増加に正比例することがわかつた。 実施例 ７ フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスによ
り同時につくられるプロテアーゼ及びグルコー
ス・イソメラーゼをこの実施例及び第６表に例示
する。
を必要としないが、スブチリシン抑制剤及び
DFPにより強く抑制される。驚くべきことに
は、PMSFは何の効果も示さない。DFP感度と
PMSF感度とは通常一緒に現れるため、このこと
は異常なことである。 実施例 ６ 本実施例は第１表のフラクシヨンを試験酵素
として使用し、洗濯用添加剤としてのフラヴオバ
クテリウム・アルボレツセンス・アルカリ性プロ
テアーゼの効果を例示する。 この酵素の染み抜き能力はエイドゲネシツセ−
マテリアループリユーフングス−アンシユタルト
（ENPA）（Eidogenoessische−Material−
Pruefungs−Anstalt）−116、血液、牛乳、及び
墨汁で均一に汚れた維繊布の試験法（Test
Fabrics、Inc.、New York）により測定した。
使用した方法は米国インデイアナ州、エルクハル
ト（Elkhart、indiana）マイルズ・ラボラトリー
ズ（Miles Laboratories）社酵素製造部門の技術
サービス部（Technical Services Departmenh
of the Enzyme Products Division）発行の「染
み抜き試験法」（“Stain Removal Test”）
（Assay No.35095、p.99.1）である。この方法は
テイー・コイル（T.Coyle）記載の方法（J.Am.
Oil Chem.Soc.、46、515、（1969））と類似して
いる。 原料の洗剤基質はアメリカン・ホーム・アプラ
イアンス・マニユフアクチヤーズ・アソシエーシ
ヨン（AHAM）（American Home Appliance
Manufactures Association）の標準燐酸塩含有
洗剤組成物であつた。ガードナー（Gardner）
XL−20トリスチムラス（Tristimulus）色度計
（Gardner Laboratories、inc.、Bethesda、
Maryland）を測定に用い、活性はブランクに対
する適当な補正をした後、酵素の濃度の関数とし
ての反射率の変化で測定される。結果を第５表に
示す。 第５表 酵素（単位／） 反射率変化 1313 1.5 2625 2.5 5250 5.3 これらの結果によれば、反射率の変化（染み抜
きの程度）は試験系のアルカリ性プロテアーゼの
濃度増加に正比例することがわかつた。 実施例 ７ フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスによ
り同時につくられるプロテアーゼ及びグルコー
ス・イソメラーゼをこの実施例及び第６表に例示
する。
【表】
グルコース・イソメラーゼ活性の１単位は１μモ
ルのグルコースを規定の条件下において１分間に
１μのフルクトースに変える酵素の量として定義
される。［ジー・ボグスラウスキー（G.
Boguslawski）及びエス・ダヴリユー・ベルチ
（S.W.Bertch）、J.Appl.Biochem.2、367−372、
（1980））参照］。 0.2％のグルコースを含む規定の媒質におい
て、プロテアーゼは合成されず、グルコース・イ
ソメラーゼは対照の約50％に低下する。
ルのグルコースを規定の条件下において１分間に
１μのフルクトースに変える酵素の量として定義
される。［ジー・ボグスラウスキー（G.
Boguslawski）及びエス・ダヴリユー・ベルチ
（S.W.Bertch）、J.Appl.Biochem.2、367−372、
（1980））参照］。 0.2％のグルコースを含む規定の媒質におい
て、プロテアーゼは合成されず、グルコース・イ
ソメラーゼは対照の約50％に低下する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 適当な栄養分を含む水性栄養媒質中において
回収可能な量の酵素を生成するのに十分な時間、
フラヴオバクテリウム・アルボレツセンス
（Flavobacterium arborescens）種の微生物を培
養し、該栄養媒質から微生物細胞を除去して該栄
養媒質をプロテアーゼ含有フラクシヨンとして残
し、そして該プロテアーゼ含有フラクシヨンから
アルカリ性プロテアーゼを採取することを特徴と
する微生物のアルカリ性プロテアーゼの製造方
法。 ２ 栄養媒質がすべて重量／容積基準で0.05〜
0.2％の酵母エキス、0.5〜2.0％のキシロース、５
〜10％のコーンステイープリカー、及び0.5〜1.0
％の燐酸カリウムを含む特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ３ 栄養媒質のPHを約6.8〜7.2のレベルに調節す
る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 微生物を29〜32℃の温度において16〜24時間
培養する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ プロテアーゼ産生微生物がフラヴオバクテリ
ウム・アルボレツセンスNRRL Ｂ−11022である
特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ プロテアーゼ産生微生物がフラヴオバクテリ
ウム・アルボレツセンスATCC 4358である特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ７ 遠心分離により微生物細胞を栄養媒質から除
去し、プロテアーゼを含む透明な上澄液を残す特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ８ プロテアーゼを、硫酸アンモニウムを上澄液
に加えて沈澱・濃縮し、次いでジメチルアミノエ
チル・セルロース上でイオン交換クロマトグラフ
イーにかけ、蔗糖勾配遠心分離を行なうことによ
り精製して均一化する特許請求の範囲第７項記載
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/425,713 US4429044A (en) | 1982-09-28 | 1982-09-28 | Preparation of an alkaline protease from flavobacterium arborescens |
| US425713 | 1989-10-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5978686A JPS5978686A (ja) | 1984-05-07 |
| JPS6151878B2 true JPS6151878B2 (ja) | 1986-11-11 |
Family
ID=23687725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58177167A Granted JPS5978686A (ja) | 1982-09-28 | 1983-09-27 | フラヴオバクテリウム・アルボレツセンスからアルカリ性プロテア−ゼを製造する方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4429044A (ja) |
| EP (1) | EP0104554B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5978686A (ja) |
| AR (1) | AR231306A1 (ja) |
| DE (1) | DE3370025D1 (ja) |
| DK (1) | DK442083A (ja) |
| MX (1) | MX7637E (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60192482U (ja) * | 1984-05-30 | 1985-12-20 | 株式会社 ダイワインダストリ | 無線機器の取付機構 |
| US4808526A (en) * | 1985-04-12 | 1989-02-28 | George Weston Limited | Continuous process for ethanol production by bacterial fermentation |
| US4808527A (en) * | 1985-04-12 | 1989-02-28 | George Weston Limited | Continuous process for ethanol production by bacterial fermentation |
| US4812410A (en) * | 1985-04-12 | 1989-03-14 | George Weston Limited | Continuous process for ethanol production by bacterial fermentation |
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| US4771003A (en) * | 1985-10-22 | 1988-09-13 | Genex Corporation | Heat stable alkaline proteases produced by a bacillus |
| US4764470A (en) * | 1986-02-05 | 1988-08-16 | Genex Corporation | Alkaline protease produced by a bacillus |
| US4840902A (en) * | 1987-05-04 | 1989-06-20 | George Weston Limited | Continuous process for ethanol production by bacterial fermentation using pH control |
| US4865983A (en) * | 1987-12-04 | 1989-09-12 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Cleaning compositions containing protease produced by vibrio and method of use |
| FR2652858B1 (fr) * | 1989-10-11 | 1993-05-07 | Snecma | Stator de turbomachine associe a des moyens de deformation. |
| US6960462B2 (en) * | 2000-02-08 | 2005-11-01 | Dsm Ip Assets B.V | Use of acid-stable subtilisin proteases in animal feed |
| US6855548B2 (en) * | 2000-02-08 | 2005-02-15 | F. Hoffman-La Roche Ag | Use of acid-stable proteases in animal feed |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4061539A (en) | 1976-10-20 | 1977-12-06 | R. J. Reynolds Tobacco Company | Preparation and use of glucose isomerase |
| US4283496A (en) | 1976-10-20 | 1981-08-11 | R. J. Reynolds Tobacco Company | Preparation and use of glucose isomerase |
-
1982
- 1982-09-28 US US06/425,713 patent/US4429044A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-08-22 AR AR293972A patent/AR231306A1/es active
- 1983-09-16 DE DE8383109162T patent/DE3370025D1/de not_active Expired
- 1983-09-16 EP EP83109162A patent/EP0104554B1/en not_active Expired
- 1983-09-27 DK DK442083A patent/DK442083A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-09-27 JP JP58177167A patent/JPS5978686A/ja active Granted
- 1983-09-28 MX MX83907U patent/MX7637E/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0104554B1 (en) | 1987-03-04 |
| DE3370025D1 (en) | 1987-04-09 |
| JPS5978686A (ja) | 1984-05-07 |
| MX7637E (es) | 1990-05-16 |
| EP0104554A3 (en) | 1984-08-22 |
| DK442083D0 (da) | 1983-09-27 |
| DK442083A (da) | 1984-03-29 |
| EP0104554A2 (en) | 1984-04-04 |
| AR231306A1 (es) | 1984-10-31 |
| US4429044A (en) | 1984-01-31 |
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