JPS6174577A - イースト菌細胞の透過性の増加法 - Google Patents
イースト菌細胞の透過性の増加法Info
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- JPS6174577A JPS6174577A JP19611285A JP19611285A JPS6174577A JP S6174577 A JPS6174577 A JP S6174577A JP 19611285 A JP19611285 A JP 19611285A JP 19611285 A JP19611285 A JP 19611285A JP S6174577 A JPS6174577 A JP S6174577A
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- yeast cells
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/60—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation occurring through the 4-amino group of 2,4-diamino-butanoic acid
- C07K7/62—Polymyxins; Related peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、イースト菌細胞をポリミキシンＢノナヘフチ
ドの有効量と共に培養することによるイースト菌細胞の
透過性を増大させる方法に関する。
ドの有効量と共に培養することによるイースト菌細胞の
透過性を増大させる方法に関する。
更に本発明は、ゲノムＤ Ｎ Ａ （１ａｎｏｒｎｉｃ
ＤＮＡ ｌ又はクローン化された遺伝子（ｃＬｏｎｄ
ｇｎａｒＬｚ ｌ を有するイースト菌をポリミキシ
ンＢノナペプチドの有効量の存在下に培養し、そしてそ
れから核ゲノム又はクローン化された遺伝子によって暗
号化されたポリペプチドを回収することを含んでなる該
イースト菌からの該ポリペプチドの分泌効率を増加させ
る方法に関する。
ＤＮＡ ｌ又はクローン化された遺伝子（ｃＬｏｎｄ
ｇｎａｒＬｚ ｌ を有するイースト菌をポリミキシ
ンＢノナペプチドの有効量の存在下に培養し、そしてそ
れから核ゲノム又はクローン化された遺伝子によって暗
号化されたポリペプチドを回収することを含んでなる該
イースト菌からの該ポリペプチドの分泌効率を増加させ
る方法に関する。
高級真核生物の染色体遺伝子の表現は、比較的容易に処
理できる真核生物ホスト例えばイースト菌においてしば
しば簡便に研究されている。イースト菌をクローン化さ
れたホストとして用いることは、ある種の利点例えば動
物細胞に含まれるものと同一の一般的な経路に従う分泌
経路を提供する。それ故に真核細胞の蛋白のポスト翻訳
改変（ｐｏｓｔ −ｔｒａｎｓ −１ａｔｉｏルαｌ
ｍａｄ乙ｆｉｃαｔｉｏｎｌが（インターフェロンにお
ける如く）生物学的活性に対して必要とされる場合、イ
ースト菌はバクテリヤよりも適当なホストである。欠乏
している蛋白を比較的多ｉＫ生産する場合には、その蛋
白のホストからの分泌を高めることが望ましい。しかし
ながら今までそのような量をイースト菌で生産すること
には問題があった。
理できる真核生物ホスト例えばイースト菌においてしば
しば簡便に研究されている。イースト菌をクローン化さ
れたホストとして用いることは、ある種の利点例えば動
物細胞に含まれるものと同一の一般的な経路に従う分泌
経路を提供する。それ故に真核細胞の蛋白のポスト翻訳
改変（ｐｏｓｔ −ｔｒａｎｓ −１ａｔｉｏルαｌ
ｍａｄ乙ｆｉｃαｔｉｏｎｌが（インターフェロンにお
ける如く）生物学的活性に対して必要とされる場合、イ
ースト菌はバクテリヤよりも適当なホストである。欠乏
している蛋白を比較的多ｉＫ生産する場合には、その蛋
白のホストからの分泌を高めることが望ましい。しかし
ながら今までそのような量をイースト菌で生産すること
には問題があった。
本発明はポリミキシンＢノナベグチド（以下「Ｐ Ｂ
Ｎｊとも言及する）の効果によってイースト菌細胞の透
過性を増加させる方法を開示する。
Ｎｊとも言及する）の効果によってイースト菌細胞の透
過性を増加させる方法を開示する。
イースト菌細胞の透過性を増大させることによって、ｒ
ツムＤＮＡ又はクローン化された遺伝子によって暗号化
されたイースト菌からのポリペプチドの分泌が高められ
、斯くして所望のポリペプチド生成物の回収及び精製は
容易となる。
ツムＤＮＡ又はクローン化された遺伝子によって暗号化
されたイースト菌からのポリペプチドの分泌が高められ
、斯くして所望のポリペプチド生成物の回収及び精製は
容易となる。
ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ ｌ Ｈは、）＜チ
ルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｔｌｕ、ｒ ｐｏＬｙｍ
ｙｘａ ｌの種々の種によって同化される複雑な抗生物
質であり、／々クチリヤ、菌及び動物の細胞にとって有
毒である。
ルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｔｌｕ、ｒ ｐｏＬｙｍ
ｙｘａ ｌの種々の種によって同化される複雑な抗生物
質であり、／々クチリヤ、菌及び動物の細胞にとって有
毒である。
この毒性はその化合物の細胞膜の合体性を破壊し、その
結果細胞の内容物が外へ出てしまうという能力に帰すこ
とができる。この抗生物質は環状ペプチド部分とアミド
結合によって連結した脂肪族アシル部分とからなる。こ
のアミド結合は・（ノセイン又はフィチンによって開裂
でき、ポリミキシンＢノナペプチド又は単にＰＢＮとし
て言及される環状ノナペプチドが生成する。ＰＥＮはｔ
＜クチリヤに対して無毒性であることが示されているが
、・ぐクチリヤ細胞を他の抗生物質又は血清補体に対し
て増感せしめる。〔パーラ（Ｖａαｒα）及びノ９−ラ
Ｃネｆヤ−（Ｎａｔｕ、ｒｔ ）、５０６巻、５２６〜
５２８（１９８３１］。
結果細胞の内容物が外へ出てしまうという能力に帰すこ
とができる。この抗生物質は環状ペプチド部分とアミド
結合によって連結した脂肪族アシル部分とからなる。こ
のアミド結合は・（ノセイン又はフィチンによって開裂
でき、ポリミキシンＢノナペプチド又は単にＰＢＮとし
て言及される環状ノナペプチドが生成する。ＰＥＮはｔ
＜クチリヤに対して無毒性であることが示されているが
、・ぐクチリヤ細胞を他の抗生物質又は血清補体に対し
て増感せしめる。〔パーラ（Ｖａαｒα）及びノ９−ラ
Ｃネｆヤ−（Ｎａｔｕ、ｒｔ ）、５０６巻、５２６〜
５２８（１９８３１］。
ポリミキシンＢノナペプチドは分子の脂肪族アシル残基
と被プチド残基を結合するアミド結合を酵素的に開裂す
ることによって抗生物質ポリミキシンから製造される。
と被プチド残基を結合するアミド結合を酵素的に開裂す
ることによって抗生物質ポリミキシンから製造される。
この反応は次のように例示することができる（式中、「
ｄ、ＬＬｂｊはソアミノ酪酸、まだ「ＦＡ」は脂肪酸に
関するものである）：ｃｔａｂ−ＦＡ ＰＢＨの製造は、本明細書に参考文献として引用される
チハラ（（、’ｈｉｈαｒ（Ｊらの方法に従い、アシル
・ヒオル・ケム（Ａｇｒ、 Ｂｉ ｏ ｌ、、 ０’ん
＄”、 ＋ ５７（１１）、２４５５〜２４６５ （１
９７３１に記述されているよって行なわれる。
ｄ、ＬＬｂｊはソアミノ酪酸、まだ「ＦＡ」は脂肪酸に
関するものである）：ｃｔａｂ−ＦＡ ＰＢＨの製造は、本明細書に参考文献として引用される
チハラ（（、’ｈｉｈαｒ（Ｊらの方法に従い、アシル
・ヒオル・ケム（Ａｇｒ、 Ｂｉ ｏ ｌ、、 ０’ん
＄”、 ＋ ５７（１１）、２４５５〜２４６５ （１
９７３１に記述されているよって行なわれる。
本発明は、イースト菌細胞の透過性を増加させ、これに
よってイースト菌細胞内のケ゛ツムＤ Ａ’ Ａ又はク
ローン化されたもしくは分枝系遺伝子のいずれかによっ
て暗号化されたポリペプチドの分泌効率を増大させる方
法を提供する。これらの目的に対しては、該ポＩＪ 被
プチドのイースト菌細胞からの分泌を増加させるのに十
分であって、細胞には有毒でないＰＢＨの有効量と一緒
にイースト菌細胞を培養する。本明細書に用いる如き「
有効量」とはＰＢＮ約０．０５〜約０．５ Ａ ２６゜
単位／−を意味する。１Ａ、６゜単位はＰＢＨの１−試
料の２６０ル展における吸光度に関するものである。１
単位は塩を含まないＰＢＨの約６ηに等しい。ＰＢＨの
吸光度の測定は、ポリミキシンＢサルフェートの酵素分
解後に塩が存在しているから、試料中のＰＢＨの濃度を
重量で決定するよりも信頼性のある方法と考えられる。
よってイースト菌細胞内のケ゛ツムＤ Ａ’ Ａ又はク
ローン化されたもしくは分枝系遺伝子のいずれかによっ
て暗号化されたポリペプチドの分泌効率を増大させる方
法を提供する。これらの目的に対しては、該ポＩＪ 被
プチドのイースト菌細胞からの分泌を増加させるのに十
分であって、細胞には有毒でないＰＢＨの有効量と一緒
にイースト菌細胞を培養する。本明細書に用いる如き「
有効量」とはＰＢＮ約０．０５〜約０．５ Ａ ２６゜
単位／−を意味する。１Ａ、６゜単位はＰＢＨの１−試
料の２６０ル展における吸光度に関するものである。１
単位は塩を含まないＰＢＨの約６ηに等しい。ＰＢＨの
吸光度の測定は、ポリミキシンＢサルフェートの酵素分
解後に塩が存在しているから、試料中のＰＢＨの濃度を
重量で決定するよりも信頼性のある方法と考えられる。
所望のポリペプチドに対して暗号化された所望の分枝系
遺伝子父はゲノムＤＮＡを含むイースト菌細胞は、技術
的に良く知られた通常の栄養媒体中において、ＰＢＮの
有効量と一緒に常法で培養゛することができる。ある培
養期間及び所望のポリペプチドの細胞からの増大した分
泌に続いて、培養環境から該ポリペプチドを常法によっ
て回収する。同業者は所望のポリペプチドを適当なベク
トルに暗号化した〔所望ならば調節領域（γｇｇｔｂｌ
α−６ｏｒｙ ｒす１ｎｒＬｌを含む〕遺伝子を分枝し
且つホストイースト菌を該ベクトルで変形することが容
易に可能である。この変形体（ｔｒａｎｚｆｏｒｍ＋謁
ｔ）からのポリペプチド生成物の表現は本発明の方法に
よって高められる。更にここに記述するように、本発明
の方法ＦｉｒツムＤＮＡ、即ちポリペプチド例えばイン
ベルターゼ又は酸ホスファターゼのようなポリペプチド
の表現に対する暗号をもつイースト菌細胞中に通常存在
するＤ ＪＶ Ａによって暗号化されたポリペプチドの
分泌効率を増加させるために等しく適用することができ
る。従って本発明の方法は天然物の工業的規模での生産
に微生物を用いる場合の重大な制限を克服するための手
段を与える。
遺伝子父はゲノムＤＮＡを含むイースト菌細胞は、技術
的に良く知られた通常の栄養媒体中において、ＰＢＮの
有効量と一緒に常法で培養゛することができる。ある培
養期間及び所望のポリペプチドの細胞からの増大した分
泌に続いて、培養環境から該ポリペプチドを常法によっ
て回収する。同業者は所望のポリペプチドを適当なベク
トルに暗号化した〔所望ならば調節領域（γｇｇｔｂｌ
α−６ｏｒｙ ｒす１ｎｒＬｌを含む〕遺伝子を分枝し
且つホストイースト菌を該ベクトルで変形することが容
易に可能である。この変形体（ｔｒａｎｚｆｏｒｍ＋謁
ｔ）からのポリペプチド生成物の表現は本発明の方法に
よって高められる。更にここに記述するように、本発明
の方法ＦｉｒツムＤＮＡ、即ちポリペプチド例えばイン
ベルターゼ又は酸ホスファターゼのようなポリペプチド
の表現に対する暗号をもつイースト菌細胞中に通常存在
するＤ ＪＶ Ａによって暗号化されたポリペプチドの
分泌効率を増加させるために等しく適用することができ
る。従って本発明の方法は天然物の工業的規模での生産
に微生物を用いる場合の重大な制限を克服するための手
段を与える。
本発明はイースト菌属のいずれかに適用できる。
しかしながら本明細書に記述される方法の最大の効果は
、分枝系遺伝子の表現に対するホストとして通常使用さ
れるイースト菌例えば酵母菌及びその突然変異体、％に
麦酒酵母菌及びその突然変異体のいろいろな種に対して
である。
、分枝系遺伝子の表現に対するホストとして通常使用さ
れるイースト菌例えば酵母菌及びその突然変異体、％に
麦酒酵母菌及びその突然変異体のいろいろな種に対して
である。
本発明を以下の非限定的実施例によって更に説明する。
ポリミキシンＢサルフェートを、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７
１中において３７°Ｃで２４時間精裂フィチン（ｆｉｃ
ｉｎ ｌにより加水分解する。次いで反応混合物を沸と
うさせ（その結果酵素を凝集させ）、そしてポリミキシ
ンＢ加水分解物を濾過によって清澄させる。次いでこの
清澄した溶液を１規定（Ｎ）ＨＯ’ｌでＰＨ２まで酸性
にし、続いてルーブタノールで抽出して脂肪族アシルジ
アミノ酪酸を溶解させる。残存する水溶液をｌＮＮａＯ
ＨでｐＨ８まで調節し、ルーブタノールで繰返し調節し
ていずれか残存するポリミキシンＢを除去する。
１中において３７°Ｃで２４時間精裂フィチン（ｆｉｃ
ｉｎ ｌにより加水分解する。次いで反応混合物を沸と
うさせ（その結果酵素を凝集させ）、そしてポリミキシ
ンＢ加水分解物を濾過によって清澄させる。次いでこの
清澄した溶液を１規定（Ｎ）ＨＯ’ｌでＰＨ２まで酸性
にし、続いてルーブタノールで抽出して脂肪族アシルジ
アミノ酪酸を溶解させる。残存する水溶液をｌＮＮａＯ
ＨでｐＨ８まで調節し、ルーブタノールで繰返し調節し
ていずれか残存するポリミキシンＢを除去する。
水性層のｐＨを再び（ｐＨ７に）調整し、この物質をア
ンバーライト（Ｂ）ＩＲＡ −ａ １０ （ＯＨ型）の
カラム中を通過させる。流出液をｐＨ５に調整し、真空
下に濃縮し、凍結乾燥する。得られるＰＢ Ａ’は多量
のＮａＣ’Ｌ （５〜４Ｍ）を含有するが、この塩は標
準的な技術例えば炭酸アンモニウムを流出剤として用い
てセファデックス■Ｇ−１００カラムを通過させること
により除去することができる。
ンバーライト（Ｂ）ＩＲＡ −ａ １０ （ＯＨ型）の
カラム中を通過させる。流出液をｐＨ５に調整し、真空
下に濃縮し、凍結乾燥する。得られるＰＢ Ａ’は多量
のＮａＣ’Ｌ （５〜４Ｍ）を含有するが、この塩は標
準的な技術例えば炭酸アンモニウムを流出剤として用い
てセファデックス■Ｇ−１００カラムを通過させること
により除去することができる。
ポリミキシンＢノナペプチドは細胞に損傷を与えること
なしに（即ち無毒性にして）イースト菌の膜機能の改変
を誘導する。細胞に有毒でなくしてイースト菌の外側の
細胞膜の構造的合体性を改変するためにＰＢＮを使用す
ることは、細胞からのポリペプチド又は他の巨大分子の
輸出（ｅｘｐｏｒｔｌを容易にし、結果として分泌効率
を増加させ且つ本明細書に記述する如くゲノムＤＮＡ又
は分枝系遺伝子の所望のポリペプチド生成物の回収を容
易にさせる。
なしに（即ち無毒性にして）イースト菌の膜機能の改変
を誘導する。細胞に有毒でなくしてイースト菌の外側の
細胞膜の構造的合体性を改変するためにＰＢＮを使用す
ることは、細胞からのポリペプチド又は他の巨大分子の
輸出（ｅｘｐｏｒｔｌを容易にし、結果として分泌効率
を増加させ且つ本明細書に記述する如くゲノムＤＮＡ又
は分枝系遺伝子の所望のポリペプチド生成物の回収を容
易にさせる。
ポリペプチド例えばプロイン／ニリン、インシュリンＡ
及びＨ４４、人間又は牛の生長ホルモン、インターフェ
ロン、ソマトスタチン、キモシン、インベルターゼ、酸
ホスファターゼなどの表現の増大は本発明の方法によっ
て達成することができる。例えばソマトスタチンを暗号
化する遺伝子は適当な分校ビヒクル（νｅｈｉｃＬｇ
ｌに挿入され、そして麦酒酵母菌中へ変形される。この
変形体をＰＢＨの有効量と一緒に培養し、これによって
ＰＢＮと共に培養してない変形体と比べてソマトスタチ
／の分泌量を増加させる。Ｐ Ｂ ｔＶと接触した変形
体からの分泌の高揚は、イースト菌細胞膜の合体性の改
変及び続くソマトスタチンの細胞外への通過の容易性に
よるものと思われる。更にＰ Ｂ ＃が細胞に対して無
毒性である限りにおいて、変形された細胞の多様性は培
養媒体中におけるＰＨＨの存在によって弱められず、斯
くして細胞に更なる量のソマトスタチンを生産し且つ分
泌せしめる。
及びＨ４４、人間又は牛の生長ホルモン、インターフェ
ロン、ソマトスタチン、キモシン、インベルターゼ、酸
ホスファターゼなどの表現の増大は本発明の方法によっ
て達成することができる。例えばソマトスタチンを暗号
化する遺伝子は適当な分校ビヒクル（νｅｈｉｃＬｇ
ｌに挿入され、そして麦酒酵母菌中へ変形される。この
変形体をＰＢＨの有効量と一緒に培養し、これによって
ＰＢＮと共に培養してない変形体と比べてソマトスタチ
／の分泌量を増加させる。Ｐ Ｂ ｔＶと接触した変形
体からの分泌の高揚は、イースト菌細胞膜の合体性の改
変及び続くソマトスタチンの細胞外への通過の容易性に
よるものと思われる。更にＰ Ｂ ＃が細胞に対して無
毒性である限りにおいて、変形された細胞の多様性は培
養媒体中におけるＰＨＨの存在によって弱められず、斯
くして細胞に更なる量のソマトスタチンを生産し且つ分
泌せしめる。
同様にインベルターゼの生産及び表現を暗号にしたゲノ
ムＤＮＡを含む麦酒酵母菌の種をＰ Ｂ Ｊｖの有効量
と一緒に培養する。このＰＢＮと共に培饗した細胞から
のインベルターゼの分泌は、ＰＢＮと共に培養していな
い細胞と比べて増加する。
ムＤＮＡを含む麦酒酵母菌の種をＰ Ｂ Ｊｖの有効量
と一緒に培養する。このＰＢＮと共に培饗した細胞から
のインベルターゼの分泌は、ＰＢＮと共に培養していな
い細胞と比べて増加する。
しミ二二ｌ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、イースト菌細胞をポリミキシンＢノナペプチドの有
効量と一緒に培養することを特徴とする該イースト菌細
胞の透過性を増加させる方法。 ２、イースト菌細胞が酵母菌属に属する特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ３、イースト菌が麦酒酵母菌及びその突然変異体の種で
ある特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、ゲノムＤＮＡ又はクローン化された遺伝子を有する
イースト菌をポリミキシンＢノナペプチドの有効量の存
在下に培養し、そしてそれから該ゲノム又はクローン化
された遺伝子によつて暗号化されたポリペプチドを回収
することを特徴とする該イースト菌からの該ポリペプチ
ドの分泌効率を増加させる方法。 ５、イースト菌が酵母菌属に属している特許請求の範囲
第４項記載の方法。 ６、イースト菌が麦酒酵母菌及びその突然変異体の種に
属している特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、特許請求の範囲第１項記載の方法によつて透過性の
増加したイースト菌細胞。 ８、該イースト菌が酵母菌属の１員である特許請求の範
囲第７項記載のイースト菌細胞。 ９、該イースト菌が麦酒酵母菌及びその突然変異体の種
である特許請求の範囲第８項記載のイースト菌細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64875484A | 1984-09-07 | 1984-09-07 | |
| US648754 | 1984-09-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6174577A true JPS6174577A (ja) | 1986-04-16 |
Family
ID=24602082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19611285A Pending JPS6174577A (ja) | 1984-09-07 | 1985-09-06 | イースト菌細胞の透過性の増加法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0173937A2 (ja) |
| JP (1) | JPS6174577A (ja) |
| DK (1) | DK408285A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7319021B2 (en) | 2002-11-01 | 2008-01-15 | Promega Corporation | Cell lysis composition, methods of use, apparatus and kit |
| SK287315B6 (sk) | 2006-06-02 | 2010-06-07 | Biotika, A. S. | Spôsob izolácie polymyxínu B z vyfermentovanej pôdy |
| SK287293B6 (sk) | 2006-06-15 | 2010-05-07 | Biotika, A. S. | Spôsob fermentácie polymyxínu B pomocou produkčného mikroorganizmu Bacillus polymyxa |
-
1985
- 1985-08-26 EP EP85110684A patent/EP0173937A2/en not_active Withdrawn
- 1985-09-06 JP JP19611285A patent/JPS6174577A/ja active Pending
- 1985-09-06 DK DK408285A patent/DK408285A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK408285A (da) | 1986-03-08 |
| DK408285D0 (da) | 1985-09-06 |
| EP0173937A2 (en) | 1986-03-12 |
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