JPS6169788A - 修飾アデニン基を有するプローブ - Google Patents

修飾アデニン基を有するプローブ

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JPS6169788A
JPS6169788A JP60184986A JP18498685A JPS6169788A JP S6169788 A JPS6169788 A JP S6169788A JP 60184986 A JP60184986 A JP 60184986A JP 18498685 A JP18498685 A JP 18498685A JP S6169788 A JPS6169788 A JP S6169788A
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JP60184986A
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タム・ユアン‐ダン
ジヤン・イゴラン
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ポリヌクレオチド、より特定的にはチミンの
反応基との間に３個の水素結合を形成し得るように〆修
飾されたアデニン基をプリン塩基として含むオリゴヌク
レオチドフラグメントから構成されるプローブ、該プロ
ーブの製法及び適用・法に係る。
・現在、ある種の分析、特にＤＮＡあるいはＲＮＡ配列
のような特定のヌクレオチド配列の検出及びそれらの配
列の単離を行なうために、プローブとして使用される所
定のヌクレオチド配列と、核酸を含むある組成物中に含
まれることのある前記プローブのヌクレオチドと相補的
なヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションに
暴く技術を使用することは当１！者にとってよく知られ
ている。ところがこの技術の実用化には特に、高感度か
つ相補的配列と安定にハイブリダイゼーション゛りるプ
ローブを１！′７る点で、依然として問題が残されてい
る。
すなわち、遺伝子工学で最もしばしば起る問題部ら相補
的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）断片とのハイブリダイゼーショ
ンによるメツセンジャーＲＮＡ配列の検出、単離及び配
列分析の問題である。この技術はＡ−Ｔ対（水素結合２
個）及びＧ−・Ｃ対（水束結合ロロの対合に暴くもので
ある。
これ等のプローブの概念及び合成は、単一のコドンを必
要とするメチオニン（ＡＵＧ）及びトリプトファン（Ｕ
　Ｇ　Ｇ　）を除いて２へ・６種のコドンから翻訳され
る他のアミノ酸全てに対する遺伝子的コードの縮重によ
って複雑になっている。
グ現在のところ、既知タンパク質配列からブロ行なわれ
ている。
ａ）配列中に、ΔよりはむしろＧ、ＣよりはむしろＴを
選択し、これによってハイブリッドピ（ジョンの結果安
定な対、または通常誤対合といわれるＧ−Ｔ対（以下「
ミスマツチＪ　Ｇ−Ｔ）を形成する。この方法はラット
　レラキシン（ｒｅｌａｘｉｎｃ）をコードするｃＤＮ
Δ合成り着Ｚ成功を修めた［ｐ、　ｌ−１ｕｄｓｏｎ　
ａｔ　ｃｏｌｌ、。
Ｎａｔｕｒｅ　　（１９８１）、　２９１．　１２７］
が、特にその感度が悪いために一般化するのが困難であ
る。
ｂ）曖昧さくａｍｂｉｇｔｌｉｔｅｓ）を有する対応の
可能む配列を全て準備する（Ｂ、　Ｅ、　Ｎｏｙｃｓ　
ｅｔｃｏｌｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａ
ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、。
ＵＳＡ　（１９７９）　、乃、　１７７０およびＭ。
Ｍｅｖａｒｅｃｈ　　ｅｔｃｏｌｌ、、　　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　　Ｃｈｉｌｌｉ（１９７９）　、植４　、７４
７２］。これには極度に面倒な合成が必要であろう。
Ｃ）同一・の配列に対する全ての曖昧さを有する「混合
プローブ」を合成する。この技術によってたとえばβ−
グロビンで良好な結果が管られた［Ｒ，Ｂ、　Ｗａｌｌ
ａｃｅ　ａｔ　ｃｏｌｌ、、　　ＮｕｃｌｅｉｃΔｃｉ
ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８１）　、　９．８７
９］　。しかしこの技術は、得られた混合物の複雑さお
よび使用するトリマーの数について有機化学者には不満
があり、特に各曖昧さのレベルで使用する様々のトリマ
ーの異なる反応性のために常に満足な結果が得られると
は限らない。その結果、得られた混合物の正確な組成に
対して確信がもてない。
本発明は従来技術の上記の如き欠点を少なくとも部分的
に除くものであり、そのために２供されるプローブは、 一複雑な配列の混合物に単独で置き換ることができ、従
って時間と費用が大幅に節約され、−明確に規定される
組成を有し、 −特に上記ａ）に記載したプローブと比較して、相補配
列とのハイブリダイゼーション後の検出感度が高くかつ
こうして形成されたハイブリッドの安定性が高り（Ｗ＆
解湿温度高い）、 −現在まで利用されていた比較的感度が低くし同定法で
用いることができる。
ヌクレオチド配列中の２′−デオキシアデノシン（Ａ）
を２−アミノ−２′−デオキシアデノシン（ＡＩ）に置
換すると、この配列により形成されたハイブリッドでは
、２［！ｉｔの水素結合を有するＡＴ対は、３個の水素
結合を有してＪ５り且つＣＧ対と同等の安定性を有する
Ａ”Ｔ対に形質転換することが知られている（アール・
シー・コンタ−及びビー・アール・シーメル、生物物理
化学、ダブリュー・エイチ・フリーマン、サンフランシ
スコ　　　Ｒ，Ｃ、Ｃｏｍｔｏｒ　　ｅｔ　　　Ｐ、　
　Ｒ，５ｃｈｉ＋ｕｅｌ　　。
Ｂ　１ｏｐｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｗ、
　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ。
３　ａｎ　　Ｆ　ｒａｎｃｉｓｃｏ　（１９８０））。
２−アミノ−２′−デオキシアデノシン基を含む自己相
補配列（六量体及び八は体）は、ＤＮＡれている（ビー
・エル・ガフニー他、核酸研究Ｂ。
Ｌ、　Ｇａｆｆｎｃｙ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、、Ｎｕｃｌｃ
ｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　ＲＱＳｅａｒＣｈ、（１９８２
）、１０　４３５１及び四面体Ｔ　ｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ。
（１９８４）、４０　３）。
しかし乍ら、チミンの反応林との間に３個の水素を形成
し、上記のような本発明のプローブの利点を有するプロ
ーブとして使用し得るように修飾されたアデニン基を含
むオリゴヌクレオチドの製造は、未だ提案、或いは示唆
されていない。
該当用途により予め決定された構造のオリゴヌクレオチ
ドフラグメントから構成される本発明のプローブは、ア
デニン基の少なくとも一部が、チミン又はウラシルの反
応基との間に３個の水素結合を形成し１ｑるように修飾
されたアデニン基により置換されていることを特徴とす
る。
アデニン基は、好ましくは、チミン又はウラシルのＣ−
２位に固定された［原子との間に水素結合を形成し得る
基を、ピリミジン環Ｃ−２位に導入することにより修飾
される。
本発明のより特定的な目的は、該当用途により予め決定
された構成のオリゴヌクレオチドフラグメントから構成
されるプローブであり、アデニン基の少なくとも一部が
、チミン又はウラシルのＣ−２位に固定された酸素原子
との間に水素結合を形成し得る基をピリミジン環のＣ−
２位に導入することにより修飾されたアデニン基により
置換されていることを特徴とする前記プローブを提供す
ることにある。
この型の比較的安定的な水素結合を形成させるには、ア
デニン桔に尋人される基をできるだけ短くすることが好
ましい。この型の好適な基は、−ＨＮ２．−ＯＨ及び−
８Ｈ基である。−Ｎ１１２基は特に好ましい。
好適具体例によると、本発明の目的は、該当用途により
予め決定された構造のオリゴヌクレオチドフラグメント
から構成されるプローブであり、アデニン基の少なくと
も一部がとリミシン環のＣ−２位に−ＮＨ２，−ＯＨ又
Ｇｔ　−Ｓ　Ｎ　、好ましくは−ＮＨ２基を導入するこ
とにより修飾された（ここでＲは−ＮＨ２−Ｏｆ−１又
は−８Ｈである。）で表される基に置換されていること
を特徴とする前記プローブを児供することにある。
本発明のプローブは、特に好ましくは、特定配列のアミ
ノ酸から誘導されており且つ曖昧さくａｍｂｉｇｕｉｔ
６）含む上記「混合プローブ」の替わりに使用できる。
実際に、各縮重が縮重のヌクレオチドの１個、待に縮重
Ｃ／Ｔの場合には王、縮重Ｇ／Δの場合にはＧで置換さ
れており、アデニン基の少なくとも一部が上述のように
修飾された７デニン基により置換されている特定配列の
アミノ酸から誘導された配列を形成することにより、混
合プローブと同様のハイブリダイピージョンをもたらし
且っ相補配列どのハイブリダイピージョン後の検出に同
様の感度をもたらすプローブを製造できることが発見さ
れた。この発見は特に、上記記載及び１す述する比較試
駆から明らかなように、縮重の場合に特定のヌクレオチ
ドを選択すると「ミスマツチ」が生じ、その結果、検出
感度の損失、史には得られたプローブの実質的な使用不
可を生じるという点から児て、驚くべき発見である。
特に有利な具体例によると、本発明の目的は、１個１．
特に、縮重Ｃ／Ｔでは王、縮重Ｇ／Ａで（、↓Ｇで置換
されていることを特徴とする上記プローブを提供するこ
とにある。
必須ではないが、多くの場合、特に最後に述べた本発明
の具体例の場合、最適検出感度を１４るためにはオリゴ
ヌクレオチドフラグメントの全７デニン基を上記のにう
に修飾されたアデニン基に買換ツることが好ましい。
殆んどの用途の場合、本発明のプローブは、２０個未満
のヌクレオチドを含ｌυでいる。しかし乍ら、特定の用
途では、より「長い」オリゴヌクレオチドフラグメント
を配置することが好ましい。曖昧さが存在していないた
め、原則的にはより長いフラグメントの製造も何ら「技
術的」に制限されない。従って、４０個より多くのヌク
レオチドを含む配列が得られることが判った。
アデシ輪つ酸基の少なくとも−゛部を、それぞれ上記の
ように修飾されたアデニン基を含むアゾ嚢より、従来の
任意のオリゴヌクレオチドフラグメント生成方法に従っ
て生成され得る。
好ましくは、生成は固相で実施され、主に、固体担体に
固定された所望の配列の３′末端ヌクレオヂドの５′＠
に、甲但体、二刊体又は三は休の３′端を固定し、その
後、所望のオリゴヌクレオチドフラクションが得られる
まで、得られた鎖の５′末端ヌクレオチドに甲吊体、二
社体及び／又は三量体を逐次固定し、場合によっては次
に担体を分離することにより得られる。
ここで、「単量体」、「二ｍ体」又は「三ｍ体」とは、
プローブの構成に含まれるべき同−又は異なるそれぞれ
１，２又は３個の核酸から構成される基である。
当然のことながら、合成の際には、該当反応に不適当な
これらの基の反応性官能基は、その後、得られたプロー
ブを劣化させない条件下で除去され得る保護基により保
護されなければならない。
非限定的な例として、このような保護基を有する単■体
、二位体及び三量体の生成は、ケー・イタタラ他、核酸
研究　Ｋ、　　ｌ　ｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ｃａｌｌ。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
（１９８０）、８　．５５０７の開示に従って実施され
得る。
保護基の遊離及び得られたオリゴヌクレオチドの精製は
、ニス・トラン・ディン他、ヨーロッパ生化学誌Ｓ、　
Ｔｒａｎ　［）ｉｎｈ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、、　［：ｕｒ
、　Ｊ。
Ｂ　ｉｏｃｈｃｍ、　　（１９８３）、　　１３３　、
　５７９−５８９又ハ？　−／Ｌ／・ダブリ１−・バー
ネット他、四面体研究　Ｒ，Ｗ。
Ｂａｒｎｅｔｔ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、、　　Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ　　Ｌ　ｅｔｔ。
（１９８１）　、　２２　、９９１−９９４の開示に従
って実施され得る。
修飾されたアデニン基を含む中屯体、二呈体及び三量体
を生成するためには、特にＤＮＡ系で（Ｊ該当ヌクレオ
チドのリン酸化により生成されるヌクレオチド、叩ら、 一アデニン基のピリミジン環のＣ−２位を−Ｎ＋−１２
Ｉｕにより陛篩すべき場合には、ダブリュー・エル・ス
ン、ジエイ・シー・ニス（シー・オー・エム・エム）Ｗ
、Ｌ−、Ｓｕｎｇ　、Ｊ、Ｃ，Ｓ。
（Ｃｏｍｍ）、　１０８９　（１９８１）中にチミジ’
、ｉ　ｌ、：　ツイテ記載されていると同様の方法で２
′−デオキシグアノシンから生成された５’−０−ジメ
トキシトリチル−Ｎ、Ｎ’　−ジイソブチリル−２−ア
ミノ−２′−デオキシアデノシン、 一アデニン基のピリミジンのＣ−２位を−０１−１基に
より廐飾すべぎ場合には、同じくダブリュー・シー・ス
ンの方法と同様の方法で対応するヤサンヂン誘導ヌクレ
オシドから生成され得る５′−〇−ジメトキシトリチル
ーＮ−イソブチリル−２−ヒドロキシ−２′−デオキシ
アデノシン、及び−アデニン基のピリミジンのＣ−２位
をＳＨｍにより修飾サベき場合に４よ、公知１ノ法に従
って０１−（基をＳＨ阜に置換することにより、同様に
対応する２−ヒドロギシ誘導体から生成され社Ｉる５′
−Ｏ−ジメトキシトリデル−Ｎ−イソブチリル−２−メ
ルカブト−２′−デオキシアデノシンを使用することが
好ましい。
ＲＮＡ系の場合、対応する修飾アデノシンを使用するこ
とが好ましい。
こうして得られたプローブを使用するためには、が好ま
しい。
従って、プローブは、模述の実施例中で述べるように、
放射性同位体により、特にポリヌクレオチドキナーゼの
存在下で［γ−３２Ｐ］ＡＴＰによりミシン環のＣ−２
位に特に−Ｎ８２１で修飾されたアデニン基が存在して
いると、この型の配列から形成されるハイブリッドの左
構造、所謂Ｚ構造は通常の８構造よりも助長されること
、及びＺキすることができる。これに対してＢ構造では
、試薬と塩基との反応を得ることは困難であり、反応が
妨げられることもある。
殆・１′！ 本発明は又、放硼印峰＃＃、特に３２ｐにより標識され
た上述のプローブに係る。
本発明は更に、保ＭＷを含んでおりばつ本発明のプロー
ブに対応し、場合によっては固体担体に結合されたオリ
ゴヌクレオチドに係る。
本発明は更に、本発明に従って使用される修飾アデニン
基及びオリゴヌクレオチド合成に一般に使用されている
塩基の他に、必要と認められ得る他の塩基、特に修飾塩
基Ｘ及び／又はＹを含む上記型のオリゴヌクレオチドを
包含するものであり、その使用は、本願と同日付で同一
出願人により出願された発明の名称［混合プローブおよ
びその応用、その前駆体、これらの製造ならびにこの製
造用の１降場基含有誘導体」中に記載されている。
前記修飾塩基は、特に反応に応じた等分子混合物、即ち
ウラシルとシトシン又はチミンと５−メチルシトシン、
及びグアニンと２−アミノアデニンとの混合物を、下＾
に従って膜結合させる。
Ｒ・Ｃ８４ 本発明は更に、塩基Ｘ及び／又はＹを含むオリゴヌクレ
オチドの膜結合で得られるプローブを包含しでいる。
従って、本発明のプローブは、好ましくは免疫複合物の
形成を含む同定、特に免疫酵素反応を用いて、特にメツ
センジャーＲＮＡ又は相補ＤＮＡの分析又は抽出技術で
使用され得る。
以下、アンチトロンビン■の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の
甲雌により生じる問題を解決するために本発明を適用す
る例について具体的に説明する。
該当アミノ酸配列は、 ２５１Ｍ　ｅｔ　−Ｍ　ｅｔ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　Ｉｎ
　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　１ｙ２５６であり、この配列はリ
ボ核酸配列： ５°”’　ＡＵＧ　　ＡＵＧ　ｔｌＡＵ　ＣＡＡ　ＧＡ
Ａｃ３°Ｏ「・””Ｃ（ｌｙＧＬ 及びｃＤＮＡ　： ５　　　ＡＴＧ＾ＩＧ　Ｔ＾ＬＣ桔ＣＡ含Ｇ３°。１１
・・・・・・、ＯＨ 個のプローブを作成した。即ち、 第一・のプローブは、対応する３個の曖昧さを含む混合
プローブ（８個の十人吊体の混合物）：３°ＴＡＧ　Ｔ
ＡＣＡＩ　ＧＴ！ｒＣＴ♀Ｃ５゜であり、アール・ビー
・ワレース他、核酸研究、Ｒ，Ｂ、　Ｗａｌｌａｃｅ　
ｅｔ　ｃｏｌｌ、、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　（１９８１）　、　　９．　８７
９の方法に従って固奮 相　　　　ら溝底した。
第一のプローブは、エイチ・イトウ他、核酸研究、ｌ−
１、１ｔｏ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、、　　Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ
　　Ａ　ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　　（１９８２）、
　１０　１７５５の方法に従い、固相二殿体及び三猜体
を用いて生成した特異配列：在づる場合にはＴ、Ｇ／Ａ
の場合にはＧを選択し、この選択で１６個のヌクレオチ
ド（ｃＤＮＡの実構造の項参照）に［ミスマツチ］を導
入した。
第三のプローブは本発明に従う特異配列：３’　　　　
ＴＡＣＴＡＣＡＴＧ　　ＧＴ工　Ｃ丁Ｔ　　Ｃ５’であ
り、該配列は、この型の配列に関して上記に示した方法
に従い、固相の単量体、ニル体及び王ｍ体を使用して生
成した。該配列中、縮重の選択は第二の配列の場合と同
様であるが、アデノシンＡを２−アミノアデノシンＡ１
に置換した。この配シリはｃＤＮＡとの間で第二の配列
よりも安定的なハイブリッドを形成すること（ハイブリ
ッドの溶融温度の上背）、及び第一の混合プローブと同
様のハイブリダイゼーションをもたらすことが認められ
た。
前１２３種類のブ【」−ブを３２ｐで標識し、アンチト
ロピン■のｃＤＮＡを含む［パンク（ｂａｎｑｕｆｌｉ
）Ｊを分析するために使用した。第−及び第三のブ１．
１−ブは、下記配列： ５’　　ＡＴＧ＾ＴＧＴＡＣＣＡＧ窩Ｇ　３　’　ｏＦ
Ｉの構造を有するｃＤＮＡを単離させ１ｑた。
前記式中、曖昧さは存在しているが第二及び第オチドに
一本線、第二及び第三のブローＸ　ｒミスマツチＪを含
むヌクレオチドに二本線を引いた。
（以下余白） Ｉ導体：５′　−♂製場疹畢？− Ｃ１（２−りＯロフェニルシアノＬ チル）−３′・−フォスフ・エート＃ ｑノ Ｎ、Ｎ’−ジイソブチル−２−シ′ミ ノ−２′　−デオキシアデノシン （ＤＭＴ　　八’、””Ｂｕｐの ＋１３ｕ 生成 乾燥思で乾燥させたフラスコ内で、無水ジＡキサン４．
５ｄに胃華トリアゾール３１２ｍａ（４，！＋２　ｚＭ
　）を溶解させた。２−クロロワ１ニルフオスフオロジ
クロ＋Ｊデート３７２ｍｇ（１，５０ｍＭ　）を添加し
、０℃で無水トリエチルアミン４４５１１１を添加した
。白色の濃厚な沈殿物を得、該沈殿物を室温、１１１５
時間撹拌した。沈殿物をジオキサンで洗浄し、５’−〇
−ジメトキシトリチルーＮ、Ｎ’　−ジイソブチクルー
２−アミノ−２′−デオキシアデノシン（ＤＭ　ＴＡ２
Ｔ”　”　Ｂｕ）　６２０ｍｇ（０，９４ｍＭ　）上で
１８α 直接濾過し、ピリジンで二度共蒸発させた。１時間撹拌
後、シアノエタノール１６０ρ及びＮ−メチ［ＣＣＨ：
ＯγＯ’ＣＨ２Ｃ１０−Ｈｅ’１ｌ（９０１０）］（以
下余白） 実施例１１ Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　　（１９８０）
、　８　５４７３に記載の方法で調整したヌクレオチド
Ｔを含む樹脂）を出発物質どし、前出のケー・イタクラ
他の方法により生成された以下の三社体を結合して混合
プローブを組立てた。
Ｃ（：Ｔ　　　ＣＣＴ　　　　　ＧＧＴ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　固イネ１旦俸最終結合後に、５
００１１１のＴＭＧを加えたピリジンアルドキシム（Ｐ
ＡＯ）とテトラメチルグアニジン（ＴＭＧ＞との等モル
混合物５００Ｊで樹脂を１晩処理する。蒸発乾燥侵、濃
アンモニア水と共に５０℃で３時間加熱し、反応媒体を
セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ　−１０
カラム（ソシエテ・ファＪＬ７　ｖ　シフ　（３ｏｃｉ
ｅｔｅ　　　Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）の網目状多糖カラ
ムの商品名）のクロマｌルブラフィーで精製し、次に、
逆相カラムの高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）で精製する。次に、８０％酢酸で５分間処理して、オ
リゴヌクレオチド混合物を脱トリデルし、蒸発乾固する
。　（９０，１）、　：　　１０．Ｄ、＝同様に、結合
剤としてトリイソブ［１ピルベンゼンスルフＡニルニト
ロトリアゾール（ＴＰＳＮＴ）を使用し、Ｔ樹脂２０ｍ
９から固相で第二の配列を合成した。
ＣＴＴ　　　　ＣＴＴ　　　　ＧＧＴ　　　　ＡＣＡＴ
　　　　　ＣＡ　　　　　Ｔ〜（Ｊ↑　　↑　　↑　　
↑　　↑ 収率　二　　　　　６１％　　　　８２％　　　７４Ｘ
　　　　７８　χ　　　９６Ｘ実施例１と同様に配列を
精製した（６．６０．Ｄ、）　、。
実施例３：木　明の第三の配列（△“を含む）ｑ１皇 Ｔ樹脂３０ｍｇからＡ′を含む配列を合成した。
ＣＴＴ　　　　ＣＴＴ　　　　Ｇ（ｙＴ　　　Ａ”　　
　　　ＣＡ”　　　ＴＣＡ”　　　　丁りＱ↑　　　↑
　　↑　↑　↑　　↑　↑ 収率　：　　　　６３％　　　　９８％　く９９％　７
７χ　　く９９％　７２％　＜９９％解離は、濃アンモ
ニア水による加熱後、７６時間エチレンジアミン１．８
７ｍｅｒ処理することから成る付加段階を○んでいる。
ＨＰＬＣ及び電気泳動による精製後、２０．Ｄ、のオリ
ゴヌクレオヂドが青られた。
による標識 マンハイムＢｏｅｈｒｉｎｃ＋ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ
　）　　０５Ｘノ容間中で、１００１）Ｍのプローブに
［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ５０μＣｉを添加した。３７℃で
３０分間放置した［ティー・マニアトリス伯、分子クロ
ーニング、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト
リ−ＴｌＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、、　Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。
（１９８２）］　、ププローラフエノールブルー１００
ｍＭＥＤＴＡ、５０％グリヒロールに緩衝液１．３４を
添加することにより反応を停止させた。総容量１００ｄ
に対してジアクリルアミド１９ｇ、アクリルアミド１９
（ｌ及び１Ｍトリスホウ酸塩１０ｄを含有する。
ゲル（０，４ｘ　３０ｘ　４０ｃｍ１上で標識化生成物
を精製した。
ブロモフェノールブルーがプレート長の３分のし、水２
ｄ中で一晩抽出した。
及皇貝１：ハイブリダイぜ一ジョン Ａ−「、に関係のないＣＤＮＡを含む３つのコロニーと
を夫々３組に分けて、５０／７１９　／　ｉｆ！のアン
ピシリンを含む完全培地プレートに接種した。これらコ
ロニーをワットマン（Ｗｈａｔｗ＋ａｎ）　　５４１型
の３つのム フィルターに移し、２５０ｘ／Ｍのクロ９づエニコール
を含む培養プレートで２０時間増殖させた。この培養プ
レートは、ハイブリダイゼーション用にティー・ビー・
ジャージエン（Ｊ、　Ｐ、　Ｇｅｒｃ＋ｅｎ）等、核酸
研究（Ｎ　ｕｃｌｃｉｃ　　Δｃｉｄｓ　　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ　）、（１９７９）　、　　７．２１１５．の方
法で調製されたものである。フィルターを、６　　ＮＥ
ＴＦ（Ｉ　ＮＥＴグ２＝　０．１５ＭのＮ　ａ　Ｃｌ！
　、　　０．０１５ＭのトリスＨＣＮ。
１）Ｈ＝　７．５．　０．００１ＭのＥＤＴＡ）と０５
％モニデット（Ｍｏｎｉｄｅｔ）　ｐ４０　　（市販洗
剤泡）と１００埒／戒の酵母ｔＲＮＡと　１００成／ｄ
の超音波処理リケ粕了ｌ）Ｎ△とを用い、４２°Ｃで２
時間ブレハイブリダ７［ティー・マニアトリス（Ｔ。
Ｍ　ａｎｉａｔｏｒｉｓ）等、ｎｉｉ出の文献に記Ｋ　
（７）　方法］。
［ｒ−ＰコＡＴＰで５′をラベルした１０６、ｃｐｍＯ
，０１５Ｍのクエン酸ｈ１ヘリウム、　　ｐ＋−＋　７
．２）と０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とを
用フィルタを、ｉ−トラジオグラフィーにかけた。
第一・の温合プローブ（８個のうちの１個の配列がｃＤ
ＮＡの相補形である。）及び３△９を含む第三の特異配
列（１個の「ミスマツチ」及びＧＣ型９７１６対）では
ハイブリダイゼーションが見られたが、第二の配列（１
個のしミスマツチ」及び二及び第三のプローブとのハイ
ブリッドの溶融温麿の差は約７℃であった（第三のプロ
ーブとの間で形成されたハイブリッドの融点はこれにり
高い）。
なお「ミックス」とは、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン（５００ｍＭ、　　Ｉ）ｌ−１８＞　。
（５０ｍｌｙｊ）の混合物の意である。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）該当用途により予め決定された構造のオリゴヌク
    レオチドフラグメントから構成されるプローブにおいて
    、アデニン基の少なくとも一部が、チミン又はウラシル
    の反応基との間に３個の水素結合を形成し得るように修
    飾されたアデニン基により置換されていることを特徴と
    するプローブ。
  2. （２）該当用途により予め決定された構造のオリゴヌク
    レオチドフラグメントから構成されるプローブにおいて
    、アデニン基の少なくとも一部が、チミン又はウラシル
    のＣ−２位に固定された酸素原子との間に水素結合を形
    成し得る基をピリミジン環のＣ−２位に導入することに
    より修飾されたアデニン基により置換されていることを
    特徴とするプローブ。
  3. （３）該当用途により予め決定された構造のオリゴヌク
    レオチドフラグメントから構成されるプローブにおいて
    、アデニン基の少なくとも一部が、一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでＲは−ＮＨ＿２、−ＯＨ又は−ＳＨ）好ましく
    は−ＮＨ＿２である。）で表される修飾アデニン基によ
    り置換されていることを特徴とするプローブ。
  4. （４）プローブが特定配列のアミノ酸から誘導された配
    列から構成されており、各縮重が縮重のヌクレオチドの
    １個、特に縮重Ｃ／Ｔの場合にはＴ、縮重Ｇ／Ａの場合
    にはＧにより置き換えられていることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載のプロー
    ブ。
  5. （５）全アデニン基が修飾アデニン基、好ましくは２−
    アミノアデニン基により置換されていることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の
    プローブ。
  6. （６）プローブがハイブリダイゼーション後の検知のた
    めに特に放射性物質により又は蛋白質、特に抗体又は酵
    素により標識されていることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項から第５項のいずれかに記載のプローブ。
  7. （７）場合によっては固体担体に結合されており、場合
    によっては反応性官能基に保護基を有している、特許請
    求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載のプローブ
    の製造用に使用されるオリゴヌクレオチド。
  8. （８）特許請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記
    載プローブ又は特許請求の範囲第７項に記載のオリゴヌ
    クレオチドの製法において、固体担体に固定された所望
    の配列の３′末端ヌクレオチドの５′端に、単量体、二
    量体又は三量体の３′端を固相で固定させ、その後、所
    望のオリゴヌクレオチドが得られるまで、得られた鎖の
    ５′末端ヌクレオチドに単量体、二量体及び／又は三量
    体を逐次固定させ、場合によってはその後、担体を分離
    することから主に構成されることを特徴とする製法。
  9. （９）生物学的分析及び抽出分野、特にハイブリダイゼ
    ーションによるメッセンジャーＲＮＡ及び相補ＤＮＡの
    検出及び抽出分野における特許請求の範囲第１項から第
    ６項のいずれかに記載のプローブの使用法。
  10. （１０）免疫反応又は免疫酵素反応及び／又は放射性標
    識により検出することを特徴とする特許請求の範囲第９
    項に記載の使用法。
JP60184986A 1984-08-22 1985-08-22 修飾アデニン基を有するプローブ Pending JPS6169788A (ja)

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DE (1) DE3575730D1 (ja)
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ES (1) ES8701777A1 (ja)
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0172153B1 (en) * 1984-05-15 1989-08-09 Smithkline Beckman Corporation Polynucleotide hybridization probes
US4734363A (en) * 1984-11-27 1988-03-29 Molecular Diagnostics, Inc. Large scale production of DNA probes
FR2575751B1 (fr) * 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
FR2601956B1 (fr) * 1986-07-22 1989-11-03 Pasteur Institut Nouveaux derives de desoxy-2' adenosine, leur procede d'obtention par voie de synthese et leurs applications biologiques
GB9119378D0 (en) * 1991-09-11 1991-10-23 Medical Res Council Improvements in oligonucleotide primers
FR2750435B1 (fr) * 1996-06-27 1998-08-28 Appligene Oncor Procede de formation de complexes d'hybridation dont la stabilite depend peu de la composition en base des deux molecules d'acides nucleiques hybridees
WO2005027980A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-31 University Of Massachusetts Rna interference for the treatment of gain-of-function disorders
US8680063B2 (en) 2003-09-12 2014-03-25 University Of Massachusetts RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders
EP2239328A3 (en) * 2005-08-18 2011-01-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Methods and compositions for treating neurological disease
WO2007087451A2 (en) * 2006-01-25 2007-08-02 University Of Massachusetts Compositions and methods for enhancing discriminatory rna interference
WO2008143774A2 (en) * 2007-05-01 2008-11-27 University Of Massachusetts Methods and compositions for locating snp heterozygosity for allele specific diagnosis and therapy

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4556643A (en) * 1982-07-26 1985-12-03 Agracetus Assay method and probe for polynucleotide sequences
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes

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EP0176396B1 (fr) 1990-01-31
PT81009B (fr) 1987-02-06
PT81009A (fr) 1985-09-01
ES547038A0 (es) 1986-12-16
EP0176396A1 (fr) 1986-04-02
US4842996A (en) 1989-06-27
GR852029B (ja) 1985-12-19
FR2569407A1 (fr) 1986-02-28
DK380085A (da) 1986-02-23
ES8701777A1 (es) 1986-12-16
ATE49976T1 (de) 1990-02-15
FR2569407B1 (fr) 1989-02-17
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DK380085D0 (da) 1985-08-21

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