JPH03107759A - カラム充填剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、カラム充填剤に関する。さらに詳しくは、
生体試料の液体クロマトグラフィによる分離分析や除タ
ンパク処理に好適なカラム充填剤に関する。

（ロ）従来の技術 従来から、クロマトグラフィ、特に高速液体クロマトグ
ラフィ（以下、）ＩＰＬｃという）が、血清などの生体
試料中の薬物の分析に汎用されている。しかし、血清な
どのタンパクを多量に含む生体試料中の薬物のＨＰＬＣ
分叶においては除タンパク操作が不可欠であり、このよ
うな前処理操作は、時間と労力を要しかつ分析精度ある
いは確度を損なうという欠点を有している。

そこで、近年、除タンパク操作を行うことなく直接血清
試料を注入し、この試料中に含まれろ各種薬物を分離・
定量することが可能なりロマトグラフィ用充填剤が開発
され、利用されている。これらの充填剤は、多孔性ガラ
スやシリカゲルを担体として、かつその細孔内外に異な
る性質を付与したものである。かかる充填剤では血清中
のタンパク質（アルブミンやグロブリン）は巨大分子な
ので細孔内に入らず、かつ親水性の外表面（孔外面）に
吸着されることなくカラムを素通りし、その一方薬物の
ような比較的小さな分子は疎水性の内表面（孔内面）で
吸着され、分離されることになる。

かかる充填剤の具体例としては、特開昭６０−５６２５
６号公報に記載された発明が挙げられる。この発明では
、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）基を化学結合させたシ
リカ充填剤の外表面にタンパク質をコートした充填剤が
用いられている。この充填剤は、ウシ血清アルブミンあ
るいは家兎血漿タンパクをカラムに吸着、変性させるこ
とにより得られる。

また、これと同様な充填剤を製造する方法として、特開
昭６１−６５１５９号公報（ピンカートンらの方法）お
よび特開平１−１２３１４５号公報（萩中らの方法）に
記載されたように、り内表面および外表面に疎水性基を
導入する、２）次いで、それ自身が巨大分子であり、細
孔内に侵入できない酵素を用いて外表面の疎水性基だけ
を切断する、３）その後、外表面に親木性基を導入する
方法がある。より具体的には何者の方法は、グリセリル
プロピル基を導入した多孔性のシリカを出発原料とし、
これにカルボニルジイミダゾールを介してオリゴペプチ
ド（グリシル−フェニルアラニル−フェニルアラニンな
ど）を結合させ、タンパク質加水分解酵素であるカルボ
キシペプチダーゼＡを用いて加水分解を行うことにより
外表面のフェニルアラニン側鎖を切断する方法である。

その結果、内表面には疎水性リガンドとしてグリシル−
フェニルアラニル−フェニルアラニンが残り、外表面は
親水性のグリシル−グリセリルプロピル基となる。一方
、後者の方法は、アミノプロピル基を導入した多孔性の
シリカを出発原料として、トリエチルアミン存在下、オ
クタノイルクロリドを反応させ、アミド結合を介して疎
水性基を導入し、次に、ポリミキシン・アシラーゼによ
り外表面のアシル基を加水分解し、外表面のアミノ基を
グリシドールとの反応を行うことにより現水性とする方
法である。

（ハ）発明が解決しようとする課題 しかしながら、上述した充填剤のうち、タンパク質をコ
ートしたＯＤＳシリカ充填剤では、使用が長期間にわた
ると吸着、変性したタンパクが溶離を起こすことがあり
、また高分離効率のカラムが得られないなど、耐久性や
分離能の点で欠点を有している。

また、ピンカートンや萩中らの方法では、酵素反応を利
用しているため、工程が複雑化すると共に得られた充填
剤の特性にバラツキが生じ易く、かつ薬物等の小さな分
子の分離能、分離種等に限界があった。

この発明はかかる状況下なされたものであり、高い除タ
ンパク能及び薬物の分離能を存しかつ耐久性が高く、し
かも再現性良く簡便に製造することができる充填剤を提
供しようとするものである。

（ニ）課題を解決するための手段 かくしてこの発明によれば、多孔性担体におけろ孔内面
が、アリール基又はキラル分割能を呈する置換基を有す
るシランカップリング剤残基で修飾されてなり、かつ孔
外面が、親水性基を有するシランカップリング剤残基で
修飾されてなるカラム充填剤が提供される。

この発明のカラム充填剤の母体となる多孔性担体として
は、表面に水酸基を有する水不溶性物質が使用でき、例
えば、いわゆる多孔性シリカゲルや多孔性ガラスを用い
ることができる。ただし、これ以外にも水酸基を有する
合成樹脂で作製された多孔性ポリマーを用いることがで
きる。かかる多孔性担体は通常、粒径５〜２０μｍでか
つ比表面積が２００〜５０（１ｍ”／９程度の多孔性の
ものが適している。

この発明のカラム充填剤は、上記多孔性担体の内外面を
、異なる置換基を有するシランカップリング剤残基で修
飾してなるものである。

ここで、孔内面は、アリール基又はキラル分割能を呈す
る置換基を有するシランカップリング剤残基で修飾され
る。ここでアリール基としては、例えばフェニル基、ナ
フチル基等が挙げられ、キラル分割能を呈する置換基と
しては、例えば、シクロデキストリン含有基、分岐シク
ロデキストリン含有基、キラルアミドおよび尿素誘導体
含有基、クラウンエーテル含有基等が挙げられろ。ここ
でアリール基含有シランカップリング剤残基による修飾
は、疎水性の程度の差に基づいて薬物を分離する場合に
主として採用され、キラル分割能を呈するシランカップ
リング剤残基による修飾は、光学活性の薬物の各対掌体
を分離する場合に主として採用され、適宜選択される。

一方、孔外面は親水性基を有するシランカップリング剤
残基で修飾される。ここで親水性基としては、水酸基、
アミノ基、カルボキシル基等が挙げられる。この孔外面
の修飾は、主として、充填剤へのタンパク質の吸着や保
持を防止し、除タンパク処理やタンパク質分離除去処理
を円滑に行う目的で行われる。

上記孔内外面の修飾は、例えば、多孔性シリカゲルある
いは多孔性ガラスなどの多孔性担体の表面水酸基に各々
各種置換基を有するシランカップリング剤を縮合付加さ
せ、必要に応じて末端置換基を変性するか他の置換基に
変換することにより行うことかできる。かかるシランカ
ップリング剤としては、置換トリ（低級アルコキシ）シ
ラン、末端置換アルキルトリ（低級アルコキシ）シラン
等が適しており、具体的には、置換−トリメトキシシラ
ン、置換−トリエトキシシラン、γ−置換一ブロビルト
リメトキシシラン、γ−置換一プロビルトリエトキシシ
ラン等が挙げられる。これらのうち、孔内面修飾用のシ
ランカップリング剤の一つの好ましい例としてアリール
基−置換トリメトキシ（又はエトキシ）シランや、３−
イソシアナートプロピルトリメトキシ（又はエトキシ）
シランとシクロデキストリンとを反応させて得られるカ
ルバミン酸シクロデキストリンエステル置換プロピルト
リメトキシ（又はエトキシ）シラン等が挙げられる。ま
た、孔内面修飾後のシランカップリング剤の一つの好ま
しい例としては、３−グリシドキシプロビルトリメトキ
シ（又はエトキシ）シランが挙げられろ。

この発明のカラム充填剤は、多孔性担体の表面水酸基に
おける孔内面と孔外面の反応性の差を利用することによ
り、効率良く作製することができる。すなわち、多孔性
担体は、細孔内部の表面（孔内面）及び細孔外部の表面
（孔外面）に水酸基を有するが、本発明者の知見によれ
ば、孔外面における化学反応性が孔内面に比して高い。

従って、この反応性の差を利用して、まず、孔内面修飾
後シランカブプリング剤を、孔内面との反応が実質的に
無視できる緩和な縮合反応条件下で多孔性担体に作用さ
せて実質的に孔外面のみに対応するシランカップリング
剤残基を結合させ、次いで孔内面修飾用シランカップリ
ング剤を、孔内面との反応が円滑に進行する強い縮合反
応条件下で多孔性担体に作用させて残存する水酸基との
縮合によって孔内面に対応するシランカップリング剤残
基を結合させ、この後、必要に応じて各シランカップリ
ング剤残基の置換基を変性・変換等することにより簡便
に作製することができる。

ここでいずれの縮合反応も、実質的に無水の非極性溶媒
（例えば、トルエン、ベンゼン、キシレン等）中に、還
流下で多孔性担体をカップリング剤と接触さ仕て行うこ
とができるが、孔外面への選択的修飾のための緩和な縮
合反応条件としては無触媒条件が選択され、孔内面への
修飾のための強い縮合反応条件としては縮合触媒を添加
した条件が選択される。ここで用いる縮合触媒としては
、有機塩基が適しており、例えば、Ｎ、Ｎ−ジイソプロ
ピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン等が挙
げられる。

なお、各々の縮合反応に供する多孔性担体とカップリン
グ剤の量はとくに限定されないが、通常、表面シラノー
ルＩｔ（例えば８．５μｍｏｌ／♂）に対し、カップリ
ング剤０，５〜４．０当量程度とするのが適している。

また縮合触媒を用いる際の量としてはカップリング剤に
対し、２．５当量程度で充分である。

また、孔外面の修飾に例えば末端グリシドキシアルキル
トリアルコキシシランを用いた場合には、孔内面修飾後
に、末端グリシドキシ基を親水性基に変性する必要があ
り、この変性は、エポキシ環を水解してジオールに変換
することにより達成できろ。ことに末端グリシドキシ基
を用いると製造途中で孔外面に結合したシランカップリ
ング剤残基の活性水素の保護を行うことなく孔内面の修
飾を行うことができるため、一つの好ましい！！１様で
ある。

このようにして得られたこの発明のカラム充填剤は、適
当なカラム容器に充填され、液体クロマトグラフィ用カ
ラムや除タンパク処理用カラムとして好適に用いること
ができる。

（ホ）作用 多孔性担体の孔内面に修飾され、アリール基又はキラル
分割能を呈する置換基を有するシランカップリング剤残
基は、細孔内に侵入しうる薬物等の比較的小さな種々の
分子をその疎水性の程度の差又は包接錯体あるいはジア
ステレオマー錯体の安定性の差に基づいて効率良く分離
するよう作用する。一方、孔外面に修飾され、親水性基
を有するシランカップリング剤残基は、多孔性担体にタ
ンパク質等の巨大分子の吸着や保護を防止するよう作用
する。

そして、これらの作用が相俟って薬物等の高精度な分離
分計が長期間に亘って可能となり、血清等の生体試料の
直接分離も可能となる。

（へ）実施例 実施例！ （工程１）３−グリシドキシプロピル基を有する孔外面
の調製 Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　６Ｏ−５（粒径５　ｇｍ、細孔径
６０人、多孔性シリカ−野村化学社製）２ｇにトルエン
１２０ｉ１２を加え、共沸により水を除いた後、３−グ
リシドキシプロピルトリメトキシシラン３．８１を加え
た後、無触媒条件下９０〜９５℃で５時間撹拌する。反
応済みシリカを濾取し、６０３！＆のトルエンおよび６
０村のメタノールで洗浄し、下記に示すごとき外面が３
−グリシドキシプロピルシリルエーテル化されたシリカ
を得ろ。

（工程２）フェニル基を有する孔内面の調製工程ｌで得
た３−グリシドキシプロピルシリカ２９にトルエン８０
ｘ（ｌを加え撹拌しておく。さらに、フェニルトリメト
キシシラン２ｘＱおよびＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミン（縮合触媒）６村を加えた後、撹拌しながら９時
間還流する。反応済みシリカを濾取し、６０ｚＱのトル
エンおよび６０１弗メタノールで洗浄し、下記に示すご
とき孔内面がフェニルシリルエーテル化されたシリカを
得る。

（工程３）孔内面にフェニル基、孔外面にジオール基を
有するシリカの調製 上記で調製した充填剤２９をｐＨ３，０の過塩素酸水溶
液８０酎中に加え、撹拌しながら４時間還流する。得ら
れたシリカを水６０ｘＱおよびメタノール６０ｘ（ｌで
洗浄し、孔内面がフェニル基含育シランカップリング剤
残基、孔外面がジオール基含有シランカップリング剤残
基で修飾されたシリカからなる下記に示すこの発明の充
填剤を得た。

実施例２ （工程１）３−グリシドキシプロピル基を有する孔外面
の調製 Ｃｈｅｍｃｏｓｏｒｂ　５ＳＩ（粒径５μｍ、細孔径８
０人、多孔性シリカ；ケムコ社製）２ｇにトルエン８０
１１Ｑを加え、共沸により水を除いた後、３−グリシド
キシプロピルトリメトキシシラン０．８ｚＱを加えた後
、無触媒条件下９０〜９５℃で５時間撹拌する。反応済
みシリカを濾取し、６０ｘＱのトルエンおよび６０酎の
メタノールで洗浄し、孔外面が３−グリシドキシプロピ
ルシリルエーテル化されたシリカを得る。

（工程２）光学分割能を呈する孔内面の調製（β−シク
ロデキストリンを孔内面に化学結合した充填剤の調製） 予め、８０℃に加熱したピリジン’ＩＯａ＋（ｌに、乾
燥したβ−シクロデキストリン４．５９を加え撹拌して
おく。窒素気流下、３−イソシアナートプロピルトリエ
トキシシラン２．６４９を徐々に加え、約５時間（イソ
シアナートの２２００−２３００ｃｍ−’の赤外吸収ス
ベクトルが消失するまで）反応する。この溶液に、上記
（工程Ｉ）で調製したシリカ２９を加え、撹拌しながら
２０時間還流する。反応済みシリカを濾取し、ピリジン
、アセトン、メタノールおよび水、各６０ｚＱで洗浄し
、下記に示す修飾シリカを得た。

（工程３）孔内面にβ−シクロデスキトリン、孔外面に
ジオール基を有する充填剤の調製上記（工程２）で調製
したシリカ約２９を５％のアセトニトリル水溶液中に加
え、２４時間室温で撹拌し、孔内面に、β−シクロデス
キトリンを有するシランカップリング剤残基、孔外面が
ジオール基含有シランカップリング剤残基で修飾された
下記に示すこの発明の充填剤を得た。

実施例３ 実施例１で作製した充填剤を、内径４６３１１１１．長
さ５ｃｍのＨＰＬＣ用ステンレス管に充填した。このカ
ラムを用いて、ヒトコントロール血清（試料Ａ）および
ヒトコントロール血清にフェノバルビタール（２０ｕ９
／　ａＬ）　、７　ｚ　二）イ：／　（４０ｕ９／　ｓ
Ｌ）およびカルバマゼピン（１０μ？／ｓＬ）を標準添
加したもの（試料Ｂ）の分離を調べた。移動相は、１０
０ｍＭ　ＮａＨ＊ＰＯ＊　−ｔｏｏ　＠Ｍ　ＮａＪＰＯ
＊　−ＣＨａＣＮ（４，５−４，５−１）を０．８　ｍ
Ｌ／ｓｉｎで送液し、検出は２５４ｎｓで行なった。ま
た、注入量は１０μしであった。得られたクロマトグラ
ムを第１図に示した。第１図のＡは試料Ａを示すもので
、ヒト血清タンパクのピークが、注入後直ちに溶出した
。第１図のＢは試料Ｂを示すもので、ヒト血清タンパク
の後に、フエノバルビタール■、フェニトイン■および
カルバマゼピン■のピークが溶出し、血清成分と良好に
分離している。

実施例４ 実施例２で作製した充填剤を、内径４■、長さ１００１
１肩のＨＰＬＣ用ステンレス管に充填した。このカラム
を用いて、ヒトコントロール血清（試料Ａ）およびヒト
コントロール血清にヘキソバルビタール（１００μ９／
＋＋Ｌ）を標準添加した乙の（試料Ｃ）の分離特性を調
べた。移動相は、１１００Ｉ　ＮａＨ＊ＰＯａ−１００
１１１！Ｉｆ　ＮａｔＨＰＯ４−ＣＨａＣＮ（２，５−
２，５−１）を０．８　ｍＬ／ｌｌ１ｎで送液し、検出
は２５４ｎｍで行なった。

また、注入量は２０μしてあった。得られたクロマトグ
ラムを第２図に示した。第２図のＡは試料Ａを示すもの
で、ヒト血清タンパクのピークが、注入後直ちに溶出し
た。第２図のＣは試料Ｃを示すもので、ヒト血清タンパ
クの後にヘキソバルビタール■（ｄ一体と４〜体）のピ
ークが溶出し、血清成分と良好に分離している。

そして、実施例３及び４における血清タンパクの回収率
はほぼ１００％であった。このことはジオール基含有シ
ランカップリング剤残基がシリカの孔外面に一様に結合
されているが、孔内面には実質的に結合していないこと
を示すものである。

実施例５ 実施例２で得られた充填剤を内径４．６３１１１１、長
さ３０ｚｍのステンレス管に充填し、血清試料の除タン
パク用カラムとして用いた。ヒトコントロール血清にフ
ェニトイン（５μ９／姓）およびカルバマゼピン（１μ
？／ｉＬ）を標準添加し、５０μＬを注入した。カラム
スイッチングのための液体クロマトグラフ流路図は、第
３図に示した。図中、ｌは分析用移動相、２はポンプ、
３は除タンパク用カラム、４はスイッチングバルブ（バ
ルブ切換時間　点線二〇〜５分、実線：５〜８分、点線
＝８分〜である）、５は分析カラム、６は検出器、７は
記録計、８はインジェクター、９はポンプ、１０は前処
理用移動相を各々示すものである。また、図中スイッチ
ングバルブの点線は前処理カラムと分析カラムが切り離
されている状態を、実線は前処理カラムと分析カラムが
連結されている状態を示すものである。

ここで前処理用移動相１０として、１４ｍＭ　ＮａＨｔ
ＰＯａ−６ｎＭ　Ｎａｔｌ［ＰＯａを流速０．８ｍＬ／
ｗｉｎで送液し、血清試料５０μＬをインジェクター８
から注入し、５分間前処理を行ない分析カラム５で分析
を行なった。

分析条件は、固定相としてＮｕｃｌｅｏｓｉｌ（ヌクレ
オシル）　５Ｃ１ｇ　（ナーゲル社製）を内径４．６■
、長さ１５０Ｒ１１のＨＰＬＣ用ステンレス管に充填し
たちのを用い、分析用移動相ｌとして１４　ｍＭ　Ｎａ
ＨｔＰＯａ　＋　６　ｍＭＮａＪＰＯａ　−ＣＨ’５Ｃ
Ｎ−ＣＨ３０口（５，５／２．５／２）を流速０．８ｍ
Ｌ／＋ｉｎで送液し、検出は２３０ｎ＊の吸収によって
行なった。第４図に得られたクロマトグラムを示した。

図中、■はフェニトイン、■はカルバマゼピンを示すし
のである。このように、この発明の充填剤は、除タンパ
ク用カラムとして有効に機能していることがわかる。

（ト）発明の効果 この発明のカラム充填剤は、孔外面は十分な親水性を有
し、孔内面は十分な疎水性あるいはキラル認識能を呈す
るために血清などのタンパクを含む生体試料中の薬物の
分析において直接注入による薬物の分析が可能であり、
また除タンパク用カラムとしての使用ら可能である。

そして、酵素反応を用いずシランカップリング剤を用い
た化学反応によって作製することができるため、製造が
簡便でかつ再現性ら良好であり、また化学結合によって
内外面に異なる性質が付与されているため、変質等を生
じず耐久性ら優れたものである。

従って、この発明のカラム充填剤の液体クロマトグラフ
ィの分野における有用性は極めて大なるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第４図は、各々、この発明のカラム
充填剤を使用して生体試料を分離分析した結果を例示す
るクロマトグラム図、第３図は、実施例で使用した液体
クロマトグラフ流路図である。 第１ 図 第 図 Ｎ藺（弁） 綺聞（分） 第 ４ 図 １゜ ０ 峙Ｐｒ　Ｃ分）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、多孔性担体における孔内面が、アリール基又はキラ
   ル分割能を呈する置換基を有するシランカップリング剤
   残基で修飾されてなり、かつ孔外面が、親水性基を有す
   るシランカップリング剤残基で修飾されてなるカラム充
   填剤。