JPS632999A - 蛋白質の相互分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は蛋白質の相互分離方法に関する。

炙胆Δ艮紅 サイトカインやペプチドホルモンなど種々の生理活性蛋
白質の存在が明らかにされ、また近年の遺伝子工学技術
の進歩は、これら生理活性蛋白質の大量生産、臨宋への
適用の途を開きつつある。

しかし、これらの蛋白質は遺伝子工学手法により製造さ
れるため、しばしば混合物中の他の物質から、最終的１
こ必要な生産物を分離せねばならないという問題が生じ
ている。特に問題になるのは、必要な蛋白質をコードす
る遺伝子の発現により産生ずる遺伝子産物が、しばしば
必要な蛋白質とそのアミノ末端にメチオニンが付加した
第二番目の蛋白質との混合物であることである。付加さ
れたメチオニン（Ｍｅｔ）は、所望の遺伝子の発現の開
始を指示する翻訳開始コドンＡＴＧの発現と、発現産物
から付加したＭｅｔ基を除く宿主細胞の発現系の不首尾
に由来するものである。この問題は、原核性宿主および
真核性宿主の両者で生ずるが、とりわけ原核性宿主にお
ける遺伝子の発現においてしばしば生ずる。

必要とする蛋白質とそのＮ　−Ｍｅｔ類似体とが混合物
として産生ずる場合、二つの分子種の物理化学的性状に
おける相違は、あるとしても非常に小さいものであるた
め、相互に分離することは、極めて困難なことである。

メチオニン残基は分子ｍ約１３１で、中程度に神水性を
有し、かつ解離基を持たないため電気的に中性のアミノ
酸残基である。従って蛋白質のようなそれ自体多数の解
離基や疎水性基および親水性基を有する巨大分子のアミ
ノ末端にメチオニン残基がｌ残基付加しても蛋白質全体
の物理化学的性質には通常大きな影響を及ぼさないと予
想され、アミノ末端にメチオニン残基が付加した分子種
と付加していない分子種とを相互に分離することはきわ
めて困難であると考えられる。

この難しい問題は、多くの蛋白質において存在し、とり
わけ発現用の宿主として大腸菌を用いて発現する蛋白質
を、これらのＮ−Ｍｅｔ類似体から分離する場合におい
て、厳しいものがある。

ｇ　ＩＩＪＩ　ｈ＜　Ｍｙ決しようとする問題点同じ蛋
白質であってもアミノ末端にメチオニン残基の付加した
分子種とそうでない分子種とは蛋白質の高次構造が相互
に異なる可能性があり、両者の間でＩｎ　ｖｉｖｏおよ
びｉｎ　ｖｔｔｒｏでの生物活性や生物学的安定性に差
のある可能性もある。また、メチオニン残基のアミノ末
端への付加が抗原性の増加あるいは減少をもたらす可能
性もあり得よう。

従って、生理学」二および産業利用」二の観点からアミ
ノ末端にメチオニン残基の付加した分子種とそうでない
分子種とを分離して両者をそれぞれ実質的に純粋な形で
取り出すことが望まれる。

μ県！（１壓するための更聚 本発明者らは、蛋白質とそのアミノ末端にさらにメチオ
ニン残基を有する蛋白質（Ｎ−Ｍｅｔ蛋白質）とを相互
に分離することを目的として鋭意研究を行った結果、そ
れらが意外にもヒドロキシアパタイトに対して異なる吸
着力を有する事実を見い出した。本発明者らは、この知
見に基づきさらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、蛋白質および該蛋白質にメチオニン残展が付
加し該蛋白質と同様の生理活性を有する蛋白質（Ｍｅｔ
−蛋白質）の混合物を、ヒドロキシアバタイ！・に対す
る両者の親和性の差異を利用する分離手段に付すことを
特徴とする蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加し
た蛋白質（Ｍｅｔ−蛋白質）との相互分離方法である。

本願明細書において「蛋白質」とは、糖鎖を有するもの
もしくは有さないもののいずれをも含み、また、例えば
化学反応もしくは酵素反応により、化学的または構造的
に修飾されたポリペプチドを包含する、アミノ酸の１次
構造からなる高分子物質を意味する。

またｒＭｅｔ−蛋白質」とは、上記「蛋白質」にさらに
メチオニン基が付加したものを意味する。本発明は、と
りわけ、所望の蛋白質およびそれと同一もしくは同様の
生理活性を有するＭｅｔ−蛋白質に係るものである。本
発明における好ましいＭｅｔ−蛋白質は、所望の蛋白質
の生理活性を奏するに十分な、該蛋白質とのアミノ酸配
列上の類似性を有するものである。

本願明細書において「生理活性」とは、生理学的および
免疫学的活性および効果を含むインビボもしくはインビ
トロで生存していてもいなくてもよい細胞、細胞の一部
、細胞もしくは他の生理学的作用に基づく生産物および
生物学的物質を含む生体および（または）生理物質への
活性または効果を意味する。

＝４− 上記蛋白質およびそれにメチオニン残基が付加した蛋白
質（Ｍｅｔ−蛋白質）の混合物は、通常遺伝子組換え技
術で製造でき、通常エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌。

酵母、動物細胞を用いて発現させることにより製造でき
る。

」二足蛋白質としては、各種生理活性蛋白質が挙げられ
、例えば、インターロイキン（インターロイキン−１，
インターロイキン−２など）、Ｂ細胞増殖因子（ＢＧＩ
？）、Ｉ’３細胞分化因子（ＢＤｒ’）、マクロファー
ジ活性化因子（ＭＡＦ’）、リンホトキシン（ＬＴ）、
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ’）などのザイトカイン；トラン
スホーミンググロースファクター（ＴＧＦ−α）；エリ
スロボエヂン、」二皮細約増殖因子、インスリン、ヒト
成長ホルモンなどペプチド蛋白質ホルモン：　Ｂ型肝炎
ウィルス抗原、インフルエンザ抗原、目蹄疫つィルス抗
原、マラリア原虫抗原などの病原性微生物抗原蛋白質；
ペプチダーゼ（例、ティシュプラスミノーゲン　アクナ
ベ−ター。ウロキナーゼ、セラペプターゼなど）やリゾ
チームなどの酵素；　ヒト血清アルブミン（１−ＩＳＡ
）などの血中蛋白成分が挙げられる。

これら蛋白質の中でも、分子量的３，０００〜５０．０
００、とりわけ約５，０００〜３０，０００のもの、ま
たアミノ酸数として約３０〜５００、とりわけ約５０〜
３００のものに対して、本発明の蛋白質の相互分離方法
は有利に適用ができる。

本発明の蛋白質としては、特に、インターロイキン−２
が好ましい。

ここでインターロイキン−２とは天然のヒトインターロ
イキン−２と同様の生物学的もしくは免疫学的活性例え
ばインターロイキン−２レセプターや抗インターロイキ
ンー２抗体との結合能、を有するものであればいずれで
もよく、具体的には第１図で示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチド（■；但しＸは水素原子）や、その生
物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸
配列からなるフラグメントでもよく、例えばポリペプチ
ド（１）のアミノ末端から１個のアミノ酸（ＲＰＣ公開
９１５３９号公報）または４個のアミノ酸を欠くフラグ
メント（特開昭６０−１２６０８８号公報）やカルボキ
シル末端部分の数個のアミノ酸を欠くフラグメントなど
が挙げられ、さらに上記ポリペプチド（１）の構成アミ
ノ酸の一部が欠損しているか他のアミノ酸に置換された
もの、例えば１２５位のシスティン残基がセリン残基に
置換され八〇の（特開昭５９−９３０９３号公報）でも
よい。これらのポリペプチドは、非グリコジル化′ポリ
ペプチドであることが好ましく、とりイつけ第１図に示
すアミノ酸配列を有するインターロイキン−２が好まし
い。

本明細書においては、第１図で示されるアミノ酸配列を
何するポリペプチドにおいてＸが水素原子であるものを
ＩＬ−２と、Ｘがメチオニン残基であるものをＭｅｔ−
ＩＬ−２とそれぞれ略称することらある。

−１−足慣白質とＭｅｔ−蛋白質との混合物としては、
混合比率が任意のむのでよく、該混合物は、約５０％以
」−の純度、さらに好ましくは、約８０％以−にの純度
を有するものが用いられる。

本発明方法において用いられるヒドロキシアパタイトは
、リン酸カルシウムの一種であり、弐〇ａ＋ｏ（Ｐ　０
４）＋１（Ｏｒ−１で表わされる。

ヒドロキシアパタイトはクロマトグラフィー用。

高速液体クロマトグラフィー用のいずれでもよく、クロ
マトグラフィー用としてはバイオゲルＨＴ　。

バイオゲルＩ−Ｉ　Ｔ　Ｐ　（いずれもバイオラッド社
製、Ｕ。

Ｓ、Ａ、）＋ハイドロキシアパタイト（株式会社日本ケ
ミカル製）などが、高速液体クロマトグラフィー用カラ
ムとしてはヒドロキシアパタイトカラム（三井東圧株式
会社製）、バイオゲルＨＰ　ＨＴカラム（バイオラッド
社製）、ＫＢカラム（高研株式会社製）などが挙げられ
る。

本発明方法における分離手段としては、たとえば通常の
クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーが挙
げられる。

クロマトグラフィーの条件としては、あらかじめ開始緩
衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに蛋白質
を負荷して、溶出緩衝液を用いて蛋白質を分離溶出する
。開始緩衝液としては、ｐＨ約５以上のリン酸緩衝液を
用い、最も一般的には約０．０１Ｍ以下のリン酸緩衝液
（ｐｌ（約６．８）を用いる。試料蛋白質の負荷爪はヒ
ドロキシアパタイト１−当たり約１〜５Ｂが適当である
。溶出緩衝液としては一般に開始緩衝液と同じｐ　Ｉ−
１値をらつ高濃度のリン酸緩衝液を用いるが、酢酸イオ
ン、シュウ酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオンを用いて
も溶出が可能である。溶出法としては、段階的溶出法と
濃度勾配法のどちらを用いてもよい。

高速液体クロマトグラフィーの条件としては、」二連の
クロマトグラフィーの条件とほぼ同様である。、具体的
にはたとえば市販のヒドロキシアバタイ］・カラム（０
，７８ｘ　Ｉ　Ｏｃｍ、三井東圧株式会社製）を用いる
高速液体クロマトグラフィーでは平衡化緩衝液としてｐ
■■約５．５〜ＩＯ２５の、好ましくはｐＨ約６．５〜
８の０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を用い、リン酸
ナトリウム緩衝液の濃度を−Ｉ−昇させることにより溶
出を行う。通常的０．１〜ｌｏＯｍｇの蛋白質をのｌ・
て約０．１〜５−／ｍｉｎの好ましくは約０．５〜１．
５＃＋１！／ｓｉｎの流速で高速液体クロマトグラフィ
ーを行う。

所望により」−記の方法に従って分離した蛋白質のみを
含む両分、該蛋白質にさらにメチオニン残基が付加した
蛋白質のみを含む両分から実質的に純粋な蛋白質、該蛋
白質にさらにメチオニン残基が付加した蛋白質（Ｍｅｔ
−蛋白質）をそれぞれ採取することができる。この目的
のためには、自体公知の塩析法、疎水りロマトグラフ法
、ゲルろ適法。

イオン交換クロマトグラフ法や高速液体クロマトグラフ
法などの蛋白質の精製に一般的に用いられる方法を適宜
組み合イつせて行なわれる。

本発明は遺伝子工学技術で製造した蛋白質から、その対
応するＭｅｔ−蛋白質を実質的に含まないよう分離する
ことができる。本発明により製造される蛋白質は、対応
するＭｅｔ−蛋白質を重量比で３％以下、好ましくは２
％以下、とりわけ１％以下しか含まないものである。ま
た、本発明により製造されるＭｅｔ−蛋白質は、対応す
る蛋白質を重量比で３％以下、好ましくは２％以下、と
りわけ１％以下しか含まないものである。

本発明により製造される蛋白質およびそれにメチオニン
残基が付加した蛋白質（Ｍｅｔ−蛋白質）は、いずれも
天然の対応する蛋白質と同様の生物学的もしくは免疫学
的活性を有し、高純度に精製されており夾雑蛋白質、発
熱物質がきわめて少ないので注射剤原体等として安全に
使用される。

たとえば、本発明により得られるＩ　Ｌ　−２およびＭ
ｅｔ−ｒＬ−２はいずれも正常なＴ細胞やナチュラルキ
ラー細胞をその機能を保持させたまま増殖させる活性を
有する。したがって、本発明により得られるｒＬ−２お
よびＭｅｔ−ＴＬ−２は、それぞれＴｌＩｎ胞やナチュ
ラルキラー細胞をインビトロで長期にわたり増殖、ｌｔ
１代したりクローン化するのに使用できる。なお、この
性質を利用してヒトインターロイキン−２の活性を測定
することができる。

さらに、本発明により得られるＴＬ−２およびＭｅｔ−
ＴＴ、−２は、たとえば腫瘍抗原を認識し、破壊する抗
原特異的なキラーＴ細胞や抗原感作の経験の有無と無関
係に腫瘍を殺す能力をもつところのナチュラルキラー細
胞をインビトロで選択的に増殖させることができ、また
このキラーＴ細胞を生体へ移入する際に、本発明により
得られる■ｌ、−２またはＭｅｔ−ＩＴ、−２を同時に
接種することにより、その抗腫瘍効果を増大させること
がら、温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、犬、ネ
コ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、人など）の腫瘍の予防
、治療や免疫機能低下疾患の治療のために用いることが
できる。

本発明により得られる目７−２およびＭｅｔ−Ｔｌ７−
２はそれぞれ夾雑蛋白質ににる抗原性がなく低毒性であ
る。

本発明により得られるＩＬ−２またはＭｅｔ−ＴＬ　−
２を腫瘍の予防、治療剤として用いるには、当該物質を
自体公知の担体、賦形剤、希釈剤と混合希釈して、たと
えば注射剤、カプセル剤などとして非経口的にまたは経
口的に投与することができる。さらに、前述したように
インビトロで増殖させたキラーＴ細胞やナチュラルキラ
ー細胞と共にまたは単独で使用することができる。

本発明のｒ　Ｌ　−２およびＭｅｔ−ＴＴ、−２は、公
知の天然から分離されたヒトインターロイキン−２と実
質的に同じ生物活性を有するのでこれと同様に使用する
ことができ、細胞のインターロイキン−２受容体との解
離定数がきわめて小さいことから、極く小量の投与で良
い。

Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用するために
は、本発明のｒＬ−２またはＭｅｔ−’ＩＬ−２を約０
．０１−１ユニット／ｍｌ、好ましくは約０．１〜０．
５ユニット／ｍｌの蟲度で培地に添加して用いることが
できる。

インターロイキン−２の生物活性の測定は、インターロ
イキン−２依存性細胞を用いる方法［バイオケミカル・
アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミコニケーシ
ョンズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　ｎ１ｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍｕｎ、）、　Ｉ　Ｏ９，３６３（
１９８２）］により行なうことができる。

Ｔ細胞をインビ！・口で増殖させる目的に使用する具体
例としては、たとえば、２０％ウシ胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ　　１６４０培地にヒト末梢血より分離したＴ細胞
（ｌ　ｘ　Ｉ　Ｏ”個／ｍｌ）およびＸ線（＋５００ラ
ツド）照射したＢ細胞トランスフォーマント（ｌ　ｘ　
］　０８個／＋ｎｌ）を加えて３７°Ｃ，５％ＣＯ，存
在下で３日間リンパ球混合培養を行なって得られるアロ
抗原感作Ｔ細胞を含む細胞浮遊液に本発明のＴＬ−２ま
たはＭｅｔ−ＴＬ−２を０．１〜０．５ユニツト／　ｍ
　ｌの濃度で加え約−週間ごとに培地交換しながら約１
か月間培養を続ける方法などが挙げられる。

本願明細書および図面において、アミノ酸を略号で表示
する場合、ＩＵＰＡＣ−ＴＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　
　ｏｎ　　Ｒｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｎｏｍｅｎｃｌ
ａｔｕｒｅにｊこる略号あるいは当該分野における慣用
略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。また、
アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示
しなければＬ−体を示すものとする。

ｃｒｙ　　：　　グリシン Ａｌａ　　：　　アラニン Ｖａｌ　　：　　バリン Ｌｅｕ　　：　　ロイシン Ｔｉｅ：　　イソロイシン Ｓｐ、ｒ　　：　　セリン Ｔｈｒ　　：　　スレオニン Ｃｙｓ　　：　　システィン １／２　Ｃｙｓ　　：　　ハーフシスヂンＭｅｔ　　：
　　メヂオニン Ｇｌｕ：　　グルタミン酸 Ａｓｐ　　：　　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　：　　リノン Δｒｇ：　　アルギニン Ｔｌ１ｓ　　：　　ヒスチジン ［ンｈｅ：　　フゴニルアラニン ’Ｔ’ｙｒ　　：　　チ【１シン ’Ｉ’ｒｐ　　：　　トリプトファン Ｐｒｏ：　　プロリン Ａｓｎ　　：　　アスパラギン Ｇｉｎ＋　　グルタミン Ａｓｐ／Ａｓｎ　　：　　アスパラギン酸おにびアスパ
ラギン Ｇ　ｌｕ／　Ｇ　Ｉｎ　　：　　グルタミン酸およびグ
ルタ＝１５− ミン 後述の参考例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コ
リ（ｌＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｎ　４８３
０　／ｐＴＢ２８５は、財団法人発酵研究所（ＴＰＯ）
に昭和６０年（１９８５年）４月２５日から受託番号Ｉ
Ｆ０　１４４３７として寄託され、また本形質転換体は
、昭和６０年（１９８５年）４月３０日から通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲｌ）に受託番号
１？ＥＲＭ　　Ｐ−８１９９として寄託され、該寄託は
ブタベスト条約に基づく寄託に切換られて受託番号ＦＥ
ｎＭ　　ＢＰ−８５２として同研究所（Ｆｌ”ｊｌ）に
保管されている。

銭伜［ 以下の実施例および参考例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

なお、生物活性の測定はインターロイキン−２依存性細
胞を用いるＢｉｏｃｈｅｍ、　１１１ｏｐｈｙｓ、　Ｒ
ｅｓ。

Ｃｏｍｍｏｎ、　、　Ｉ　Ｏ９，３６３（１９８２）に
記載の方法に従って行った。

実施例１　ヒドロキシアパタイトカラムを用いる高速液
体クロマトグラフィーによる１ １、−２とＭｅｔ−ＥＴ、−２との分離：参考例１（ｖ
ｉ）で得られたＴ　Ｌ　−２およびＭｅｔ　−Ｔ　Ｌ　
−２の混合物である非グリコジル化ヒトインターロイキ
ン２を含む０．００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐｌ
−１５、０）（蛋白質濃度１　、０３　ｍｇ／１ｎ（１
’）２ｙｕ（２，０６ｍｇ）を高速液体クロマトグラフ
ィー用ヒドロキシアパタイトカラム（０，７８ｘ　Ｉ　
Ｏｃｍ。

４．８ａｆｆｌ、三井東圧株式会社製）にのせ、以下の
条件下で蛋白質を溶出した。カラム温度、２５℃；溶出
溶媒ＡＪ＋、０１Ｍリン酸すトリウム緩衝液（ｐａｌ７
．５）；溶出溶媒Ｂ、０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐａｌ　７　、５　）；溶出プログラム１０分（９
５％Ａ−１−５％Ｂ）−４５分（８７％Ａ＋＋３％Ｂ）
−６５分（８７％Ａ＋＋３％Ｂ）；流速、０，６ｍＣ／
ｍｉｎ；検出波長、２８０ｎｍ、本条件下において、非
グリコジル化インターロイキン２は保持時間４３分で溶
出されるピーク１と保持時間５４分で溶出されるピーク
２とに分離された。そこで、これらを分取扱、高速液体
クロマトグラフィーで用いたリン酸ナトリウムを除去す
るため、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶
媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った。

カラム、ウルトラボアＲＰＳＣ（１，Ｏｘ２５ｃｍ。

アルテックス社、アメリカ）；カラム温度、３０℃；溶
出溶媒Ａ、Ｏ，１％トリフルオロ酢酸−９９，９％水；
溶出溶媒＋１．０．１％トリフルオロ酢酸−９９，９％
アセトニトリル；溶出プログラム、０分（５５％Ａ＋４
５％Ｂ）−４分（５５％Ａ＋４５％Ｂ）−２８分（４２
％Δ＋５８％Ｂ）−３８分（３４％八十へ６％Ｂ）−，
１３分（２０％Ａ＋８０％Ｂ）−４４分（５５％Ａ＋４
５％Ｂ）：溶出速度３　、０　ｍｌ／　ｍｉｒ＋ａこの
クロマトグラフィーに、ｌ二って得られた溶液をそれぞ
れ凍結乾燥に付し、白色粉末を得た。ヒドロキシアパタ
イトカラムクロマトグラフィーにおけるピーク！および
ピーク２から得られたものを、それぞれＰＩおよびＦ２
となずけた。Ｐｌの収量は０．８０ｍｇ（３８，８％）
、Ｆ２の収量は０．４６ｍｇ（２２，３％）であった。

次に得られたＰＩおよびＦ２について蛋白化学的分析を
行った。ＰｌおよびＦ２それぞれ４５Ｉｔ　ｇ（３ｎｍ
ｏｌ）を用い、気相プロテインシークエンサー（アプラ
イド・バイオシステムズ社製４７０Ａ型）を用いる自動
エンドマン分解法によりＰＩおよびＦ２のアミノ末端ア
ミノ酸配列を決定した。

フェニルチオヒダントインアミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸
）はミクロパックＳｒ’−ＣＩ８カラム（パリアン社製
）を用いる高速液体クロマトグラフィーにより同定した
。ステップ１〜４で検出されたＰＴ　Ｈ−アミノ酸を第
１表に示す。

（以　下　余　白） 第　　　ｌ　　　表 サイクル　　検出されたＰ　Ｔ　Ｈ−アミノ酸（ｐｍｏ
＋） ＰＩ　　　　　　Ｆ２ １　　　　Ａｌａ　　　Ｍｅｔ　　　Ａｌａ　　　Ｍｅ
ｔ２　　　　　Ｐｒｏ　　　Ａｌａ　　　Ｐｒｏ　　　
Ａｌａ（３８）　　（２３７０）　（１６９０）　　（
６ｇ）３　　　　　Ｔｈｒ　　　Ｐｒｏ　　　Ｔｈｒ　
　　Ｐｒ。

４　　　　　Ｓｅｒ　　　Ｔｈｒ　　　Ｓｅｒ　　　Ｔ
ｈｒカルボキシル末端アミノ酸の分析は次のようにして
行った。すなわちＰＩおよびＦ２をヒドラジン分解用ガ
ラス管にとり、無水ヒドラジンを加えて減圧下に封管し
たのち１００℃で６時間加熱した。得られたヒドラジン
分解物をベンズアルデヒド処理したのち、遊離アミノ酸
を日立製８３５型アミノ酸分析計により測定した。その
結果、ＰＩお上びＦ２ともにスレオニンのみが検出され
、回収率はそれぞれ３０．３％および２８．５％であっ
た。このことからＰｌおよびＦ２のカルボキシル末端ア
ミノ酸はスレオニンと同定された。アミノ酸組成分析は
４％チオグリコール酸を含む定沸点塩酸を加えて減圧下
に封管後、１１０℃で２４゜４８．７２時間、加水分解
し、日立製８３５型アミノ酸分析計により実施した。シ
スチンおよびシスティンは過ギ酸酸化したのち、減下下
定沸点塩酸中で２４時間加水分解してアミノ酸分析計に
よりシスティン酸として定量した。アミノ酸分析値は２
４．４８および７２時間の加水分解で得られた値を平均
して求めた。ただし、セリンおよびスレオニンの値は加
水分解時間を０時間に外挿して求めた。その結果を第２
表に示す。アミノ末端アミノ酸配列分析およびアミノ酸
組成分析の結果から、Ｐｌは第１図中Ｘ＝メチオニン残
基で示される分子種（Ｍｅｔ−ｒ　Ｌ　−２）を、Ｐ２
は第１図中Ｘ−水素原子で示される分子種（ＩＬ−２）
をそれぞれ９７％および９５％以」−の純度で含んでい
ることが確認された。

（以下余白） 第　　　２　　　表 Ｔｈｒ　　１２．６１２．８　１３ Ｓｅｒ　　７，５７．６　８ Ｇｌｕ／ＧＩｎ　１８，６１８．８　１８Ｐｒｏ　　５
．０４．９　５ Ｇｌｙ　　２．４２．２　２ Ａｌａ　　５．２５．０　５ １／２Ｃｙｓ　　２．７２．７　３ Ｖａｌ　　Ｌ９３．９　４ Ｍｅｔ　　４．９４．０　４ Ｔｌｅ　　８，２　ｇ、３　９ Ｌｅｕ　　２１．９２２．４　２２ Ｔｙｒ　　３．３３．３　３ Ｐｈｅ　　６，０６．２　６ Ｔ、ｙｓ　　１０．９１０．９　１１ １１ｉｓ　　３．０３．０　３ Ａｒｇ　　４．１４．０　４ Ｔｒｐ　　＋、０１．１　１ 参考例１　非グリコジル化ヒトインターロイキン−２の
製造 （ｉ）　　発現用プラスミドの構築 ヒトインターロイキン−２遺伝子を有するプラスミドｐ
ｌＬＯＴ　＋３５−８　［特開昭６０−１１５５２８号
公報］を制限酵素１１ｇ１Ａｌで切断した。得られた１
２９４ｂｐＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＥｃｏＲＩリ
ンカ−ｄＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡを結合
させた。得られたＤＮＡをｒ！ｃｏＲＩで消化し、翻訳
開示コドンＡＴＧおよびヒトインターロイキン−２遺伝
子を有するＤＮＡ断片を得た。

このＤＮＡ断片を、あらかじめＩＥｃｏＲｌ　−Ｐｓ　
ｔ　１部位を消化したｐｔｒｐ７８１［ヌクレイツク・
アシズ・リザーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、第１１巻。

３０７７頁（１９８３）］にＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て挿入した。かくして得られた発現用プラスミドｐＴＦ
　１はｔｒｐプロモーターの下流に翻訳開示コドンとヒ
トインターロイキン−２遺伝子を有する。

１１１リンカ−と結合させた。このプラスミドＤＮＡを
制限酵素ｆｌａｗ　ＩＩＩおよびＥｃ−ｏ　ＲＩで処理
し、ついで旦ｃｏＲＩ−１１ａｍ　Ｉ１１部位にλ円、
プロモーターを有するプラスミドｐＴ１１２８１に挿入
した。かくして得た発現用プラスミドをｐＴｎ２ｇｓと
命名した。

（１１）形質転換体の製造 」―記で得たプラスミドｐＴＢ２８５でエシェリヒアコ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ　ｉ）［８３０
をコーエンらの方法しプロシージンゲス・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・才ブ・ザイエンス（ｒ’ｒｏ、　Ｎ
ａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ　、　ＵＳＡ）、第６９巻、　２＋１０頁（１
９７２）］に従い形質転換し、」二足プラスミドを含有
する形質転換体エシェリヒアコリＮ４８３Ｇ／ｒｌＴＢ
２８５（Ｉ　ｒ；’　ＯＩ　４４３７　。

Ｆ’Ｅｌ’１Ｍ　　ＢＰ−１１１５２）を得た。

（ｉｉｉ）　　形質転換体の培養 形質転換体エシェリヒア・コリ　Ｎ４８３０／ｐＴＢ２
Ｂ５（Ｉｒ’０　１４４．３７．ＦＥｒ（Ｍ　　ＢＰ−
８５２）を２５１１ｍ１容フラスコ内のバクト・トリプ
トン（デイフコ・ラボラトリーズ、アメリカ）１％、バ
クト・イーストエキス（デイフコ・ラボラトリーズ。

アメリカ）０．５％２食塩０８５％およびアンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含む液体培地（ｐＨ７，０）５０ｍｌ
に接種して３７℃で一晩回転振盪培養した。この培養液
をカザミノ酸０．５％、グルコース０．５％およびアン
ピシリン５０　ｔｔ　ｇ／ｎ＋１を含むＭ９培地２．５
Ｑの入った５Ｑ容ジャーファーメンタ−に移し３５℃で
６時間、ついで４２℃でさらに３時間通気攪拌培養して
培養液２．５Ｑを得た。この培養液を遠心分離し、菌体
を集め、−８０℃で凍結して保存した。

（ｉｖ）抽出 凍結菌体２０ｇを７Ｍ塩酸グアニジン０．１Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−１１ＣＩを含む抽出（ｐＨ７，０）　Ｉ　ＯＯｍｌ
に均一に懸濁し、４℃で１時間攪拌した後、２８．ＯＯ
Ｏｘｇで２０分間遠心分離し−に清を得た。

（Ｖ）　　インターロイキン−２蛋白質の部分精製得ら
れた−に清を０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩｉｌｌ衝
液（ｐＨ８，５）に対して透析後１９．ＯＯＯｘｇで１
０分間遠心分離して得た」二清をＯ，ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ
−Ｉ！ｅｌｌ衝液（ｐＨ８，５）で平衡化したＤＥ５２
（ＤＢＡＩ！−セルロース、ワットマン社製。

イギリス）カラム（５０ｍｌ容）に通して蛋白を吸着後
、ＮａＣｌ濃度直線勾配（０〜０．　＋５Ｍ　　ＮａＣ
ｌ　、　Ｉ　Ｑ＞を作成して、Ｉ　Ｌ　−２を溶出させ
、活性画分を得た。

（ｖｉ）　　インターロイキン−２蛋白質の精製−１−
記で得られた活性画分をＹＭ−５メンプラン（アミコン
社製、アメリカ）を用いて、５ｉ＋Ｉに濃縮し、０、Ｉ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ（ｐｌ＋　８．０）　−１Ｍ　
ＮａＣｌ緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００（
ファルマシア製、スウェーデン）カラム（５００ｍｌ容
）を用いてゲルろ過を行った。活性画分４０ｎ＋ＩをＹ
ｌｌ−５メンプランで３１に濃縮した。得られた濃縮液
を、ウルトラボアＲＰＳＣ（アルテックス社製、アメリ
カ）カラムに吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニト
リル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを
行った。カラム、ウルトラボアＲＰＳＣ（４，６ｘ　７
５開）；カラム温度、３０℃：溶出溶媒＾、０．１％ト
リフルオロ酢酸−９９，９％水；溶出溶媒１１．０．１
％トリフルオロ酢酸−９９，９％アセトニトリル：溶出
プログラム、０分（６８％＾＋３２％Ｂ）−２５分（５
５％＾→−４５％Ｂ）−３５分（４５％Ａ’＋　５５％
ｎ）　−４−５分（３０％Ａ＋７０％ＩＩ）　−４８分
（１００％１３）；溶出速度、　０．８ｎ＋ｌ／ｍｉｎ
；検出波長、　２３０ｎｍ。

本条件下で保持時間約３９分の活性画分、　Ｉ　Ｌ−２
およびＭｅｔ　−Ｔ　Ｌ−２の混合物１０ｍ１を集めた
。

茜贋匡ソ杓吐 本発明により蛋白質と該蛋白質にさらにメチオニン残基
が付加した蛋白質との相互分離ができるので、該分離方
法により得られる蛋白質は、それぞれ医薬品等として有
利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｓ　Ｌ　−２のアミノ酸配列（図中、Ｘ−水
素原子）およびＭｅｔ−ＴＬ−２のアミノ酸配列（図中
、ｘ＝メチチオン残基）をそれぞれ示す。 第２図は、実施例１における高速液体クロマトグラフィ
ーの結果を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 蛋白質およびそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を
   有する蛋白質の混合物を、ヒドロキシアパタイトに対す
   る両者の親和性の差異を利用する分離手段に付すことを
   特徴とする蛋白質とそのアミノ末端にさらにメチオニン
   残基を有する蛋白質との相互分離方法。