JPS6191570A - 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の定量法 - Google Patents
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の定量法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の利用分野
本発明は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（以下これらをｒＮＡＤ （Ｐ）Ｈ」という）の定
量法に関し、さらに詳しくは触媒の存在下ＮＡＤ （Ｐ
）Ｈを含む試料とレサズリンを反応せしめて、生じた可
視部の吸光度の変化を測定することを特徴とするＮ、６
．Ｄ（Ｐ）Ｈの定量法に関する。
または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（以下これらをｒＮＡＤ （Ｐ）Ｈ」という）の定
量法に関し、さらに詳しくは触媒の存在下ＮＡＤ （Ｐ
）Ｈを含む試料とレサズリンを反応せしめて、生じた可
視部の吸光度の変化を測定することを特徴とするＮ、６
．Ｄ（Ｐ）Ｈの定量法に関する。
従来の技術
従来ＮＡＤ （Ｐ）Ｈを定量する方法は、（１）それ自
身の有する紫外部の吸収または螢光を測定する方法、（
２）ジアホラーゼの存在下ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとテトラゾリ
ウム化合物などの色原体を反応せしめてホルマザン色素
に導き、その可視部の吸収を測定する方法および（３）
触媒の存在下ＮＡＤ （Ｐ）Ｈとレサズリンの反応によ
って生成したレゾルフィンの螢光を測定する方法〔メソ
・ノズ イン エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、）第４１巻、５３〜５６頁、 １９７５年〕
が知られている。
身の有する紫外部の吸収または螢光を測定する方法、（
２）ジアホラーゼの存在下ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとテトラゾリ
ウム化合物などの色原体を反応せしめてホルマザン色素
に導き、その可視部の吸収を測定する方法および（３）
触媒の存在下ＮＡＤ （Ｐ）Ｈとレサズリンの反応によ
って生成したレゾルフィンの螢光を測定する方法〔メソ
・ノズ イン エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、）第４１巻、５３〜５６頁、 １９７５年〕
が知られている。
上記紫外部の吸収を測定する方法は、血清などの生体体
液を試料とする場合は共存する紫外部に吸収を有する物
質によって妨害を受けることおよび感度が低いという欠
点があり、また螢光を測定する方法は測定感度が高いに
もかかわらず、螢光光度計が高価で一般的に普及してい
ないため繁用されていない。また、上記ホルマザン色素
を測定する方法は該色素が難溶性であるため光度針のセ
ルやチューブに付着することおよび測定感度が低いとい
う欠点がある。
液を試料とする場合は共存する紫外部に吸収を有する物
質によって妨害を受けることおよび感度が低いという欠
点があり、また螢光を測定する方法は測定感度が高いに
もかかわらず、螢光光度計が高価で一般的に普及してい
ないため繁用されていない。また、上記ホルマザン色素
を測定する方法は該色素が難溶性であるため光度針のセ
ルやチューブに付着することおよび測定感度が低いとい
う欠点がある。
ＮＡＤ （Ｐ）Ｈは脱水素酵素および還元酵素の補酵素
であり、生体体液中に存在するこれら酵素の測定または
これら酵素の基質となる生体体液中の成分の定量の際に
、酵素反応によって生じたＮＡＤ （Ｐ）Ｈの変化が測
定される。現在、生体体液中の成分の定量には酸化酵素
を用いる方法がもっばら利用されているが、この方法は
試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビンなどの還
元性物質による妨害を受は易いという欠点がある。脱水
素酵素または還元酵素を用いる方法はこのような還元性
物質による影響を受けにくい有利な方法であるが、前記
した理由によりあまり利用されていないのが実状である
。
であり、生体体液中に存在するこれら酵素の測定または
これら酵素の基質となる生体体液中の成分の定量の際に
、酵素反応によって生じたＮＡＤ （Ｐ）Ｈの変化が測
定される。現在、生体体液中の成分の定量には酸化酵素
を用いる方法がもっばら利用されているが、この方法は
試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビンなどの還
元性物質による妨害を受は易いという欠点がある。脱水
素酵素または還元酵素を用いる方法はこのような還元性
物質による影響を受けにくい有利な方法であるが、前記
した理由によりあまり利用されていないのが実状である
。
発明が解決しようとする問題点
本発明は前記した従来のＮＡＤ （Ｐ）Ｈの定量におけ
る欠点を改良した、簡便で高感度な定量法を提供するこ
とを目的とする。
る欠点を改良した、簡便で高感度な定量法を提供するこ
とを目的とする。
問題点を解決するための手段
本発明者はＮＡＤ （Ｐ）Ｈの定量法に関して、実用的
に有利な発色色素を利用する手段がないかと鋭意研究し
た結果、触媒の存在下ＮＡＤ （Ｐ）Ｈとレサズリンか
らレゾルフィンを生成せしめる反応において、レサズリ
ンおよびレゾルフィンが可視部の特定の波長に吸収極大
を有するという性質を利用してＮＡＤ （Ｐ）Ｈを定量
する方法を見いだした。即ち、レサズリンは微アルカリ
性側で６００ｎｍ付近に吸収極大を有する青色物質であ
り、一方レゾルフィンは５７Ｏｎｍ付近に吸収極大を有
する赤色物質であるから、それぞれの吸収極大付近の波
長における吸光度を測定することによりＮＡＤ （Ｐ）
Ｈが定量される。ＮＡＤ （Ｐ）Ｈとレサズリンの反応
式を次に示す。
に有利な発色色素を利用する手段がないかと鋭意研究し
た結果、触媒の存在下ＮＡＤ （Ｐ）Ｈとレサズリンか
らレゾルフィンを生成せしめる反応において、レサズリ
ンおよびレゾルフィンが可視部の特定の波長に吸収極大
を有するという性質を利用してＮＡＤ （Ｐ）Ｈを定量
する方法を見いだした。即ち、レサズリンは微アルカリ
性側で６００ｎｍ付近に吸収極大を有する青色物質であ
り、一方レゾルフィンは５７Ｏｎｍ付近に吸収極大を有
する赤色物質であるから、それぞれの吸収極大付近の波
長における吸光度を測定することによりＮＡＤ （Ｐ）
Ｈが定量される。ＮＡＤ （Ｐ）Ｈとレサズリンの反応
式を次に示す。
］−
レサズリンおよびレゾルフィンはそれぞれ吸光係数が小
さいため通常使用される分光光度針では微量定量が困難
なことがある。このような場合には反応液の希釈を必要
“とせず歩容量（３０〜２０（１）で測定が可能なマイ
クロプレート方式の分光光度計を用いることが好ましい
。
さいため通常使用される分光光度針では微量定量が困難
なことがある。このような場合には反応液の希釈を必要
“とせず歩容量（３０〜２０（１）で測定が可能なマイ
クロプレート方式の分光光度計を用いることが好ましい
。
本発明においてＮＡＤ （Ｐ）Ｈとレサズリンからレゾ
ルフィンを生成する反応の触媒として使用されるのは、
例えばジアホラーゼ、フェナジンメチルサルフェートで
あり、特に好ましくはジアホラーゼが用いられる。
ルフィンを生成する反応の触媒として使用されるのは、
例えばジアホラーゼ、フェナジンメチルサルフェートで
あり、特に好ましくはジアホラーゼが用いられる。
本発明によるＮＡＤ （Ｐ）Ｈの定量は、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを補酵素とする酸化還元酵素の活性の測定または該酵
素を用いた基質の測定に利用する゛ことができる。この
ような酸化還元酵素の例としては、乳酸脱水素酵素、ア
ルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルタミン
酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、α
−グリセロリン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素
、コレステロール脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、
ビロリン−５−カルボン酸還元酵素などが挙げられる。
Ｈを補酵素とする酸化還元酵素の活性の測定または該酵
素を用いた基質の測定に利用する゛ことができる。この
ような酸化還元酵素の例としては、乳酸脱水素酵素、ア
ルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルタミン
酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、α
−グリセロリン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素
、コレステロール脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、
ビロリン−５−カルボン酸還元酵素などが挙げられる。
実施例Ｉ ＮＡＤＨの定量
３ｍＭレサズリン１０ｐｆ！、２０１Ｊ／ｍｌ！ジアホ
ラーゼ（ベーリンガー社製）１０ｇ、ＩＭＩ−リス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０） ５４および標準試料として０〜
１．４ｍＭの各濃度のＮＡＤＨｌｏｍを混合し、水を加
えて全量を７０度としたのち、３７℃において１０分間
インキュベーションした。次いで、マイクロプレート方
式の三波長分光光度計（コロナ電気社製１ＭＴ Ｐ −
１２型）を使用して反応液の６１０ｎｍおよび５５０ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。結果を第１図の検量線に
示す。上記標準試料に代えて濃度未知の試料を用いて上
記と同様に操作を行い、得られた吸光度と上記検量線を
対比することにより試料 。
ラーゼ（ベーリンガー社製）１０ｇ、ＩＭＩ−リス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０） ５４および標準試料として０〜
１．４ｍＭの各濃度のＮＡＤＨｌｏｍを混合し、水を加
えて全量を７０度としたのち、３７℃において１０分間
インキュベーションした。次いで、マイクロプレート方
式の三波長分光光度計（コロナ電気社製１ＭＴ Ｐ −
１２型）を使用して反応液の６１０ｎｍおよび５５０ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。結果を第１図の検量線に
示す。上記標準試料に代えて濃度未知の試料を用いて上
記と同様に操作を行い、得られた吸光度と上記検量線を
対比することにより試料 。
中のＮＡＤＨが定量される。
実施例２ ＮＡＤＰＨの定量
実施例１において、ＮＡＤＨに代えてＮＡＤＰＨを用い
て同じように操作したところ、第１図と同じ検量線が得
られた。同様に濃度未知の試料を用いて上記と同じ操作
を行い、得られた吸光度と上記検量線を対比することに
より試料中のＮＡＤＰＨが定量される。
て同じように操作したところ、第１図と同じ検量線が得
られた。同様に濃度未知の試料を用いて上記と同じ操作
を行い、得られた吸光度と上記検量線を対比することに
より試料中のＮＡＤＰＨが定量される。
実施例３ オルニチンの定量への利用
０、ＩＵ／ｍｅオルニチン−ケト酸アミノトランスフェ
ラーゼ（大野製薬社製）５４．０−１０／ｍｌ！ピロリ
ンー５−カルボン酸還元酵素（大野製薬社製）５ｐＲ，
５０ｍＭα−ケトグルタル酸５ｇ、１００μＭジチオス
レイトール５越、４００μＭ ＮＡＤＨ１０＃、ＩＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） ５ｕおよび標準試
料としてＯ〜０．３ ｍＭの各濃度のオルニチン１（ｌ
をマイクロプレート（タック社製、ディスポーザルＵ型
、９６穴）に入れ、水を加えて全量を５Ｍとしたのち、
３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。次い
で反応液に２ｍＭレサズリン１０度および２００／ｍｅ
ジアホラーゼ１０ｕを添加して、さらに５分間インキエ
ヘーションしたのち、マイクロプレート方式の三波長分
光光度計を使用して反応液の６１０ｎｍにおける吸光度
を測定した。
ラーゼ（大野製薬社製）５４．０−１０／ｍｌ！ピロリ
ンー５−カルボン酸還元酵素（大野製薬社製）５ｐＲ，
５０ｍＭα−ケトグルタル酸５ｇ、１００μＭジチオス
レイトール５越、４００μＭ ＮＡＤＨ１０＃、ＩＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） ５ｕおよび標準試
料としてＯ〜０．３ ｍＭの各濃度のオルニチン１（ｌ
をマイクロプレート（タック社製、ディスポーザルＵ型
、９６穴）に入れ、水を加えて全量を５Ｍとしたのち、
３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。次い
で反応液に２ｍＭレサズリン１０度および２００／ｍｅ
ジアホラーゼ１０ｕを添加して、さらに５分間インキエ
ヘーションしたのち、マイクロプレート方式の三波長分
光光度計を使用して反応液の６１０ｎｍにおける吸光度
を測定した。
なおブランクテストは上記反応液よりピロリン−５−カ
ルボン酸還元酵素を除いた他は同様に操作した。測定結
果を第２図の検量線に示す。上記標準試料に代えて濃度
未知の試料を用いて上記と同様に操作を行い、得られた
吸光度と上記検量線を対比することにより試料中のオル
ニチンが定量される。
ルボン酸還元酵素を除いた他は同様に操作した。測定結
果を第２図の検量線に示す。上記標準試料に代えて濃度
未知の試料を用いて上記と同様に操作を行い、得られた
吸光度と上記検量線を対比することにより試料中のオル
ニチンが定量される。
発明の効果
本発明法により可視吸光光度計を用いる簡便な方法によ
り高感度なＮＡＤ （Ｐ）Ｈの定量が可能となった。ま
た、本発明法の波及的効果として試料中に共存する還元
性物質による妨害をうけにくい酸化還元酵素の測定法ま
たは該酵素を用いる生体体液成分の定量法が確立された
。
り高感度なＮＡＤ （Ｐ）Ｈの定量が可能となった。ま
た、本発明法の波及的効果として試料中に共存する還元
性物質による妨害をうけにくい酸化還元酵素の測定法ま
たは該酵素を用いる生体体液成分の定量法が確立された
。
第１図は本発明のＮＡＤＨ定量における検量線を表す図
であり、第２図は本発明のＮＡＤ （Ｐ）Ｈの定量法を
利用したオルニチンの定量における検量線を表す図であ
る。
であり、第２図は本発明のＮＡＤ （Ｐ）Ｈの定量法を
利用したオルニチンの定量における検量線を表す図であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまた
は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
を含む試料とレサズリンを触媒の存在下反応せしめて生
じた可視部における吸光度の変化を測定することを特徴
とする還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドま
たは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸の定量法。 ２ レサズリンに由来する６１０ｎｍにおける吸光度の
変化を測定する特許請求の範囲第１項記載の定量法。 ３ 反応により生成したレゾルフィンに由来する５５０
ｎｍにおける吸光度の変化を測定する特許請求の範囲第
１項記載の定量法。 ４ 触媒がジアホラーゼである特許請求の範囲第１項記
載の定量法。 ５ マイクロプレート方式の分光光度計を用いて吸光度
を測定する特許請求の範囲第１項記載の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21499484A JPS6191570A (ja) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21499484A JPS6191570A (ja) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6191570A true JPS6191570A (ja) | 1986-05-09 |
| JPH0553477B2 JPH0553477B2 (ja) | 1993-08-10 |
Family
ID=16664938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21499484A Granted JPS6191570A (ja) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6191570A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101324630A (zh) * | 2007-06-13 | 2008-12-17 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 乙醇诊断/测定试剂盒及乙醇的浓度测定方法 |
-
1984
- 1984-10-12 JP JP21499484A patent/JPS6191570A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.ANAL.TOXICOL=1984 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101324630A (zh) * | 2007-06-13 | 2008-12-17 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 乙醇诊断/测定试剂盒及乙醇的浓度测定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0553477B2 (ja) | 1993-08-10 |
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