JPS6187626A - 高純度抗血友病性因子濃縮物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 む通常の沈殿剤を用いて抗血友病性因子（ＡＩＩＦ）含
有分１１４４体を多段１することにより該分散体からの
改善された特異活性及び減少されたフイプリノケ゛ン（
ｆｌｈｒｉｎｏｇｅｎ）不純物量を有する高純度抗血友
病性因子−縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）のりｙ遣方
法に関するものである。

ポルソン（Ｐｏ　１　ｓｏｎ　）による米国特許第４４
１５゜８０４号に （１）水の存在下で蛋白物質をポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）と混合して分散体を生成させ、その際にＰＥ
Ｇ−水分散体は溶媒相のみで存在し；（２）蛋白物質及
び工程（１）における混合物中の残シの成分の相対濃度
を蛋白相及び水を含む水性液体相並びに混合物の残りの
成分を効果的に分離させるｐ　Ｉｉ値及び偏度に調整し
； （６）　　該蛋白相及び該水性液体相を工程（２）から
分離し；そして （４）蛋白性分別生成物を工程（５）からの該フラクシ
ョンの少なくとも１つから回収することによる蛋白物質
の混合物の４段階の分別方法か定義されている。

この特許の方法に用いる際に適するポリエチレングリコ
ールは５００〜１０１１０００、好ましくは６００〜２
へ０００、更に好ましくは１．５００〜２店０００、例
えばへ０００の範囲の分子量を有する。また２１？ルソ
ンは十分公知の他のパラメータ、例えばｐ　Ｈ値を蛋白
成分の等電点に近づけて調整し、そしてイオン性濃Ｅ全
低め、且つ蛋白成分の分離を高めるために温度を増加さ
せるか、まｆｃは低下させることは同じ効果を持たせる
ために該方法に使用し得ることを開示している。

シャンブロム（ａｈａｎｈｒｏｍ）　　らによる米国特
許第３．６５１．０１８号ＩＣＡ　）Ｔ　Ｆノｍ：！ｉ
＃物の改善すれた！ｅ’４ｊ３方法が開示されており、
その際に改善法は （１）　　−Ａｊ−（Ｑ　＆こ約５〜４　＞１ｊＦｉ）
−のポリエチレングリコールを用い、Ａ”；ｊ、いて上
澄みを回収し；（２）次にポリエチレングリコールを約
１０重量％までに加え、を売いて生じる沈殿を回収し；
そして （５）　・最Ｖｔにエイゴ：Ａ２）からのｆｔ１３’Ｚ
のＩ？ｒ液に１．５〜１．８Ｍのグリシンを加え、続い
て生じる沈殿を回収する３段階沈殿において；１？リエ
チレングリコール及びグリシンの両方を用いてＡ　ＴＩ
　Ｆの低τ品沈殿（ｃｒｙｏｐｒ＋＝ｅｉｐｉｔａｔｅ
）　濃ｊｆＨ物を分別する。

との特Ｊ′「の方法を用いる際に適するポリエチレング
リコールは２００〜２０．　Ｏ０口、好ましくは４００
〜６，０００、更に好ましくは約４．０００の範囲の分
子量を有している。この特許Ｆｉｒ易度及びｐＨ値に関
していずれの限定しｆｃＩ＋’）囲も示していない。し
かしながら、この特許における実施例４は室温及びｐ　
Ｈ６，５〜６．８８で沈殿を行うことを示している。

ソヨンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）　　らによる米国特許第
３．６５２，５５０号に最初に水酸化アルミニウムグル
を用いてｐ　Ｈ５，６〜７．０で、次にポリエチレング
リコールを！ｈ、０〜６，３％の濃縮物に、そして最後
にポリエチレングリコールを１０〜１２％の濃縮物に加
えて高純度のＡＨＦを含む沈殿を得ることからなる順次
３工程の沈殿におけるポリエチレングリコールを用いる
低温エタノール（ｃｒｙｏ−ｅｔｈａｎｏｌ）沈殿によ
りイ寄られる沈殿物の抽出液を処理することにより高純
度のＡＨＦを調製する方法が開示されている。

フエケテ（Ｆｅｋｅｔｅ）らによる米国特許第３゜６８
２．８８１号に１．５〜１．８Ｍグリシンで処理された
クエン酸塩加血漿からプロトンビン錯体及びＡ　ＨＦ　
ｆ＆３縮物の製造方法を開示している。生じた沈殿をポ
リエチレングリコールを用いて最初は３〜４％、次に１
０重−１１７％の濃縮物に、そして最後に１．８Ｍグリ
シンを用いて順次処即した。

シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）　　らによる米国特許第
４．４０４．１３１号に通常の分別、例えば低温沈殿に
より得られるＦ６■を低温アルコールで沈殿させてＹ。

■Ｃ！縮物を調製する改善てれた方法が開示されている
。

フエケテらによる米国再発行特許第２９．６９８号にヘ
パリンの添加による低温沈殿で得られる血漿及び血漿フ
ラクションから得られるＡＨＦの収率を改善する方法が
開示されている。次にヘパリン処理された低温沈殿をポ
リエチレングリコール及びグリシンを用いて更に分別す
ることができる自へＡＩＪン処理された低温沈殿を更に
分別した場合、へ・２リンは好ましくは２回、１回は最
初の低温沈殿、そして続いて更に分別された濃縮物に加
えられる。

シャンブロムによる米国特許第４．０６９．２１６号に
シャンブロムらによる上記の米国特許第へ６３１．０１
８号に開示された改善法が開示されており、その際にこ
の工程において沈殿が起こるまでＦ、■及び６チボリオ
ールの緩衝溶液を０〜５℃に保持する。

ミトラ（Ｍｔｔｒａ）らによる米国特許第４．　ｓ　８
６：０６８号に水酸化アルミニウムグルを用いてＡＨＦ
蛋白質を含む低温沈殿の水性懸濁液を処理し、生じる溶
液を限外ろ過し、次に限外ろ過物を緩衝液及び塩水中で
溶液化することによるＡＨＦ儂縮濃縮物造方法が開示さ
れている。場合によっては、限外ろ過から生じる溶液を
更にｖＩ製する念めに１．６〜２．２Ｍグリシンで処理
することができる。

ブロムパック（Ｂｌｏｍｂａｃｋ）　　らによる米国特
許第４．５４ａ５１５号に不純物と共にＦ。■を含む組
成物を１５℃及びｐＨ６，５〜Ｚ８で１．５Ｍグリシン
に溶解させてＦ。■を含む溶液及び不純物を含む沈殿を
得ることにより低湛沈殿ま７Ｃはコーン（ｃｏｈｎ）・
フラクション■−Ｏから出発するＦ、■錯体の精製及び
／または濃縮方法が開示されている。場合によっては、
この特許の方法には生じるＦ、■含有グリシン溶液にＰ
ＥＧｆｆｉ加え、続いて沈殿させ、次に精製させたＦ。

■を溶液からｇ％１１計する追加の工程が含１れる。

ロック（Ｒｏｃｋ）　　による米国特許［４４，２０３
゜８９１号に血液捷たは血漿もしくは血漿フラクション
を供与者から直接ヘノぞリン、ナトリウムヘパリンまた
はその混合物から選ばれ、カルシウムの生理学的（１３
度を減少させない抗凝固剤中に捕集し、そしてＡＨＦを
回収することにより全血液、血漿″！！たけ血漿フラク
シヨンからの抗血友病性因子■（ＡＨＦ）の収率を増加
させる方法が開示されている。好ましくは、全血液また
は血漿の全容量を基準として０．１〜１０単位／−の範
囲で抗凝固剤を用い、そしてグリシン、エタノール、エ
タ／−ルーグリシン、ポリエチレングリコールまたはグ
リシン−ポリエチレングリコール沈殿ヲ用いる分別によ
りＡＨＦを回収する。

ロックらによる米国特許第４．２８９．６９１号に約１
〜１０単位／−の範囲の血漿中で使用されるヘパリンを
カルシウムキレート化抗凝固剤中に血漿搬出法によυ捕
集された新鮮な血漿に加え、血漿を凍結し、血漿を再溶
解し、低温性１殿を血漿から単離し、低温沈殿を再溶解
し、再溶ｙｐｒ　ｔ、た低湿沈殿にクエン酸塩液へＡリ
ン緩衝溶液を加え、再溶解し、緩衝液を加えた低温沈殿
をヘパリン沈殿可能な冷却不溶性グロブリンの存在下に
て約Ｏ〜１０℃で約１時間を越える時間培養し、ＡＩＩ
Ｆに富む沈殿を分離し、そして沈殿からＡＨＦを単離す
ることにより新鮮な血漿からＡＨＦをイ０る方法が開示
されている。

アム：１７＝（Ａｍｒａｎｉ）による米国特許第４゜２
１Ｑ。

５８０号に硫酸塩化されたムコ多糖類例えばへ・（リン
の存在下で約α１５〜α２５η／　ｍｅ血漿（ヘパリン
約２２．５〜５７．５単位／　ｍｅ血漿）のｒ度にＡＨ
Ｆ及びフィブロネクチン（ｆｉｈｒｏｎｅｃｔｔｎ）を
低温沈殿（０〜１５℃）により分離し、そして単離する
方法が開示されている。生じるフィブロネクチン沈殿物
をクロマトグラフィーで精製し、そしてへ・ｆ　リン上
澄みを陰イオン交換樹脂例えばヘノクラワルツ（Ｈｅｐ
ａｒａｓｏｒｂ）を有するＤＥＡＢと混合してへ・ぐリ
ンを除去し、９０〜９５％の初期の凝血促進剤活性を有
する上澄みを与える。

ロックによる米国特ＦＦ第４．５８３，９８９号にりエ
ン酸塩緩衝液を存在させずに新たに得られた血漿または
血漿フラクション會へノンリン約６〜８単位／ｄ血傾の
比でヘパリン、ナトリウムヘパリンまたはその混合物中
に直接捕集し、そしてヘノリン沈殿可能な冷却不溶性グ
ロブリンを用いる冷却培養法（０〜１０℃）を適用する
ことによ、９　ＡＨＦを得る方法が開示されている。

フエケテらによる米国特許出願第２９．６９８号に低温
沈殿により血漿または血漿フラクシヨンから得られるＡ
ＨＦＬ７）濃縮物１ｍｌ当シαＯｆ〜ｆＱ単位のヘノＺ
リンを加えることにより血漿及び血漿フラクションから
のＡＨＦの収率を改善する方法が開示されている。

７４４７国特許ｇａ５０４１０１号（Ｄｅ　ｒｗｅ　ｎ
　ｔＡｂｓｔｒａｃｔ　　８４−０２５５００１０５）
［低温沈殿の冷却精製、トリス−塩酸緩衝液中での因子
■の抽出、へＡリンを用いるプロトロンビン錯体の脱活
性化、及びポリエチレングリコールを用いるフイプリノ
グンの選択的沈殿による高純ＵＡＩ−ＩＰの製造方法が
開示されている。生じる溶液を追加のポリエチレングリ
コールで処理して約０〜２℃で低温沈殿を含む因子■を
得る。

抗血友病性因子（「ＡＨＦ」及び「Ｆ。■」とも称する
）の製造方法は促進された特異的活性及び純度に四する
生成物の品質、及びまた生成物であるＡＨＦの収率また
は回収率においである程度の改善を与えるが、従来の方
法で得られるＡＨＦ特異的活性の減少′ｆｆ：最少にし
て高収率及び読純度でＡ　ＨＦ　ｆｆ１濃縮物を得るた
めに更に工程を改善する必要性が残されている。

本発明は血漿または血漿フラクションからの抗血友病性
因子の一段または多段製造方法の別々及び異なった工程
で単独に使用されていた２つまたはそれ以上の蛋白沈殿
剤を配合し、ある範囲内の沈殿剤及び出発物質を含む出
発抗血友病性因子の量及び比率、ｐＨ値並ひに媒質の温
度を用いることにより、約１０またはそれ以上の促進さ
れた特異的活性、抗血友病性因子単位１．０００当９２
０■またはそれ以下のフイプリノグンの範囲に減少倍さ
Ｊ′した抗血友病性因子の収率を有する抗血友病性因子
生成物を得ることができることからなる発見である。

従って、ちる特徴において、本発明は場合によって、且
つ好ましくはヘパリンもしくはナトリウムヘパリンまた
（／ｉその混合物も含み、水酸化アルミニウムグル、ポ
リエチレングリコール及びグリクンから選ばれる抗血友
病性因子蛋白沈殿剤を有する抗血友病性因子含有分散体
またはｈａを多段精製工程にて処理することにより商純
度の状態及び高収率で、且つ促進された抗血友病性因子
凝固活性を保持する抗血友病性因子ンロ１、催物を製造
する改）−λさ１また方法であり、その際に該改善法は
各々の沈殿°において沈殿物の配合体を用い、最初に分
散体または溶液に酸性のｐＨ値及び約５〜１０℃の温度
下で抗血友病性因子含有分散体または溶液の８曙を卑７
Ｑ＋として約１〜４重４（チのポリエチレングリコール
を有する約１〜６％の水酸化アルミニウムケ゛ルを加え
、１七いで生じる沈殿上指て、そして生じる上澄み溶液
を回収し、次Ｖこ回Ｈｊｙされた溶液中のポリエチレン
グリコールτ；、ｊ度七最初の沈殿からの上澄み溶液の
容量を基１′Ｉ！として約９〜１５重量％に増加きせる
に十分に加えられたポリエチレングリコールと生じる溶
液の全容量を基準として約１０〜２０重量％のグリシン
及び生じる溶液の全容量を基準として約１０〜２０〜（
重量／容蛋）の塩化す１１ウムとの配合物を用い、酸性
のｐ　ｉｆ値及び約５〜１０℃の幅度で加え、Ｒ’ｉ’
６いて生じる上澄み液を捨て、そして生じる沈殿娑回収
することにより抗血友病性因子含有分散体貰たは溶液を
順次２段階で沈殿させることからなる。

かくて回収された沈Ｅ例は高純度の抗血友病江因子濃縮
生成物を含有する。

他の特徴において、本発明は本発明（・こよる方）とで
製造される高純度抗血友病性因子ハ縮物である。

かくて生成される高、ｆ、ＨＱ度抗血友病性田子公縮物
（ま通常の生理学的に適用し得る水性υＯ″Ｊ溶液に溶
解させることができ、このものに場合によっては通常の
ｊ！、’−薬学的財、形削を加えて製粟字的ｕ”　＝’
ｌ物を提供し得る。抗血友病性因子濃縮物またはその製
薬学的、ｉ１″４製物は通常の技術及び方法を用いて処
理し、感染性微生物（［−減少させるか、または除去し
、次にど；Ｆ４’ｒ　’！プまたは製薬学的調製物で処
置された患者に非感染性にさせることができる。

出発０負として、抗皿友り性因子（Ａ　）（Ｆ　）を含
む血漿ま１こ龜血漿フジクションを用いることがてきる
。好ましくは、出発物質は血漿フラクション、史に詳細
にはＡ　ＨＦ含有低山沈殿、例えばハーシュフールド（
Ｈｅｒｓｈｇｏｌｄ）らによるＪ。

Ｌａｈ、＆　Ｃ１１ｎ、Ｍｅｄ、、６７゜２５　　（１
９６６）、バーケン（Ｈ＾ｇｅｎ）　　らによる米国特
許第４９７３、　ａ　０２号及びリュー（装置Ｕ）らに
よる米国特「１彫４，１７へ６５９号にｉＣ載きれる方
法により製造きれるもので乏・ろう、約２〜６℃からの
搗度で凍結され１こ新鮮な血漿をｂ解し、溶解した血漿
を比心労離し、そして固体残澁−低瘍沈殿を抽象するこ
とにより低温沈殿を生成させる０次に低温沈殿わハ水性
緩衝浴液まｋは水性塩溶液、好ましくは射出用水（ＦＷ
Ｉ）に１詐濁させることによりこのものを可溶化し、低
温沈殿の分散体または溶液を得る。低温沈殿は１〜８０
％（重量／容量）、好ましくは約２〜５０％（重量／容
量）、更に好ましくは約５〜２５％（重量／容量）、そ
して最も好ましくは約１０〜２０％（重量／容量）の湯
度で水溶液中に存在させ得る。

好適な具体例において、不法において１つまたはそれ以
上の工程でヘノ臂リンの添加を用いることができる。こ
の好適な具体例の特徴において、低腐沈殿ヘノンリンも
しくはナトリウムヘパリンまたはその混合物に約１０〜
２００単位／−１更に好ましくは約５０〜１６５学位／
ｍｔ　％特に好ましくは約６０単位／　ｗｔｌの範囲量
の出発分散体または溶液を加えることができる１本発明
による方法においてここにｎ己載されるへ・ぐリンを使
用することにより収率は増加し、そして一般的に生成物
ＡＨＦの純度（ｆｉ−異活性により表現）が高められる
。

上記のように、本発明による改善された方法に使用され
る抗血友病性因子蛋白沈殿剤は十分公知であり、そして
単一または多段工程操作において通常単独で使用され、
抗血友病性因子を含む血漿蛋白を単離し、そして精製す
る１本発明による方法に使用される水酸化アルミニウム
懸濁液は水中での水酸化アルミニウムのいずれかの試薬
級グル懸濁液であることができる。一般に、用いる水酸
化アルミニウム懸濁液は懸濁液の全重量を基準として約
１〜５％の水中での水酸化アルミニウムの懸濁液であろ
う。用いる水酸化アルミニウム懸濁液の量は出発物質中
に含まれる蛋白質１２当り約α１〜α２５Ｆの水酸化ア
ルミニウム懸濁液を与える範囲であろう。

用いる。ｌ？　リエチレングリコール沈殿剤は一般的に
酸化エチレンをエチレングリコールまたは水と反応させ
て末端ヒドロキシル基及び末端ヒドロキシルエチル基間
に反復するオキシエチレン基を有する重縮合生成物を得
ることにより生成嘔れる高分子量重合体である。しばし
ば「ＰＥＧ」と略記されるＩＩポリエチレングリコール
ｄ約２００〜２０．０００、好ましくは約２．０００〜
ｉｏ、ｏｏｏ、更に好ましくは約４０００〜ａ、ｏ　ｏ
　ｏ、最も好ましくは約４０００〜４．０００の分子伍
の範囲であシ得る１本発明による方法に用いる際に適し
、そして商業的に入手し得るポリエチレングリコール生
成物の例として、ユニオン・カーバイド（ＴＪｎ　ｉ　
６ｎＣａｒｂｉｄｅ）Ｃｏｒ’ｐ、　　により販売され
る製品ＰＥＧ　　５５５０を挙げ得る。

最初の沈殿操作において、抗血友病性因子含有分散体ｉ
たは溶液の容量を基準として約１〜４重量％の４リエチ
レングリコールを１〜５％の水酸化アルミニウム邂濁液
と一緒番でする。第二の沈殿操作において、最初の沈殿
からの上澄み溶液の容量を基準として約９〜１５重量％
のポリエチレングリコールを生じる溶液の全重量を基準
として約１０〜２０重量％のグリシン及び生じる溶液の
全容量を基準として約１０〜２０重量％の塩化ナトリウ
ムと一緒にする。第二の沈殿操作におけるポリエチレン
グリコールの濃度は９〜１５重量％のポリエチレングリ
コール儂度を得るに十分な；す？ヌエチレングリコール
を最初の沈殿操作から回収するポリエチレングリコール
水溶液に加えることにより約９〜１５チに調整すること
ができる。また、最初の沈殿操作から回収されるポリエ
チレングリコール水溶液を限外ろ過して約９〜１５％の
ポリエチレングリコールを含む溶液を得ることができ、
次にこのものにグリシン及び塩化ナトリウムを加えるこ
とができる。この操作に使用し得る代表的（ＩＣＬＯＯ
Ｏダルトン）などがある＠　　（ＡｍｌｃｏｎはＡｍ１
ｅｏｎ　　Ｃｏｒｐｏｒａ日Ｏｎ、　　レキシントン、
マサチューセッツの商標で８Ｊ）：Ｒｏｍｉｃｏｎ　は
Ｒｏｍｌｃｏｎ　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　　ウオ
パーン、マサチューセッツの商標である）。例として限
外ろ過工程に使用し得る適当な循環ポンプにはＡｍ１ｃ
ｏｎ　　ＬＰ−２０（Ａｍｉｃｏｎ　　Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ）空気圧操作式ダイヤフラムポンプ及びＷａｒ
ｒｅｎ−Ｒｕｐｐ　　５ａｎｄｐｉｐｅｒ　　ポンプ（
ＳＡＩ−Ａ−ＤＢ−４−ＳＳ型）　（Ｔｈｏｍａｓ　ａ
ｎｄ　Ａｇｇｏｃｉａｔｅａ＠コルテ・マデラ、カリフ
ォルニア）がある。

本発明による方法に使用する際に適し、そして商業的に
入手し得るグリシン生成物の例として、味の累株式会社
、東京により販売されている製品であるグリシンを挙は
得る。

本発明によりポリエチレングリコール及びグリシンと共
にいずれかの試薬級の塩化ナトリウム生成物を使用し得
る。

本発明の全工程には次の工程が含まれる：（ａ）　　血
漿及び血漿フラクションから選ばれる出発物質を含む抗
血友病性因子を単離し；（ｂ）　　工程（ａ）からの単
離された抗血友病性因子含有物質の水溶液を生成させ、
その際に該溶液は随時及び好ましくは生じる溶液の全容
量を基準として約１０〜２００単位／　ｗｌｔ　％更に
好ましくは約３０〜１６５単位／−１特に好ましくは約
６０単位／ｄの範囲量でこのものに加えられるヘノ９リ
ンもしくはナトリウムへ１？リンまたはその混合物を更
に有しており； （ａ）　　工程（ｂ）からの物質を含む抗血友病性因子
の溶液に懸濁液の全型ｆを基準として約１〜５重量％、
好ましくは約２〜３重量％の水中の水酸化アルミニウム
、及び工程（ｈ）からの溶液の容量を基準として約１〜
４％（重量／容タコ）のポリエチレングリコールを加え
、生じる混合物のｐＨ値を約６．６〜６．８に、且つ生
じる混合物の温度を約５〜１０℃に調整し、そして生じ
る混合物を約１５分間攪拌することにより第一の血漿蛋
白質を沈殿させ； （ｄ）　　例えば通常の線心分離法により工程（ａ）か
ら生じる沈殿を分離し、そして上澄みのポリエチレング
リコール水溶液を回収し； （ａ）　　例えば十分なポリエチレングリコールを加え
るか、または工程（ｄ）からのポリエチレングリフール
水溶液を限外ろ過することにより工程（ｄ）からのポリ
エチレングリコール水溶液のポリエチレングリコール薗
縮物を工程（ｄ）からの溶液の容量を基準として約９〜
１５％（重量／容量）に調整し、更にかくして調整され
る溶液に工程（ａ）における溶液の全容量を基準として
約１〜５重区係のグリシン及び工程（ｅ）Ｋおける溶液
の全容量を基準として約１０〜２０重ｒｌ’ｌｙの１′
？１化ナトリウムを加え、生じる混合物のｐＨ値ヲ５．
７〜６．８に、且つ生じる混合物の温度を約５〜１０℃
に調整し、そして生じる混合物を約１５分間攪拌するこ
とにより第二の血漿近白負を沈殿させ； （ｆ）　　例えば通常の遠心分離法により上澄みのポリ
エチレングリコール水溶液を分離し、そして工程（ａ）
から生じる沈りｋ回収し； ω）　例えば塩化ナトリウム−グリシン緩衝溶液を用い
て約２℃でかくて回収される沈殿を洗浄し、そして沈殿
を回収し； （ｈ）　　工程（ｇ）からの洗浄された沈殿を適当な水
性媒質、例えばクエン酸塩−塩化ナトリウム−グリシン
緩衝溶液に溶解させ： （１）　　工程（ｈ）で得られる溶液を無菌ろ過し；そ
して Ｕ）　　工程（１）からの無菌ろ過した溶液を凍結乾燥
して乾【′Ａした高純度のＡＨＦ生成物を得る。

本発明の方法により製造される生成物からなる製薬学的
調製物は感染媒体、微生物を撲滅するか、もしくは不活
性化するか、または微生物の感染性を減少させ、且つ除
去し、そして該調製物を非ウィルス、殊に非肝炎感染性
にするために常法を用いて処Ｊ・Ｐすることができる。

この袈柴学的調製物は焦菌ろ追するか、加熱処理するか
、化学的に処理するか、紫外線で処理するか、ま１ζは
コロイド状シリカ上で処理することができろ。

例えば湿ｄ’Ａ”、：ｆこは乾燥状態（即ちそれ自体液
体Ｕｒ’４　ｉ・）；１勿１ンてはｉｔｉ結乾ｊｊ、−
：勿として）の調ンＪ１勿を必要に応じて一般にルへ安
定剤の存在下にてＸ）６０〜８５℃の湯度で１数分間か
ら数日曲の期間加熱することができる。適ン１なγＪ定
剤ｖｃ　ｉ：ｊ；　ａ　ｏより大きい分子量を有する非
極性に′＝イオン、糖、還元糖及びアミノ「ｉ３が含ま
れる。

ｉ＝当な非相性［ψイオンのｅｄ　Ｖｃｔよりルボン酸
、ヒドロキシカルボン酸及びアミノ酸の塩例えばカプリ
ル酸、カシリン酸、オレイン＆、ラウリン酸、割町、、
”）、アセチルフェニルアラニン、アセチルロイシン及
びアセチルトリプトファンのナトリウム−！たはカリウ
ム塩が含まれる。、適当な糖の例にはグルコース、ショ
糖及びマルトースなどが官省れ、そして適当な還元糖の
例にはエリトリトール及びマンニトールが含まれる。適
当々アミノ酸の９１にはりジン、グリシン、プロリン及
びグルタミン酸などが含賛れる。

限定しない列として、感染性微生物を減少させるか、ま
ｆ、は除去し、そして調２ｉ物を非ビールス部染性にす
る適当な通常の公知の方法には米国特許第３．０４１．
２４２号、同第３．０５７．７８１号、同第３．２２７
．６２６号、同第４．０６１，７５５号、同第４．１５
７．５０７号、同第４．２９４３４４号、同第４７０５
．２５０号、同第２．６９７．１２５−号、同第５．２
８４．５０１号、同第５，４５４，９２９号、同第４．
５７９．０８５号、同第４．５７０．２６４号、同第４
．４４０．６７９号及び同第４．４２４，２３６号並び
にヨーロツ・？將許出願公告第住０５Ｂ、９９５号、同
第０．０７７．８７０号及び同第０．０９４．６１１号
、並びに該特許中にｆ′Ｆ］示でれた参考文献に記載さ
れるものが含まれる。

好適な具体例において、出願の譲り受は人（ａｓｓｉｇ
ｎｅｅ）　により通常所有の１９８２年　　　　′１２
月２０日付は米国特許出願第４５１．６４６号に記載の
熱的に鋭敏な、治療上活性のある蛋白質をパスツール殺
菌する方法を用いることができる。

上記の方法に従って本発明の方法に応用した際に、代表
的な例とし−ＣＡＨＦ生成物を水性媒質中で最初に爪邦
対呑万、ペースで少なくとも約５０％、好ましくは＃′
Ｊ５４　％から飽和までのそれぞれショ糖及びエリトリ
トールの如き糖及び還元糖から運ばれる１１″、合物を
有するグリシン、リジン、アルギニン及びアラニンから
迅ばれる少なくとも１つのアミノ１コ支約００４〜０．
８Ｍと混合する。次にこの混合物を約６０〜７５℃の！
＋’ｎ！辰及び約５，５〜ａＯのｐＨ値で少なくとも約
１０１９１ｉ：ｉｌ加熱する。

次の実施例は本発明のいくつかの具体例のみを説明する
ものであり、そして範囲を限定）るためのものではない
。特記せぬ限りすべての部及び百分率は重量により、ぞ
してｌ高度はセラ成度によるものである。

実施ｆｌＪ　　１ 新たな低湿沈殿４００ｖを４倍容址の射出用水と２０〜
５０℃で混合した。溶解した低温沈殿を水懸濁液中の２
％Ａｌ（ＯＨ）、６４ｍ（低温沈殿１ｇ当り２％Ａｌ（
ＯＨ）ｓα１６づ）及び分子量６５５０ｉ有するポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ５５５０）Ｕｎｉｏｎ　　Ｃ
ａｒｂｉｄｅ　　Ｃｏｒｐ、）（６２２）に加えて溶液
中に６係ＰＥＧを得ｆｃ、１Ｍ酢酸を用いてｐ　Ｈ１１
１１を６，７±α１に調整し１こ、生じた溶液を９℃に
冷却し、次に８５０Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離した。

沈殿’？！：’捨て、そして上澄み液約１Ｆ３５０ｍｉ
ｆ：回Ｖした。苗゛浄な上澄みにＰＥＧ５５５０（１４
８ｆ）ｋ加えて１１％の最終ＰＥＧぴえ度に調卜し１６
１５％グリシン（重置／谷ｍ）（２４Ｇ、５り）及び１
４％ＮａＣ１（重量／容量）（２５５Ｍ’）を加え、そ
してｐＨ値を約５．７に保持することによりこの溶液か
ら因子■を沈殿させた。この溶液を６℃に冷却し、そし
て８５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。生じた沈殿
（約５０２）をグリシン／　Ｎ　ａ　Ｃ１緩衝液（１３
％グリシン／１４％Ｎａ１ｌ　水溶液）を用いて２℃で
洗浄し、８５０Ｄｒｐｍで１５分間遠心労離し、そして
クエン酸塩−ＮａＣ１−グリシン緩衝液（α００５Ｍク
エ／酸クエン酸ナトリウム５ＭＮａＣ１及びＱ、１Ｍグ
リシンを含む水溶液、ｐ　Ｈ７，２〜７．４　）約４０
０　ｆ１／（溶解させた。

この生成物を常法により無菌ろ過し、そして凍結乾燥す
ることができた。無菌ろ過後、クエン酸塩−ＮａＣ１−
グリシン緩衝液中にて９単位／Ａ２８ｏの特異活性を有
する高純度ＡＨＦ生成物の溶液４００りがかくて得られ
、ここにＡ２８゜は２１３０　ｃｍ　−’　での蛋白質
の紫外吸光度であり、そして存在する蛋白質量の尺度で
あり；そしてＡＨＦ凝血促進剤活性蛋白質の単位／ｉ（
ｐ、■：Ｃ）＝３５．０であった。

比較例　Ａ 次のように米国特許第４６５１，０１８号（実施例４）
に開示された方法により比較ＡＨＦ生成物を調製した： 試薬 クエン０加食塩水−０．９％食塩水４重量部に対してα
１モル濃度クエン酸ナトリウム１部。

グリシンクエン０加食塩水−十分なグリシンを上のクエ
ン０加食塩水に加えてそれぞれ１１モル尚度のグリシン
溶液を調製しｌこ。

緩衝化された洗浄水−０．５モル０度のクエン酸を用い
てα５モル濃度のクエン酸ナトリウムをｐＨ６，８８に
ｖ１整することにより製造した緩衝化されたクエン酸塩
１／１００容是を蒸留水に加えた。

酢酸−１，０規定及び０１規定の両方の水溶液を調１−
″ｔ０ グリシン−１，５モル濃度の水溶液を調製。

方法 低温沈殿１２０ｆにグリシンクエン０加食塩水を加え、
その量は低温沈殿を表わす血漿の容量の十分の−である
。温環境（室温であるが３０℃を越えない）中で低温沈
殿及びグリシンクエン０加食塩水１５００−を混合して
溶解させた。

溶解した低温沈殿をα１規定酢酸でｐ　Ｈｆｓ、　５に
調整した。この溶液にポリエチレングリコール４０００
を加えてＰＥＧ濃度をＡ５％に調整した。

この混合物を室温で１０分間温和に攪拌し、次に５００
０　ｒ、ｐ。口１゜で１５分間遠心分離した。上澄みを
傾捨し７、そしてｎｉ規定水酸化ナトリウムテｐ　Ｈ６
，８８Ｋ調製した。この溶液に更にポリエチレングリコ
ール４０００を加えてｉ＝最終ＰＥＧＣ度１０％に調整
した。この混合物を室温で３０分間混和に（？□）押し
、そして５０００　ｒ、ｐ、ｍで１時間半遠心分随Ｌ−
Ｒ，ｏ上澄みを傾捨し、そして沈殿を冷水（２℃）中で
洗浄した。次に５００゜ｒ、ｐ、ｍで一４℃の温度にて
５分間スピン（ｓｐｉｎ）洗浄を行った。上澄みを傾捨
し、そして沈殿をクエン０加食塩水に再溶解させｆ？：
、。

再溶解した沈殿をα１規定酢酸でＰＨ＆８８に調整し、
次にこの溶液を６〜１０℃の温度に冷却し、そしてグリ
シンに関して１．８Ｍの溶液に調整するに十分なグリシ
ンを加えることによりグリシンで再沈殿した。この混合
物を２〜１゛０℃で４５〜６０分間（司押した。グリシ
ン沈殿物を洗浄し、清澄し、次に凍結乾燥した。

公知の酢酸セルロース電気泳動法により測定した際の実
施例１の高純度ＡＨＦ生成物及び比較例ＡのＡＨＦ生戎
物の種々の蛋白成分の特異活性（単位／ｐ、　　　　）
及び相対百分率を求めた。その結果を下のａ′↓１表及
び第２表に示す。

第」及び第２表において、Ａ１ｂ＝アルブミン；α、＝
アルファー１グロブリン；α！＝アルファー２グロフリ
ン；β＝ベーターグロブリン：φ＝フイプリノケ９ン；
及びγ＝ガンマーグロブリンである。

第１表 第１表はＡｌ（ＯＨ）３懸濁液及びＰＥＧ５６ｓ。

（５％）の配合物を用いる実施例１並びにＰＥＧのみ（
３，５％）を用いる実施例Ａにおける最初の沈殿に続い
ての中間体生成物における相対的な特異活性及び蛋白質
分布を示す１本発明による方法からの中間体は従来の比
較法の中間体のものとかなり異なった特性を有している
ことは注目されよう。

第２表 実施例 １　　　９　　　０　　０８２．５１４．６　　０　　
五１第２表はＰＥＧ（１１チ）、グリシン（１５％）及
びＮａＣ１（１４％）の配合物を用いる実施例１におけ
る第二の沈殿に続いて、そして実施例Ａにおける第二の
ＰＥＧ（１０％）及び第三の（最後の）グリシン沈殿に
続いての最後生成物における相対的な特異活性及び蛋白
質分布を示す１本発明による方法の代表である実施例１
の生成物が従来法の代表である実施例Ａの比較生成物と
比べた場合、２０倍を越える大きさの特異活性及び完全
　・に異なった蛋白質分布を有することが分るであろう
。

実施例　２ （ａ）５００Ｆの出発低温沈殿を用いる以外は実質的に
実施例１に記載の方法に従って高純度ＡＨＦ生成物の他
の製造を行った。４倍容量の射出用水中の低温沈殿の溶
液に対して２０〜５０℃で水中の２％ＡＩ（ＯＨ）、懸
濁液８１．６−及びＰＥＧ５５５０　７９Ｆを加えて溶
液中に５％ＰＥＧを得た。１Ｍ酢酸を用いてｐＨ値を約
６．６９に調整した。生じた溶液を８℃に冷却し、次に
ろ過した。

沈殿を捨て、そして上澄み溶液的２５６５−を回収した
。生じた中間体は次の特性を有していた：Ａ２８ｏ＝４
．１７：単位／ｙＡＨＦ凝血促進剤活性蛋白質（Ｆ、■
：Ｃ）＝１２．２：特異活性＝２．９３．上澄み溶液を
８８０ゴ及び１５００−の部分に分割した。１５００−
の部分を下の実施例３に記載のように更に処理した。

（ｂ）　　上記の最初の蛋白沈殿から回収した上澄み溶
液８８０−にＰＥＧ５５５０　７ａｔを加えて最終ＰＥ
Ｇ濃度１１％に調整した。生じｆｃ浴液を４７０−の２
つの部分に分割した。１つの４７０−の部分を下の比較
例Ｂに記載のように更に処理し友。

（ｃ）１１％ＰＥＧ’ｉ含む溶液の他の４７０ゴの部分
にグリシン（１５チグリシン）６１．１Ｆ及びＮａＣ１
−（１４１ＮａＣ１）６５．８Ｆを加えｒｃｅ生じた混
合物のｐ　Ｈ値を６．７に調整し、そしてこの混合物を
６℃に冷却し、次に８５０　Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で１５分間遠心分離した。生じた沈殿をグリシン゛／　
Ｎ　ａ　Ｃ１緩衝液を用いて２℃で洗浄し、８５００ｒ
、ｐ、ｍで１５分間遠心分離し、そしてクエン酸塩−Ｎ
　ａ　Ｃ１−グリシン緩衝液に溶解させた。無菌ろ過後
、２２．４９の重さの溶液が得られた。生じた生成物は
次の特性を有していた：Ａ２８ｏ＝１α９；Ｆ、■：Ｃ
＝１２＆４単位／＋＋＋ｔ：特異活（１＝１１．８：及
びフイプリノケ“ン＝１五１％。

比較例　Ｂ 実施例２の（ｈ）部において更に処理するために別にし
ておいた１１％ＰＥＧを含む溶液の４７０ｒｒ、ｉの部
分ｋ　ｐ　Ｈ６，７に詞兄し、６℃に冷却し、そして８
５００　ｒ＊ｐ、ｍ、　　で１５分間遠心分阻した。

生じた沈殿ｔグリシン−ＮａＣｌ　　緩衝液を用いて２
℃で洗浄し、Ｑ　５００　ｒ、ｐ、ｍ、　　で１５分間
遠心分＾１トシ、そしてクエン酸塩−ＮａＣ１−グリシ
ン緩衝液に溶′Ｍ嘔せ７ヒ、熱凸ろ過後、２２．ｓｙの
重さの溶液を得た。生じた生成物は次の特性を有してい
た：Ａ２８ｏ＝２２．０：Ｆ、■二Ｃ＝：　４６．６単
位／ｍ／！：特異活性＝２．２１？及びフィブリノゲン
＝　１９．５ヂ。

実施例　５ （ａ）　　実施例２、（！Ｌ）部における最初の沈ｂ）
’ｉ　？に作から生じた上澄み溶液の１５００　ｍｌの
部分を３２．５℃で限外ろ過して水を除去し、容量を５
．６分の１に減少させ、そしてこれにより１α５±０．
　５　％の最終Ｉ’ＥＧ濃度を有するＰＥＧ水溶液４１
５ｉ／！を得た。１α５±０．３％のＰＥＧを含む生じ
たｒＧ液を７℃に冷却し、そして２１０ａｔ及び２００
−の部分に分勿した。１２００ｍ（！の部分を下の比較
例Ｃに記載のように更に処理した。

（ｈ）１α５±α５Ｉ％のＰＥＧを含む溶液の２１０−
の部分にグリシン（１５％グリシン）２７、５　を及び
ＮａＣ１（１４％ＮａＣＩ）２９．４ｒを加えた。生じ
た混合物ＯｐＨ値を７．０　（ａに調整し、そして混合
物を９℃に耐却し、次に８５０゜ｒ、ｐ、ｍ、　　で１
５分間遠心分離した。生じた沈殿忙クリシンーＮａＣ１
畿衝溶液を用いて２℃で洗浄し、　８５００　ｒ、ｐａ
ｍ、　　で１５分間遠心分離し、そしてクエン酸塩−Ｎ
ａＣ１−グリシン緩衝液に溶解さ・さた、無菌ろ過後、
２！Ｌ２ｆの重さの溶液を得た。生じた生成物は次の特
性を有していた：Ａ２８ｏ＝ａ６１　：Ｆ、■：Ｃ＝１
１五６単位／ｎｄ！　＠　特；ｍ　ｒ古注＝１五２；及
びフィブリツク°ン＝２７、７矛。

比較ｆンリ　　Ｃ 実施例３、（ａ）部において史に処理するために別にさ
れたＰＥＧ１α５±α５チを含む浴液の２００ｍ１の部
分ｔ　ｐ　ＨｚＯ６ＶＣ＝’４Ｊｆし、７〜９℃に冷却
し、そして９５００　ｒ、ｐ、ｍ、　で１５分間遠心分
離した。生じた沈殿をグリシン−ＮａＣ１緩衝液を用い
て２℃で洗浄し、８５００　ｒ、ｐ、ｍ。

で１５分間遠心分離し、そしてクエン酸塩−ＮａＣｌ−
グリシン緩衝液に溶解させた。無菌ろ過後、２α４Ｆの
重さの溶液を得ｆ（ａ生じた生成物は次の特性を有して
いた：Ａ　　　＝１α９；Ｆ、■：Ｃ＝４．４単位／　
ｍｅ単位行異活性＝α４；及びフィブリツク′ン＝５　
！Ｌ６％。

実施例　４ 上の実施例１に記載のクエン酸塩−ＮａＣＩ−グリシン
緩衝液に溶解した実施例１による第二の沈殿工程から回
収されｆＣ，ＡＨＦを含む約１００ｆの４−ストまたは
沈殿の約１００２の溶液的１７５Ｉｆにグリシン、リジ
ン、ＣａＣ１１及びシヨ糖ヲ加えてα８モル／ｌのグリ
シン、１８モル／ｌのリジン、２．０ミリモル／ｌのＣ
ａ　Ｃ１２及び１、２　ｆ　／　＠ｇのショ糖を含む混
合物を得た。この混合物を６０℃で１０時間加熱して／
４スツール殺菌し、次にクエン酸塩−ＮａＣ１−グリシ
ン緩衝液に対して二重ろ過（ｄｉａｆ目ｔｅｒ）　した
。無菌ろ過後、次の特性を有する溶液２．５５−を得ｆ
ｃ：Ａ２８ｏ＝４９１　：ＡＨＦ凝血促進剤活性（■：
Ｃ）＝５２．２単位／−；及び特異活性＝ａ２６単位／
Ａ２６ｇ＊（凝血促進剤活性（Ｆ、ＶＩＩ：Ｃ）は２ン
グデル０．ａｎｇｄｅ　ｌ　１　）　　らによるＪ　ａ
　Ｌ　ａ　ｂ　ａＣｌｉｎ、Ｍｅｄ、、４１．６５７　
　（１９５５）及びブロクター（Ｐｒｏ　ｅ　ｔｅ　ｒ
　）らによるＡｍ　−Ｊ　６　Ｃ１ｉ　ｎ　−Ｐａｔｈ
、、５６，２１２　　（１９６１）の方法から改良した
一工程ＡＰＴＴ試験により測定した〕。

実施例　５ 上の実施例１に記載のように約２５０−のクエン酸塩−
ＮａＣ１−グリシン緩衝液に溶解させた、比例的に減少
させｆＣ量の試薬を用いて新たな低温沈殿２５０１で出
発した実施例１による第二の沈殿工程から回収されたＡ
ＨＦを含むペーストまたは沈殿の溶液的２５０−にアル
ブミンを加えて２．５ｑ／ｍｌのアルブミンを含む溶液
を得７Ｃ，ＡＨＦ濃縮物／アルブミン混合物を無菌ろ過
し、無菌的に瓶に充てんし、そして通常の技術を用いて
凍結乾燥した。瓶中に含まれる凍結乾燥されたＡＨＦ濃
縮物を６８℃で７２時間加熱してノ！スツール殺萌した
１次に、この乾燥し、熱処理し７′ｃＡＨＦ濃縮物を射
出用水１〇−中で還元させた。この還元し、熱処理した
代表釣瓶のＡＨＦ濃縮物は次の特性を有していた：蛋白
質含有量＝＆００１ｒｌＩ／ｍ／４：Ｆ、■：Ｃ＝２五
８単位／−；及び特異活性＝７、９５単位／キ蛋白質。

実施例　に の実施例は出発物質の溶液にヘノクリンを加えることを
用いる本発明の具体例により達成される改善法を更に説
明するものである。実質的に実施例１に記載の方法に従
って、ヘパリンを用いて高純度ＡＨＦ生成物を製造し、
その際に下の第５表に示す条件下で出発低温沈殿を溶解
させる最初の水中に該ヘパリンを配合させて導入す゛る
か、またはへ７９リンなしで行った。

第３表 ａｌ　　　　４５０　　　０　　　　１２．２　　　　
４９．９２”　　　　４００　　０　　　１ＥＬ５　　
５２．２０Ｃ，４，００００１２，０４１，４０ ｄ”　　　４，２００　　０　　　１［Ｌｏ　　　５９
．８６ｅ’　　　３１０　１６２　　　１ａ２　　４５
．７６”　　１１．０００　１６２　　　　９．８　　
５に５１ｇ’　　　５，０００　　０　　　１４．２　
　６２．５４ｈ′　　へ０００　６０　　　　９．４　
　７Ａ１６１’　　　４５００　　０　　　　６．７　
　．５１．４６」６ ５．５５０　　　６０　　　　　１２．０　　　　５１
．１７”　　　５，０００　　０　　　１４．０　　４
ａ６９１７５．０００　　６０　　　１１．７　　６６
．６７１°　　２，５００　　０　　　１１．５　　４
２．０２ｎ’　　　２，５５０　　６０　　　１６．４
　　６１．７６脚注− １、チ収率は血＠ｓ　ｔ／１．の平均低温物（ｃｒｙｏ
）収率をペースとする。

２、チ収率は血漿から測定てれる低湿物の実際の収率を
ペースとする。

五　ヘパリンはｐＨ７に調波後に加えた。

４、ヘパリンはＡＩ（ＯＨ）ａ懸濁液の添加前に加えた
。

５、　出発物質は高いＣＭＶＯ力価を有する血漿から誘
導されｒｃ新鮮な低温物であった。

＆　出発物質は高い狂犬病ビールスの力価を有する血漿
から誘導された凍結した低温物であった。

２　出発物質は高いＣＭＶの力価を有する血漿から誘導
された凍結した低温物であった。

ａ　出発物質は低いグツイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍ
ｏｎａｓ）の力価を有する血漿から誘導されｆ７ｃ新鮮
な低温物であった。

第五表中のデータは高純度ＡＨＦ生成物が従来公知であ
る方法により製造された匹敵する生成物におけるフィブ
リノゲンの量に対して生成物中のフイプリノケ゛ン量の
減少を与える本発明の多段工程による利点に加えて、本
発明の多段工程による全体的な収率改善はこの工程にお
いて低温沈殿を溶解させる際に用いられる水性媒質中か
、または低Ｙ品沈殿の溶液もしくは懸濁液にヘパリンを
加えることにより更に改善し得ることを示している。

上のデータは特異活性におりる変化を示し、いずれのパ
ターンであるかを理解し、そして識別するものではない
が、特に大規模製造における収率の増大に利点があり、
そしてフイブリノグン量の減少により植々の、または低
い特異活性が許容される。

ヘパリンまたはその組成物の添加を用いる木兄ＣαＣ１
，及び１２ｙ／ｍｅショ糖の存在下で実施ｆ＋０５（６
ｓ℃で７２時間「乾式」加熱処理）または実施例４（６
０℃で１０時間「湿式」加熱処理）に記載の通りに処理
し、生成物または組成物をパスツール殺菌することがで
きた。上の実施例６ｈに記載のように加えられたヘパリ
ン（６０μ／　ｍｅ　）？用いて製造されたＡＨＦの代
表的試料を無菌ろ過し、そして実施例５に記載されるよ
うに「乾式」加熱処理して「乾式」加熱処理工程ｅこお
ける加熱前のＡＨＦの出発量を基準としで最終平均８０
チのチ収率が得られた。上の実施例ｈｓ　　Ｌ　　ｌ及
びｎに記載のように加えられたへバリア（６０μ／ｍｔ
）を用いて製造されたＡＨＦの代表的試料を実施例４に
記載のように「湿式」加熱処理して「湿式」加熱処理工
程における加熱前の出発ＡＨＦを基準として最終平均収
率７２慢が得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）血漿及び血漿フラクシヨンから選ばれる出発
   物質を含む抗血友病性因子を単離し； （ｂ）工程（ａ）からの出発物質を含むかくて単離され
   た抗血友病性因子の溶液を生成させ； （ｃ）工程（ｂ）からの出発物質を含む抗血友病性因子
   の溶液に工程（ｂ）からの溶液の容量を基準として約１
   〜４％（重量／容量）のポリエチレングリコールを加え
   、生じる混合物のｐＨ値を約６．６〜６．８に、且つ生
   じる混合物の温度を約５〜１０℃に調整し、そして生じ
   る混合物を約１５分間攪拌することにより第一の血漿蛋
   白質を沈殿させ；（ｄ）工程（ｃ）から生じる沈殿を分
   離し、そして上澄みのポリエチレングリコール水溶液を
   回収し；（ｅ）工程（ｄ）からのポリエチレングリコー
   ル水溶液のポリエチレングリコール濃縮物を工程（ｄ）
   からの溶液の容量を基準として約９〜１５％（重量／容
   量）に調整し、生じる混合物のｐＨ値を約５．７〜６．
   ８に、且つ生じる混合物の温度を約５〜１０℃に調整し
   、そして生じる混合物を約１５分間攪拌することにより
   第二の血漿蛋白質を沈殿させ；そして （ｆ）工程（ｅ）からの上澄みのポリエチレングリコー
   ル水溶液を分離し、そして沈殿を回収する工程により、
   促進された特異活性及び減少されたフィブリノゲン不純
   物を有する高純度抗血友病性因子濃縮物の製造方法にお
   いて、 （ｉ）工程（ｃ）における第一の沈殿物中のポリエチレ
   ングリコールに懸濁液の全重量を基準として約１〜３重
   量％の水中の水酸化アルミニウムを含む懸濁液を配合し
   、その際に水酸化アルミニウム懸濁液は出発物質を含む
   出発抗血友病性因子中の蛋白質１ｇ当り水酸化アルミニ
   ウム約０．１〜０．２５ｇの比で用い、そして （ｉｉ）工程（ｅ）における第二の沈殿物中のポリエチ
   レングリコールに工程（ｅ）中の溶液の全容量を基準と
   して約１０〜２０重量％のグリシン及び工程（ｅ）中の
   溶液の全容量を基準として約１０〜２０重量％の塩化ナ
   トリウムを配合することからなる改善法。 ２、工程（ａ）において血漿から単離される抗血友病性
   因子を含む血漿フラクシヨンが低温沈殿である、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３、（１）約２〜３重量％のポリエチレングリコール及
   び約２〜３％の水中での水酸化アルミニウムの懸濁液を
   出発血漿フラクシヨンの蛋白質１ｇ当り約０．１５〜０
   ．２ｇの比の水酸化アルミニウム懸濁液を用いて工程（
   ｃ）における第一の沈殿を行い、そして（ｉｉ）約１０
   〜１５重量％のポリエチレングリコールに対して、約１
   ２〜１８重量％のグリシン、及び約１２〜１８重量％の
   塩化ナトリウムを用いて工程（ｅ）における第二の沈殿
   を行う、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、（ｉ）約２〜３重量％のポリエチレングリコール及
   び約２〜３％の水中での水酸化アルミニウムの懸濁液を
   出発血漿フラクシヨンの蛋白質１ｇ当り約０．１５〜０
   ．２ｇの比の水酸化アルミニウム懸濁液を用いて工程（
   ｃ）における第一の沈殿を行い、そして（ｉｉ）約１０
   〜１５重量％のポリエチレングリコールに対して約１２
   〜１８重量％のグリシン及び１２〜１８重量％の塩化ナ
   トリウムを用いて工程（ｅ）における第二の沈殿を行う
   、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、（ｉ）約３重量％のポリエチレングリコール及び３
   ％の水中での水酸化アルミニウムの懸濁液を出発血漿フ
   ラクシヨンの蛋白質１ｇ当り約０．１６ｇの比の水酸化
   アルミニウム懸濁液を用いて工程（ｃ）における第一の
   沈殿を行い、そして（ｉｉ）約１０〜１２重量％のポリ
   エチレングリコールに対して約１２〜１５重量％のグリ
   シン及び約１２〜１５重量％の塩化ナトリウムを用いて
   工程（ｅ）における第二の沈殿を行う、特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ６、（ｉ）約３重量％のポリエチレングリコール及び３
   ％の水中での水酸化アルミニウムの懸濁液を出発血漿フ
   ラクシヨンの蛋白質１ｇ当り約０．１６ｇの比の水酸化
   アルミニウム懸濁液を用いて工程（ｃ）における第一の
   沈殿を行い、そして（ｉｉ）約１１重量％のポリエチレ
   ングリコールに対して約１３重量％のグリシン及び約１
   ４重量％の塩化ナトリウムを用いて工程（ｅ）における
   第二の沈殿を行う、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７、工程（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも１つにおいてヘ
   パリン、ナトリウムヘパリンまたはその混合物の少なく
   とも１つを懸濁液の溶液の１０〜２００単位／ｍｌの範
   囲量で加える、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、更に工程（ｆ）から回収した沈殿を可溶化し、可溶
   化した沈殿を無菌ろ過し、次に無菌ろ過した可溶化沈殿
   を凍結乾燥する工程からなる、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ９、工程（ｂ）において約６０単位／ｍｌのヘパリン、
   ナトリウムヘパリンまたはその混合物の少なくとも１つ
   を加える、特許請求の範囲第６項記載の方法。 １０、更に無菌ろ過した可溶化沈殿を処理して感染微生
   物を減少させ、且つ除去し、そして無菌ろ過した可溶化
   沈殿を非肝炎感染性にする工程を含む、特許請求の範囲
   第６項記載の方法。 １１、更に無菌ろ過した可溶化沈殿を処理して感染微生
   物を減少させ、且つ除去し、そして無菌ろ過した可溶化
   沈殿を非肝炎感染性にする工程を含む特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。 １２、更に無菌ろ過した可溶化沈殿を処理して感染微生
   物を減少させ、且つ除去し、そして無菌ろ過した可溶化
   沈殿を非肝炎感染性にする工程を含む、特許請求の範囲
   第８項記載の方法。 １３、特許請求の範囲第１項記載の方法により製造され
   る高純度抗血友病性因子濃縮物。 １４、特許請求の範囲第２項記載の方法により製造され
   る高純度抗血友病性因子濃縮物。 １５、特許請求の範囲第６項記載の方法により製造され
   る高純度抗血友病性因子濃縮物。 １６、特許請求の範囲第７項記載の方法により製造され
   る高純度抗血友病性因子濃縮物。 １７、特許請求の範囲第８項記載の方法により製造され
   る高純度抗血友病性因子濃縮物。 １８、特許請求の範囲第１０項記載の方法により製造さ
   れる高純度抗血友病性因子濃縮物。 １９、特許請求の範囲第１１項記載の方法により製造さ
   れる高純度抗血友病性因子濃縮物。 ２０、特許請求の範囲第１２項記載の方法により製造さ
   れる高純度抗血友病性因子濃縮物。