JPS6163700A - シアリル化されたＬｅｗｉｓｘエピト−プ，抗体及び診断 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 腫瘍関連抗原に向けられたモノクローナル抗体について
今まで多くの報告がある。しかしながら、これらのうち
少数の抗体のみが血清中の腫瘍関連抗原を検出するため
に有用であると知られている。

大部分、抗原が腫瘍性組織に関連しているが、隣接の正
常組織には関連しないことが見出される場合において、
その抗原は他の部位では正常組織に存在していることが
その後見出される。従って、多くの場合誤りた陽性の程
度が診断として抗原の検出に対してどんな価値をも破壊
する。

技術の現状において、生理液体中の抗みの検出が癌の完
全な予言者であることは必要でない。

腫瘍が取り除かれる多くの場合、腫瘍の効果的除去又は
腫瘍が引き続き存在しているかの診断として、特異エビ
トビツクマーカーの生理液体中における存在の変化をだ
れでもがモニターすることができる。他の場合において
、確実に腫瘍状態を見分けるために２又はそれ以上のマ
ーカーが使用されるかも知れない。さらに他の場合にお
いて、腫瘍を見分けるために、マーカーが正常な細胞と
比較して腫瘍細胞の表面上に、十分に多く分布すること
のみが必要であるということが想像される。

従って、腫瘍に関する特異エビドーグを定義することが
できることは非常に価値があシ、このエビドーグとは、
生理液体〔たとえば血液又は血清〕における腫瘍の診断
を、合理的な正確さで可能にし、この場合、マーカーは
単独で又は、他のマーカーと接合において用いられる。

〔従来の技術〕

（１９８２）１：１３３２〜１３３３は、消化管筋の指
標としてのＬ＠ｗ１ｍ血液型の診断に関する１９−９と
称するモノクローナル抗体を報告している。この抗体は
、結腸癌患者からの血清の約６０チと反応する。マグナ
ニ、など、、キャンサーリ５４８９〜９２は、１９−９
が結合する抗原が、癌患者の血清中に放出されるムチン
上に存在するエビドーグ又ｉｒｔリアリレイトＬ＠ｗｉ
ｍ’構造であることを報告した。バスト、など、、工、
−イング８８３〜８８７は、高分子量グリコタンパク質
であシそして卵巣癌腫をもつ患者の血清中に８２−見出
されるＣＡ１２５と称する抗原と反応するモノクローナ
ル抗体を報告している。ラウパラ、ジ（１９７６）２５
１ニア５１７〜７５２０は、ヒト腎臓の新しいガングリ
オシドとしてラクト−Ｎ−フコペンタオース■のシアリ
ル化（Ｓｉａｌｙｌ島ｔ＠ｄ）誘導体（これはシアリル
化し＠８と呼ばれる）を公表している。

新生物におけるシアリル化（Ｓｌａｌｙｌａｔｉｏｎ）
の重要性は多くの報告の主題であった。たとえば次の文
献を参照のこと：ウオレン、など、、プロスｏｆ　ｔｈ
ｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉ
ｅｎｃｅｓ　ｏｆグアンビーク、など・、プリティ、シ
ュジャーナルオプキャンサ−（Ｂｒ１ｔ１ａｈ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆＣａｎｃｅｒ）（１９７７）３６：１５
７〜１６５；（１９７８）５１６：９７〜１２７；グリ
、り。

バイオケミストリイ（Ｂｌｏｃｈ＊ｍ１ｓｔｙｙ　）　
（１９７９）１８：２５２５〜２５３２；及びユージイ
ースウォレン及びタオ、バイオケミカルアンドバイオフ
ィジカルリサーチコミュニケーションＣｏｍｍｕｎｌｃ
ａｔｌｏｎａ　）（１９８０）　９５　：　１４５２〜
１４６０．癌細胞に対して生ずる多くのモノクローナル
抗体はシアリル化されたＬｅｗ１ｍ’　（マグナニ、な
ど、ｌジャーナルオプデパイオロジカＣｈ＠ｍ１ａｔｒ
ｙ）（１９８２）２５７：１４３６５〜１４３６９　；
　）　；　Ｌｅｗｉｍ”　（ブロックハウス、な１３２
２３〜１３２２５）；及びＬａｔｉｎ”　（ハコモリ、
など、、バイオケミカルアンドバイオフィズイカルリサ
ーチコミ、ニイケーシ、ン（Ｂｌｏｃｈ＊ｍ１ｅａｌ　
ａｎｄ　Ｂｌｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ＲａｓｓａｒｅｈＣ
ｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）（１９８１）１　００　
　：　　１５７８〜１５８６）のような末端炭水化物構
造に対してその主たる活性を持つものとして報告されて
いる。

以下余白 〔す６明の敬約〕 血清中のシアリル化されたＬｅｘエビドーグ又は構造を
含む分子の検出が診助として使用される。

シアリル化されたＬｅｘ　（構造）に対するモノクロー
ナル抗体は、種々の用途において、すなわち診け［及び
治療におけるＩｎ　ｖｉｔｒｏ及びＩｎマ１マ０の両者
において使用されうる。モノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドマは、他の細胞を形質転換し、その細胞をモ
ノクローナル抗体産生性にするために、又は免役ダロプ
リンの発現のための遺伝子源として用いられることがで
きる。

〔特定の実施態様の説明〕

功しい方法及び組成物が、次のような構造、ＮｅｕＡｃ
α：’＋３Ｇａｌβ１→４Ｇｌ　ｃＮＡｃ／　１＋３Ｇ
ａ　ｌβ→↑ Ｆｕｃαｌ 金持ち、そして／又はＣ５ＬＥＸＩと命名されたモノク
ローナル抗体に結合しているエビドーグの存在の検出の
ために提供される。このエピトープは肘瘍細胞、及び相
当数の正常組織上に高発生率で存在していることが見出
される。

エビドーグはＬｅｗｌ・”１４造のシアリル化型である
ことによって特徴づけられている。それは一般的にＣＳ
ＬＥＸ１抗体による、細胞性テストによって決定される
ように１粒球上に見つけられるがしかし、同じ細胞毒性
テストによって明らかなように、リッツ１球、単球、血
小板及び赤血球細胞に関連していることは見出されない
。それは、またほとんどの白血病−リンパ腫系上でも、
明らかでない。

シアリル化されたＬｅｘエビドーグは、正常組織及び食
道の腺と粘膜、いくらか膵臓の豚房細胞及び結腸の深陰
窩の限定部位、及びＨ＠ｎ　１　ｅの近位紙管及び下降
係蹄において見出すことができる。抗みは、ｌＩＪ、肺
、脳、胸腺、皮膚、卵巣、子宮、副腎、及び筋肉のテス
トされた正常組織においては検出されない。

シアリル化されたＬｅｘエビドーグは、胃、結腸及び膵
臓の腺癌を含むいろいろな癌、並びに食道、胸、及び卵
巣のＩＦＩ８瘍上に存在する。

エピトープは、またＣＦＵ−、Ｃ上のＣＳＬＥＸ１抗体
の効果によって立証されているように、顆粒球の前駆細
胞上に見つけられる。

ンアロシルラクトフコインタオシル（Ｉｎ）セラミド及
びシアロシルジフコシルガングリオシド（ＶＩＢ）とし
てシアリレイト　Ｌｅｘ構造は、検出されそして、他の
多くのガングリオシド類、セラミド類及びグロゲシド類
から区別され得る。

シアリル化されたし＠８構造はヒト腎臓に存在するグリ
コリピッド上で検出された（ラウパラ、ジ（１９７６）
２５１ニア５１７〜７５２０）。そしてグロナーゼによ
る活性の部分的低下及び結腸線心における管の管腔含有
物中におけるそのムチンの存在によって明確なようにた
ぶんムチン上に存在する。

７アリル化された型のＬｅｘは、広く種々の方法におい
て用いられ得る。シアリル化されたＬｅｘに対する４リ
クローンナル抗血清の生成のための又は好ましくはシア
リル化されたＬｅｘに対するモノクローンナル抗体のた
めの免疫原を得るための抗原と接合したＡｆテンとして
、それを用いることができる。この抗体はＩｇＭ　、　
ＩｇＧ又はＩｇＡ、特ｌｃＩｇＭ又はＩｇＧ　　である
。抗体は、血液中に存在する補体又は他の細胞溶解活性
との組み合せにおいて、細胞毒性又は非細胞毒性を示す
かも知れない。

シアリル化されたＬｅＸは、診断検定において試薬とし
て使用のために修飾することができる。すなわち検出可
能なシグナルを供給するラベルＫ。

受容体（たとえば抗体）を通して共有的に又は非共有的
にハゲテンが接合される。例示的ラベルは、放射性同位
元素（ｆｃ）：、工は’Ｈ、”’Ｉ　、　”’Ｉ　）　
；螢光物（ｆｃとえばフルオレスセイン、フィコピリタ
ンパク質、稀土類キレート、ダンシル、ロダミン、等）
；酵素基質及び酵素阻害物質；酵素（たとえばホースラ
ディシュパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
グルコースー６−ホスフェ−トデヒドロソナーゼ、アセ
チルコリン一二ステラーゼ、等）；粒子（たとえば、デ
キストラン。

アガローズ、金属粒子、磁気粒子、ポリスチレン粒子、
等）もしくは、同様の物を含んでいる。種杜のラベルに
ハプテンを接合する方法は、広く文献に記載されている
。たとえは、アメリカ特許番号３，８１７，８３７；４
，１３４，７９２；及び４．２２０，７２２を参照のこ
と。結合の部位は、シアリル化されたラクト−Ｎ−７コ
インタオース■である必要はないが、しかしＬ＊”抗原
に接触した基（たとえばホスフｔリビッド、結合基、も
しくは同様の物）に接触した基を通して、結合されるか
も知れない。

すでに指摘したようにハプテンは、抗体を誘発するだろ
うイムノグンを供給する抗原と接合することができる。

一方、ノ・ブテンを担持する細胞（元のままの又はフラ
グメントとしていづれかの）は、適切な背椎動物におい
て免疫反応を誘発するために、使用され得る。特に、通
常の技法（コア（１９７５）２５６：４９５〜４９７）
に従ってバグテンに対して特異なモノクローナル抗体を
産生ずることが望ましいだろう。どの種かが、モノクロ
ーナル抗体を調製するために用いられる場合、最とも便
利であシ及び有用に利用可能な融合パートナ−を持つの
で、大部分マウスが使用されるだろう。しかしながら、
人間の治療に卦いて又は人間においてインビゴイメーノ
ングにおいて使用のために、ヒトモノクローナル抗体を
１７）３５することが望ましいかも知れない。例示的な
ヒト融合ノー−トナーは、１９８１年３月２６日に提出
された出願番号２４７，６５２及び１９８２年１月２７
日に公表されたヨーロッノ々特許出願００４４７２２に
見い出される。宿主の免疫化、融合、クローン化、選択
及びモノクローナル抗体の単離のための技法は、十分に
確立されていてそしてさらにここで説明する必要はない
。この目的のために、この開示を引用にようこの明細書
中に組み入れる。

モノクローナル抗体は診断、治療、インピビイメージン
グ、もしくは同様の事に使用される。特カニの使用に依
イｆして、抗体は、独自に又は、共有的に又は非共有的
に抗体に接合した他の物質と共に用いることができる。

ハプテンと共に使用のために、すでに記載したのと同タ
イグのラベルを、訟断検定において用いるために、抗体
と共に使用することができる。インビトロイメーソング
のために、ここで記載されたもの以外の放射性核種（特
にテクネチウム、ヨードもしくは同様の物）が使用され
るだろう。

使用されるラベル化は通常の技法に従いそして抗体当υ
のラベルの数は、ラベルの性質、所望のシグナルの感屁
、ラベル化の目的、及び同様の事に依存して変わるだろ
う。血液、血清又は血漿中のシアリル化されたＬ＠”ハ
ゲテンを含む分子の検出のための多くの種々の診断検定
においてモノクローナル抗体が使用される。多くの検定
は、広範囲ないろいろのハプテン（これはこの発明にお
いて適用される）の検出のために抗体とともに使用する
方向に開発されてる。上で引用したアメリカ特許を参照
のこと。

＊’４　ｍされるハイブリドマは、柚々の方法において
、たとえば特定の抗体についての遺伝子コード源として
所望の抗体を作る新ハイブリドマを付与する他の融合ハ
ードナーとの融合のために、ハイブリドマ以外のものに
よる抗体の製造法を開発するために使用するため罠、又
はハイブリドマの結合部位が検定に使用される場合の試
薬としての使用目的のために使用することができる。

完全な抗体を、使用する必要はなく、むしろ単にフラグ
メント（たとえばＦａｂ　、　（Ｆａｂ’　：、　、　
Ｆｖ　　。

もしくは同様のもの）が使用される。

ネズミモノクローナルＩｇＭ（ＣＳＬＥＸ１と命名され
た）が特に興味の対照である。

次の例は、限定的でなく、例示的に提供される。

生後４〜６週間の雌のＢ　Ａ　Ｌ　Ｅ　／　ｃ　マウス
を、フロイント完全アノユパント中に乳化された両線癌
組織（３２−ＯＰ−Ｔ−３Ｔ　）からの０５ｍ９Ｆｌｒ
　ｌ　７パク質を用いて皮下に免疫化した。ｒｉ］量の
膜タンバク質による２回の追加免疫注入を、２週間隔で
行なった。３日後、肺臓細胞の融合を、牌Ｐくプラスト
細胞のＰａｒｃｏｌｌグラノイエントｖＡ縮を使用しな
がら、ＫＯｈｌ＠ｒ及びＭｌｌｓｔｅｉｎの修飾された
方法によって骨髄腫Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３Ｃ力
１２３：１５４８〜１５５０）と共に行なった。

融合の後２過間、上滑液を、ＥＬＩＳＡ及び微細胞毒性
テストによって、抗体生成について分析した。

１３８の肉眼的なりローンを、融合の後同定し、これら
のうち１７個は、免疫組織と反応するが、しかし正猟な
胃及び結腸とは反応しない。このＩ・イブリドクローン
を、限界希釈法によって二度サブクローンし、そしてＢ
　Ａ　Ｌ　Ｂ／　ｃ　　マウス中に継代’ｆａ　８し、
腹水を生成せしめた。

組織、　いろいろな脂管からのヒト腫瘍組織を手術で得
、そして−８０℃で保存した。正常なヒト組織を、死体
腎臓提供者及び腫瘍性疾患を有しない患者の死体解剖か
ら得、その次即座にイソ４ンタンドライアイスの混合物
中で冷凍しそして一８０℃に保存した。

細胞糸、　胃癌細胞系（Ｈ，ホンソヨーによって確立さ
れたＭＫＮＩ　、ＭＫＮ２８　、ＭＫＮ４５、及びＭＫ
Ｎ７４並びにＭ、セキグチによりて確立されたＫＡＴＯ
−ｍ）を、日本の新潟大学（Ｈ，ワタナベ教授）の第１
病理学課から得た。胃癌系ＭＫ−９２はＳ、ムカイ及び
Ｙ、クロス（日本大学１日本）によって確立された。肺
及び結腸癌系（ＰＣ−１。

ＰＣ−３，ＰＣ−６，ＰＣ−７，ＰＣ−８，ＰＣ−９、
ＰＣ−１０、ＰＣ−１２、ＰＣ−１３。

ＰＣ−１４，ＱＧ−５６及びＣ−１）を、Ｙ、ハヤタ（
東京医科大学１日本）及びに、タナ力（先回大学１日本
）から得た。結腸細胞系Ｍ−７６０９を、Ｍ、ツクシマ
（弘前大学２日本）から得た。食道癌系（ＴＥ−１及び
５ＨＩ）は、Ｔ、ニジヒラ（東北大学２日本）及びイイ
ズカ（国立病センター、日本）によって確立された。こ
の研究において使用される他の細胞系を、Ａｍ＠ｒｌｃ
ａｎ　ｔｙｐ＠Ｃｕ１ｔｕｒｅ（：ｏｌｌ＠ｃｔｌｏｎ
から得た。すべての細胞系を１５チの子牛の胎児血清（
ＰＣ３）　、ペニシリン及びストレプトマインンによっ
て補われたＲＰＭＩ−１６４０培地での４＠養によって
維持した。

設￥ｔ、、ｌ製法、　粗膜分画を、冷凍組織から分離し
た。要約すれば、検体を、１ｍＭフェニルメチルスルフ
ォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及び２ｍＭ塩化カルシ
ウムを含む、ｐＨ７，４で、４℃のＰＢＳ中で、解凍し
た。細かくした後、細胞を、細胞破壊ボンベにおいて破
壊し、次に破壊された細胞の分別遠心分＝ｍを行なった
。この粗膜分画を、ＰＢＳ中に再懸濁しそして一８０℃
で保存した。

ング ミクローＥＬＩＳＡテストのために、テラサキ組社冶養
平板（Ｆａｌｃｏａ　）を杜々の膜分画（声９６のｌ炭
敲塩緩衝液において２５μｍ／ｄで）によシ４℃で１晩
抜盈した。ＰＩＩＳ　−０，０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０
　　’中で洗浄の後、ウェルを亜炭酸塩緩衝液中、１多
オバルプミンにより、３７℃で１時間被覆オパルプミン
の除去の後、５μｔのサンプルを添加しそして３７℃で
２時間インキュベートした。３回の洗浄（ＰＢＳ−０，
０５％Ｔｖｅ＠ｔ＋２０により）の後、５μｔのパーオ
キシダーゼでラベルされたヤイ抗マウスＩｇ　（ＩｇＧ
＋ＩｇＭ　）　（ＫＰＬ　　５ビラトリイズ）を、反応
させるために３７℃で１時間放飯した。

５回の洗浄の後、５μｔの０−フェニレンノアミンを、
室温で添加し１５分分間−た。この反応を２．５Ｍ硫酸
で止められた。光学濃度を、ＤｙｎａｔａｃｈＴＲ２０
０リーダーにより４９２ｎｍ′ｔ′測定した。

補体依存のマイクロサイトドキシティテストを、標準ミ
クロ技法（テラサキ、など、アメリカンノヤーナルオプ
クリニカルパソロジイ（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　）
　（１９７８）６９：１０３〜１２０）により実施した
。要約すれば、１μｔの抗体を、約１５００目標細肥と
３０分間インキュベートし、次にウサギ補体と共に２５
℃で１時間インキュベートした。生存は、染料υ１除に
よって査定された。

以下全白 間装的免疫螢光検定 ５０μｔのおおまかに希釈した抗体と、細胞を室温で３
０分間反応することによって、間接的免疫螢光法を実施
した。ＰＢＳ−０，０１％ナトリウムアジドによる３回
の洗浄の後、細胞を、ＦＩＴＣ−接合されたヤギ抗マウ
スＩｇＭの５０μを中において、４℃で、３０分間イン
キュベートし、次ＩＣ３回洗浄した。細胞を螢光顕、微
鏡法によシ試験し、１０〜２０μＰ／ｄのマウス骨髄種
１ｇＭを負対照として用いた。

イムパーオキシターゼ染色法によって、反応性抗原の免
疫化学的局在定位を検査するために正常な及び腫瘍性の
新鮮々組織を用いた。Ｔｒｉｍ−緩衝溶液（ＴＢＳ）中
、４％ホルマリンにおいて、１．５〜５分間固定され、
低温槽で製造された組織断片を、１チウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を含むＴＢＳ中に希釈されたモノクローナ
ル抗体と共に室温で１時間培養した。５〜１０μ？／−
のマウス骨髄腫ＩｇＭを、負対照として用いた。ＰＢＳ
中で洗浄の後１：１００Ｋ希釈された、ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ＋ＩＩＭ（ＫＰＬ　　ラゴラトリイズ）のノぐ−オ
キシターゼ接合Ｆ　（ａ　ｂ’　）　２を、室温で４５
分間組組織片に加えた。ＰＢＳ中で洗浄の後、ｐＨ５，
２及び０．０１％Ｈ２０□で、０．０２Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液中、０．０２１％ｗ／マ３−アミノー９−エチ
ルカル？ゾル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　）にお
いて、６分間長ライドを処理し、次に、ヘマトキシリ／
にょシ対比染色しそしてグリセロール／ＰＢＳにおいて
固定Ｌ７’ｈ。

酵素処理 ！ロナーゼ（６０μＰ１０．１ｄ、　Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｓｍ−Ｂ＠ｈｒｉｎｇ　、　Ｓａｎ　Ｄｉｓｇｏ　、　
ＣＡ　）　、　　）リグシン（５００＃Ｐ１０．１１１
４　、　Ｗｏｒｃｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈ＠ｍｌ　
−ｃａｌ　、　Ｆｒｅ＊ｈｏｌｄ　、　ＮＪ　）　、　
７４シｙ（１０μＦ１０．１１Ｉｊ、５１ｇｎ５　Ｃｈ
＠ｍ１ｃａｌ、ＳＬ、Ｌｏｕｉ＊、ＭＯ）。

ノイラミニダーゼ（０，５ＩＵ／ｄ　、　０．Ｉ　ＩＵ
／ｍ／　。

０、０２１Ｕ／Ｍｌ　、　Ｖ、Ｃｈｏｒｅａ　、　Ｃａ
ｌｂｉｏａｈｅｍからの）、及び過ヨウ素酸ナトリウム
（５ｍＭ　）を使用して、標準ＥＬＩＳＡ技法によりて
、免疫化用青線癌組織の酵素処理を行なった。この酵素
反応は、３７℃で１時間行った。

イムノ々−オキシターゼによるノイラミニダーゼｃｌ＠
ｎｓ　）由来、　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　）を用いて、
３７℃、２時間のインキュベートによシ行なった。

ＯＦＵ　−Ｃ検定 ＣＦＵ−Ｃ検定のために、１０％ＦＣ３を含むＲＰＭ１
１６４０培ｉ中３　Ｘ　１０’／ｍＴｃＤ骨髄細胞懸濁
液５０μｔを、いろいろな希釈のモノクローナル抗体の
溶液２５μｔと共に３７℃で３０分間インキュベートし
た。正常のウサギ血清を、袖体源として添加しそして６
０分間続けてインキュベートした。この処理された細胞
（１ｘ１ｏ’）を、２０％ＦＣ８＃　２０　％　ＰＨＡ
　−ＬＣＭ　（７４）　ヘム７　／’ルチニン）及び０
．３％寒天を含むα培地と共に混合しそして次にミクロ
グレート上に置いた。５％の二酸化炭素空気中、３７℃
で１０日間の培養の後ニア０ニーにつき４０細胞以上を
有するコロニーの数を計数した。この結果は対照と比較
して二ロ二−形成細胞のチ回収として表した。

決定は、カア一二一、など、、キャンサーリサ４９９７
〜５００５によシ記載された方法にょシなされた。おの
おののウェルを、１０ｎ）の糖脂質、並びに５　Ｏｎ）
のレシチン及び３０　ｎ９−のクロレスチロールによシ
被覆した。この固層放射免疫測定法において使用される
独々の糖脂質の構造並びＫ、下記のＴＬＣ免疫染色検定
において使用されるね々の糖脂質の構造は、第６表に示
されている。

ＴＬＣ免疫染色法を、マグナニ、など、、アナ４０２の
方法を用いて、Ｂａｋ＠ｒのＨＰＴＬＣミ；−グレー）
（５Ｘ６ｅｌｎ）上で行なった。抗体を３ｏ。

倍に希釈しそして非特異染色を最小にするためにＴＬＣ
グレート上に適用した。

以下余白 結　果 正常な末梢血ｇｌ細胞及び白血病−リンパ腫系に対する
反応性 第１表に示めされるように正常なパネル細胞及び白血病
−リン・４腫系によ、９　ＣＳＬＥＸ１モノクロ一ナル
抗体の細胞毒活性を検査した。

以下５τ白 第１表：正常なパネル細胞及び白血病／リン・平原系に
対するモノクローナル抗体 Ｔ−リンパ球　　　　１１０　　　　０Ｂ−９７７４球
　　　　５５　　　　０単球　　　２１０ 顆粒球　　　　　　　２０　　　　２０　　１．１０血
小板　　　　　　　１５０ ＲＢＣ：Ａ　　　　　　プール　　　　　ＯＢ　　　　
　ゾール　　　　　０ ＫＭ−３，Ｒｅｈ ＡＰＬ系　　　　　　１　　　　１　　１：１０’〜１
０５Ｌ−６０ 組織法リンパ腫系　　　１　　　　１　　１：１０４〜
１０５ＩｇＭ抗体（腹水力価１：１０’）は、テストさ
れる顆粒球に対して細胞毒性を示し、そしてテストされ
るリンパ球、単球、血小板、及び赤血球に対して、非サ
イトドキシイーであった白血病−リンノや腫系において
、それは、２つの細胞系、検定されるＡＰＬ系（ＨＬ−
６０）及び組織法リン１５腫系（Ｕ−９３７）だけに反
応性を示すが、しかし、検定されるＴ−ＡＬＬ系（８４
０２，ＣＥＭ、ＭＯＬＴ−４゜ＨＰＢ−ＭＬＴ）、Ｂ−
リンツク腫系（Ｄａｕｄｉ　、　Ｒａｍｏｓ。

Ｒａｊｉ　、Ｗｅｌ　）　　、及びＣＡＬＬ系（ＫＭ−
３，Ｒｅｈ）には反応性を示さなかった。これらの白血
病−リンパ腫系に対するＣＳＬＥＸ１の免疫螢光法は同
一の結果を得た。

３４の種々の腫瘍細胞系が、第２表に示されるように、
ミクロサイトキシティー、免疫螢光法及び免疫パーオキ
シターゼ染色法によって反応性について検定された。Ｃ
ＳＬＥＸ１は、２つの胃癌系（ＫＡＴＯ−［１及びＭＫ
Ｎ２８）１１つの肺腺癌系（ＰＣ−３）、３つの肺鯨状
細胞癌系（ＰＣ−１゜ＰＣ−９，ＱＧ−５６）、５つの
結腸腺癌系（Ｃ−１、Ｍ７６０９　、Ｃ０ＬＯ２０５、
ＷＩＤｒ　。

Ｃ０ＬＯ３２０）、２つの肺癌系（５Ｋ−ＢＲ−２［［
及びＢＴ−２０）、及び１つの食道腫瘍系（ＴＥ−１）
により生じる。３４細胞系のうち合計１４（４１チ）と
共に陽性反応を示した。特に高頻度の陽性反応性は、結
腸腺癌系に観察された（７のうち６又は７１チ）。

以下余白 １１＋１ｌｌｌ＋ｌ＋　　　　＋＋ １１＋１ｌＩｌ　　　＋　　ｌ＋　　　　　　＋　＋止
′１、−及び９性組〜Ｉβ７におけるＣＳＬＥＸ１抗原
の組織分布 免疫パーオキンダーゼ染色法によって、ＣＳＬＥＸ１抗
体反応性抗原の組織分布は、第３表に与えられている。

正常組織の強い陽性染色は、食道腺及び食道粘膜におい
て、並びに腎臓のＨｅｎ１ａの近位側％及び下降係蹄に
おいて観察される。弱い染色は、結腸の深陰窩のひじょ
うに限定された部分に、膵臓の腺房絢胞に、肝属（の肝
細胞及びＫｕｐｆｆｅｒ＃ｉ胞、及び顆粒球において観
察された。抗原は、検定される胃、肺（肺胞のマクロフ
ァージを除く）、脳、胸腺、皮膚、卵巣、子宮、副腎、
筋肉、もしくは結合組織において検出されなかった。

７４の種々のテストされた腫瘍組織が第４表に示されて
いる。鷲くことに、ＣＳＬＥＸ１抗体によって認識され
る抗原が多くの癌において検出することができた−１７
の両線癌のうち１６．１７の結膜腺癌のうち１３．１６
の肺腫瘍のうち１０．４の食道ルＱ瘍のうち２．３の膵
臓腺癌のうち３．８の胸肝瘍のうち２、及び６の卵巣腫
瘍のうち３である。マウス骨髄ルｉｉＩｇＭ（５〜１０
μｍ／ｄ）は、コントロールとして用いられそしてこれ
らの組織のどれとも反応しなかった。すべてのサンプル
は腫瘍組織だけを含んでいたが、しかし、１７の結腸腺
癌サンプルのうち６が腫瘍組織及び隣接の正常組織を含
んでいた。これらの６のサンプルのうち５つにおいて、
正常の組織部が染色されなかった。

陽性に反応する結腸腺癌サンプルの癌性部は、管癌の先
端の細胞質及び管腔含有物において染色を示した。ムチ
ンレイクを含む４の胃サンプルのうち３及び８の結腸サ
ンプルのうち８が、たぶんムチン上の抗原の存在によっ
て、この抗体と陽性反応を示した。ＣＳ　ＬＥＸ　１に
よる腫瘍組織の高頻度の陽性染色は癌細胞の分化度には
関係なく、腺癌、たとえば胃、結腸、及び肺において観
察された。

陽性染色性は、またいくらかの鱗状細胞癌サンプル中に
おいて観察された。ＣＳＬＥＸ１抗体は、テストされる
７４腫瘍のうち５０（６８％）と反応し魁　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　、下本臼第３表：正猟
な、８＋１織におけるＣＳＬＥＸ１抗原の組織分布 組　織　　　　　反応性 造血器／リン・母系器官 ＲＢＣ−ｂ 顆粒球　　　　　　　　　　　十 リンパ球　　　　　　　　　　　− 胸腺（３１ａ− 膵臓（４）　　　　　　　　　士複数のＰＭＮ及び網状
赤血球Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞（６）　　　　　　　　　±
神経系 脳　（２）− 叢　　　　　　　　　　　− 末梢神経　　　　　　　　　　− 消化系 食道（４）　　　　　　　　　什粘膜及び食道豚胃　　
（２）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−結
腸（１υ　　　　　　士いくらかの深陰窩の限定部肝臓
（６〕　　　　　　　士肝細胞 第３表（続き） 組織　　　　　　反応性 膵　臓（８）　　　　　　士腺房細胞のいくらかの部分
胆　管（６）− 膵臓管（８）− 尿道 腎　臓（８）　　　４）Ｈｅｎｌｅの近位細管及び下降
係蹄尿　管　　　　　　　　　　＋上皮 肺（６） 肺胞Ｍ　　　　　　　　　　　± 柔細胞　　　　　　　　　　　− 気管支　　　　　　　　　　　− 皮膚（１） 外皮　　　　　− 結合組織　　　　　　　　　　− 汗腺　　　　　− 血管系 動脈　　　　　− 静脈　　　　　− ？１”７３表（続き） 他 卵巣（１）− 子宮（１）− 副腎（１）− 筋肉　　　　　　　　　− ａ＝テストされたサンプル截 ｂ＝ニスライド評価のために、′材料及び方法”第４表
＝Ｉｌ！Ｉ！幻組織に対するＣＳＬＥＸ１抗体の反応性 釉　　　テス）％陽性　反　応　性８　ムチンｂした数
　　　　＋１＋　什　＋　± 胃　　　　　１７９４％　８　１　４　３　３／４結腸
　　　１７７６％　２　１　６　６　８／８肺：ＡＤｃ
９　７８％　５１　ｏ　Ｉ ＳＱ　　　　４　　５０％　１０１０ ＵＣ３３３％　０００１ 合計　　　１６６３％　６１１２ 食道　　　　４５０％　０２００ 卵巣　　　　６５０％　３００　。

胸　　　　　　８　２５％　０１０１ 膀胱　　　　１１００チ　１０００ 腎＃　　　　　１０％　００００ 膵臓　　　　３１００チ　１１０１ 子宮　　　　１０％　ｏｏｏ。

合計　　７４６８％ ａ　＝反応性：ｍ、散在性；朴、４０〜８０％；＋、１
０〜４０％；±１１〜ｌｏ％。

ｂ＝４４性の数／ムチンレイクを含むテストサンプルの
意。

ｃ＝ＡＤ、腺癌：　ＳＱ　１　ｔ＋：（状細胞癌；ＵＣ
，未分化前。

ノイラミニダーゼ及びナトリウムパーヨーディト免投性
胃腺癌の処理は、ＣＳＬＥＸ１の結合を完全に減じた。

グロナーゼによる処理は、一部、結合を減少させた（第
５−Ａ表）。これらの結果は。

免＆性組織上の抗原が／アリル化された糖タンパク鎖で
あることを水製する。

ＣＳＬＥＸ１を翁する正常な腎臓管及び食道組織のイム
ノパーオキンダーゼ染色法は、ノイラミニダーゼ処理に
よって廃止された（第５−Ｂ表）。

Ｌｅｘに対して向けられた抗体（ＣＳＬＥＸ１）によっ
て検出される抗原は、ノイラミニダーゼ処理によって、
影響されなかった。

＊　ｃ　：　７−スロハクｐ−ウｖア７アシェンス（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ　）からのメイラミニダーゼ＊ｄニ
スライドの評価については、′材料及び方法′を参照の
こと ＣＦＵ　−Ｃ検定 モノクローナル抗体がＣＦＵ−Ｃ上に効果を持っていた
。ＣＦＵ−Ｃの回収率は、ウサギ補体による処理の後、
１　：　１０’の希釈で２８チであった。これは、ＣＳ
ＬＥＸ１がＣＦＵ−Ｃ１すなわち顆粒球の前為体と反応
するどい５ことを示している。

棟々のガングリオシドとのＣ３ＬＥＸ１の反応性異なっ
た抗体′Ｉｌｉ、釈度でのガングリオシドとの反応性を
、固層イムノラノオアッセイによって決定Ｌｙ７’ｃ。

シアロフルラクトフコインタオシル（Ｉｌｌ）セラミド
（Ｒａｕｖａｌａ　）及びシアロシルソンコシルガング
リオンド（６Ｂ）と、抗体は反応したが、テストされた
他の物とは反応しなかった。ＣＳＬＥＸ１抗体によるガ
ングリオシドのＴＬＣ免疫象色パターンも、決定した。

Ｃ５ＬＦ：ＸＩは、６Ｂ７！／ングリオシド及びＲａｕ
ｖａｌａのガングリオシドの両方と反応したが、しかし
、シアロフルＬ−分画とも他のがングリオシドとも反応
しなかりた。

第６表は、ＣＳＬＥＸ１抗体に対してテストされた７コ
ガングリオシドを示し【いる。モノクローナル抗体は、
シアロシルＬ＠ｗｌ　ｇ”ハゲテンを含む、最初の２つ
のガングリオシドと反応したことが見られる。この抗体
は、第６表に示されたようにわずかに異なった化学構造
をもつ類似の誘導体とは反応しなかった。

以−１・７Ｊ、白 杯血球凝集テストを、２倍に希釈した血清のｏ、　ｏ　
ｓ　ａｔ及び１チの敏感にされたオックス赤血球六ｕ１
胞の０．０５１＋ｊを含んでいるＵ−型ウェルにおいて
実施した。反応性は室温で２時間のインキュベーション
の後、読み取った。感作された赤血球を添加する前に、
患者の血清及びＣＳＬＥＸ１と共にインキュベートする
ことによす錨認テストを実施した。第７表を参照のこと
。

ＣＳＬＥＸ１抗体が、癌患者からの３１３の血清のうち
２３チの血清と反応するが一方、８０の正常人からのど
の血清とも反応しないということを、次のデータは証明
している。シアリル化されたＬｅａの場合のように、シ
アリル化された形のＬｅｘは癌患者の血清中に存在する
が、しかし正常な患者の血清中には存在しない（マグナ
ニイ、キャン４３：５４８９〜５４９２）、従って、腫
瘍の存在を恢出し、腫瘍をうまく除去するためにモニタ
ー・に写し、及び、さらに腫瘍の位置の徴候をもたらす
ために診シ「テストにおいて、ＣＳＬＥＸ１抗体は使用
され得る。

この発明は、例示の方法及び明確に理解するために例に
よっていく分詳しく記載されたけれども、ある変更及び
改変を行うことができる。

なお、ハイブリドーマＣ５ＬＥＸＩは、１９８４年６月
２０日に罵）ＩＢ８５８０としてＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，に寄
託された。

以］動泊

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、腫瘍を持つと疑われる哺乳類宿主の腫瘍の状態を診
   断するための方法であって、シアリル化されたＬｅ＾ｘ
   ハプテンを含む分子の血液中での存在検出することを含
   んで成る方法。 ２、シアリル化されたＬｅ＾ｘハプテンに対して特異な
   モノクローナル抗体が前記検出のために使用される特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記モノクローナル抗体がＣＳＬＥＸ１である特許
   請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、ネズミハイブリドマＣＳＬＥＸ１。 ５、シアリル化されたＬｅ＾ｘハプテンに対して特異な
   モノクローナル抗体。 ６、前記ハイブリドマＣＳＬＥＸ１から得られた特許請
   求の範囲第５項に記載のモノクローナル抗体。 ７、検出可能なシグナルをもたらすことができるラベル
   に共有結合したシアリル化されたＬｅ＾ｘ。 ８、検出可能なシグナルをもたらすことができる化合物
   に接合したシアリル化されたＬｅ＾ｘに対するモノクロ
   ーナル抗体。 ９、前記ラベルが螢光物である特許請求の範囲第８項に
   記載のモノクローナル抗体。 １０、前記ラベルが酵素である特許請求の範囲第８項に
   記載のモノクローナル抗体。 １１、前記ラベルが放射性同位体である特許請求の範囲
   第８項に記載のモノクローナル抗体。