JPH0228556A - 免疫試験の標準化および制御のための粒子安定化ピトープ製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、血しようあるいは他の生物学的液体中など
の抗原の濃度および存在を決定する免疫試験に用いられ
る制御および基準を用意するための方法に係り、特には
、特異な病理学あるいは生物化学的な病気に関連１−で
知られている抗原の粒子安定性エピトープを製造する方
法に関する。

［従来の技術］ 生物学的液体にある抗体の免疫試験は、人間を含む動物
において生理的ないしは病理的状態の評価を行う場合に
用いられることが多い。免疫試験の成分は、抗原および
特異抗体であり、試験は各成分の濃度とは独立にこれら
の成分を互いに結合させることにまで及ぶ。

抗原は二つの性質がある。一つは、抗体の生成を促す能
力、二つ目は、抗体に特異的に反応する能力。本質的に
は、ポリサッカライド、核蛋白、リポ蛋白、合成ポリペ
プチドあるいは高分子値の蛋白に結合するハブテンとい
った低分子の蛋白質は抗原となる。ハブテンは、抗体の
生産には小さすぎて不完全な抗原であるが、ハブテンが
大きな抗原体に結合して動物に注入された場合には特異
抗体として反応する能力がある。抗体形成あるいは免疫
は、抗原が生体に皮膚、筋肉、ｌ！股あるいは静脈注射
により導入された場合に引き起こされる。抗原の抗体生
産能力は、その成分が細胞内に止まる場合には引き士、
げられる。この知見により抗原を長期にわたって徐々に
解放する物質は補助剤として知られ、抗原に対する抗体
反応む向上させるのに用いられる。

抗体反応を引き出す能力は、使用する生体系、量や投与
経路に依存する。抗原に対して動物は抗体を生成して異
物として認識される抗原のあらゆる位置に反応する。抗
体の特異性とされる抗原の最小部位は、抗原決定子ある
いはエピトープと称される。特定の抗原に対して生成さ
れる抗体は、多数の異なった抗体生産細胞系があるため
で、これらはポリクロナール抗体あるいはボリクロナ・
−ル血清と称される。ポリクロナール抗体は、動物が生
涯に受ける多数の抗原の全てに対する抗体特異性を含ん
でいる。血清中の抗体のほとんどは、どんな抗原に対し
ても特異的でないために、特定の抗原に対する抗体を精
製する難しさがある。ポリクロナール抗体は、下記の事
項に対して極端にヘテロである。すなわち、抗原に対す
る親和性、温度効果、ＰＨ１免疫反応率に関するイオン
の強さあるいは抗原に対する免疫反応が動物によってば
らつきがあることである。本発明のモノクロナール抗体
の用途は、ネイヂャー誌（２５６４９５−４９７，１９
７５）にコラ−とミルシュタインにより記載された方法
から得られたもので、ポリクロナール抗体かへテロであ
ることについて生ずる１ゴ題を解消し、−様な結合親和
性と特異性とを有するホモジーニアス（−様）な反応剤
を供するものである。モノクロナール抗体は、抗原決定
子あるいはエピトープと称される大きくてもっと複雑な
抗原の非常に小さい部分に反応する。

生物学的液体中にある抗原は、類似もしくは同様の試料
と未知の試料との反応を比較することにより評価される
。抗原の標準量あるいは免疫試験の標準を用いることに
より未知漿の抗原が評価される。これが標準化として知
られている方法である。標準化の反応は、抗原の容量に
間係し、抗原の容量をグラフのＹ軸にとり、既知の抗原
の容１をＸ軸にとって標準化曲線を表すことができる。

未知の反応は、Ｙ軸に表示され未知の値をＸ軸に求める
に使用することができる。この標準化の方法は、試料や
未知の抗原に加えられた標準の類似反応に依存する。

標準の抗原は、所定の抗体に反応するまで何度も変更し
て行われる。このため、標準化の過程を監視したり制御
して異なる時間におこなった試験の結果を比較する必要
がある。免疫試験を制御する方法は、計測される試験試
料と同様の液体内にある抗原を含む制御試料の試験に係
わってくる。

この制御試料は、試験が標準化される度に試験を受け、
所定の時間の間は同様に反応すると仮定される。試験を
受けた制御値の傾向およびばらつきは、標準化が劣化し
ておこる、標準化曲線のずれに表れてくる。免疫試験の
標準化および抑制には正確さと再現性を得るため安定し
た材料が重要になる。この正確さとは、得られた値がど
れほど真実の値に接近しているかで決まり、精度とは一
連の観察結果の広がり度合い、再現性で決まる。この広
がり度合いとは、連続的に得られる精度や日数単位で得
られるといったように特宜的に述べられる、これらの述
語は、リトルブラウン　アンドカンパニ　バブリッシャ
ー発行でシアドアーコルトン著のｌ医学統計」の３８頁
（ｂ９７４）に詳しい。制御と標準化は、抗体や抗原に
対数する免疫試験の有用性において重要になる。ある免
疫試験では、標準化や制御が特に芦しくなる。これは、
抗原が不安定で、抗体に対して−様な反応をみぜないか
らである。安定な標準化と制御を行うには必要なことで
あるが、特定の抗原に少々の変更を加えると、免疫試験
には重要なことではあるが、抗体に対する結合力が大幅
に変わることがある。もつと微妙な変化は、抗原−抗体
反応に悪影響を及ぼす第３、第４の構造に関する抗原の
構造に生ずるやしたがって、試験の正確さおよび精度と
を維持させるために長期間にわたって試験の標準手段お
よび制御手段を保存することが重要となっているだけに
所定の免疫試験の標準手段および制御手段を作成する際
に問題が生ずる。この標準化と制御とは抗体に対して変
わらない−様な反応能力を有するように作成されなけれ
ばならない。

この発明のｆｆｉ’ＪＱな面には、モノクロナール抗体
に対して免疫試験を行う際、制御と標準化に用いられる
特異なエピトープを精製したり分離したりすることがあ
る。モノクロナール抗体とは、通常−度だけ現われ、特
定の抗原に対しては再現性を示すエピトープに関して特
異的である。蛋白質でできたエピトープは、５ないし７
個のアミノ酸の残滓で、ｔｉ造によっては線状のアミノ
酸系列あるいは立体的なアミノ酸構造をもっている。何
度の親和性をもったモノクロナール抗体を用いれば、こ
れに対応するエピトープが抗原あるいは修正を受けたか
断片化された抗原から分離されてＩＷ製される。一般に
は、抗原が大きくなればなるほど、不安定化して断片化
ないしは小さく破片化する。

エピトープは常に変化を受けない無傷の抗原より小さい
ことから、エピトープの安定性は常に元の抗原の安定性
よりも大きい、一方、ポリクロナール抗体は、元の抗原
の分解に大きく影響される事情があり、エピトープは元
の抗原の断片内に完全に残っているモノクロナール抗体
により規定されることから、とりわけ特異なアミノ酸系
列に反応するモノクロナール抗体を注意深く選択するこ
とにより影響を受けずに済む。この発明の重要な側面に
は、元の抗原が断片化した後にもエピトープが破壊１−
ないモノクロナール抗体を選択することがある。

表面に対する物質の結合力は、その物に対する安定性を
向上させる。従来では、抗原あるいは抗体は、予め固体
の表面に結合させる反応に続いて自由な抗原から抗体結
合性抗原を分岐するのを促す。この発明の重要な特徴は
、抗原あるいは抗体の粒子に対する結合力を用いること
にあり、結合性エピトープは安定化して免疫試験の際に
標準化手段および制御手段を作成するに役立つものであ
る。さらに、エピトープが粒子上で安定化すると、大き
な表面積とエピトープの高い濃度が得られ、後続する反
応に便宜が得られる。これにより反応時間が大幅に短縮
され、動的な試験が実用化できる。

血液中のコレステロールの量と動脈硬化あるいは冠動脈
疾患との間に関連があることは、コロンビア　ユニバー
シティ　カレッジの内科、外科の［家庭の医学Ｊ　（ク
ラウンバブリッシャー発行の３６７頁　１９８５）でも
報告されているように良く知られたことである。コレス
テロールは、はとんど水のようであるが血液には溶けな
い脂質で、血液中に入る訂には洗剤のような物質にくっ
ついている。この物質にアポリポ蛋白で知られる蛋白質
があり、脂質に結合するとリポ蛋白と呼ばれる分子を形
成する。リポ蛋白には種類があり、高速遠心分離装置で
決められる大きさや密度で分類される。もっとも重いも
のは、蛋白成分が最大の高密度リポ蛋白（ＨＤ　Ｌ、　
）である、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）は、）（ＤＬより
も軽くコレステロールの成分を多くもっている６過低密
度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）は、トリグリセリドの成分を多
くもっており、リピッドは、脂質の代謝に重要である。

最近の研究によると、ＨＤＬは動脈からコレステロール
をもち去り、このため動脈内でコレステロールの蓄ＭＪ
ｌと他の脂質量との均衡をとる上で重要になる。Ｌ、　
Ｄ　Ｌ、は、コレステロールを動脈に運ぶことから動脈
硬化を起こす主要因と考えられている。血しょう中にり
、　Ｄ　Ｌ、コレステロールに対して高い濃度でＨＤＬ
コレステロールが含まれていることが、望ましいと今で
は考えられている。Ｌ、ＤＬコ１ノステロールに対して
ＨＤＩ、コレステロールが高くなれば、なるほどよいと
いう関係にある、最近の研究結果によれば、ＨＤＬ（ア
ポリポ蛋白Ａ−１，ａｐｏＢ）　、Ｌ、ＤＬ　（アポリ
ポ蛋白Ｂ、ａｐｏＢ）あるいはアポリポ蛋白Ａ−Ｉとア
ポリポ蛋白Ｂ（ａｐｏＡ−ＩとａｐｏＢ）に関する主要
なアポリポ蛋白量は、■−７ＤＬコレステロールおよび
ＨＤＬコレステロールの測定値よりも心不全を心配する
尺度となっている。冠動脈疾患に関しては、ａｐｏＢに
強い相関があり、ａｐｏＡ−Ｈには相関がない、さらに
は、アポリポ蛋白の定量的な決定をする方法をもっと精
密にすれば、人間の心臓疾患に関する原因を正確に突き
■・められるかもしれない。

リポ蛋白、アポリポ蛋白に関する免疫試験での問題は、
よく知られたことではあるが反応の回数で、これにより
蛋白質の構造が変えられたり、アポリポ蛋白の抗原構造
が変化を受けて免疫反応が変更されてしまう。この反応
には、脂質の過酸化や、過酸化物、酸素あるいは酵素の
分解や集積による蛋白質の分解がある。この反応のうち
いずれもが、ａｐｏＢおよびａｐｏＡ−Ｉの免疫試験に
悪影響を及ぼすおそれがある。ａｐｏＢおよびａ。

ｐｏＡ−Ｉは不安定であることからも、これらに関する
免疫試験の標準化および制御化において改良を施すこと
が緊急な課題となっている。脂質の環境を変えると、構
造や免疫反応に変化が起こることは良く知られている。

したがって、本発明では、Ｌ　Ｄ　Ｌ、およびＨＤＬの
重要な成分を免疫試験における標準化および制御化に資
するため、ａｐｏＢおよびａｐｏＡ−Ｉに特異的な粒子
安定化エピトープを提供する一面をもっている。

［問題を解決するための手段］ この発明によれば、エピトープが粒子に付着した後にエ
ピトープに反応性を保持する単細胞系の産物であるモノ
クロナール抗体を選択する手順と、前記エピトープを分
離する手順と、粒子に付着させることにより前記エピト
ープを安定化させる手順と、前記抗体の通常値の０．０
１から１０倍の濃度範囲で緩衝水に希釈することにより
粒子安定化エピトープを標準化する手順と、前記モノク
ロナール抗体に反応するエピトープは含んでいないが、
試験試料の成分を擬態する液体に懸濁させることにより
粒子安定化エピトープを制御試料として作製する手順と
を具備している。

請求項２によれば、前記エピトープは、不変の抗原、化
学的に変形された抗原、抗原成分、化学合成された抗原
、生物的に合成された抗原および前記モノクロナール抗
体に対する反応力を保持するハゲテンからなる群から選
択された抗体の決定子であることを特徴とする 請求項３によれば、前記抗原は、蛋白質、ペプチド、炭
水化物、蛋白−炭水化物複合体、リピッド蛋白−炭水化
物複合体および免疫グロブリンからなる群から選択され
たことを特徴とする請求項４によれば、前記エピトープ
は、高濃度リポ蛋白、低密度リポ蛋白および過低密度リ
ポ蛋白からなる群から選択されたリポ蛋白の誘導物であ
ることを特徴とする 請求項５によれば、前記抗原は、エピトープを含む断片
に化学的に切断されたことを特徴とする請求項６によれ
ば、前記エピトープは、被試験体である抗体物に特異的
なモノクロナール抗体を用いた免疫親和性により分離さ
れたことを特徴とする 請求項７によれば、前記エピトープは、粒子に化学的に
付着させて安定さぜたことを特徴とする請求項８によれ
ば、前記エピトープは、粒子に物理的に吸収させること
により安定させたことを特徴とする 請求項９によれば、前記粒子は、乳液、澱粉、樹脂、エ
ステル、有機酸および生物学的溶液には不溶性の有機基
からなる群から選択した成分であることを特徴とする請 求項１０によれば、前記粒子は、ヨードパミドエステル
（Ｉ　Ｄ　Ｆ、　）からなることを特徴とする請求項１
１によれば、前記粒子の密度は、０゜１゜からＬｏｇ／
ｃｃの範囲にあることを特徴とする 請求項１２によれば、前記粒子の粒径は、２５％より少
ないばらつきで１から１００．０００ナノメータの範囲
にあることを特徴とする請求項１３によれば、前記粒子
安定化の標準化および制御化は、脂質親和性物質により
行なっｌ：ことを特徴とする 請求項１４によれば、同一の抗原から誘導した互いに異
なる２から２０個のエピトープは、粒子上に安定化され
て抗原の免疫試験のため標準化および抑制化に資するこ
とを特徴とする 請求項１５によれば、同一の抗体から誘導した互いに異
なる２から２０個のエピトープは、粒子」二に安定化さ
れて互いに異なる２から２０個の抗原の免疫試験のため
標準化および抑制化に資することを特徴とする 請求項１６によれば、２から２０個のエピトープは、互
いに異なる２から２０個の細胞系統の産物である互いに
異なる２から２０個のモノクロナール抗体であることを
特徴とする 請求項１７によれば、抗原から誘導された２から２０個
のエピトープは、大きさ、密度、成分、外観表面といっ
た物理的性質を異にする粒子上に安定化され、モノクロ
ナール抗体と反応した後に前記エピトープの分離を容易
にすることを特徴とする 請求項１８によれば、エピトープが粒子に付着した後に
エビＩ・−ブに反応性を保持する単細胞系の産物である
モノクロナール抗体を選択する手順と、前記エピトープ
を分離する手順と、粒子に付着させることにより前記エ
ピトープを安定化させる手順と、前記抗体の通常値の０
．０１．から１０倍の濃度範囲で緩衝水で希釈すること
により粒子安定化エピトープを標準化する手順とを具備
している。

請求項１９によれば、エピトープが粒子に１１着した後
にエピトープに反応性を保持する即細胞系の産物である
モノクロナール抗体を選択する手順と、前記エピトープ
を分離する手順と、粒子に付着させることにより前記エ
ピトープを安定化させる手順と、前記モノクロナール抗
体に反応するエピトープは含まないが、試験試料の成分
をｒＩｉ：態する液体に懸濁させることにより粒子安定
化エピトープを制御試料として作製する手順とを具備し
ている。

請求項２０によれば、生物学的液体中のリポ蛋白成分を
計測し、冠動脈疾患に関する病気への危険性を手当てす
るモノクロナール抗体系の免疫試験手段で、リポ蛋白成
分は、リポ蛋白に対して親和性のあるモノクロナール抗
体と固体粒子表面に安定化された代理のリポ蛋白からな
っている免疫試験手段を備えている。

［発明の作用および効果］ この発明によれば、抗体に一様に反応する基準化および
制御化手段が作製され、免疫試験の長期間にわたる基準
化および制御化が得られる。

さらに本発明では、抗原決定子やモノクロナール抗体の
特異性を規定するエピトープを保持し゛〔大きくて複雑
な抗原の小さな断片が、生成される。

エピトープは元の抗原よりは小さいことがら抗原よりも
安定している。この発明のもう一つの面には、モノクロ
ナール抗体を用いて免疫試験の標準化と制御化に使用さ
れる特異なエピトープを分離して精製することにある。

このエピトープは、化学的修正を受けた抗原あるいは化
Ｔ的、生物′を的に合成された抗原にすることができる
。このエピトープは、蛋白質、ペプチド、炭水化物、リ
ポ蛋白、蛋白質−炭水化物複合体、免疫グロルビン、核
酸やハブテンなどの他の抗原物質がらなっている。エピ
トープを含む断片が共有結合あるいは物理吸着によりヨ
ードパミドエチルエステル（ＩＤＥ）、塩化ポリビニー
ルあるいはボリスヂレンからなっている粒子に付着して
エピトープが安定化される。多数のエピトープが同一あ
るいは異なる粒子に付着して二個具」二の試験の標準化
および開御化が行われる。

［実施ｆＩＡ１ この発明は、血しょうあるいは他の生物学的液体中など
の抗原の濃度および存在を決定する免疫試験に用いられ
る制御および基準を用意するための方法に係り、特には
、特異な病理学あるいは生物化学的な病気に関連して知
られている抗原の粒子安定性エピトープを製造する方法
に関する。抗体に一様に反応する基準化および制御化手
段が作製され、免疫試験の長期間にわたる基準化および
制御化が得られる。安定した制御および基準化は下記の
手順により得られる。

すなわち、くい）エビＩ・−プが粒子に付着した後にエ
ピトープに反応性を保持ずろ単細胞系の産物であるモノ
クロナール抗体を選択する手順と、（ろ）前記エピトー
プを分離する手順と、（は）粒子に付着させることによ
り前記エピトープを安定化させる手順と、（に）訂記抗
体の通常値の００１から１０倍の濃度範囲で綾街水に希
釈することにより粒子安定化エピトープを標準化する手
順と、（は）前記モノクロナール抗体に反応するエピト
ープは含んでいないが、試験試料の成分を擬態する液体
に懸濁させることにより粒子安定化エピトープを制御試
料として作製する手順とを具備している。

前記エピトープは、不変の抗原、化Ｔ的に変形された抗
原、抗原成分、化学合成された抗原、生物的に合成され
た抗原および前記モノクロナール抗体に対する反応力を
保持するハプテンからなる群から選択された抗体の決定
子である。

さらには、前記抗原は、蛋白質、ペプチド、炭水化物、
蛋白−炭水化物複合体、リピッド蛋白−炭水化物複合体
、核酸および免疫グロブリンからなる群から選択された
ことを特徴とする。

前記エピトープは、高湯度リポ蛋白、低密度リポ蛋白お
よび過低密度リポ蛋白からなる群から選択されたリポ蛋
白の誘導物である。

この発明では、モノクロナール抗体は、部分的な抗原や
全体の抗原の掻く小さな部分でできているエピトープを
分離する。このエピトープは、分離された方法により抗
体との反応が保障される。

エピトープは、精製後のエピトープが抗体反応を維持す
ることから、モノクロナール抗体に結合させることとは
別の方法で精製される。エビ１−・−１は、クロマトグ
ラフや′！気泳釣法などの既知の分離手段で予備的な分
離に続いてモノクロナール抗体を用いて分離される。こ
のエビ１−一ブは、共有結合あるいは物理吸着によりヨ
ードパミドエチルエステル、塩化ポリビニールあるいは
ボリスヂレンからなっている粒子に付着する。エピトー
プは、化学的な修正を受けて結合性が活発になりエピト
ープを安定さぜる８粒子は多くの物質から構成できるが
、実際の免疫試験を促進するには大きさとか密度などの
物理的性質が決められた特定の物質だけが当該製法には
有用である。粒子は、化学的に活性化してエピトープに
対する付着を最適にすることができ、安定化させること
もできる。これらの粒子は、乳液、澱粉、エステル、有
機酸、あるいは生物学的液体に不溶な有機基からなる群
から選択した物質でできている。我々は粒子としてヨー
ドパミドエチルエステル（ＩＤＥ）を用いな例を供する
。この物質は、モノクロナール抗体に対する反応性を保
持するようにアポリポ蛋白のエビトー７を結合させるに
使用される。この物質は、高い密度をもった望ましい性
質があり、生物学的溶液から分離を容易にさせる。この
発明では、０゜１から１０ｇ／ｅｃの密度を有する粒子
が有用であることが分かっている。誤差が２５％以下で
１から１００，０００の範囲の粒径を有する粒子が選ば
れ、抗体の濃度に関係なくエピトープと抗体との相互の
反応を最大にする０粒子上の安定化されたエピトープに
より特にはリポ蛋白に適用される免疫試験に用いる特異
な性質が得られる。このときには、粒子はリポ蛋白の大
きさが、アポリポ蛋白の免疫試験の標準化および制御化
に適するように用意されている。明らかな利点は、粒子
が不活性でリポ蛋白の中芯（コア）が不安定であること
である。

この免疫試験は、既知濃度の粒子安定化エピトープを加
えて、これらを所定量のモノクロナール抗体あるいはモ
ノクロナール抗体混合物に滴定を行うことにより標準化
される。そして、各基準液に対する免疫反応は、比較に
より生物学的溶液中の未知量の抗原を評定する基準曲線
を作成するのに用いられる。制御試料に対しては、エビ
Ｉ・−プは被測定の生物′７的溶液に類似した環境の中
で作られ、あたかも未知の試料のごとく試験される。

試料が血しょうで試験が行なわれる場合には、制御試料
は、エピトープが速用されたものとは異なる種類の動物
からの血しよう内の粒子安定化エピトープからなってい
る。モノクロナール抗体は、人間の抗原には特異的であ
るが、牛の抗原には特異的でない種類が選ばれる。基準
化および制御化手段が、粒子安定化エビＩ・−１から作
製されることから、それらは長期にわたって反応性を維
持する。基準化および制御化手段は、凍結あるいは凍結
乾燥もしくは凍結により乾燥させた状態で貯蔵し、必要
に応じて解凍される。

エピトープは小さいため、多くの同一エビｌ−コブは、
粒子の表面に付着してエピトープとモノクロナール抗体
との物理的相互反応を最適にする。

また、他の実施例によれば、モノクロナール抗体により
規定された同一の抗体の異なるエピトープが粒子の表面
に付着される。さらに、数個に異なる抗原からの多数の
エピトープが粒子の表面に付着されて数種の免疫試験の
基準化試験に使用される。これらの試験は、粒子安定化
エピトープが抗体と反応する意味の不変抗原的性質を有
しているために有効に働くが、所定の環境内では変形を
起こしやすい性質は失われる。互いに異なる抗原から得
られた多数のエピトープは、大きさ、密度、成分や外観
などの物理的性質を異にする混合粒子上に安定化されて
モノクロナール抗体に反応した後にエピトープの分離を
促進する。したがって、このような粒子の一試料は、多
数に異なる免疫試験の標準化および制御化に畜与する。

試験例 下記の試験例はあくまで一例であってこの例のみに限ら
れるものではない。

（ｂ）ＩＤＥ　　−人　　、ｌボ　　Ｂのエビーブ　　
　モノ　ロ　−ル （ａ）　　　　　＋１　　　　　　ＬＤＬ過低過度密度
リポ蛋白ＬＤＬ）を高速遠心分離装置により１４℃の温
度下に平均１７５．０００ｇで１６時間かけて人間の血
しようから分離した。

これは、血しようを１０ｍｊｌあたり０．１７７ｇの臭
化ナトリウムで溶かすことにより塩密度１゜０１９８／
ｍｊｌとなるように調整した。ＶＬＤＬを含む不透明の
浮渡物を取り除き、この浮瀞物を１ｍＮあたり０．６０
８ｇの固体臭化ナトリウムで溶かすことにより塩密度］
１．０６３ｇ／ｍρとなるように調整した。低密度リポ
蛋白（ＬＤｌ、）は、高速遠心分離装：〃により１４℃
の温度下に平均１７５，０００ｇで１８時間かけて分離
した。

黄色のＬＤｌ−の浮瀞物を取り除いた。ｌ−Ｄ　Ｌ断片
の９５％以上はアポリポ蛋白（ａｐｏＢ）であった。Ｌ
ＤＩ、調整液からは塩分が取り除かれた。このときには
、分子量３５０ドル１−ン以十、の物質を透過しない半
透性セルロース膜を用いて０．１５Ｍの塩化ナトリウム
に対して透析を行った。

ｂ）マウスの　ヒトＬ　Ｄ　Ｌモノ　ロナールａ作夏 生後２ないし４週間のマウス（ネズミ）にＬＤＬ１００
μｇをＯ６５ｍｊｌ皮下注射して免疫化させた。このり
、　Ｄ　Ｉ−は結核菌の懸濁液を含む鉱物油を全量０．
５ｍｊ！に乳化させたものである。マウスは３週間後に
鉱物油とＬＤＬｌｏｏｐ、ｇとを全量で０゜５ｍｌ皮下
注射して再び免疫化させた。

３週間後には血しようを尾の静脈から取り出し、両方の
マウスにヒトのａｐｏＢに対する特異的抗体の生産があ
ることが確認された（表■参照）。

特異抗体の濃度が最大のマウスでは、ひ臓細胞が骨髄細
胞にハイブリッド（融合）化する数週間前にａｐｏＢに
対して再免疫化した。ハイブリッド化の数日前にＬ　Ｄ
　Ｌ　１μｇを皮下注射した。ハイブリッド化の４日前
にはり、ＤＬＬ００μｇを腹膜に注射した。ハイブリッ
ド化の３日前には、Ｌｍ）Ｌ２００μｇを静脈に投与し
、ハイブリッド化の２日前にはａｐｏ８１００μｇを同
様に静脈に投与して、ハイブリッド化の１．目前にはヒ
トのａｐｏ８２００Ｊｊｇを腹膜に投与するとともに静
脈に皮下注射した。最後の注射を終えた１日後には、マ
ウスを殺してひ臓を摘出して、１０％の子牛の血しょう
（媒介液）含む煮汁中の単細胞懸濁液に分散する。ひ臓
細胞は媒介液でもう一度洗浄され、細胞系Ｐ３−Ｘ６’
ｌ−Δｇ８．６５３から得られた骨髄細胞に混ぜられた
。このＰ３−Ｘ６３Ａｇ８．６５３とは、ポリエチレン
グリコールの存在のもとて骨髄細胞１に対してひｌ１ｆ
ｉ細胞１ないＬｌｏの割合でアメリカ流の細胞培養によ
り沈澱さぜなものである。この融合方法は、ネイチャー
誌の２５６．４９５−４９７　（ｂ９７５）に報告しな
コラ−とミルシュタインの著作と同様である。

細胞どうしがハイブリッド化された融合細胞（ひ臓細胞
と骨髄細胞）あるいはバイブリド−マスは、洗浄されて
骨髄細胞ではなくバイブリドーマスのみの生育を選択的
に許容する媒介液に懸濁させ、しかる後に９６個の皿に
加える。バイブリド−マスの！４−４育は、定期的に培
に液に加えることにより促される。この培養液どは、他
のマウスの１１０　ＩＮ控を洗浄した後の生物学的溶液
から得られｌ：：腹膜マクロファ・−ジで、−皿あたり
百万個の細胞をもっている。バイブリド−マスが増殖し
ていることは、マクロファージの特徴で確認された。大
［１１な生育を迎えた後には、細胞あるいは培五浮澹液
上の媒介液にヒｌ−Ｌ　Ｄ　Ｌ、に対する特異的抗体の
産出があるかの試験を行なった（表■参照）。ヒトの！
、２ＤＩ−に対してモノクロナール抗体を確保している
バイブリド−マスは、その数が数えられ媒介液で稀釈さ
れ、皿２個あたり細胞１個の割合で９６個の皿に再び培
養された。これは、後続する抗体生産細胞の成長が単細
胞バイブリド−マスの子孫であるかクローンであるかを
確認するためである。モノクロナール抗体生産クローン
の培養浮瀧液は、ヒトＬ、ＤＬに対して特異的抗体があ
るために間欠的に再試験がなされた。５個のクローンが
抗体生産能力を保持した（表■参照）。これらの細胞系
列は、最初は２４個の皿で生育させ、ついで５０ｍρの
フラスコで次には２７５＋ｔｄのフラスコで生育させる
ことにより拡張した。５個のクローンからのそれぞれ約
百万個のバイブリド−マス細胞がマウスに腹膜注射され
た。これらのマウスは、バイブリド−マスの注射をする
に先立つ少なくとも１週間前には、２．６．１０、ｉ　
４−＝テトラメヂールペンタデカン（ブリスタン）の０
．５ｍＮ溶液で処理したものである。１ケ月するうちに
腹水に腫瘍が発生して、この腹水が集められ、ヒＩ・の
Ｌ　Ｄ　Ｌ、に対するモノクロナール抗体が２２−３５
ｍ　ｇ／ｍ、０含まれていた。

（（：）マウス　ヒ）　Ｌ　Ｄ　Ｌ、モノ　ロナールの
メクユし≦呵Ｚグ 免疫マウスから集めたマウス血しよ・う内のヒトのり、
ＤＬ、に対するポリクロナール抗体ならびにバイブリド
−マスが成長している培養浮部液内のモノクロナール抗
体は、下記のようにして試験が行われる。ヒトのＬＤＩ
−は】ａで概説したように調製され、０．１５Ｍの炭酸
すｌ・リウム、０．０３５Ｍの重炭酸ナトリウムＰＨ９
，０の緩衝液で１０Ｍｇ／ｍｊの濃度に希釈され、つい
で希釈したＬ　Ｄ　Ｌの０．１ｍ１ｌを９６個の皿にそ
れぞれ加えて４℃の温度で一昼夜ねかず。わかした後に
は、各国から液体成分を吸引により除く。各国は、０゜
】−５Ｍの塩化すトリウムとＰＨ７，４で０．０５Ｍの
リン酸緩衝液（リン酸緩衝塩ＰＢＳ）との溶液に溶かし
た子牛の血しよう（ＢＳＡ）の１重量％の０．２ｍρに
より３回洗浄した。洗浄後には、各国はＰＢＳ内に１重
量％の０．２５ｒｎ、ＱのＢＳＡを加えた溶液で満たさ
れ、２ないし４時間室温でねかす。その後、各皿内の液
体は除かれて免疫マウスからの希釈血しょう（表■）の
０．１ｍ、ｌｌあるいは、バイブリド−マス（表■）の
培養浮瀞液からの媒体液を０．１ｍρ皿に加えて４°Ｃ
の温度で一昼夜ねかず。わかした後には、各国から液体
成分を吸引により除く。各国には、放射性同位元素のヨ
ード（Ｉ）１２５でラベルされた羊の反マウス抗体を加
えた。この羊の抗体は、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡで希釈
され、１分、１ｍｊｌ　　（ＤＰＭ／ｍｕ）あたり６０
０．０００個に分解するものである。各国は、２ないし
４時間室温でねかず。

わかした後には、各国から液体成分を吸引により除いて
、各国をＰＢＳ中の１％のＢＳＡで３回洗浄しか。ヒト
のり、　Ｄ　Ｌに反応するマウスの抗体を示す各皿内の
放射能や（ＤＰ〜１）は放射試験が行われ、その結果を
表Ｉおよび表■に示す。表１は、マウスにヒ１〜のり、
　Ｄ　Ｌを抗原どして投与、したときに得られた結果を
要約している。免疫前の血しようは、マウスがり、　Ｄ
　Ｌの投与を受（Ｊる前の試験結果であり、免疫血しよ
うの結果は、マウスが■７ＤＬ、の投与を受けた試験抗
体に現れる。マウスの抗体のスクリーニング試験は、希
釈血しょう（ｂ：１０、］、：１００．１：］、０ＯＯ
）で行なわれる。

表１に示すように、マウス】、は希釈血しょう（ｂ：１
０００）を用いた結合ＤＰＭ（免疫前血しよう対免疫後
匍しよう）では４３倍に増加した。これに対して、マウ
ス２は希釈庇しよう（ｂ：　１０００）を用いた結合Ｄ
ＰＭ　（免疫前血しよう対免疫後血しよう）では３８倍
に増加した。この結果は５両マウスともヒトのＬＤＬに
対し”Ｃ高度に免疫化されたことを示す。

表１ ヒ　のａｏＢＤＰＭ　　皿　に　　　マウスのバ１　ロ
　−レ′　の　甲 マウス１ 免疫前血しよう マウス２ 希釈　　　　免疫前血しよう　免疫後直しょう１・１０
２２４７１１５ １１００　　　　　２０３　　　　　　８．１９２１　
：　１０００　　　　　２１０　　　　　　８１６４表
■は、マウス１のひ臓から精製したバイブリド−マスの
５個のクローンにおりる培養浮澹液をモノクロナール抗
体８の産出のため試験を行ったとき得られた結果を要約
したものである。ヒＩ・のＬＤＬに特異的な抗体がある
と、ＬＤＬを被覆１−た皿上の放射能をネガティブな制
御にするに関して５から１０倍の増加が見られる。表■
に示す５個のクローンのそれぞれは、ヒトのａｐｏＢに
対して単一モノクロナール抗体を産出する細胞を示免疫
後血しよう 希釈 １：１０ １　：　１００ １：１０００ ず。

表■ ネガティブ　　クロ・−ン１　　クローン２クローン３
　　クローン・４ クローン５ ｄ）マ　ス　ヒ　のａ　　ｏＢモノ　ロ　−ル目−異且
Ｕ豆を状淀 リピッドは、４℃の温度での］０ｍ１クロロホルム、１
０ｍ９のメタノ−＝・ルおよび２０ｎＬｊｌのジエチル
エーテルの混合液内にＬＤＬを１．Ｏｍｊ！希釈するこ
とにより除去される。　Ｌ、　Ｄ　Ｌ、のａ、　ｐ　ｏ
　Ｂは、温度４℃で２０分間１．０．０００ｇの遠心分
離装置にかけることにより白色の沈澱物として得られた
。この沈澱物を２０ｎｉＮのジエチルエーテルにより一
度洗浄して、その後に吸引によりジエチルニーデルを取
り除く、沈澱物は、約３５℃まで温められて残留するジ
エチルニーデルを除き、ついで０．０６７Ｍの２−アミ
ノ−２−ヒドロキシルメチ−ルー１．３−プロバネジオ
ール、ＰＨ６，８の塩酸緩衝液く１−リスバッファ）、
ＰＨ６゜８で２％のドデシル硫酸すＩ・リウム、ＳＤＳ
、１９％のグリセロールおよび５％の２−メルカプタン
からなる溶液に溶かされる。ａｐｏＢの沈澱物を溶かし
た後には、溶液は３分間加熱されて］００℃にまで温度
上昇し、その後室温まで冷却される。溶液中の蛋白質は
、電気泳動法により分子量ごとに分離される。この電気
泳動法は、０．２６％のＮ−Ｎ’−メヂレンビスアクリ
ルアミド、２゜８５％のアクリルアミド、０．３５７Ｍ
の２−アミノ−２−ヒドロキシルメチ−ルー１．３−プ
ロパンジオール、塩酸緩衝液、ＰＨ８，８で２％のドデ
シル硫酸ナトリウム、０．０２５％の過硫酸アンモニウ
ムおよび０．５μｍ／ｍｌのＮ、Ｎ、Ｎ′、Ｎ’−テＩ
・ラメヂレンジ゛γミンを含む溶液から重合した厚み１
．．５ｍ１ｎの矩形のゲル内で行な・ったものである。

貯溜用緩衝溶液は、０．０２５Ｍの２−アミノ−２−ヒ
ドロキシルメチール１．３−プロパンジオール／塩酸緩
衝液、ならびに０．１．９２Ｍのグリセリンお、）二び
１％のデオデシル硫酸ナトリウムからＰＨ８，３に調製
した緩衝液を含む。蛋白溶液は、矩形のゲルおよび、−
１［，１ｏＢの端部に充てられて、ａ、　ｐ　ｏ　Ｂの
断片は１５０■を４時間電気泳動法に適用することにＪ
：リー゛方向に分雛され、貯溜用緩衝溶液は７℃に冷却
される。この電気泳動法による分断の後、分離された蛋
白質を含む矩形のゲルは、緩衝溶液に漬（つられて１０
分間攪拌された。この緩衝溶液は、Ｏ７３％の２−アミ
ノ−２−ヒドロキシルメヂール１．３−プロパンジオー
ル、１１．４４％のグリセリンおよび２０％のメタノー
ルを含む。この操作は、３回繰り返されアクリルアミド
ゲルからドデシル硫酸すｌ・リウム及び塩分を取り除く
。固体の矩形板をゲルと同様な大きさに二ｌ・ロセルロ
ース糸から形成して同様の緩衝溶液でわかしてアクリル
アミドゲルと接触するように配置する。気泡を除去して
２つの成分は、表面上に試験管を巻くことにより絞っ°
Ｃニトリセルロースアクリルアミドゲルのサンドイッチ
を形成する。

アクリルアミドゲル上から分にされた蛋白質は、サンド
イッチを電気泳動管内に入れることによりアクリルアミ
ドゲルからニトロセルロース糸に渡されて、０．１アン
ペアで１６ないし１８時間緩衝溶液内で電気泳動を受け
る。このＭ街溶液は、０．３％の２−アミノ−２−ヒド
ロキシルメヂール−１，３−プロパンジオール、］、４
４％のグリシン、４°Ｃに予冷された２０％のメタノー
ルを含む。蛋白が二Ｉ−ロセルロース糸に渡された後に
は、薄い破片に切られてナフｌ−−ルブルーブラック（
Ｃ，Ｉ　、　２０４７０；アミノブラック１０Ｂ；バッ
ファローブラック　ＮＢＲ＞により染色され、蛋白質帯
域の位置が後１コのため視認できるようにする。

残るニトロセルロースの板は、０．１５Ｍの塩化ナトリ
ウムおよび０．０５％のトウィーン２０を含むＰＨ７，
５で０．０２Ｍのトリス緩衝液内の３％のゼラチン中に
室温で−ｉ夜ねかぜて蛋白の結合箇所をニトロセルロー
スの板」、に結合させる。

この断片は、渡されＡ＝蛋白を含みゼラチン処理された
二１−口セルロースの板から切断され、それぞれのハイ
プリドーマクローンの培養浮遊液とともに一昼夜緩衝液
内でわかせ−る。、二の緩衝液は、０゜１５塩化すトリ
ウム、０．０２ＭでＰＨ７，５のトリス緩衝液内の１％
のゼラチンをａ−んだものである。わかした後には、断
片は、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、０．０５％のトウ
イーン２０を含むＰＩ−１７，５で０．０２Ｍのトリス
緩衝液で３回洗浄してからアルカリフォスファターゼを
結合させた羊の反マウス抗体中に室温で４時間わかず。

さらに、断片は、０．１５Ｍの塩化すトリウム、ＰＨ７
，５で０．０２Ｍのトリス緩衝液で３回洗浄して最終的
に蛋白の帯に対するモノクロナー、ル抗体の結合を検出
した。これは、アルカリフォスファターゼ基中にわかし
てアルカリフォスファターゼを結合した羊の反マウス抗
体反応の結合性を検出することにより見い出された。こ
のアルカリフォスファターゼ基の溶液は、０．１Ｍの重
炭酸１００ｍ、Ｑおよび１ｎｎＭの塩化マグネシウム中
に入れた７０％のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド１４０
ｍｊｌに溶かした１、０ｍｇのＮ、Ｎ−ジメチルホルム
アミド、３０ｍＪ）のニトロブルーテトラゾリウムある
いは２．２’−Ｄｉ−ｐ−二ｌ・ロフエニールー・５．
５−ジフェニール−３，３’−［３，３′−ジメトキシ
−４，４−ジフェニレンコ塩化ジテ）・ラゾリウムに溶
解した１５ｍｇの５−ブロモ−４クロロ−３インドール
リン酸塩を含む。ａｐｏＢの特異性は、ａｐｏＢに特徴
的な分子、１をもつニトロセルロースに渡された染色ａ
ｐｏＢの変化により決定される。

ヨードパミドエチルエステル（ＩＤＥ）の粒子は、ポリ
ビニールポリリドン（ｂ５，ＯＯＯＭＷ）を１分間に５
ｍ１ｌの割合で低温（４℃）で急速に攪拌された溶液に
一部はジメチルスルフオキザイド（ＤＭＳＯ）中のＩＤ
Ｅに、また一部はエタノールに注入することにＪ−り生
じた２成分の水溶液（０，１％）を融合することで調製
される。粒子を生成した直後には、蛋白質の特異的活性
（蛋白質の一分あたり１ｍｇの分解量）のわかっている
とともに、１ｍｇあたり０．４から６４１μｇの間の蛋
白濃度でヒトの低密度リポ蛋白のヨード１２５でラベル
したａｐｏＢを１、Ｏｍｊ）をＩＤＥの粒子１．Ｏｍｊ
に加える。これらの粒子と蛋白とは混合されて粒子は０
．１％の濃度でヒトの血しようアルブミンを含む０．１
．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０５Ｍのリン酸ナトリウ
ムのＰ　Ｈ７，４の溶液を加えて洗浄される。遠心分解
装置をかけた後には、洗浄液は吸引により除去され粒子
は再び懸濁されて再洗浄され、洗浄液中の放射能が無視
できるまでにする（約４回の洗浄を行う）。

ＩＤＥ粒子に結合さぜ、ヨード１２５でラベルしたａｐ
ｏＢは、放射試験を受け、元のヨード１２５でラベルし
たアポリポ蛋白の特異的活性を利用してＩＤＥ粒子に結
合したａｐｏＢの質ｌが算出される。この結果を表■に
示す。

表■ メ 結合量μｇ ０．２３ ０．２８ ０．４３ １．０ ５．９ Ｇ、１ ９．３ ５９．０ ６３．０ ８１．０ １３０．０ い；Ｉ’ａ　　ｏＢ 旦五１０シュ免皮井 ヒトのａｐｏＢに被覆したヨードバミドエチ・−ルエス
テル（Ｉ　Ｄ　Ｆ、　）粒子（Ｂ／ＩＤＥ粒子）は、ａ
ｐｏＢに対する特異性がＦＡ（２）ｂ）に記載するよう
に決定したものを持つモノクロナール抗体に反応する。

Ｂ／ＩＤＥ粒子は、１８５や２０８て′指定したように
特異なモノクロナール抗体を分泌するの２個のハイブリ
ドーマクローンの培養浮澹液で４℃の温度で一昼夜わか
す。わかしたら、粒子は、０，１％の子牛の血１−７よ
うアルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＨ８中で３回洗浄を行
う６Ｂ／ＩＤＥ粒子は、羊の反マウス抗体をビオチン（
ヘキサハイドロ−２−オキシ−ＩＨ−チエノール［３，
４−ｄ　］イミダゾ・−ルー４−ペンタノイック　アシ
ド）に共有結合させた状態で３時間室温でわかされる。

この後、粒子は、ＰＨ８中の０．１％Ｂ、ＳＡにより３
回洗浄され、螢光イソチオシアネートに共有結合させた
アビジン（蛋白質）とともに室温で３０分間ねかす。螢
光ラベルさせたアビジンは、羊の反マウス抗体に付着し
た粒子を螢光化させるビオチンと非常に強力な複合体を
形成する。このため、マウスのモノクロナール抗体と反
応するａｐｏＢに１１着した粒子は１．螢光を発する。

Ｂ／ＩＤＥ粒子は、０．１１％のＢＳＡを含む緩衝液に
より３回洗浄されて螢光粒子は、螢光活性フローザイＩ
・メトリにより分析される。この結果を表■に示す。

表■ 調整　　　　　　　　　　　平均チャネルＢ／ＩＤＥ粒
子のみ　　　　　　　　２９．８ネガティブ染色制御　
　　　　　　　３５．０不適当なモノクロナール抗体　
　　　３５．３モノクロナ一ル反ヒトａｐｏＢ　（ｂ８
５）５２．　１モノクロナ一ル反ヒトａｐｏＢ　（２０
８）５３．　１Ｂ／ＩＤＥ粒子からの螢光は１．二の方
法を用いると、単位粒子あたりの螢光量として算定され
、結果は螢光平均チャネルで表現される。この螢光平均
チャネルは、単位粒子あたりの平均螢光量を示す。この
チャネルが高くなるほど、単位粒子あたりの螢光量が多
くなり、粒子に結合するモノクロナール抗体が多くなる
東情にある。寸法は、線形ではなく対数である。

ネガティブ染色制御の平均チャネル、粒子のみ（抗体な
し）、不適当なモノクロナール抗体のヒ１−ａｐｏＢ（
ｂ８５および２１８）に特異的モノクロナール抗体反応
に対する差異は１８であった。

これらの結果から下記のことが立証できた。

すなわち、（ア）ａｐｏＢはＩＤＥ粒子に付着した；（
イ）モノクロナール抗体はＩＤＥ粒子に反応１−な；（
つ）不適当なモノクロナール抗体に対する粒子の反応が
ないから、反応はａｐｏＢモノクロナール抗体に特異的
である。

この例からは、大きな抗体のエピトープは、特異的モノ
クロナール抗体の反応性を保持するように粒子表面に付
着することがわかる。

（２）　　、覧１ビニール″″　たａ　　ｏＢのエピト
ープ　　　モノ　ロ　−ル　　の下記の全ては例（ｂ）
で説明した手順により行なわれた。Ｌ、ＤＬは高速遠心
分離装置によりヒトの血しようから分離され、マウス反
ヒトのＬＤＬモノクロナール抗体がヒトのり、　Ｄ　Ｌ
、により免疫化されたマウスから調製される。バイブリ
ド−マスは、ヒトのり、ＤＬ、に対する特異性モノクロ
ナール抗体の産出のためスクリーンされ、こうして産出
されたモノクロナール抗体のａｐｏＢ特異性は例（ｂ）
ｄ）で述べたように決定される。

ａ）　　ボｔビニールに　　　ａ　　ｏＢの　４性 蛋白特異的活性（ＤＰＭ／ｍｇ）の知られているａｐｏ
Ｂをヨード１２５でラベルし、ＰＢＳｉＩ衝液中で０．
４９から３．９ｍｇ／ｍＪ間の濃度にして塩化ポリビニ
ールの７．１ｍｍ’の面積表面に加え、その後−昼夜４
℃の温度のもとてねかす、液体成分を除去して表面をＰ
Ｈ３中の１％のＢＳＡで３回洗浄する。洗浄液を吸引に
より除去した後には、表面を放射試験して塩化ポリビニ
ールに結合したａｐｏＢの質量を算出する。この算出に
は、ヨード１２５でラベルしたａｐｏＢの特異的活性を
利用している。この結果を表Ｖに示す。

表■ 添加量（μｇ）　　　　　　　結合Ｊｉ（μｇ）０．４
９　　　　　　　　　　　　　０．０２５０．９８　　
　　　　　　　　　　　０．０４５１．９５　　　　　
　　　　　　　　０．０８０３．９０　　　　　　　　
　　　　　０．１３８ｂ）ａ　　ｏＢのエピトープの 面積７．１．ｍｍ２の塩化ポリビニールの表面を、４℃
で０．１５Ｍの炭酸すトリウム１０．３５Ｍの重炭酸ナ
トリウムのＰＨ９，０の溶液に溶解させた１、、５μｇ
／ｍｕの濃度にしたヒトのＬＤＬとともにねかず。わか
した後には、表面をＰＨ３中の１％のＢＳＡで３回洗浄
し、て同様の溶液内に室温で２時間ねかす。わかした後
には、表面から吸引により液体成分を取り除いて、ＰＨ
３中に１％のＢＳＡをｉニア５０で希釈したハイブリド
ーマクローンのマウス反ヒトａｐｏＢモノクロナール抗
体の浮遊培養液を加える。この直後に、ＰＢＳ中に１％
のＢＳＡを希釈した０、１ｍＮのヒトのＬ　Ｄ　Ｌ、を
加えて、１０から１１００ｎのａｐ。

Ｂが塩化ポリビニールの表面に付着したａｐｏＢエピト
ープと対抗させる。この混合液は、４℃で１６時間わか
せ°ζ表面をＰＢＳ中の１％のＢＳＡで３回洗浄する。

Ｌ、ＤＬ、のａｐｏＢに反応するモノクロナール抗体は
、表面を洗浄することにより除去され、塩化ポリビニー
ルに付表したａｐｏＢエピトープに反応するモノクロナ
ール抗体が、ヨード１２５でラベルした１反マウス抗体
と最終的にねかすことにより検出される。ａｐｏＢの塩
化ポリビニール安定化エピトープの対抗免疫試験結果は
、下記の表■に示す、ＬＩＩｌ、ａｐｏＢを加えるほど
塩化ポリビニール安定化ａｐｏＢエピトープに結合する
放射能は少なくなる。全添加１ｔ（Ｙ軸）をり、ＤＬａ
ｐｏＢの添加１１（Ｘ−軸）に対してグラフ化して基準
曲線を作成する。ａｐｏＢの未知量を含んだ試料に対し
て、試験試料にある全添加量に対する割合（％）を計算
すれば、未知試料中のａｐｏＢの値が求められる。

表■ Ｌ叶（ｎｇ）　　結合ＤＰＨ ０５２５７、５２８０ ５４６８８，４５３４ ４０２９９２，２９４５ 平均ＤＰ８ Ｇ１２ 全Ｊｔ（％） １００．０ ８７．５ ８４．３ ７２．２ ６６．７ Ｇ４ ５０．７ ４３．６ ３９．９ ＬＤＬを例〈１−） ａ）で示した手順で高速遠心 分離装置によりヒトの血しＪうから分離する。蛋白特異
的活性（Ｄ　Ｐ　Ｍ　／　ｍ　ｇ　）の知られているａ
ｐｏＢをヨード１，２５でラベルしたものを用いて直径
が３ｍｍで表面積が２．８ｍｍ２のポリスチレン粒子に
対するａｐｏＢエピトープの結合性を評価する。この粒
子は、ＰＢＳの単位ｍρあたり５０から１５０μｇのヨ
ード１２５でラベル！イなａｐｏＢの１．０ｍｆｆ１の
溶液中に４℃で一昼夜ねかす。わかした後には、粒子は
３回洗浄されて結合したヨード１２５のａｐｏＢが放射
試験される。

ポリスチレン粒子に結合したａｐｏＢの質議は、ヨード
１２５でラベルした元来のａｐｏＢの特異的活性を用い
て算出される。この結果を表■に示す。

表■ 添加ｉｔ（μｇ／ｍ１）　　　結合量（μｇ／ｍｊ　）
０゜ ０゜ １、 過低密度リポ蛋白（Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌ　）および低密度リ
ポ蛋白（Ｌ、　Ｄ　Ｌ、　）をヒトの血しょうから高速
遠心分離装置により取り除く。この高速遠心分離装置は
、１４°Ｃで平均１７５，０００ｇで１８時間運転を行
ない、血しようは、これの１０ｍｆｌあたり０．７７８
ｇの臭化す）・リウムにより溶解することで１．０６３
　ｇ／ｍＡの生物学的溶液に調製される。濁ったＶ　１
．　Ｄ　Ｌ、および１−　Ｄ　ｉ−５を含んだ浮部成分
を取り除いて１０ｍｊｌあたり２．１４５ｇの臭化ナト
リウムをさらに加えることにより１．２１ｇ／ｍｌ！の
生理食塩水に再調製する。

高密度リポ蛋白（ＨＤｌ、）は、高Ｊ１′遠心分離装置
により１４℃、平均１．７５，０００ｇで４０時間かけ
られて分ギされる。高密度リポ蛋白（Ｉ（Ｉ）し、）の
浮遊層は除去され、生理食塩はＩ−（Ｄ　Ｌ調製液から
取り除かれる。この取り除きは、３５００ドルトン分子
鼠よりも大きな成分を排する半透性のセルロース膜を用
いてＯ，１５Ｍの塩化ナトリウムに対して透析する。

ｂ）マウス　ヒトＨＤ　Ｌモノクロ　−ル　　の週！ 生後２ないし４週間のマウスを１１００ｕのＩ）ＤＬ７
を０．５ｍｊｌ皮千注射することにより免疫化させる。

このＨＤＬは、懸濁させた結核萌を含む鉱物油０．５ｍ
、Ｉ）を全容量として乳化さぜなものである。これらの
マウスは、ＨＤＩ−の１００μｇ乳化液および０．５ｍ
Ｊｌの鉱物油を皮下注射することにより再免疫化される
。３週間後にＪとの静脈から血しようを採取し、ｒＩＡ
（４）ｄ）の場合と同様にして試験を行い、ヒトＨＤ　
Ｌ、に対する特異的抗体の産出を確認する。ＨＤ　Ｌ、
に対する特異的抗体産出の濃度が最大のマウスは、ひ臓
細胞が骨髄細胞にハイブリッド（融合）化しないうちの
週に数回再免疫化させる。ハイブリッド化の４日前に、
１００ＭｇのＨＤＬを腹膜に投与して、ハイブリッド化
の３日前に、２００ＭｇのＨＤＬを１復膜および静脈に
投与し、さらには、ハイブリッド化の２日前に、１００
μｇのＨＤ　！−を静脈に投与し、ハイブリッド化の１
日ｉｒｆに、２００　ｔ、ｔ　ｇ　ノｆ（Ｄ　Ｉ−を静
脈および腹膜に投与する。モノクロナール抗体は、例（
ｂ）ｂ）で示したのと同様にして調製する。

免疫マウスから集めてバイブリド−マスが成長している
培秀液に分泌さぜな血しょうからのし１へＨＤ　Ｌ、に
対する抗体は、下記のようにして試験が行われる。

すなわち、ヒトＨＤ　Ｌは例（４）ａ＞で概説ｌ〜たよ
うにユ１１製され、０．１５Ｍの炭酸すトリウム、０．
０３５Ｍの重炭酸ナトリウムＰ　Ｈ９、ｏの緩衝液で１
０．ｉｚｇ／ｎｕの濃度に希釈され、ついで希釈したＬ
ＤＩ−の０．１ｍｇを９６個の皿にそれぞれ加えて４℃
の温度で一昼夜わかず。わがした後には、冬服から液体
成分を吸引により除く。冬服は、０．１５Ｍの塩化ナト
リウムとＰＨ７，４で０．０５Ｍのリン酸緩衝液（リン
酸緩衝塩ＰＢＳ）との溶液に溶かした子牛の血しよう（
ＢＳＡ）の１重量％の０．２ｍＮにより３回洗浄した。

洗浄後には、冬服はＢＳＡ内に１重量％の０．２５ｍｇ
のＢＳＡを加えた溶液で満たされ、２ないし４時間室温
でねかす。その後、各皿内の液体は除かれて免疫マウス
からの希釈型しょう（表■）の０．１ｍＮあるいは、バ
イブリド−マス（表ＩＸ）の培養浮瀞液からの媒体液を
０゜１ｍＮ皿に加えて４℃の温度で一昼夜ねかす。わか
した後には、冬服から液体成分を吸引により除く。冬服
には、放射性同位元素のヨード（Ｉ）１２５でラベルさ
れた１反マウス抗体を加えた。この羊の抗体は、ＰＢＳ
中の１％のＢＳＡで希釈され、１分、１ｍＭ　　（ＤＰ
Ｍ／ｍｕ　）あたり６００，０００個に分解する。冬服
は、４時間室温でねかす、わかした後には、冬服から液
体成分を吸引により除いて、冬服をＰＢＳ中の１％のＢ
ＳＡで三回洗浄した。

ヒトのＬＤｌ、に反応するマウスの抗体を示す各皿内の
放射能や（ＤＰＭ）は放射試験が行われ、その結果は表
■および表ＩＸに示ず。表■は、マウスにヒトＬ　Ｄ　
Ｌを抗原として投与したときに得られた結果を要約して
いる。免疫前の血しょうは、マウスがＬ　Ｄ　Ｌの投与
を受ける前の試験結果であり、免疫になった血しょうの
結果は、マウスが１．ＤＬの投与を受けた試験抗体に現
れる。マウスの抗体のスクリーニング試験は、希釈型し
ょう（ｂ：１０．１　：　１．　ＯＯｌｌ：］、０００
．１　：　２５００．１　：　５０００．１　：　１０
，０００）で行われる。

表■に示すように、マウス１は希釈型しょう（ｂ：　１
０，０００）を用いた結合ＤＰＭ　（免疫前血しよう対
免疫後血しょう）では３１倍に増加した。これに対して
、マウス２は希釈型しょう（ｂ：　１０，０００）を用
いた結合ＤＰＭ　（免疫前血しよう対免疫後血しょう）
では１３倍に増加した。この結果は、両マウスどもヒト
１．、、　Ｄ　Ｌに対して高度に免疫化したことを示す
が、マウス１はＨＤＬに対する特異的抗体産出物の濃度
が特に高いことが分かる。

表■ マウス１゜ 希釈　　　　免疫前血しょう　免疫ｆ＆Ｉ１ｍしょう１
：１０　　　　１２８４　　　　　　　６６１８１・１
００　　　　９９２　　　　　　１１２１６１・１００
０　　　５７９　　　　　　１２．４１１１：２５００
　　　４９１　　　　　　１２６４９１：５０００　　
　４２８　　　　　　１２０１８１：１００００　　　
３６７　　　　　　１１４１７マウス２ 希釈　　　　免疫前血しょう　免疫後型しょう１：１０
　　　　１７９３　　　　　　　８１０４１：１００　
　　　９８３　　　　　　１０７３０１：１０００　　
　１００８　　　　　　１２．３３０１：２５００　　
　９７８　　　　　　１１，４６２１：５０００　　　
９５３　　　　　　１１２３９１：１００００　　　７
０６　　　　　　　９６９４表ＩＸは、マウス１く表■
）のひ臓から精製したバイブリド−マスの５個のクロー
ンにお（Ｊる培養浮漉液をモノクロナール抗体の産出の
ため試験を行ったとき得られた結果を要約したものであ
る。ヒトのり、Ｄｌ、、に特異的な抗体があると、放射
性をネガティブな制御にするに関して５０倍の増加が見
られる。表ＩＸに示す５個のクローンのそれぞれは、ヒ
トのａｐｏＡ−１に対して単一モノクロナール抗体を産
出する細胞を示す。

表Ｉｘ ネガティブ　　クローン１　　クローン２２！’＋８　
　　　　１２６８２　　　１３３２６クローン３　　ク
ローン４　　クローン５リビツドは、４℃の温度での１
０ｍＮクロロホルム、１０ｍｊ！のメタノールおよび２
０＋ｎｆＩのジエチルエーテルの混合液によりｔ（Ｄ　
Ｌ、を］、、Ｏｍ１希釈することにより除去される。Ｈ
ＤＬのアポリポ蛋白は、温度４℃で２０分間１０．００
０ｇの遠心分離装置にかけることにより白色の沈澱物と
して得られた。この沈澱物を２０ｍＭのジエチルエーテ
ルにより一度洗浄して、その後に吸引によりジエチルエ
ーテルを取り除く、沈澱物は、約３５℃まで温められて
残留するジエチルエーテルを除き、ついで０．０６７Ｍ
の２−アミノ−２−ヒドロキシルメチール〜１．３−プ
ロバネジオール／塩酸緩衝液およびＰＨ６，８の緩衝液
（２％のドデシル硫酸ナトリウム、１０％のグリセロー
ルおよび５％の２−メルカプタンを含む）からなる溶液
に溶かされる。アポリポ蛋白の沈澱物を溶かした後には
、溶液は３分間加熱されて１００℃にまで温度」１昇し
、その後室温まで冷却される。

溶液中の蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム中で例（ｂ
）ｄ）のａｐｏＢの場合に述べたように電気泳動法によ
り分子量ごとに分離される。アクリルアミドゲル上から
分離されたＨ　Ｄ　Ｌ、のアポリポ蛋白質は、電気泳動
管によりアクリルアミドゲルからニトロセルロース糸に
渡される。蛋白質が二）−ロセルロース糸に渡された後
には、薄い断片を切断してから染色して蛋白質帯域の位
置が後日のため視認できるようにする。残るニトロセル
ロースの板は、ａｐｏＡ−Ｎに対して調製した各バイブ
リド−マスの培養浮澹液を断片と一緒に一昼夜ねかすこ
とを除けば、例（ｂ，）ｄ）でａｐｏＡＩの場合に述べ
たように処理される。ニトロセルロースに渡されたＨＤ
Ｌの分離アポリポ蛋白に対する反応は、ＰＡ（ｂ）ｄ）
で説明したように、アルカリフオスファターぜを結合し
た羊の反マウス抗体を用いて検出した。モノクロナール
抗体のａｐｏＡ−Ｉ特異性は、ニトロセルロース系上−
にあり、特徴的な分″ｆ−量の帯域のａｐｏＡ−Ｉの免
疫反応により決定される。

ヨードパミドエヂルエステル（Ｉ　Ｄ　Ｅ　）の粒子は
、ポリビニールポリリドン（ｂ５，ＯＯＯＭＷ）を−分
間に５ｍＮの割合で低温（４℃）で急速に攪拌された溶
液に一部はジメチルスルフォキザイド（ＤＭＳＯ）中の
ＩＤＥに、また一部はエタノールに注入することにより
生じた２成分の水溶液（０，１％）を融合することで調
製される０粒子を生成した直後には、蛋白質の特異的活
性（蛋白質の１分あたり１ｍｇの分解量）が分かってい
るとともに、１ｍＪあたり０，５から２．５マイクログ
ラムの間の蛋白濃度でヒトの低密度リポ蛋白のヨード１
２５でラベルしたａｐｏＡ・−１の１゜０ｍＪｌをＩＤ
Ｅの粒子１．、Ｏｍｊ！に加える。これらの粒子と蛋白
とは混合され、粒子は０．１％の濃度でヒトの血しよう
アルブミンを含むＰＢＳを加えることにより洗浄され、
遠心分離装置にかけられる。遠心分層装置をかけた後に
は、洗浄液は吸引により除去され、粒子は再び懸濁され
て再洗浄され、洗浄液中の放射能が無視できるまでにす
る（約４回の洗浄を行なう）、ＩＤＥ粒子に結合さぜ６
ヨード１２５でラベルしたａｐｏＡ−Ｉは、放射試験を
受け、元のヨード】２５でラベルしたａｐｏＡ−Ｈの特
異的活性を利用してＩＤＥ粒子に結合した３ｐｏＡ−Ｉ
の質蚤が算出される。この結果を表Ｘに示す。

表Ｘ ＩＤＥ　　　に　八　ｔ・アポリポ 加えた＃（μｇ）　　　　　　結合量（μｇ）０、５　
　　　　　　　　　　　０．１６１００．２２ １．５０．２６ ２．０　　　　　　　　　　　　０．２７２．５　　　
　　　　　　　　　０．３０ａｐｏＡ−Ｉのエピ１−−
１に付着したヨードパミドエチルエステル（ＩＩ）Ｅ＞
粒子（Ａ／Ｉｆ’）Ｅ粒子）は、４℃で一昼夜わかずこ
とによりａ、　ｐ　０Ａ−Ｉに対して特異的に反応する
。

わかした後は、粒子を０．１−％の子牛の血しょうアル
ブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中で３回洗浄を行う、そ
の後には、Ａ／ＩＤＥ粒子は、ビオチン結合型の羊の反
マウス抗体を反応させ、しかる後には例（ｂ）ｆ）で述
べたように螢光イソチオシアネートに共有結合させたア
ビジン（蛋白質の一種）とともに室温で３０分間ねかす
。

螢光的にラベルさせたアビジンは、羊の反マウス抗体に
結合した粒子を螢光化させるビオチンと非常に強力な複
合体を形成する。このため、マウスのモノクロナール抗
体と反応するａｐｏＢに付熱した粒子は螢光を発する。

ａｐｏＡ−Ｉ／ＩＤＥ粒子は、０．１％子牛の血しょう
を含むＰＢＳにより３回洗浄され、螢光粒子は螢光活性
フローサイトメトリにより分析される。この結果を表Ｘ
Ｉに示す。

表ＸＩ 調整 ＩＤＥ粒子のみ ネガティブ染色制御 不適当なモノクロナール抗体 平均ヂャネル ３０．１ ３２．６ ３３．７ ヒ１−ａｐｏ　Ａ−１に対するモノクロナール（７，０
８）４１．３ ヒ１−ａｐｏ　Ａ−１に対するモノクロナール（７，１
８）９８．５ ａｐｏＡ−Ｉ／ＩＤＥ粒子からの螢光は、この方法を用
いると、単位粒子あたりの螢光展とｌ−で算定され、結
果は螢光平均チャネルで表現される。

この螢光平均チャネルは、単位粒子あたりの平均螢光量
を示す、このヂャネルが高くなるほど、単位粒子あたり
の螢光厘が多くなり、粒子に結合するモノクロナール抗
体が多くなる事情にある。寸法は、線形ではなく対数で
ある。

ネガティブ染色制御の平均ヂャネル、ａｐｏＡ−Ｘ／Ｘ
ＤＥ粒子のみおよび不適当なモノクロナール抗体に対す
る９および６６のヒトａｐｏＡＩのエピトープに関する
モノクロナール抗体の特異性への比較から生じた差異に
より下記のことが立夏できた。

すなわち、（イ）ａｐｏＡ−ＩのエピトープはＩＤＥ粒
子に付着した；　（ロ）モノクロナール抗体はａ　ｐ　
ｏ　Ａ　−１／　Ｉ　Ｄ　Ｅ、　粉子に反応した；（ハ
）この反応はａｐｏＡ−Ｉのエピトープに特異的である
。

この例からは、ａｐｏＡ・−■のエピトープは、特異的
モノクロナール抗体に対するエビト−１の反応性を保持
するように粒子に付着することが分かる。

下記の全ては例（４）で左開した手順により行なわれた
。高密度リポ蛋白（ＨＤＩ、）は高速遠心分離装置によ
りヒトの血しようから分離され、マウス反ヒトＨＤ　Ｌ
、モノクロナール抗体がヒトのＨＤＬにより免疫化され
たマウスから調製される。

バイブリド−マスは、ヒトＨＤＬ、に対する特異性モノ
クロナール抗体の産出のためスクリーンされ、こうして
産出されたモノクロナール抗体のａｐ。

Ａ−Ｉ特異性を決定する。

ａ）　　　、、Ｉビニールに　　　ａｏＡ−Ｉの級立性 蛋白特異的活性（ＤＰＭ／ｍｇ）の知られているａｐｏ
Ａ−Ｉをヨード１２５でラベルし、ＰＢＳ緩衝液中で０
．４９ｍｇ／ｍｕから１５．６ｍｇ／ｒ＋ｄ間の濃度に
して塩化ポリビニールの７１ｍｍ２の面積表面に加え、
その後−４，夜４℃の温度のもとてねかす。液体成分を
除去して表面をＰＨ３中の１％のＢＳＡで３回洗浄する
。洗浄液を吸引により除去した後には、表面を放射試験
して塩化ポリビニールに結合したａｐｏＡ−Ｉの質量を
算出する。この算出には、ヨード１２５でラベルＬ７た
ａｐｏＡ−Ｉの特異的活性を利用！−でいる。この結果
を表ｘ■に示す。

表Ｘ■ 添加層〈μｇ） ０．４９ ０．９８ １、９５ ３．９０ 結合：ｌ（メ１ｇ） ０．０２１ ０．０３８ ０．０６０ ０．０８２ ７．８０ ０．０９９ １５．６０ ０．１．１８ 面ｆａ７．１ｍｍ２の塩化ポリビニールの表面を、４℃
で０．１５Ｍの炭酸ナトリウム１０．３５Ｍの重炭酸ナ
トリウムのＰＨ９，０の溶液に溶解させた１、５μｇ／
ｍＪｌの濃度にしたヒトのＨＤ　Ｌとともにねかす。ね
かした後には、表面をＰＨ３中の１％のＢＳＡで３回洗
浄して同様の溶液内に室温で２時間ねかず。わかした後
には、表面から吸引により液体成分を取り除いて、ａｐ
ｏＡ−Ｉに対するバイブリド−マス産出型のモノクロナ
ール抗体からの浮部培養液を１：２５０で希釈した０、
１ｍｊ！を加える。この直後に、ヒトＨＤＬをＱ、ｌｎ
ｄ加えて、１０から１１００ｎのａｐ。

Ａ−ＩをａｐｏＡ−Ｉの塩化ポリビニール安定化エピト
ープと対抗させる。この混合液は、４℃で１６時間ねか
せて表面をＰＨ３中の１％のＢＳＡで３回洗浄する。ａ
ｐｏＡ−Ｉの塩化ポリビニル安定化エビ１−一ブに対す
るモノクロナール抗体の結合は、ヨード１２５でラベル
した１反マウス抗体と最終的にわかすことにより検出さ
れる６ａｐｏＡ−Ｉの塩化ポリビニール安定化エピトー
プに対する対抗免疫試験結果は、下記の表Ｘ■に示す。

ＨＤＬａｐｏＡ−Ｉを加えるほどａｐｏＡＩの塩化ポリ
ビニール安定化エピトープに結合する放射能は少なくな
る。全添加量（Ｙ−軸）を１゜ＤＬａｐｏＢの添加１（
Ｘ−軸）に対し゛Ｃグラフ化して基準曲線を作成する。

表Ｘ■ 希釈度 緩衝液のみ １　：　１００ １：８０ １：５０ 結合針Ｈ 全＋ｉ（％） １００．０ ５７．９ ５０．５ ４３．４ １：４０　　　　　　　　５８０　　　　　　　　　３
０．５１　：２０　　　　　　　　　３５０　　　　　
　　　　１８．４１：１０　　　　　　　　　１００　
　　　　　　　　５．３この発明は、コレステロールに
関連するリポ蛋白成分を測定するに特に有用であり、冠
状動脈系の疾患に関する危険性を評価するために、生物
学的溶液内のりボ蛋白成分を測定する免疫試験−式に基
づいたモノクロナールにも係わっている。

さらには、この免疫試験−式は、本発明の工明で有用と
分かった他の物質にも関している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（ａ）エピトープが粒子に付着した後にエピトープ
   に反応性を保持する単細胞系の産物であるモノクロナー
   ル抗体を選択する手順と、 （ｂ）前記エピトープを分離する手順と、 （ｃ）粒子に付着させることにより前記エピトープを安
   定化させる手順と、 （ｄ）前記抗体の通常値の０．０１から１０倍の濃度範
   囲で緩衝水に希釈することにより粒子安定化エピトープ
   を標準化する手順と、 （ｅ）前記モノクロナール抗体に反応するエピトープは
   含んでいないが、試験試料の成分を擬態する液体に懸濁
   させることにより粒子安定化エピトープを制御試料とし
   て作製する手順とを具備してなる免疫試験の標準化およ
   び制御のための粒子安定化エピトープ製造方法。 ２）前記エピトープは、不変の抗原、化学的に変形され
   た抗原、抗原成分、化学合成された抗原、生物的に合成
   された抗原および前記モノクロナール抗体に対する反応
   力を保持するハプテンからなる群から選択された抗体の
   決定子であることを特徴とする請求項１記載の免疫試験
   の標準化および制御のための粒子安定化エピトープ製造
   方法。 ３）前記抗原は、蛋白質、ペプチド、炭水化物、蛋白−
   炭水化物複合体、リピッド蛋白−炭水化物複合体および
   免疫グロブリンからなる群から選択されたことを特徴と
   する請求項１記載の免疫試験の標準化および制御のため
   の粒子安定化エピトープ製造方法。 ４）前記エピトープは、高濃度リポ蛋白、低密度リポ蛋
   白および過低密度リポ蛋白からなる群から選択されたリ
   ポ蛋白の誘導物であることを特徴とする請求項１記載の
   免疫試験の標準化および制御のための粒子安定化エピト
   ープ製造方法。 ５）前記抗原は、エピトープを含む断片に化学的に切断
   されたことを特徴とする請求項１記載の免疫試験の標準
   化および制御のための粒子安定化エピトープ製造方法。 ６）前記エピトープは、被試験体である抗体物に特異的
   なモノクロナール抗体を用いた免疫親和性により分離さ
   れたことを特徴とする請求項１記載の免疫試験の標準化
   および制御のための粒子安定化エピトープ製造方法。 ７）前記エピトープは、粒子に化学的に付着させて安定
   させたことを特徴とする請求項１記載の免疫試験の標準
   化および制御のための粒子安定化エピトープ製造方法。 ８）前記エピトープは、粒子に物理的に吸収させること
   により安定させたことを特徴とする請求項１記載の免疫
   試験の標準化および制御のための粒子安定化エピトープ
   製造方法。９）前記粒子は、乳液、澱粉、樹脂、エステ
   ル、有機酸および生物学的溶液には不溶性の有機基から
   なる群から選択した成分であることを特徴とする請求項
   １記載の免疫試験の標準化および制御のための粒子安定
   化エピトープ製造方法。 １０）前記粒子は、ヨードパミドエステル（ＩＤＥ）か
   らなることを特徴とする請求項１記載の免疫試験の標準
   化および制御のための粒子安定化エピトープ製造方法。 １１）前記粒子の密度は、０．１から１０ｇ／ｃｃの範
   囲にあることを特徴とする請求項１記載の免疫試験の標
   準化および制御のための粒子安定化エピトープ製造方法
   。 １２）前記粒子の粒径は、２５％より少ないばらつきで
   １から１００，０００ナノメータの範囲にあることを特
   徴とする請求項１記載の免疫試験の標準化および制御の
   ための粒子安定化エピトープ製造方法。 １３）前記粒子安定化の標準化および制御化は、脂質親
   和性物質により行なったことを特徴とする請求項１記載
   の免疫試験の標準化および制御のための粒子安定化エピ
   トープ製造方法。 １４）同一の抗原から誘導した互いに異なる２から２０
   個のエピトープは、粒子上に安定化されて抗原の免疫試
   験のため標準化および抑制化に資することを特徴とする
   請求項１記載の免疫試験の標準化および制御のための粒
   子安定化エピトープ製造方法。 １５）同一の抗体から誘導した互いに異なる２から２０
   個のエピトープは、粒子上に安定化されて互いに異なる
   ２から２０個の抗原の免疫試験のため標準化および抑制
   化に資することを特徴とする請求項１記載の免疫試験の
   標準化および制御のための粒子安定化エピトープ製造方
   法。 １６）２から２０個のエピトープは、互いに異なる２か
   ら２０個の細胞系統の産物である互いに異なる２から２
   ０個のモノクロナール抗体であることを特徴とする請求
   項１、１４および１５記載の免疫試験の標準化および制
   御のための粒子安定化エピトープ製造方法。１７）抗原
   から誘導された２から２０個のエピトープは、大きさ、
   密度、成分、外観表面といった物理的性質を異にする粒
   子上に安定化され、モノクロナール抗体と反応した後に
   前記エピトープの分離を容易にすることを特徴とする請
   求項１記載の免疫試験の標準化および制御のための粒子
   安定化エピトープ製造方法。 １８）（ａ）エピトープが粒子に付着した後にエピトー
   プに反応性を保持する単細胞系の産物であるモノクロナ
   ール抗体を選択する手順と、 （ｂ）前記エピトープを分離する手順と、 （ｃ）粒子に付着させることにより前記エピトープを安
   定化させる手順と、 （ｄ）前記抗体の通常値の０．０１から１０倍の濃度範
   囲で緩衝水に希釈することにより粒子安定化エピトープ
   を標準化する手順とを具備してなる免疫試験の標準化お
   よび制御のための粒子安定化エピトープ製造方法。 １９）（ａ）エピトープが粒子に付着した後にエピトー
   プに反応性を保持する単細胞系の産物であるモノクロナ
   ール抗体を選択する手順と、 （ｂ）前記エピトープを分離する手順と、 （ｃ）粒子に付着させることにより前記エピトープを安
   定化させる手順と、 （ｄ）前記モノクロナール抗体に反応するエピトープは
   含まないが、試験試料の成分を擬態する液体に懸濁させ
   ることにより粒子安定化エピトープを制御試料として作
   製する手順とを具備してなる免疫試験の標準化および制
   御のための粒子安定化エピトープ製造方法。２０）生物
   学的液体中のリポ蛋白成分を計測し、冠動脈疾患に関す
   る病気への危険性を手当てするモノクロナール抗体系の
   免疫試験手段で、リポ蛋白成分は、リポ蛋白に対して親
   和性のあるモノクロナール抗体と固体粒子表面に安定化
   された代理のリポ蛋白からなっていることを特徴とする
   免疫試験手段。