JPS6163293A - ヒアルロン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明ｆｄ：ヒアルロン岐生酸生成能する微生物（以下
、とアルｔ２／酸生産菌という。）によるヒアルロン酸
の製造法に関する。さらに詳しくは血清を添加した培養
液でヒアルロン酸生産菌を培養し、ヒアルロン酸を培養
液中に生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
るヒアルロン酸の製造法に関する。

を演じている。また該ヒアルロン酸は保水作用を有する
ところから、化粧品、創傷治癒薬、眼薬、関接炎治療薬
として広い需要がある。

従来、該ヒアルロン酸に土工業的にはニワトリのトサカ
、牛の関節、ヒトの１声帯もしくはクジラの軟骨などか
ら抽出法により得られている。

しかし、これら生体から抽出法により得たヒアルロン酸
は蛋白質やコンドロイチン等のムコ多糖と複合体を形成
しているので、分離精製に複雑な工程を必要とし、また
ヒアルロニダーゼが混在することが多いので、抽出工程
中で該ヒアルロン酸が分解されて分子量が低下し、保水
力が低くなるといった欠点がある。

これらの欠点を改良するために、ヒアルロン酸生産菌を
培養し、該培養液から直接該ヒアルロン酸を抽出し、精
製する方法が特開昭５８−５６６９２号公報に開示され
ている。

この方法は、ヒアルロニダーゼを含まないヒアルロン酸
生産菌を培養してヒアルロン酸を得る方法なので、前述
の生体からの抽出法のように、抽出工程で分解を受ける
ことが少なく、該ヒアルロン酸を抽出により動物組織内
から得る方法にくらべて簡単であり、経費も安いといっ
た利点がある。

しかしながら、この方法ではヒアルロン酸の生産量が培
守液１１当りせいぜい約１ｙ程度と少ないのが欠点であ
る。

本発明者らはヒアルロン酸の製造にかかわる上述一つ問
題点を解決するべく鋭意研究した。その結果、ヒアルロ
ン酸生産菌を血清を添加した培養液中で培養することに
よりヒアルロン酸の生産量を大巾に向上させることがで
きることを見い出し、本発明を完成した。

以上の記述から明らかなように、本発明の目的はヒアル
ロン酸生産菌を血清を添加した培養液中で培養したのち
、ヒアルロン酸を生成蓄積せしめ、これを採取すること
により大巾にヒアルロン酸の生産量を向上させることの
できる製造法を提供することである。

本発明は以下の構成を有する。

血清を添加してなる培養液にて、ヒアルロン酸生成能を
有する微生物を培養して、培養液中にヒアルロン酸を生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするヒアル
ロン酸の製造法。

本発明に用いるヒアルロン酸生産菌としては、ストレプ
トコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐ７ｏｇｅｎｅｓ　）　、ストレプトコッカス・エクイ
（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｅｕｓ　ｅｑｕｉ　）、ストレ
プトコッカス０エクイシミリス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ　）、ストレプトコッ
カス・ディスガラクチイエ（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｄｙｉｇａｌａｃｔｉａｅ　）、ストレプトコッカ
ス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｚ
ｏｏｅｌ）ｉｄｅｍｉｃｕａ　）、パスツレラ−？ルト
クダ（Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｒｎｕｌｔｏｃｉム）
などがあげられる。

本発明に用いられる血清は、牛、馬、豚、山羊、羊、ニ
ワトリまたはヒトの血清のうちいずれでもよい。また牛
の血清に関しては、胎児、新生児、分生または成牛のい
ずれの血清でもよい。さらに血清のかわりＫ、牛、馬、
豚、山羊、羊、ニワトリまたはヒトの全血を用いること
もできる。また血清のかわりにこれらの動物およびヒト
の血清から分画された成分を用いてもよい、該培養液に
添加する血清の量は０．３〜５．０容禁％好ましくは１
．５容禁％である。

該培養液の血清をのぞく他の成分は、通常の培養液の成
分を用いればよく、例えばブドウ糖２．０％、リン欲１
カリウム０．３％、リン酸２カリタム０．２％、チオ硫
酸ナトリウム０．０１％、ＱＲマグネシウム７水塩０．
０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、消泡剤０．５
％を含むｐＨ６，０〜８．５の成分の培養液を用いるこ
とができる。（ただし％はいずれもｆｆ１ｆ／容量％で
ある。）本発明のヒアルロン酸の製造は、まず血清を含
まない培養液を加圧蒸気波菌等でｆＩＲＷＩシたのち、
冷却し、該培養液の温度が４５°Ｃ以下になった時点で
血清を無菌的に該培養液に添加する。

ついでヒアルロン酸生産Ｖｉを該培養液に接種したのち
、該培養液を逃気攪拌もしくは静置して温度２５〜４０
℃、好ましくは３５°Ｃにて、ｐＨを６．５〜８．０、
好ましくは７．０に制御して培養する。上述の条件で２
〜４日間培養したのち、該培養液を遠心分離もしくは濾
過によって除菌し該炉液を限外濾過もしくは透析するこ
とに界面活性剤による分画沈殿、イオン交換クロマトグ
ラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーなどの公知
の手段によって、生成したヒアルロン酸を精製する方法
により行なわれる。

培養液ＶＣ添加された血清の作用の詳細は不明であるが
現在のところ次のように推測される。

すなわち、添加される血清中には微量の溶菌酵素が含ま
れており、ヒアルロン酸生産菌は該溶菌酵素から自分自
身を守るため、自分の周囲にヒアルロン酸を多量に分泌
するのではないかと考えられる。つまり溶菌酵素によっ
て、ヒアルロン酸合成酵素活性が誘導されるためではな
いかと推測される。

以上記述した本発明の製造法を用いることにより、従来
の培養法では培養液１１あたシせいぜい１ｙ程度のヒア
ルロン酸しか生産できなかったものが、篤くべきことに
培養液１１あたり５〜６１と従来の培養法の５倍以上の
ヒアルロン酸を生産することができることが判明した。

また本発明により得られるヒアルロン酸は不純物の含有
量がきわめて少なく、高純度のヒアルロン酸であり、医
薬品、化粧品の用途に適したものであることも判明した
。

さらに本発明の製造法では上述のヒアルロン酸の生産性
が５倍以上に向上するところから、若干高価な血清を用
いるにもかかわらず従来の培養法にくらベヒアルロン酸
の製造経費を大巾に節減できることも判明した。

以上記述したように本発明に係るヒアルロン酸の製造法
は純度の高いとアルクン酸を高い生産性で製造できる方
法であることが確証された。

以下実施例および比較例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれにより限定されるものではない。

実施例１、比較例１ ブドウ糖２．０％、リン酸１カリウム０．３％、リン酸
２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム００１１％、
硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム
０．００２％および大豆油１．０％（ただし％はいずれ
も重量／容量％を示す。）からなるＰＨ７，０の培養液
１．５１に牛新生児血？？　２２．５１を無菌的に加え
、ストレプトコッカス・エクイの前培養液１００ｍ１を
接種し、毎分３００回転、通気ｆ４０．７　ｖｖｍ　％
温度３５℃で、ｐＨを７．０に自動制御して４０時間培
養した。

その後培養液にさらにブドウ糖２５９ｆｅ無菌的に加え
て１０時間培養したのち、該培養液にイオン交換水１．
６１を加えて遠心分離し、菌体を除去した。得られた上
澄液に希塩酸を加えてｐＨを５．５に調整し、それを中
空糸限外ｐ過器にて０．７５１　ＫＤ、＠　Ｌ、さらに
イオン交換水に対して透析した。この液を用いて、エチ
ルアルコールによる沈殿分別、塩化セチルピリジニルア
ンモニウム処理、イオン交換セルロファインによるクロ
マトグラフィー等の公知の方法にてＩＪ製し８．７ｇの
精製ヒアルロン酸ナトリウムの白色粉末を得た。

培養液１１幽り５，８ノの生産量であった。

この精製ヒアルロン酸の蛋白質含有量はＯ，ＯＳ重量％
であった。またセファロース６Ｂによるゲルー過クロマ
トグラフィーで分子ｆｔ’を測定したところ２　Ｘ　１
０’ダルトンであった。ウサギに本ヒアルロン酸す）　
ＩＪウムの１重世％生理食塩水を静注したが発熱反応は
みられなかった。

また比較例１として、実施列１の培、−ｉ液よシ血清成
分を除いた成分の培養液を用いるほかは実施例１と同様
の条件、方法によりヒアルロン酸生産菌を培養し、実施
例１と同様の処理、精製を行ない０．９ｇのｆ＃製ヒア
ルロン酸ナトリウムの白色粉末を得た。培養液１４当り
ｏ、６ｙの生産量であった。

以上

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）血清を添加してなる培養液にて、ヒアルロン酸生
   成能を有する微生物を培養して、培養液中にヒアルロン
   酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
   ヒアルロン酸の製造法。
2. （２）血清として牛、馬、豚、山羊、羊、ニワトリまた
   はヒト血清を用いる特許請求の範囲第（１）項に記載の
   ヒアルロン酸の製造法。
3. （３）血清として牛、馬、豚、山羊、羊、ニワトリまた
   はヒトの全血を用いる特許請求の範囲第（１）項に記載
   のヒアルロン酸の製造法。
4. （４）血清として、牛、馬、豚、山羊、羊、ニワトリま
   たはヒトの血清から分画された成分を用いる特許請求の
   範囲第（１）項に記載のヒアルロン酸の製造法。