JPS6169799A - インタ−フエロンの精製法 - Google Patents
インタ−フエロンの精製法Info
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- JPS6169799A JPS6169799A JP59192788A JP19278884A JPS6169799A JP S6169799 A JPS6169799 A JP S6169799A JP 59192788 A JP59192788 A JP 59192788A JP 19278884 A JP19278884 A JP 19278884A JP S6169799 A JPS6169799 A JP S6169799A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はインターフェロンを色素固定化担体に吸着させ
た後、該インターフェロンを溶出することを特徴とする
インターフェロンの精製法に関する。
た後、該インターフェロンを溶出することを特徴とする
インターフェロンの精製法に関する。
従来の技術
インターフェロンの精製法としては、ＣＰＧ（コントロ
ールポアガラス）と亜鉛キレートアガロースによる方法
（Ｊ、Ｗ、１Ｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ、 ＮＹＡＳ、
１９８０）。
ールポアガラス）と亜鉛キレートアガロースによる方法
（Ｊ、Ｗ、１Ｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ、 ＮＹＡＳ、
１９８０）。
ブルーセファロースによる方法（ε、Ｋｎｉｇｈｊ、ｇ
ｒ ｅｔａｌ、 Ｊ、Ｂ、Ｃ，２５６（８） １９８１
＞ 、 Ｃａｎ へセファ０−スＣＰｈｅｎｙｌセファ
０−スによる方法（Ａ、 Ｊ、 ！Ｊ＋ｋｕｌｓｋ＋ｅ
ｔ ａｌ、 Ｐｒｅｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ １０ （２）
１９８０）、 固定化アルブミンによる方法（Ｈｕ
ａｎｇ、 Ｊ、ＩＣｅｔ ａｌ、 Ｊ、Ｂ、Ｃ。
ｒ ｅｔａｌ、 Ｊ、Ｂ、Ｃ，２５６（８） １９８１
＞ 、 Ｃａｎ へセファ０−スＣＰｈｅｎｙｌセファ
０−スによる方法（Ａ、 Ｊ、 ！Ｊ＋ｋｕｌｓｋ＋ｅ
ｔ ａｌ、 Ｐｒｅｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ １０ （２）
１９８０）、 固定化アルブミンによる方法（Ｈｕ
ａｎｇ、 Ｊ、ＩＣｅｔ ａｌ、 Ｊ、Ｂ、Ｃ。
２４９１９７４）等が知られている。
発明の目的
これら公知の手法によっては純度をあげるために繰返し
の操作が必・要で収率が下がり、高純度のインターフェ
ロンを収率よく得る＆！ｉ製法の開発が要望されている
。
の操作が必・要で収率が下がり、高純度のインターフェ
ロンを収率よく得る＆！ｉ製法の開発が要望されている
。
問題点を解決するための手段
本発明方法によると、インターフェロンを色素固定化担
体に吸着させた後、該インターフェロンを溶出すること
により高純度のインターフェロンを得ることができる。
体に吸着させた後、該インターフェロンを溶出すること
により高純度のインターフェロンを得ることができる。
又、必要に応じて該ＩＩＩｊ’Ｊしたインターフェロン
をキレート化金属結合但体に吸着させた後、溶出するこ
とにより、さらに、高純度のインターフェロンを（辱る
ことができる。
をキレート化金属結合但体に吸着させた後、溶出するこ
とにより、さらに、高純度のインターフェロンを（辱る
ことができる。
色素固定化担体とは、例えば反応基としてモノクロル基
又は／クロル基を有するアントラキノン骨核又はフタロ
／ニアン骨核を有する色素と水酸基を有するアガロース
とが結合したものがあげられる。具体的には、例えば、
マドレックスゲルグリーンＡ（商品名、アミコン社製）
、レッドアガロースゲル（商品名、ファルマンア社製）
、マドレックスゲルレッドＡ（商品名、アミコン社製）
等が市販されていて容易に人手できる。
又は／クロル基を有するアントラキノン骨核又はフタロ
／ニアン骨核を有する色素と水酸基を有するアガロース
とが結合したものがあげられる。具体的には、例えば、
マドレックスゲルグリーンＡ（商品名、アミコン社製）
、レッドアガロースゲル（商品名、ファルマンア社製）
、マドレックスゲルレッドＡ（商品名、アミコン社製）
等が市販されていて容易に人手できる。
本発明に適用されるインターフェロンとしては、天然の
インターフェロン、動物細胞の培養によって製造される
インターフェロン、組換えＤ Ｎ Ａ技１ネｉによって
得られる微生物の培養によ−、て契Ｉ；与されるインタ
ーフェロンなどが含まれ、又、α、β。
インターフェロン、動物細胞の培養によって製造される
インターフェロン、組換えＤ Ｎ Ａ技１ネｉによって
得られる微生物の培養によ−、て契Ｉ；与されるインタ
ーフェロンなどが含まれ、又、α、β。
γのいずれの型のインターフェロンも含まれる。
時に、組換えＤＮＡ技術によって得られる微生物の培養
によって製造されるヒトインターフェロン−βの精製に
有用である。
によって製造されるヒトインターフェロン−βの精製に
有用である。
これらの培養物等から得られるインターフェロン含有液
をそのまま用いることもできるが、好ましくは公知の手
法で１度精製して得られるインターフェロン含有液（粗
インターフェロン溶液という）が用いられる。微生物が
産生じたものを使用する場合は、その培養液を濾過ある
いは遠心分離等の手法を用いて微生物を集め、ｐ Ｈ５
，５〜８５のリン酸またはトリス塩酸緩衝液で溶解する
。その菌体濃縮液を凍結融解あるいは超音波ホモノナイ
ザー、ダイノミル等の機械的破砕機を使用して菌体を破
砕し、インターフェロンを抽出する。
をそのまま用いることもできるが、好ましくは公知の手
法で１度精製して得られるインターフェロン含有液（粗
インターフェロン溶液という）が用いられる。微生物が
産生じたものを使用する場合は、その培養液を濾過ある
いは遠心分離等の手法を用いて微生物を集め、ｐ Ｈ５
，５〜８５のリン酸またはトリス塩酸緩衝液で溶解する
。その菌体濃縮液を凍結融解あるいは超音波ホモノナイ
ザー、ダイノミル等の機械的破砕機を使用して菌体を破
砕し、インターフェロンを抽出する。
その抽出液を目通あるいは遠心分ｔｓ機等で処理して、
除濁後、上澄液を従来より報告されている一般的インタ
ーフェロンの精製半没で処理することにより粗インター
フェロン溶液を得る。
除濁後、上澄液を従来より報告されている一般的インタ
ーフェロンの精製半没で処理することにより粗インター
フェロン溶液を得る。
色素固定化担体とインターフェロン含有溶液とを接触さ
せるには、例えばハツチ法、カラム法があるが、好まし
くはカラム法が用いられ、該溶液をそのまま又は必要に
応じて、リン酸１’ｌ ｌｉ液等で希釈して用いられる
。該インターフェロン含有溶液と色素固定化担体との接
触はカラム法の場合、通常空間速度１〜２ Ｑ ｈ ｒ
−’で通液されるし、バッチ法の場合１〜５０時間保持
される。
せるには、例えばハツチ法、カラム法があるが、好まし
くはカラム法が用いられ、該溶液をそのまま又は必要に
応じて、リン酸１’ｌ ｌｉ液等で希釈して用いられる
。該インターフェロン含有溶液と色素固定化担体との接
触はカラム法の場合、通常空間速度１〜２ Ｑ ｈ ｒ
−’で通液されるし、バッチ法の場合１〜５０時間保持
される。
使用する色素固定化担体の量は、処理すべきインターフ
ェロン量に対し、０．１〜ｌＯβ／ｇの範囲で適宜用い
られる。
ェロン量に対し、０．１〜ｌＯβ／ｇの範囲で適宜用い
られる。
接触終了後、該担体を０．５〜２Ｍの食塩を含む水また
はリン酸緩衝液中２０％以下のプロピレングリコール、
エチレングリコールまたはグリセリンを含む溶液で洗う
ことにより、該インターフェロン以外の不純蛋白質の大
部分を除去することができる。
はリン酸緩衝液中２０％以下のプロピレングリコール、
エチレングリコールまたはグリセリンを含む溶液で洗う
ことにより、該インターフェロン以外の不純蛋白質の大
部分を除去することができる。
色素固定化担体に吸着したインターフェロンを溶出する
ために用いる溶出剤としては、溶量比で４０〜６０％の
エチレングリコールまたはプロピレングリコールを含む
食塩（０，５Ｍ〜２Ｍ）含有の緩衝液、例えば〔リン酸
緩衝液（ｐＨ６〜８）〕が用いられる。
ために用いる溶出剤としては、溶量比で４０〜６０％の
エチレングリコールまたはプロピレングリコールを含む
食塩（０，５Ｍ〜２Ｍ）含有の緩衝液、例えば〔リン酸
緩衝液（ｐＨ６〜８）〕が用いられる。
使用された色素固定化担体は該インターフェロンを回収
後、例えば、０．ｌＮ−ＮａＯＨまたは８Ｍ尿累含イ］
の０．５ Ｎ −Ｎ ａ ＯＨを通＋’＆することによ
り不溶出のインターフェロン以外の不純蛋白質等を除去
し、カラムを洗浄することにより繰り返し使用すること
ができる。
後、例えば、０．ｌＮ−ＮａＯＨまたは８Ｍ尿累含イ］
の０．５ Ｎ −Ｎ ａ ＯＨを通＋’＆することによ
り不溶出のインターフェロン以外の不純蛋白質等を除去
し、カラムを洗浄することにより繰り返し使用すること
ができる。
本発明に使用するキレート化金属結合担体は、キレート
化能を有する交換基、例えばビスカルボキンイミノ基を
結合した不溶性多糖類系担体（例としてエポキン活性化
“セファロースＡＢ”、ファルマ／ア社！Ｍ）に金属を
結合して：Ａ！！Ｉ！Ｉする。
化能を有する交換基、例えばビスカルボキンイミノ基を
結合した不溶性多糖類系担体（例としてエポキン活性化
“セファロースＡＢ”、ファルマ／ア社！Ｍ）に金属を
結合して：Ａ！！Ｉ！Ｉする。
この担体は通常Ｎａ型のものを過剰のコバルト。
ニッケルまたは亜鉛イオンを含む弱酸性溶液と接触させ
ることにより対応する金属キレート型に変換し、次いで
水もしくは弱酸性溶液で洗い、さらに中性の緩衝液で平
ｉｉｉ化することによってインターフェロンの吸着体と
することができる。
ることにより対応する金属キレート型に変換し、次いで
水もしくは弱酸性溶液で洗い、さらに中性の緩衝液で平
ｉｉｉ化することによってインターフェロンの吸着体と
することができる。
インターフェロンの高純度精製を目的とする場合は結合
する金属として亜鉛が好適であり、亜鉛結合量としては
５００−１００Ｏｒ／ｍｌが好ましい。
する金属として亜鉛が好適であり、亜鉛結合量としては
５００−１００Ｏｒ／ｍｌが好ましい。
かかる吸着体の市販品としては亜鉛キレートセファロー
ズ（ファルマンア社製）があげられる。
ズ（ファルマンア社製）があげられる。
該金属キレート担体と前記工程の色素固定化担体から回
収したインターフェロン溶液をそのまま接触させること
もできるが、液の粘性が高い場合にはリン酸ｔＡ 衝液
で６釈して用いてもよい。
収したインターフェロン溶液をそのまま接触させること
もできるが、液の粘性が高い場合にはリン酸ｔＡ 衝液
で６釈して用いてもよい。
接触方法としてはバッチ法とカラｌ、法があるが、カラ
ム法が好ましく用いられる。
ム法が好ましく用いられる。
該亜鉛キレート担体量と接触時間は処理すべきインター
フェロンを実質的にほとんど吸着させるに必要な世と時
間を適宜選択する。
フェロンを実質的にほとんど吸着させるに必要な世と時
間を適宜選択する。
該金属キレート担体に吸着したインターフェロンを高純
度に回収するためには、インターフェロンを回収する前
に、例えばｐ Ｈ７，４の１００ｍＭリン酸−カリウム
、ニナトリウム緩衝液、ｐＨ５の１００ｍＭ酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液の順に接触させ、不純物だけを選択的
に除去した後、ｐＨまたは回収剤の濃度を連続的または
段階的に変化させることによって、高純度のインターフ
ェロンを含む分画を採取することができる。
度に回収するためには、インターフェロンを回収する前
に、例えばｐ Ｈ７，４の１００ｍＭリン酸−カリウム
、ニナトリウム緩衝液、ｐＨ５の１００ｍＭ酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液の順に接触させ、不純物だけを選択的
に除去した後、ｐＨまたは回収剤の濃度を連続的または
段階的に変化させることによって、高純度のインターフ
ェロンを含む分画を採取することができる。
使用後の金属キレートカラムはインターフェロンを回収
した後、例えばＥＤＴＡ溶液を通液して亜鉛イオンを除
去し、０．１Ｎ ＮａＯＨを通液し、ついで水で中性
になるまで洗浄することによって、通常Ｎａ型に再生で
き、亜鉛イオンを含む弱酸性溶液と接触して亜鉛キレー
トを形成させ繰り返し使用することができる。
した後、例えばＥＤＴＡ溶液を通液して亜鉛イオンを除
去し、０．１Ｎ ＮａＯＨを通液し、ついで水で中性
になるまで洗浄することによって、通常Ｎａ型に再生で
き、亜鉛イオンを含む弱酸性溶液と接触して亜鉛キレー
トを形成させ繰り返し使用することができる。
以下、実施例を示す。
実施例１゜
粗インターフェロン溶液として、参考例１で得られた粗
ヒトインターフェロン−β溶液を用いた。
ヒトインターフェロン−β溶液を用いた。
この粗溶液はインターフェロン活性として４Ｘ１０５１
Ｊ／ｍｌ、蛋白として１ｍｇ／ｍｌを含有している。
Ｊ／ｍｌ、蛋白として１ｍｇ／ｍｌを含有している。
該粗インターフェロン溶液２００ Ｑｍｌをレフトアガ
ロースゲル２０ｍ１に通塔、インターフェロンを吸着せ
しめ、ｐＨ７，５の２０ｍＭ！Ｊン酸す） ＩＪウムを
含有するＩＭの塩化す） ＩＪウム溶液２００ｍ１を通
液しく第１洗浄）、ｐＨ７，５の２０ｍＭリン酸ナトリ
ウムＩＭを含有する２０％エチレングリコール溶液１０
Ｑｍｌを通液しく第２洗浄）、ヒトインターフェロン
−βを溶出のため、ｐ Ｈ７，５の２０ｍＭリン酸ナト
リウムと１Ｍ塩化ナトリウムを含有する５０％エチレン
グリコール溶液１２０ｍ１を通液した。
ロースゲル２０ｍ１に通塔、インターフェロンを吸着せ
しめ、ｐＨ７，５の２０ｍＭ！Ｊン酸す） ＩＪウムを
含有するＩＭの塩化す） ＩＪウム溶液２００ｍ１を通
液しく第１洗浄）、ｐＨ７，５の２０ｍＭリン酸ナトリ
ウムＩＭを含有する２０％エチレングリコール溶液１０
Ｑｍｌを通液しく第２洗浄）、ヒトインターフェロン
−βを溶出のため、ｐ Ｈ７，５の２０ｍＭリン酸ナト
リウムと１Ｍ塩化ナトリウムを含有する５０％エチレン
グリコール溶液１２０ｍ１を通液した。
該溶出液にはインターフェロン５Ｘ１０＠単位が含まれ
ており、粗インターフェロン溶液からの回収率は６６％
であった。またその比活性は１×１０１単位１ｍｇ蛋白
質で精製倍率は２５倍であった。
ており、粗インターフェロン溶液からの回収率は６６％
であった。またその比活性は１×１０１単位１ｍｇ蛋白
質で精製倍率は２５倍であった。
この溶液を脱塩後、２−メルカプトエタノールで処理し
、ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２２７６８０
−６８５゜＋ｑ７０） に従ってドデンル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）の存在下、アクリルアミドゲルを用いる
電気泳動分析にかけサクマジプＩＪ ＩＪアントブルー
ｈ２５０による染色を行い、クロマトスキャナー（島津
社製、Ｃ５−９００）による純度分析（λ、＝６００ｎ
ｍ、 λ＝ ＝４００ｎｍ）を行ったところ、その純度
は分子量１８．０００〜１９．０００のワンバンドのみ
で、検出限界の９９．５％以上の純度であった。
、ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２２７６８０
−６８５゜＋ｑ７０） に従ってドデンル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）の存在下、アクリルアミドゲルを用いる
電気泳動分析にかけサクマジプＩＪ ＩＪアントブルー
ｈ２５０による染色を行い、クロマトスキャナー（島津
社製、Ｃ５−９００）による純度分析（λ、＝６００ｎ
ｍ、 λ＝ ＝４００ｎｍ）を行ったところ、その純度
は分子量１８．０００〜１９．０００のワンバンドのみ
で、検出限界の９９．５％以上の純度であった。
その結果を第１表に示す。
第１表
実施例２゜
実施例１と同様の粗ヒトインターフェロン−β溶液を用
いた。
いた。
粗インターフェロン溶液２０００ｆｆｌ＋をグリーンア
ガロース（マドレックスゲルグリーンＡ）カラム２１］
ｍし７通）＆シた。ついてカラムにｐ Ｈ７，５の２Ｑ
ｍＭリン酸ナトリウムを含む１Ｍ塩化ナトリウム２０
Ｑｍｌ （グリーンカラ１．第１洗浄）、ついてｐ Ｈ
７，５の２０ｍＭリン酸ナトリウムと１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含をする２０％エチレングリコール溶液ｉ ｏ Ｑ
ｍｌ （グリーンカラム第２洗浄）を通液し、最後に同
じく塩を含む５０％エチレングリコールン容液１２ Ｑ
ｍｌ （グリーンカラムインターフェロン溶出）をｉ！
ＴＩ液した。
ガロース（マドレックスゲルグリーンＡ）カラム２１］
ｍし７通）＆シた。ついてカラムにｐ Ｈ７，５の２Ｑ
ｍＭリン酸ナトリウムを含む１Ｍ塩化ナトリウム２０
Ｑｍｌ （グリーンカラ１．第１洗浄）、ついてｐ Ｈ
７，５の２０ｍＭリン酸ナトリウムと１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含をする２０％エチレングリコール溶液ｉ ｏ Ｑ
ｍｌ （グリーンカラム第２洗浄）を通液し、最後に同
じく塩を含む５０％エチレングリコールン容液１２ Ｑ
ｍｌ （グリーンカラムインターフェロン溶出）をｉ！
ＴＩ液した。
路出液にはインターフェロン５．８ＸＩＯ’単位が含ま
れており、粗インターフェロンからの回収率は７２％で
あった。またその比活性は０．８Ｘ１０’車位ｌｌｌ１
ｇ蛋白質で精製倍率２０倍であった。
れており、粗インターフェロンからの回収率は７２％で
あった。またその比活性は０．８Ｘ１０’車位ｌｌｌ１
ｇ蛋白質で精製倍率２０倍であった。
またその純度はＳＤＳの存在下、アクリルアミドを用い
る電気体動分析にかけ、サクマジブＩＪ ＩＪアントブ
ルーＲ２００による染色を行い、青色の染色バンドに対
するヒトインターフェロンのバンドの割合を波長６６０
１ｍでヂンントメーター測定し求めたところ、９９．１
％であった。
る電気体動分析にかけ、サクマジブＩＪ ＩＪアントブ
ルーＲ２００による染色を行い、青色の染色バンドに対
するヒトインターフェロンのバンドの割合を波長６６０
１ｍでヂンントメーター測定し求めたところ、９９．１
％であった。
５０％エチレングリコール溶液を通液するときから、グ
リーンアガロースカラムの出口に５ｍｌの亜鉛キレート
担体カラム（内径１．５ ｃｍ ＞に２０ｍ１／ｈｒの
流速で通液した。
リーンアガロースカラムの出口に５ｍｌの亜鉛キレート
担体カラム（内径１．５ ｃｍ ＞に２０ｍ１／ｈｒの
流速で通液した。
次に亜鉛キレート担体カラムに対し、ＩＭ塩化ナトリウ
ム含むｐ Ｈ７，４の２０ｍＭリン酸−カリウム、ニナ
トリウム緩衝液（亜鉛カラム第１洗浄）、ついで０．５
Ｍ塩化す） ＩＪウム含むｐ Ｈ５の１００ｍＭ酢酸−
酢酸す） ＩＪウム緩衝液（亜鉛カラム第２洗浄）の順
に通液し、０．５Ｍ塩化す） ＩＪウム含むｐＨ３，７
５の１００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３，
３の１００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝イにの１１６
に通液した。
ム含むｐ Ｈ７，４の２０ｍＭリン酸−カリウム、ニナ
トリウム緩衝液（亜鉛カラム第１洗浄）、ついで０．５
Ｍ塩化す） ＩＪウム含むｐ Ｈ５の１００ｍＭ酢酸−
酢酸す） ＩＪウム緩衝液（亜鉛カラム第２洗浄）の順
に通液し、０．５Ｍ塩化す） ＩＪウム含むｐＨ３，７
５の１００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３，
３の１００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝イにの１１６
に通液した。
このｐＨ３，７５及びｐ Ｈ３，３の酢酸−酢酸ナトリ
ウム溶液にはインターフェロン３．５×１０８ｍ位が含
まれており、粗インターフェロン溶液からの回収率は４
３％であった。またその比活性は、１、２ Ｘ １０°
単位／ｍｇ蛋白質で精製倍率は３００倍であった。
ウム溶液にはインターフェロン３．５×１０８ｍ位が含
まれており、粗インターフェロン溶液からの回収率は４
３％であった。またその比活性は、１、２ Ｘ １０°
単位／ｍｇ蛋白質で精製倍率は３００倍であった。
上記同様の条件で電気泳動により純度を求めたところ、
９９．９％であった。
９９．９％であった。
その結果を第２表に示す。
第２表
参考例１゜
ヒトインターフェロン−β生産菌の培養液１０βを集菌
して辱だ菌体を５０ ｍ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７
，５）２ｆに！！！濁し、マントンガラリンにより圧力
４００ｋｇ／ｃｄで菌体を破砕したものを使用した、 得られた菌体破砕・夜を遠心分離し、抽出液１６１を？
斗ゾニ。
して辱だ菌体を５０ ｍ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７
，５）２ｆに！！！濁し、マントンガラリンにより圧力
４００ｋｇ／ｃｄで菌体を破砕したものを使用した、 得られた菌体破砕・夜を遠心分離し、抽出液１６１を？
斗ゾニ。
この抽出液を５０ ＱｍｌのＣＰＧ （孔径３００ へ
のコントロールポアグラス）を゛充填したカラトに通し
、ヒトインターフェロン−βを吸着させた後、１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）２ｆで洗浄し、１Ｍ塩化
す） ＩＪウムを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９
，０）２βを流して、ヒトインターフェロン−β全溶出
し、粗ヒトインターフェロン−β溶液を１等だ。
のコントロールポアグラス）を゛充填したカラトに通し
、ヒトインターフェロン−βを吸着させた後、１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）２ｆで洗浄し、１Ｍ塩化
す） ＩＪウムを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９
，０）２βを流して、ヒトインターフェロン−β全溶出
し、粗ヒトインターフェロン−β溶液を１等だ。
発明の効果
本発明方法により、高純度のインターフェロンを得るこ
とができる。
とができる。
特許出願人（１０２＞協和醗酵工業株式会社代表者 加
藤 幹 夫、 ”：’、１＋°、□パノ 〜−二−シ′ 手 続 捕 正 書 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１９２７８８号 ２、発明の名称 インターフェロンの精製法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 弥
（１０２）協和醗酵工業株式会社（置： ０３−２０
１−７２１１ 内線３３９１＞代表者 加 藤
幹 夫 ４、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の濶 ５、補正の内容 明細書第１１頁下５行と６行の間に次の文章を加入する
。
藤 幹 夫、 ”：’、１＋°、□パノ 〜−二−シ′ 手 続 捕 正 書 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１９２７８８号 ２、発明の名称 インターフェロンの精製法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 弥
（１０２）協和醗酵工業株式会社（置： ０３−２０
１−７２１１ 内線３３９１＞代表者 加 藤
幹 夫 ４、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の濶 ５、補正の内容 明細書第１１頁下５行と６行の間に次の文章を加入する
。
「実施例３
実施例１において、レッドアガロースゲルから得られた
インターフェロンを含む５０％エチＬ／７グリコール溶
液１２０ｍ１ （５００Ｘ１０’単位）をｐ Ｈ７，５
の２０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する榎所液で３倍に
希′釈し、５ｍｌの亜鉛キレート担体カラムに２３ｍ１
／ｈｒの流速で通液した。次いで、亜鉛キレート担体カ
ラムに対し、１Ｍ塩化ナトリウムを含むｐ Ｈ７，４の
２０ｍＭリン酸−カリウム、ニナトリウムｌｌｉ液、０
５Ｍ塩化す） ＩＪウムを含むｐｆ−１５の１００ｍＭ
１￥￥酸−酢酸すｌ−ＩＪウム緩衝液の順に通液し、さ
ろに０．５ Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ３，７５の１
００ｍＭ酢酸−酢酸す） ＩＪウム緩所液を血、１支し
たところ、回収液５Ｑｍｌ中にインターフェロン３００
Ｘ ｌ ０６単位が含まれており、回収率は６０％で
あった。又、その比活性はｌＸｌ０’単位／ｌｌ１ｇ蛋
白質で精製倍率は２５０倍であった。
インターフェロンを含む５０％エチＬ／７グリコール溶
液１２０ｍ１ （５００Ｘ１０’単位）をｐ Ｈ７，５
の２０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する榎所液で３倍に
希′釈し、５ｍｌの亜鉛キレート担体カラムに２３ｍ１
／ｈｒの流速で通液した。次いで、亜鉛キレート担体カ
ラムに対し、１Ｍ塩化ナトリウムを含むｐ Ｈ７，４の
２０ｍＭリン酸−カリウム、ニナトリウムｌｌｉ液、０
５Ｍ塩化す） ＩＪウムを含むｐｆ−１５の１００ｍＭ
１￥￥酸−酢酸すｌ−ＩＪウム緩衝液の順に通液し、さ
ろに０．５ Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ３，７５の１
００ｍＭ酢酸−酢酸す） ＩＪウム緩所液を血、１支し
たところ、回収液５Ｑｍｌ中にインターフェロン３００
Ｘ ｌ ０６単位が含まれており、回収率は６０％で
あった。又、その比活性はｌＸｌ０’単位／ｌｌ１ｇ蛋
白質で精製倍率は２５０倍であった。
実施例４
実施例２において亜鉛キレートから回収されたインター
フェロンを含む回収液６０”’（ｅｋインターフェロン
活性３５０Ｘ１０’単位、蛋白質５０γ／ｍ１）を５ｍ
ｌのレッドアガロース担（本カラムに３０ｍｌ／ｈｒの
流速で通液した。次いてレフトアガロース担体カラムに
対し、ｐ Ｈ７，５の２０ｍＶＩリン酸ナトリウムと１
Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液５０ｍ１を通液した。さる
に、２０９６エチレングリコールを含む同じぜ容・夜２
５ｍ１を通（夜し、ヒトインクーフェロンーβを溶出の
ため、５０％エチレンクリコールを含む同じ溶液３０ｍ
１を通液した。
フェロンを含む回収液６０”’（ｅｋインターフェロン
活性３５０Ｘ１０’単位、蛋白質５０γ／ｍ１）を５ｍ
ｌのレッドアガロース担（本カラムに３０ｍｌ／ｈｒの
流速で通液した。次いてレフトアガロース担体カラムに
対し、ｐ Ｈ７，５の２０ｍＶＩリン酸ナトリウムと１
Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液５０ｍ１を通液した。さる
に、２０９６エチレングリコールを含む同じぜ容・夜２
５ｍ１を通（夜し、ヒトインクーフェロンーβを溶出の
ため、５０％エチレンクリコールを含む同じ溶液３０ｍ
１を通液した。
該溶出液にはインターフェロン２８０Ｘ１０’単位が含
まれており、回収率は８０％であった。
まれており、回収率は８０％であった。
又、比活性は１．４Ｘ１０”ｊｌｔ位／ｍｇ蛋白質で精
製倍率は３６０倍に上昇し、溶出液の蛋白濃度は１．６
０ｏｒ／ｍｌであり、濃縮倍率は３０倍に上昇した。
製倍率は３６０倍に上昇し、溶出液の蛋白濃度は１．６
０ｏｒ／ｍｌであり、濃縮倍率は３０倍に上昇した。
実施例５
実施例３において、亜鉛キレートから回収されたインタ
ーフェロンを含む回収液６０ｍ１Ｂ、ｇインターフェロ
ン活性３００Ｘ１０６単位、蛋白１度５０γ／ｍ１）を
５ｍｌのグリーンアガロース担体カラムに３０ｍ１／ｈ
ｒの流速で通液した。
ーフェロンを含む回収液６０ｍ１Ｂ、ｇインターフェロ
ン活性３００Ｘ１０６単位、蛋白１度５０γ／ｍ１）を
５ｍｌのグリーンアガロース担体カラムに３０ｍ１／ｈ
ｒの流速で通液した。
以下、実施例４と同様に溶出した。
該溶出液にはインターフェロン２６５Ｘ１０６単位が含
まれており、回収率は８５％であった。
まれており、回収率は８５％であった。
又、比活性は１．４ Ｘ １０°単位／ｍｇ蛋白質で精
製倍率は３５０倍に上昇し、溶出液の蛋白濃度は２００
０γ／ｍｌで濃縮倍率は４０倍に上昇した。」
製倍率は３５０倍に上昇し、溶出液の蛋白濃度は２００
０γ／ｍｌで濃縮倍率は４０倍に上昇した。」
Claims (1)
- インターフェロンを色素固定化担体に吸着させた後、該
インターフェロンを溶出することを特徴とするインター
フェロンの精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59192788A JPS6169799A (ja) | 1984-09-14 | 1984-09-14 | インタ−フエロンの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59192788A JPS6169799A (ja) | 1984-09-14 | 1984-09-14 | インタ−フエロンの精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6169799A true JPS6169799A (ja) | 1986-04-10 |
Family
ID=16297004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59192788A Pending JPS6169799A (ja) | 1984-09-14 | 1984-09-14 | インタ−フエロンの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6169799A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02177894A (ja) * | 1988-12-28 | 1990-07-10 | Toray Ind Inc | ネコインターフェロンの精製方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5622794A (en) * | 1979-07-31 | 1981-03-03 | Hoffmann La Roche | Human fibroblast interferon |
| JPS5661997A (en) * | 1979-10-12 | 1981-05-27 | Du Pont | Purification of interferon |
| JPS58201794A (ja) * | 1982-05-17 | 1983-11-24 | Toray Ind Inc | ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 |
| JPS5982095A (ja) * | 1982-11-02 | 1984-05-11 | Suntory Ltd | ヒトγ型インタ−フエロンの製造方法 |
-
1984
- 1984-09-14 JP JP59192788A patent/JPS6169799A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5622794A (en) * | 1979-07-31 | 1981-03-03 | Hoffmann La Roche | Human fibroblast interferon |
| JPS5661997A (en) * | 1979-10-12 | 1981-05-27 | Du Pont | Purification of interferon |
| JPS58201794A (ja) * | 1982-05-17 | 1983-11-24 | Toray Ind Inc | ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 |
| JPS5982095A (ja) * | 1982-11-02 | 1984-05-11 | Suntory Ltd | ヒトγ型インタ−フエロンの製造方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02177894A (ja) * | 1988-12-28 | 1990-07-10 | Toray Ind Inc | ネコインターフェロンの精製方法 |
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