JPS58201794A - ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はインターフェロンの濃縮精製法に関するもので
ある。

インターフェロンは生きている細胞をウィルスまたは特
別の試剤等で刺激することによって細胞から産生される
糖蛋白質であり、その化学構造は動物種によって異なり
、また同じ動物種においても複数のインターフェロン種
が知うれている。また産生細胞種によっても多少異なる
。

細胞または細胞外液から回収されるインターフェロンは
、これで動物の組織または細胞を処理すると広範囲のウ
ィルスに対する保護効果を生じさせる。インターフェロ
ンは抗ウィルス活性としてウィルス種に対する非特異性
とインターフェロンを産生じた細胞と同一種の組織およ
び細胞に対しては有効な抗ウィルス活性を与えるものの
他種の組織および細胞に対しては多くの場合無効であっ
たり、弱い抗ウィルス活性しか与えないという動物種特
異性が知られている。

インターフェロンの作用として抗ウイルス活性以外に抗
腫瘍性、細胞増殖抑制作用、マクロファージの機能促進
その他の多面的な作用が知られている。（「インターフ
ェロン研究の進ｉ」（蛋白質核酸酵素別冊第２５号、共
立出版、１９８１年）、小林茂保著「増補版インターフ
ェロン−基礎研究から臨床応用への展望」（１９７８・
年・講談社すイエンテイフイク）等参照。） このためインターフェロンはウィルス性疾患例工Ｉｔｆ
、Ｂ型肝炎、ヘルペス、インフルエンザ等の治療薬また
は予防薬として、さらに脳腫瘍、骨肉腫、白血病その他
の抗ガン剤としても期待されている。

ここでヒトに投与されるべきインターフェロンは先に述
べたインターフェロンの種特異性のためヒトインターフ
ェロンでなければならずこれはヒト細胞によって産生さ
れる。

現在、ヒトインターフェロンはヒトインターフェロンα
、βおよびγの三種に分類されている０ ヒトインターフェロンαはヒト白血球細胞によって産生
されるインターフェロンに代表され、ヒトインターフェ
ロンβはヒト二倍体線維芽細胞によって産生されるイン
ターフェロン（ヒトフィブロブラストインターフェロン
）に代表される。また、ヒトインターフェロンγは、Ｔ
リンノ′く球細胞によって産生されるインターフェロン
である。

本発明は、これらヒトインターフェロンの濃縮精製法に
関するものであり、特にヒトインターフェロンβの濃縮
精製に最適な方法を提供するものである。

ヒトインターフェロンβは、通常、ガラスモしくはプラ
スチック等の表面またはＤＥＡＥ化デキストランのマイ
クロキャリアー表面上等で培養されたヒトインターフェ
ロンβｉ！ＪＢ胞（以後単に細胞と略すことがある）を
例えばＰ、ｏｌｙ、ｉ、：Ｃのような合成二本鎖ＲＮＡ
による誘発処理と続いて行なう超誘発処理（例えばシク
ロヘキシミドとアクチノマイシンＤの組合せによる代謝
阻害法または紫外線照射法等）に付した後、細胞を培養
液中に２０〜４８時間培養することにより、この培養液
中に産生され、ヒトインターフェロンβを含有する産生
液としく　６　） て取得される。

この場合、培養液としては、例えばイーグルＭＥＭ培養
液が用いられ、必要に応じ血清および種々の添加物が加
えられる。もちろんこれ以外の培養液が用いられる場合
もありうる。

このようにして得られるヒトインターフェロンを含有し
ている産生液中のヒトインターフェロンは一般的に低濃
度〔数千〜数万年位（生物学的検定法により、ＮＩＨ供
与ヒトインターフェロンリファランススタンダードで換
算した力価すなわち国際単位を示す）／ｍｌ）であり、
この産生液にはヒトインターフェロンの他に細胞由来、
培養由来または添加物由来の多くの夾雑物を含んでいる
ので医療に用いるにはヒトインターフェロンを濃縮精製
することが要求されている。

純品としてのヒトインターフェロンの生物学的活性は蛋
白質１Ｔｎｇ当り０．４〜ＩＸ　１０９　　単位と言わ
れている。

従来から、ヒトインターフェロンの濃縮精製（４） 法について多くの方法が報告されている。例えば硫酸ア
ンモニウムを用いる沈澱法、中空繊維限外濾過膜を使用
する膜濃縮法、ＣＭ−セファデックスを用いるイオン交
換法、セファデックスやポリアクリルアミドゲル等を用
いる分子ふるい法等が知られている。

ヒトインターフェロンβのもつ疎水性を利用して疎水性
担体、例えばコンカナバリンＡ１オクチル基、トリプト
フィル基、フェニル基等を導入したアガロースゲルを用
いる疎水性クロマトグラフィーによるヒトインターフェ
ロンの濃縮精製法も知られている。（Ｗ、　Ａ、　Ｃａ
　ｒ　ｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５　、
７０４　（１９７６）　；　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
。

２５１．５３８１（１９７６）；１ｂｉｄ、２５１．７
２６０（１９７６））。

近年、下式の化学構造を有する色素を結合させた担体を
用いるインターフェロンの精製が知られている。この色
素はＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ社から”シバクロンブルーＦ
３ＧＡ″′まタハ゛シバクロンブルー３ＧＡ”なる商品
名で売られている青色色素であり、一般名はＣＩリアク
ティブブルー２である。

上記色素を結合させた担体を用いるヒトおよび動物のイ
ンターフェロンの精製および水性化がＪａｎｋｏｗｓｋ
ｙ　　らによって「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ第１
５巻第５１８２〜５１８７頁（１９７６）に、またＢｏ
ｌｌｉｎ　　らによって［ＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＢｉ
ｏｃｈｅｍｉ　５ｔｒｙ　Ｊ第８巻第２５９〜２９２頁
（ｉ９７Ｂ）に、またＥｒ１ｃｋｓｏｎらによって［Ａ
ｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　ＶｉｒｏｌｐｇｙＪ第６３巻、
第２５６〜２６１頁（１９８０）に示されているＯ Ｅ、ナイトらは特開昭５０−６１９９７において粗ヒト
インターフェロンβ溶液を、架橋アガロースゲルに上記
色素を結合させた”ブルーセファロース″″（ファルマ
シア社製）にかけ比活性４　Ｘ　１０８単位／ｍｇ・蛋
白質で純度９５％以上の精製ヒトインターフェロンβを
収率５ｏ％で得たと主張している。

しかし、ここで精製されたヒトインターフェロンβを注
射用標品とするには含有されるエチレングリコールおよ
び高濃度の塩化ナトリウムを除去するいわゆる脱塩工程
が必要である。脱塩するためには、例えばパセファデツ
クスＧ−２５＃を用いるゲルｐ過法や透析などの手段が
あるが、エチレングリコールが高粘性を有するため、そ
の十分な除去は難かしい。また単にブし′１マｏ−”ｋ
”゛。

ルー　　　　　　　での精製では、発熱性物質の除去が
必ずしも十分でなく、注射用に供するには問題がある。

また゛°ブルー　４７４’Ｏ”ｋ　”、≠は、インター
フェロンの産生に使用したアクチノマイシンＤＫ対して
親和性があり、インターフェロン回収区ｉ（７） にはアクチノマイシンＤが混入されやすい。アクチノマ
イシンＤは抗ガン剤として用いられているものの、一方
強い突然変異原であり、その混入が認められることは極
めて大きな問題点となる。

さらに本発明と関連のある亜鉛キレート担体カラムクロ
マトグラフィーを用いるものとしてＶ、　Ｇ、　Ｅｄｙ
らの方法が知られている〔Ｊ、　Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈｅｍ、２５２，５９３４（１９７Ｂ）：ｌｏ　Ｅｄ
ｙらは、亜鉛キレート担体カラム容量の約１４倍の粗Ｆ
’−ＩＰ溶液（２万ＩＵ／ｍＪ、蛋白質含量０．４　ｍ
９　／　ｒｕｇ　）を中性条件下刃ラムに通液してＦ−
ＩＰをカラムに吸着させた後、酸性溶出液を用いて６２
倍精製されたＦ−ＩＦの溶液を得ている。また溶出にｐ
Ｈグラディエンド法を用いて５１００倍精製された蛋白
質１ｍｇ当り１０８°５単位のヒトインターフェロン溶
液を得ている。

この方法は溶出域が広く、インターフェロン活性濃度が
高々１．１〜２　Ｘ　１０５単位／　ｍｅとそれほど高
くないことが問題としてあげられる。

（８） またサルコラスキーらは「Ｊ、Ｇｅｎ、ＶｉｒｏｌＪ第
４３巻第７０１〜７０６頁（１９７９）でコンカナバリ
ンＡ架橋アガロースゲルによるクロマトグラフィーと亜
鉛キレートクロマトグラフィーの組合せによるインター
フェロンβの’Ｗｔ製を提案している。ここでコンカナ
バリンＡアガロースゲルカラムから５０％エチレングリ
コールで回収したインターフェロンβをｐＨ７，４の２
０ｍＭ　リン酸ナトリウムを含む１ＭＮａｃ７溶液に透
析した後、亜鉛キレートクロマトグラフィーにかけてイ
ンターフェロンβを亜鉛キレートカラムに結合させてい
る。しかしコンカナバリンＡアガロースゲルからの回収
インターフェロンを透析せずに直接または上記透析外液
で二倍希釈して２５％エチレングリコール溶液として、
亜鉛キレートカラムにかけるとすべて素通りしてしまう
。またハイネらは多孔質ガラスピーズと亜鉛キレートカ
ラムクロマトグラフィーの組合せによるヒトインターフ
ェロンβの８製を特開昭５５−１４９２６２に提案して
いるが、多孔質ガラスピーズからヒトインターフェロン
βの溶出がｐＨ２であるため回収インターフェロＶＷＩ
液をサルコラスキーらと同様、ｐＨ７，４の２０　ｍＭ
リン酸ナトリウムを含む１ＭＮａＣ７溶液に対して透析
した後亜鉛キレートクロマトグラフィーに付している。

これらはいずれも２種のクロマトグラフィーを接続する
に際し、透析というやつかいな手段を間にはさむことが
必要となり、操作上の欠点を有している。

本発明の目的は、大量の粗ヒトインターフェロン溶液か
ら経済的な手段で高純度に精製されかつ高濃度のヒトイ
ンターフェロンを高回収率で得ようとするものである。

このような観点からすると従来の方法にはいずれも何ら
かの欠点を有し、本発明の目的に適うものではなかった
０本発明者等は上記目的に適う方法を見い出すべく鋭意
研究の結果、効果の顕著な本発明に到達した。

即ち本発明はヒト細胞によって産生された粗ヒトインタ
ーフェロンの溶液を不溶性ブルー担体と接触させヒトイ
ンターフェロンを該ブルー担体に吸着させた後、溶出液
を用いて該インターフェロンを溶液として回収し、次い
でこの該インターフェロン溶液をコバルトニッケルおよ
び亜鉛からなる群から選ばれた少くとも一つの金属をキ
レート化させたキレート基結合担体（金属キレート担体
）に接触させた後溶出液を用いて該インターフェロンを
溶液とし回収し、濃縮精製されたヒトインターフェロン
ヲ得る方法を提供するものである。

本発明方法に適用される粗ヒトインターフェロン溶液と
は、たとえばヒトインターフェロンβの場合は、ヒトイ
ンターフェロンβを産生ずる能力を有するヒト繊維芽細
胞またはヒト株化細胞を培養し、細胞に対しヒトインタ
ーフェロンβ誘発処理または引き続いて行なう超誘発処
理をした後、産生培養液にヒトインターフェロンβを産
生せしめて得られたヒトインターフェロンβ含有溶液を
いう。この産生培養液とじて（１１） は例えばイーグルＭＥＭ培養液が用いられ、必要に応じ
血清および種々の添加物が加えられて用いられるがこれ
以外の培養液が用いられる場合もある。

また本発明方法に適用されるヒトインターフェロンとし
ては、上記の細胞培養法によって産生されたヒトインタ
ーフェロンの他に、ヒトインターフェロンの遺伝子を組
み込んだ大腸菌、酵母等の微生物によって産生されたヒ
トインターフェロンも含まれる。

本発明方法に用いられる不溶性ブルー担体とは、前記の
ＣＩリアクティブブルー２に代表される青色色素を多糖
不溶性担体に結合させた担体であり、たとえば、（Ａ）
ＢｒＣＮ活性化アガロースゲルにアントラキノンのアミ
ン基を介して結合させた担体、（Ｉ３）トリアジンカッ
プリング法で、塩素の結合している部位を架橋アガロー
スゲルとエーテル結合させた担体、（ｑトリアジンカッ
プリング法でデキストランに色素を結合させたいわゆる
“ブルーデキストラン”（ファルマシ（１２） ア社製）をＢｒＣＮ活性化アガロースゲルと結合させた
担体、ＣｆｊＪ”アフィゲル−１０″′（ノクイオラド
社製）なる担体の側鎖にペプチド結合させた担体等が知
られている。

これらの担体のうち、色素と担体である架橋アガロース
ゲルがエーテル結合で結ばれている担体（１３）ｌｔ下
ジブルーアガロースゲル呼ぶ）は、次の点で最も好まし
い。すなわち（１）、ヒトインターフェロンβとの結合
が強い。（２）クロマトグラフィーで取扱うｐＨ６〜１
５の範囲で、色素と担体の結合は極めて安定であり、色
素の離脱はほとんどない。（３）“ブルーセファロース
ＣＬ−６Ｂ’（ファルマシア社製）、その他の商品名で
市販品が容易に入手できる。

ブルーアガロースゲルとしては、たとえば”ブルーセフ
ァｏ　−”−ス”　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、″マ
ドレックスゲルブルーＡ　”　（Ａｍｉｃｏｎ社製）お
よび６アフイゲルブルー”（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）の商
品名で市販されている下記の化学構造をもつものがあげ
られる。

これらの不溶性ブルー担体と粗ヒトインターフェロン溶
液を接触させるにはバッチ法とカラム法があるが、どち
らも用いることができる。

不溶性ブルー担体と接触させるには、産生されたインタ
ーフェロン溶液をそのままのｐＨ約７〜Ｚ５で行なうこ
とができるが通常ｐＨ５〜９の範囲で行なう。さらに粗
ヒトインターフェロン溶液に不溶物が存在する場合には
、前もって遠心分離または沢過等の手段によって不溶物
を除去しておくことがすすめられる。また塩化ナトリウ
ム等の中性塩を添加してイオン強度をあげておくことも
できる。粗ヒトインターフェロン溶液と不溶性ブルー担
体との接触はヒトインターフェロンの不溶性ブルー担体
への吸着が実質的に完了するまで行なうことが好ましい
が、カラム法の場合、通常空間速度１〜２Ｑｈｒ−”で
通液されるし、バッチ法の場合１〜１００時間の接触が
行なわれる。使用すべき不溶性ブルー担体の量は、処理
すべきヒトインターフェロン溶液中のインターフェロン
を実質的にほとんど吸着できるのに必要な量が粗ヒトイ
ンターフェロン溶液に対し容積比で１／１０〜１／　１
００００の範囲で適宜用いられる。接触終了後不溶性ブ
ルー担体を水またはリン酸緩衝液さらには６％食塩水、
３０チ以下のエチレングリコールまたはプロピレングリ
コールを含有する食塩水等で洗うことにより、インター
フェロン以外の不純蛋白質の大部分を除去することがで
きる。

不溶性ブルー担体に吸着したヒトインターフェロンを回
収するために用いられる溶出剤としては、容量比で４５
〜７０％のエチレングリコールまたは４０〜５５チのプ
ロピレングリコールを含む食塩水（０，５〜２Ｍ）に、
中性近く（ｐＨ６〜８）に保つ緩衝剤を加えたものが用
いら（１５） れる。溶出剤の量は特に限定されるもので無いが実質的
に吸着していたヒトインターフェロンを回収するのに必
要な量が用いられる。

本発明に用いられるキレート基結合担体とはキレート化
能を有する交換基、例えばビスカルボキシメチルイミノ
基（−Ｎ（ＣＨ２Ｃ０ＯＨ）２　）　　が結合したキレ
ート基を有する不溶性多糖類系担体または三次元架橋し
たポリオレフィン系担体等が用いられる。好ましくはビ
スカルボキシメチルイミノ基を有する不溶性多糖系担体
が用いられる。例としてＪ、Ｐｏｒａｔｈら（Ｎａｔｕ
ｒｅ　２５８゜５９８（１９７５）］によって開発され
たものでエポキシ活性化”セファロース”（ファルマシ
ア　社製）から誘導され下式の化学構造を持つものがこ
れに該当する。

（ａｇａｒｏｓｅ）　−０−ＣＨ２−ＣＨｏＨ−ＣＨ２
−０−（ＣＨ２）４−０ＣＨ２ＣＯＯ− ／ （Ｍｅ２＋：Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋または＋Ｚｎ”）（１
６） 市販“エポキシ活性化セファロース６Ｂ”から上記の担
体を調製する場合、キレート化容量は約１５〜６０μモ
ル／　ｖｔｌであるが、別途調製して異なったキレート
化容量を有する担体として用いることができることは当
然である。この担体は通常Ｎａ型のものを過剰のコバル
ト、ニッケルまたは亜鉛イオンを含む弱酸性溶液と接触
させることにより対応する金属キレート型に変挨し、つ
いで水もしくは弱酸性溶液で洗い、さらに中性の緩衝液
で平衝化した後に用いることが好ましい。該金属キレー
ト担体と前記工程で不溶性ブルー担体から回収したヒト
インターフェロン溶液との接触は通常ｐＨ５，６〜９の
範囲、特に好ましくはｐＨ７〜８の範囲で行なわれる。

不溶性ブルー担体から回収したヒトインターフェロン溶
液は、そのまま接触させることができるが、希釈してエ
チレングリコールまたはプロピレングリコール濃度を下
げた後に接触させることもできる。接触方法としてはバ
ッチ法とカラム法があるがカラム法が好ましく用いられ
る。

用いられる該金属キレート担体量と接触時間は処理すべ
きヒトインターフェロンが実質的にほとんど吸着される
に必要な量と時間が適宜選ばれる。

該金属キレート担体に吸着したヒトインターフェロンを
回収する一つの方法として酸性溶出液を用いる方法があ
る。酸性溶出液は有機酸もしくは無機酸とこれらの塩と
の混合物を溶質として用いることが好ましく、通常ｐＨ
６以下、好ましくはｐＨ３〜５の溶液として用いられる
。例えばｐＨ４，５の０．１　Ｍクエン酸−０，２Ｍリ
ン酸二ナトリウム緩衝液、あるいはｐＨ４〜５の０．１
〜０．５Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、またはこれら
に塩化ナトリウムを加えた溶液といった通常の酸性緩衝
液が適宜用いられる。

該金属キレート担体からヒトインターフェロンを回収す
る別の方法としてキレート化剤水溶液を用いる方法があ
る。キレート化剤としてはＥＤＴＡ、イミノニ酢酸、ヒ
スチジン等遷移金属に対してキレート能を有することが
知られているキレート化剤を適宜用いることができるが
、中性ヒスチジン溶液が特に好壕しく用いられる。

このヒスチジン溶液としてはヒスチジン塩酸塩を水酸化
ナトリウムで中和した０、０１〜０．２Ｍのヒスチジン
−塩化ナトリウム溶液が好ましく用いられる。

また純度の高いインターフェロンを回収するためには、
金属キレート担体からインターフェロンを回収する前に
、インターフェロン回収条件より若干弱い条件の薬液を
接触させて不純物だけを選択的に除去することが好まし
い。

具体的には、回収条件のｐＨより高く、吸着条件のｐＨ
を越えないｐＨ例えば６〜７の緩衝液や、ｐＨとしては
回収条件の範囲に入るが低濃度の緩衝液、例えばｐＨ５
の５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５の２０
　ｍＭクエン酸ナナトリウム緩衝液用いることができる
。また、回収を行なうにあたって、ｐＨまたは回収剤の
濃度を連続的または段階的に変化させて、流出液を分画
し、高純度のインターフェロンを含む分画を採取するこ
ともできる。

（１９） このようにして回収されたインターフェロンは、高純度
に精製されていて、一般的に活性が不安定となりやすい
。そのためその後の操作に先立って安定化剤としてヒト
アルブミンまだはヒトプラズマネート蛋白質を添加する
ことが好ましい。

さらに水、希薄塩または酸溶液中にて透析またはセファ
デックスなどを用いるゲル沢過法によって脱塩ないし低
塩化した後、場合によってｐＨ調整し必要に応じラクト
ース、ヒトアルブミン等の添加物を加えた後無菌濾過し
、さらに分注、凍結乾燥して注射用製剤とされる。

上記方法で使用された不溶性ブルー担体は、ヒトインタ
ーフェロンを回収後、例えば０．１ＮＮａＯＨまたは０
．５　Ｍ　ＮａＯＨ＋８．Ｍ尿素を通液することにより
インターフェロン回収条件で溶出しなかった汚染物質を
除去し、かつカラム内を滅菌し、ついで塩化ナトリウム
水溶液または水でカラムを洗浄して繰返し使用すること
ができる。また使用後の金属キレートカラムはインタ（
２０） 一フエロンを回収した後、例えば中性ヒスチジン溶液ま
たはＥＤＴＡ溶液を通液して金属イオンを除去した後、
例えば０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨを通液しカラム内に残存
している汚染物質を除去し、かつカラム内を滅菌し、つ
いで塩化ナトリウム水溶液または水でカラムを洗浄しつ
いで参考例１に示した方法で金属キレートを形成させ繰
返し使用することができる。

本発明方法によるヒトインターフェロンの濃縮精製効果
を金属キレート担体カラム単独使用の場合および不溶性
ブルー担体単独使用の場合の濃縮精製効果と比較すると
本発明の著効は明白なものとなる。

すなわち金属キレート担体カラムに担体量のし１ ５’０倍容量の粗←＝インターフェロン溶液を通液した
ところヒトインターフェロンは実質的に吐 カラム内に吸着されカラム素通り液の杵二インターフェ
ロンはわずかであり、続いて０．２Ｍヒスチジン−塩化
ナトリウムを通液すると大部分のＦ−インターフェロン
が濃縮精製されて回収できる。しかし６倍容量に当る担
体量の１５０倍量の粗ヒトインターフェロン溶液を通液
した場合、はとんどのヒトインターフェロンが素通り液
中に含まれ、回収液中に含まれたヒトインターフェロン
はわずかである。このことは粗ヒトインターフェロン溶
液の中に金属キレート担し■ 体にいったん吸着した←インターフェロンを′脱着させ
る何らかの成分が入っているだめと考えられる。このた
め金属キレート担体で処理しうる粗ヒトインターフェロ
ン溶液量は高々担体量の１５０倍容量以下に過ぎず、必
然的に高純度、高濃度の一キインターフェロン溶液を回
堅゛１することは難かしくなるｏ　　　　　　　　　　
””一方、不溶性ブルー担体を単独で用いる方法は次の
ような結果を与えた。すなわち実施例中に示されるよう
に粗ヒトインターフェロン溶液を不溶性ブルー担体に担
体量の１０００倍容量を中性条件下バッチ法で接触せル
め、ヒトインターフェロンを吸着せしめた後、ｐＨ７，
２の１０ｍＭ　　リン・酸ナトリウ・ムを含む１Ｍ塩化
ナトリウム溶液またはこれらを含む２５％エチレングリ
コール溶液で担体を洗浄後同じく食塩を含む５５チエチ
レングリコール溶液を接触させるとインク−７エロンが
回収され、１００倍近くの濃縮と６０倍近くの精製がな
され、比活性約１×１０７単位／　１ｒＱ蛋白質の１イ
ンターフエロンが得らζ・ れる。しかし発熱性物質やアクチノマイシンＤが残存し
医薬品として用いるには適していないことがわかったＯ ｔ嘴これに対し本発明の方法により、まず粗ヒトインタ
ーフェロン溶液を不溶性ブルー担体と接触させてヒトイ
ンターフェロンを吸着させた後、先に述べた溶液で担体
を洗った後、例えばｐＨ７，２の１０ｒｎＭリン酸ナト
リウムと１Ｍ塩化ナトリウムを含む５５％エチレングリ
コール溶液をカラムに通液してインターフェロンを回収
し、ついでこの回収液を直接あるいは、適宜希釈した後
肢金属キレート担体カラムに通液するならば該金属キレ
ート担体１容量当り粗ヒトインターフェロン溶液約６０
００倍容量分の（２６） ヒトインターフェロンを実質的にほとんど吸着させるこ
とができるようになり、その結果必然的に高濃度、高純
度のヒトインターフェロン溶液を回収することが可能と
なったのである。またこのようにして得られたヒトイン
ターフェロン純度は比活性約１〜４Ｘ１０Ｂ単位／ｍ９
蛋白質に向上し、ウシ−アルブミンやグロブリン等の異
種蛋白質（０，０３μ）以下／１０６単位）、アクチ／
’マイシン１）　（ｏ、　５ｎｙ−以下／１０６単位）
および発熱物質も含まれず（リムラステストおよびウサ
ギ発熱テストでマイナス）極めて高純度のものである。

以下実施例により本発明を説明する。

参考例１（金属キレート担体カラムの調製）金属キレー
ト担体は、　Ｊ、Ｐｏｒａｔｈらの方法に準じて調製し
た。すなわち攪拌装置のついた容器中でイミノニ酢酸ナ
トリウム（東京化成製）１４ｙ−と炭酸ナトリウム２０
Ｐを水１００ｒｎｌに溶解したところに、水中で良く膨
潤させたのちグラスフィルター上で水洗、炉別した゛′
エポキ（２４） シ化セファロース６Ｂ”（ファルマシア社製）４５ｙ−
（膨潤時１３５ｍ１）を加え、５６℃で１６時間攪拌し
た。炉別水洗した後、容器内の１Ｍエタノールアミン水
溶液１００ｍ／と共に５６℃で４時間攪拌した。その後
炉別水洗してキレート担体を得た。このキレート担体を
必要量カラムに充填した後Ｎ／１ＯＮａＯＨで滅菌後、
水洗、ｐＨ４，７の酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を通液
してカラムをｐＨ４，７とした後ｐＨ４，７の１％塩化
コバルト、塩化ニッケルまたは塩化亜鉛水溶液をカラム
の２倍容量通液し、さらにｐＨ４，７の酢酸−酢酸ナト
リウム緩衝液、水または０．１５Ｍ　ＮａＣＬ等でカラ
ムを洗浄した後、チャージ液と同じ組成の溶液（ｐＨ７
ｓ）を通液してカラムを平衡化してから用いる。ここで
用いた金属キレート担体のキレート能は約６０μモル／
ｍｌであった。

実施例１ 出発材料は、ヒト線維芽細胞をポリイノシン酸−ポリシ
チジル酸で刺激しさらにシクロヘキシミドとアクチノマ
イシンＤで超誘発処理した後、０．４％のメチルセルロ
ースを含有するイーグルのＭＥＭ培地に産生させて得だ
インターフェロン溶液である。この粗インターフェロン
溶液は１を当り、インターフェロン６２０万単位、蛋白
質を２１ｍ９含んでいた。またアクチノマイシンＤを１
を当り１００μノ含んでいた。この粗インターフェロン
溶液３０ｔに対し５５０ｍ１ｌのブルーアガロースゲル
（商品名“アフィゲル・ブルー”バイオ、ラド社）を加
え、攪拌装置のついたガラス反応槽の中で４０　ｈｒ攪
拌した。

６時間静置後２上清をすて、ついでこの、ブルーアガロ
ースゲルをリン酸緩衝生理塩水で洗いナカラ内径６ｍの
カラムに移した。とのカラムに対し、第１番の洗いとし
てｐＨ７，２の１０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する１
、　０　Ｍ塩化ナトリウム溶液５２０ｍ１を通液し、次
に第２番目の洗いとしてｐＨ７，２の１０ｍＭリン酸ナ
トリウムと　１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する２５％
エチレングリコール溶液２８０ｍ１を通液した。その後
インターフェロン溶出のためにｐＨ７，２の１０ｒｒＭ
リン酸ナトリウムと１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する
５５％エチレングリコール溶液４００　ｍｌを通液した
。

この５５％エチレングリコール溶液５００　ＷＬｅには
、インターフェロン１５０Ｘ１０６単位カ含まれており
、粗インターフェロン溶液からの回収率は８２％であっ
た。また含有総蛋白質量は１５ｍ９であり、この溶液の
インターフェロンの比活性は１．０．Ｘ１０’単位／ｍ
ｙ、蛋白質であり、精製倍率は６６倍であった。

ブルーアガロースゲルから回収されたインター　７　エ
ロ、　７溶液３００ｍ１のうち２８５ｍ１を５５チエチ
レングリコール溶液のまま、１ｏＷＬｌ！の亜鉛キレー
ト担体カラム（内径１．５　ｃｍ　）に２０ｍ１／ｈｒ
の流速で通液した。亜鉛キレート担体は、″エホキシ活
性化セファロース６Ｂ″′（ファルマシア社）とイミノ
ジ酢酸ナトリウムを結合させた担体に、塩化亜鉛溶液を
接触させて調製した。　　（Ｂｄｙら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ　２５２．５９３４〜５９３５（１９７７）
参照）０ （２７） 次に亜鉛キレート担体カラムに対し第１の洗いとして蒸
留水とｐＨ６，７の０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液を３
０ｍ１／ｈｒの流速で１時間ずつ交互に通した。次に第
２の洗いとしてｐＨ５，０の２０ｍＭクエン酸ナトリウ
ム溶液５０ｍ１を通液した。

その後インターフェロン溶出のために、１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含有する０、　１　Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ４，５）を通液したところ、溶エロンの回収率
は亜鉛キレート工程で８７％、通算して７０％で、あっ
た。回収インターフェロンの比活性は１．　ＯＸ　、１
　、［３８単位／■蛋白質で精製倍率は３６０倍であっ
た。回収インターフェロン液をＣｌ〜１０ｍ／の第１区
分と１０〜５０ｍ１の第２区分とに分けたとき、第２区
分のインターこの溶液を一部ドデシル硫酸ナトリウム（
８ＤＳ　）の存在下透析し、次に凍結乾燥し、メルカプ
ト（２８） エタノールで環元した後、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ　２２７　、６８０〜６８５（１９７０）　：
）に従って、ＳＤＳの存在下、アクリルアミドゲルを用
いる電気泳動分析にかけ、インターフェロン活性の分析
とクーマシブリリアントブルーＲ２００による染色を行
なったところ、分子量約２３．ＯＤＤの位置にのみ、イ
ンターフェロン活性が検出され、かつ、濃い青色の染色
バンドが見られた。

さらに溶出区分にヒト血清アルブミンを１ｍｌ当り１　
ｍ９添加した後セファデックスＧ２５を用い１０ｍＭ食
塩水を展開液とするゲルクロマトグラフィーにかけて低
塩化した。さらに少量のヒト血清アルブミンとラクトー
スを添加後、０．２μｍのフィルターを通し、ガラスバ
イアル瓶ニ分注後凍結乾燥した。凍結乾燥品を生物学的
検定によりアクチノマイシンＤを分析したところ、イン
ターフェロン１０６単位当り０．　ＯＯ０３μノ以下で
あった。またそれぞれ６羽の家兎に体重１　［３’当！
１ｌ１２Ｘ１０５単位と２Ｘ１０’単位を耳静脈投与し
たときの発熱は、６羽合計でそれぞれ０．５℃および０
．６℃の上昇で、発熱テストで陰性と判定された。一方
、ブルーアガロース溶出区分には、アクチノマイシンＤ
が０．７μｆ／　ｍｅ　、総計２１０μノ含まれている
ことが、４３０ｎｍの吸収および生物学的検定法によっ
て確かめられた。

ブルーアガロース溶出区分の一部にヒト血清アルブミン
を添加し、”セファデックスＧ　−２５”を用いるゲル
クロマトグラフィーに付し、エチレングリコールを除去
した後凍結乾燥してみたが、インターフェロン１０６単
位当５約０．７μノのアクチノマイ′シンＤが検出され
た。

またうさぎに体重１即当り２Ｘ１０５単位静脈投与した
ときの発熱は６羽合計で１．５℃で疑陽性と判定された
。

実施例１を表１に示す。

表　　　　１ 実施例２ 実施例１と同様の粗インターフェロン溶液を出発材料と
した。粗インターフェロン溶液２０ｔｌｒ：２０ｒｒｔ
ｌのブルーアガロース（商品名“マドレックスゲルブル
ーＡ”）カラムに通液した。ついでカラムにｐＨ７，２
の１０ｍＭ　　リン酸ナトリウムを含む１Ｍ塩化ナトリ
ウム２００ｍＡ’（ブルーカラム第１洗い）、ついでｐ
Ｈ７，’２の１０？？ＺＭリン酸ナトリウムと１Ｍ塩化
ナトリウムを含有する２５％エチレングリコール溶液２
００ｍ１！’（ブルーカラム第２洗い）、同じく塩を含
む４０％エチレングリコール溶液４０ｆｆｉｌ！（ブル
ーカラム第３洗い）、最後に同じく塩を含む５５％エチ
レングリコール溶液２００　＋ａＡ！’（ブルーカラム
・インターフェロン溶出）を通液した。

５５％エチレングリコール溶液を通液するときからブル
ーアガロース力ラムの出口に５　ｔａｇめ亜鉛キレート
カラムを接続させて、ブルーカラムからの溶出インター
フェロン溶液を直接亜鉛キレートカラムに通液した。そ
の後亜鉛キレートカラムに蒸留水とｐＨｌｌ５．７の０
．１Ｍリン酸ナトリウムを交互に通液（亜鉛カラム洗い
１）しだ後ｐＨ５，０の２’［］　ｍＭ　ｃ７）”５ｃ
ン酸ナトリウムを通液（亜鉛カラム洗い２）゛し、最後
に１Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ４，５のｏ、　２Ｍ酢
酸−酢酸ナトリウム緩衝液を通液（亜鉛カラムインター
フェロン溶出）しだ。゛ 出発粗インターフェロン、各カラムでの非吸着分、洗い
部分および亜鉛カラムからの回収インターフェロンの総
インターフェロン活性ト回収率、蛋白質量および比活性
を表２に示す。

以下余白 表　　　　　２ 実施例３ 実施例１と同様に粗インターフェロン溶液２０ｔと、ブ
ルーアガロース担体（マドレックスゲルブルーＡ　）　
４０　〃ｌｌを接触させ、インターフェロンを吸着させ
た。担体をカラム（２，５ｚφ）に充填しなおし、ｐＨ
７，２の１０ｍＭリン酸ナトリウムを含む、１Ｍ塩化ナ
トリウム溶液４００・ｙｒｌ。

ｐＨ７，２の１０ｍＭリン酸ナトリウムと１Ｍ塩化ナト
リウムを含む２５％エチレングリコール４００ｍ１を通
液してカラムを洗った後、ｐＨ１２の１０ｍＭリン酸ナ
トリウムと１Ｍ塩化ナトリウムを含ｔｒ５５％エチレン
クリコール４００ｍ１を通液して、インターフェロンを
回収した。

粗インターフェロン溶液には１を当り１５×１０Ｌ１単
位のインターフェロンと６０〜の総蛋白質を含んでいた
。ブルーアガロースカラムから回収されたインターフェ
ロン溶液２００ゴにはインターフェロン２６０Ｘ１０’
単位（８７％）と蛋白質２７０■含まれていて、その比
活性は１．０×１０７単位／ｍ９・蛋白質であった。

この、ブルーアガロースカラムからの回収インターフェ
ロン溶液１００　ｍｅ　（総インターフェロン活性６５
×１０６単位）を５　ｍｌのニッケルシト キレーシ担体カラムに通液した。ニッケルキレート担体
は、亜鉛キレート担体の調製に用いた塩化亜鉛の代わり
に塩化ニッケルを用いることによって調製された。カラ
ムにかけたインターフェロンのうち０．７Ｘ１０’単位
（１％）が吸着しなかったニッケルキレートゲルカラム
に対し、蒸留水とｐＨ６，７の０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム溶液を交互に通液した後、１Ｍ塩化す）　ＩＪウムを
含有するｐＨ４，５の０．２Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩
衝液を通液したところ、回収液２０ｍ１中に、インター
フェロン５５Ｘ１０’単位（回収率７５％）と蛋白質０
．５５７＃が回収された。回収インターフェロンの比活
性は１×１０８）＃Ｌ位／ｍ９蛋白質であった。

回収されたインターフェロン溶液はリムラス・ライゼー
トを用いるテストで発熱性物質陰性と判定され、アクチ
ノマイシンＤも検出されなかつた。

実施例４ 実施例６でブルーアガロースゲルから回収された、イン
ターフェロンを含む５５％エチレンクリコールｇ液１０
０ｍ１（総インターフェロン活性６５Ｘ１０６単位）を
５　ｍｌのコバルトキレート担体カラムに通液した。コ
バルトキレート担体は亜鉛キレート担体の調製に用いた
塩化亜鉛の代わりに、塩化コバルトを用いることによっ
て調製された。カラムにかけたインターフェロンのうち
約４０％のインターフェロンカ価がカラム通過液中に検
出されたので、とのカラム通過液に対し、２倍量（２０
０ｍ／）のｐＨ７，２の１０ｍＭリン酸ナトリウムを含
有する１Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えた後、再度、上記
コバルトキレート担体カラムに通液した。カラム素通り
液中のインターフェロン活性は５％に減少した０ コバルトキレート担体カラムに対し、蒸留水とｐＨ６，
７００，１Ｍリン酸ナトリウム溶液を交互に通液後、１
Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ４，５の０．２Ｍ酢酸−酢
酸す）　ＩＪウム緩衝液を通液したところ、回収液１５
ｍ／中にインターフェロン４５　Ｘ　１０６単位（回収
率６０チ）と蛋白質０．２５ｍ９が回収された。回収イ
ンターフェロンの比活性は１．８Ｘ１０８単位／ｍ９蛋
白質であった。このインターフェロン溶液は、実施例ろ
と同じように発熱性物質陰性であり、かつアクチノマイ
シンＤ不検出であった。

特許出願人　東し株式会社 （６９）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）粗ヒトインターフェロン溶液を不溶性ブルー担保
   と接触させ該インターフェロンを該ブルー担体に吸着さ
   せた後溶出液を用いて該インターフェロンを溶液として
   回収し、ついで該インターフェロン回収液をコバルト、
   ニッケルおよび亜鉛からなる群から選ばれた少くとも一
   つの金属をキレート化させたキレート基結合担体に接触
   させ該インターフェロンを該キレート基結合担体に吸着
   させた後溶出液を用いて該インターフェロンを溶液とし
   て回収することを特徴とするヒトインターフェロンの濃
   縮精製法。