JPS6193200A - 中性スフインゴリピドに対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、細胞膜グリココンジュゲート（ｇｌｙｃｏ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）に対する新規な七ツクローナル
抗体、その誘導体、これらの抗体及びその誘導体の製造
方法、これらの抗体を分泌するハイブリドーマセルライ
ン、このようなハイブリドーマの製造方法、モノクロー
ナル抗体又はその誘導体を含有する医薬組成物、並びに
癌の診断及び治療におけるモノクローナル抗体及びその
誘導体の使用に関する。

〔従来の技術〕

グリココンシュダートは炭水化物官能基を含有するパイ
オー分子、例えばグリコスフィンゴリピドのごとき糖脂
質、糖蛋白質（Ｎ−グリコジル化されたもの又は０−グ
リコジル化されたもの）、及びプロテオグリカンである
。グリコスフィンゴリピド（ＧＳＬ　）及び糖蛋白質は
生物学的膜の多数の機能の幾つかを担当する。

グリコスフィンゴリピドは３つの基本的構造単位、すな
わち塩基、脂肪酸、及び炭水化物から構成されている。

ＧＳＬのリピド成分は長鎖アミノアルコール、多くの場
合スフィンゴシン（ｓｐｈｌｎｇｏｓｉｎｅ）を含有し
、このスフィンゴシンにアミド結合を介して脂肪酸が連
結されている。この構造はセラミド（ｃｓｒａｍｉｄｅ
　）と称される。親水性炭水化物ユニットがグリコシド
結合によりスフィンゴシンの第１ヒドロキシ基に連結さ
れている。この炭水化物は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラ
クトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−７コース、Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサ
ミン、及び／又はＮ−アセチルニューラミン酸（シアル
酸）から構成されるモノサッカライド又は一般にはオリ
ゴサツカライドである。グリコスフィンゴリピドは一般
に原形質膜の外層葉（ｏｕｔｅｒｌ＠ａｆｌｅｔ　）中
に存在する。これらに幾つかの機能が帰属されている。

これらは膜に構造的剛性を付与し、膜を通してのイオン
の輸送に関与し、糖蛋白質ホルモン、リンフ才力イン、
細菌毒素等に対する受容器機能を示し、そして細胞表面
抗原であシ、そして細胞増殖及び細胞相互作用に関与す
るマーカーである。後者の性質は腫瘍形成性及び転移に
関連して研究されている。ＧＳＬ組成の変化が悪性と関
連し、そして少数のユニークなＧＳＬ抗原が腫瘍中にの
み見出されている。

腫瘍の診断及び免疫療法における価値ある手段を得ると
いう観点から、これらの抗原性グリコスフィンゴリピド
を含む腫瘍細胞表面構造に対して抗体が形成されている
。ハコモリ〔ツレチン・ドク’キャンサー（Ｂｕｌｌｅ
ｔｌｎ　ｄｕ　Ｃａｎｃｅｒ　）＋／４す。

７０．１１８（１９８３））は、発癌性形質転換に関連
する糖脂質の変化及びこれに関するモノクローナル抗体
を総説している。

独国出願公開第３２２８２３３号等は、ヒトにおける腫
瘍の治療のための抗体Ｒ−２４の使用を記載している。

この抗体は悪性黒色腫細胞に対して形成され、そしてガ
ングリオシド、すなわちシアル酸含有グリコスフィンゴ
リピドとして同定される抗原に特異的である。米国特許
第４，４４４．７４４号に記載されている癌胎児性抗原
に対して形成された抗体又はヨーロッパ特許出願第３７
９５３号に記載されている悪性腎細胞に対して向けられ
た抗体の幾つからまた、細胞表面膜の一体成分であるこ
とが示されているグリコスフィンゴリピドに特異的であ
る。グリコスフィンゴリピドの炭水化物残基と脱糖蛋白
質との関連性に基き、糖脂質に対して形成された抗体は
糖蛋白質をも認識し、この逆も成立する。

ケラ−及びミルスタインのハイブリドーマ技法〔ネイチ
ュアー（Ｎａｔｕｒｅ　）匝、　４９５　（１９７５）
：］は、高度に特異的な抗体の均一な集団、いわゆるモ
ノクローナル抗体を、再現性良く且つ理論的には無限に
、細胞培養物から製造することを可能にする。骨髄腫細
胞と、特定の抗原によってあらかじめ免疫された哺乳類
動物の肺臓から採取された抗体分泌性リンパ球との融合
は、イン−ビトロにおける無限の複製及び増殖と肺臓細
胞の抗体産生性とを合わせ持つハイブリド細胞をもたら
す。

従って、特定の抗原に対する個々の生物の免疫応答を分
離及び増幅すること、並びにハイブリドのイン−ビトロ
における永久的培養によりモノクローナル抗体を製造す
ることが可能である。

一般的技法は概念的にはよく理解されるが、特定のケー
スについては遭遇される多くの困難が存在し、そして変
法が要求される。事実、目的とするハイブリドーマが得
られるであろうこと、それらが遺伝的に安定で抗体が分
泌すること、又はこうして製造された抗体が目的の特異
性を有するであろうことの保証は存在しない。成功の程
度は主として免疫化において使用される抗原のタイプ及
び純度、免疫化の方法、細胞融合の技法、並びに特に特
定のハイブリドーマ細胞クローンの選択方法により影響
される。

〔発明の記載〕

この発明は、上皮細胞により産生される中性グリコスフ
ィンゴリピドと結合することを特徴とする新規なモノク
ローナル抗体及びその誘導体に関する。

特にこの発明は、悪性上皮細胞、例えば乳癌細胞、肺癌
細胞又は結腸直腸癌細胞、特に乳癌細胞により意生され
る中性グリコスフィンゴリピドに′結合するととを特徴
とするモノクローナル抗体及びその誘導体に関する。さ
らに、胎便から得られる中性グリコスフィンゴリピドに
結合するモノクローナル抗体及びその誘導体が好ましい
。

１０１８Ｓ１９．１．１．１０１ＢＳ６９．４．１０２
１Ｓ１１．２８．１０２２Ｓ２５．１７、及び１０２２
Ｓ２８．２４と称するモノクローナル抗体及びその誘導
体が特に好ましい。しかしモノクローナル抗体自体が特
に好ましい。

この発明のモノクローナル抗体の誘導体は、例えば抗体
断片、放射性ラベルされたモノクローナル抗体、モノク
ローナル抗体と細胞毒素、放射性核種錯化剤又は酵素と
の接合体である。

この発明のモノクローナル抗体の断片は、例えばＦａｂ
　ｔ　Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片であって、抗原
決定基に対する特異性を維持しているもの、すなわちグ
リコスフィンｆ　リビド混合物に対する親モノクローナ
ル抗体の特徴的結合・臂ターンを維持しているものであ
る。

放射性ラベルされたモノクローナル抗体は、例えば放射
性ヨウ素（１２１５Ｉ、１２５工、１５１１）、炭素（
１４ｃ　’）、硫黄（５５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）等
で一ナル抗体が好ましい。

この発明の抗体接合体は例えば、モノクローナル抗体又
はその断片と、細胞素剤及び制癌剤、例えばリシンのＡ
鎖又は関連ペプチド、アドリアマイシン、メントレキセ
ート、ビンクリスチン、ダウノマイシン、６−メルカゾ
トプリン、シトシン、アラビノシト、シクｏｉスフアミ
ド等との接合体、あるいはメタロセン又は金属キレート
、例えばデキストラン−アミン、カルＭン酸もしくはホ
スホン酸残基を担持するポリアルキレンイミン、例えば
ジエチレントリアミンペンタ酢酸等との接合体５７Ｃｏ
、９７Ｒｕ、　？９Ｒｕ又は９９ＴＣと錯体を形成する
）、あるいは酵素、例えばホースラディツシュ・千−オ
キシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシ〆−ゼ、グルコース−オキシダーゼ、グルコアミ
ラーゼ、カルボアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステ
ラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ又はグ
ルコース−６−ホスフエードプヒドロダナーゼとの接合
体である。このような接合体においては、抗体は細胞毒
素、放射性核種錯化剤又は酵素と直接に、又はスペーサ
ーもしくはリンカ−基により結合している。ヨーロッ、
ｐ４特許出願第８８６９５号に記載されているような血
清成分酵素のいずれかによる切断に対して感受性のリン
カ−又は結合を介して細胞毒性剤と連結されたモノクロ
ーナル抗体接合体が好ましい。

この発明のモノクローナル抗体及びその誘導体は上皮細
胞により産生される中性グリコスフィンカリヒトに結合
する。これらのグリコスフィンゴリピドは上皮細胞の細
胞膜中に導入され、又はそれらによって体液中に放出さ
れることができる。

この発明のモノクローナル抗体は、種々の組成のグリコ
スフィンゴリピド混合物に対するそれらの結合パターン
、種々の器官からの正常な組織サンプル及び悪性組織サ
ンプルの組織片及びそれに含まれる細胞タイプに対する
それらの結合能力、確立された腫瘍セルライン由来の全
細胞に対する結合能力、異る提供者からの唾液に対する
それらの結合能力、及びそれらの免疫グロブリンクラス
又はサブクラスについて分析される。

グリコスフィンゴリピド（ＧＳＬ）混合物に対するモノ
クローナル抗体の結合ノ々ターンは、例えば公知の方法
により、例えば溶剤抽出、溶剤分配及びクロマトグラフ
法により、種々の組織、例えば乳房、肝臓、腎臓、膵臓
、扁桃腺、さらに腫瘍組織、例えば乳房癌、肺癌等から
、赤血球及び他の細胞性分離源、例えば胎便、例えば新
生児の便から得られる。ＧＳＬ混合物を薄層クロマトグ
ラフィーにより分離し、完全なりロマトグラフィーノ譬
ターンをニトロセルロースに移す。との目的のため、薄
層クロマトグラフィーを適轟々溶剤、例えば水性低級ア
ルコールで湿し、そして多孔性ニトロセルロースのシー
ト上に圧し付ける。得られたニトロセルロース上のレプ
リカを、場合によってはストリップに切断し、そしてモ
ノクローナル抗体を含有する溶液と共にインキュベート
シ、そして抗体とニトロセルロース上に吸着されたグリ
コスフィンゴリピドとの免疫反応を当業界により公知の
方法により、例えば酵素に接合した第２抗体及びそれに
続く酵素基質を用いる発色により、又は放射性ラベルさ
れた第２抗体による発色により検出する。

この発明のモノクローナル抗体を、１９人の個個のヒト
由来の乳房癌生検体材料からのＧＳＬ混合物に対する結
合ノ々ターンについてのＧＳＬ−プロッティングにより
分析する。この発明のモノクローナル抗体は試験したほ
とんどのＧＳＬ混合物中の中性ＧＳＬに結合するが、ヅ
ングリオシド、すなわちシアル酸含有ＧＳＬには結合し
ない。抗原性ＧＳＬの炭水化物鎖のモノサッカライドの
およその数を表に示す。

異る組織片及びそれに含まれる細胞タイプに対するこの
発明のモノクローナル抗体の結合能力を、公知の方法、
例えば免疫組織化学的染色によ）決定する。この目的の
ため、正常な乳房、肝臓、腎臓、膵臓、肺、結腸及び扁
桃腺組織の、並びに結腸直腸、乳房、肺及び上皮のり腫
腫瘍組織の寒冷切片をこの発明のモノクローナル抗体と
インキュベートし、そしてこの発明のモノクローナル抗
体を識識しそして結合する酵素接合第２抗体により発色
せしめる。次に、酵素基質の適当な発色反応がモノクロ
ーナル抗体と組繊細胞表面膜中に含有されるグリココン
ジ、ダートとの免疫反応を可視化する。例外なく、結合
は上皮細胞膜に限定される。すなわち、他の細胞タイプ
、例えば線維芽細胞、内皮、赤血球、リンパ球、筋細胞
等の膜については観察されない。結果を例に集める。

乳癌、結腸直腸癌及び肺癌由来の確立された腫瘍セルラ
インの全細胞に対するこの発明のモノクローナル抗体の
結合能力を同様にして、例えば免疫組織化学的染色によ
り決定する。

既知のＡ、Ｂ、０及びレービス（Ｌ＠ｖｒｉｍ　）血液
グループを有する異る提供者の唾液に対するこの発明の
モノクローナル抗体の結合能力は、悪性上皮細胞上に見
出される抗原性グリココンジ、ダートと唾液上で発現さ
れる既知の血液群マーカーとの間の推定上の関連を明ら
かにするための助けとなシ、そしてさらに試験された抗
体の非−同一性を示す簡単な手段である。このアッセイ
は、この発明のモノクローナル抗体を認識しそして結合
する第２酵素接合抗体を使用する、ニトロセルロースシ
ート上の唾液斑点による公知のドツト−免疫結合アッセ
イに基礎を置いている。

この発明のモノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス
及びサブクラスは、よく知られた方法により、例えばク
ラス特異的第２抗体を用いる免疫拡散オークテルロニー
技法により決定される。

以下余白 表中、 １１／１９：合計１９中１１が陽性であることを示す。

ｎ、ｔ、　　：試験せず。

−：反応せず。

（＋）：疑わしい。

＋　　：弱い。

＋＋二十分に明瞭。

この発明のモノクローナル抗体及びその誘導体は、それ
自体公知の方法により得られ、この方法は、前記モノク
ローナル抗体を分泌するノ）イブリドーマ細胞を、 ａ）イン−ビトロ培養し、そして培養土清液からモノク
ローナル抗体を単離し、又は ｂ）適当な哺乳類動物中でイン−ビデ増殖せしめ、そし
てこの動物の体液からモノクローナル抗体を回収し、そ
して所望により、 Ｃ）得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換す
ることを特徴とする。

方法＆）のイン−ビトロ培養のために適当な培地は、標
抛的培地、例えば、場合によりては哺乳類動物血清、例
えばウシ胎児血清が補充されているドルベコ改変イーグ
ル培地又はＲＰＭ１１６４０培地である。モノクローナ
ル抗体の単離は、培養土清液中に含まれる蛋白質を硫酸
アンモニウム又はこれに類似するものにより沈澱せしめ
、次に標準的クロマトグラフ法、例えばグル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＮセルロース上での
クロマトグラフィー、又はイムノアフィニティークロマ
トグラフィーにより免疫グロブリンを精製することによ
り達成される。

多量の目的とするモノクローナル抗体は、方法ｂ）ＶＣ
よるハイブリドーマ細胞の増殖により得ることができる
。細胞クローンを、抗体産生腫瘍を増殖せしめる同系哺
乳類動物に注射する。１〜３週間後、目的とするモノク
ローナル抗体を前記哺乳動物の体液から回収する。１例
として、Ｂａ１ｂ／ｃマウス由来のハイブリドーマ細胞
を、場合によっては炭化水素、例えばプリスタンにより
前処理されているＢａｌｂ／ｅマウスに腹腔内注射する
。目的とするモノクローナル抗体を体液からそれ自体公
知の方法により、例えば硫酸アンモニウム又はこれに類
似するものにより蛋白質を沈澱せしめ、次に積率的クロ
マトグラフ法、例えばグル濾過、イオン交換クロマトグ
ラフ４−１ＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィ
ー、又はイムノアフィニティークロマトグラフィーによ
り免疫グロブリンを精製することにより単離する。

グリコスフィンゴリピドの抗原決定基に対する特異性を
維持しているモノクローナル抗体の断片、例えばＦａｂ
、　Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片は方法ａ）又はｂ
）により製造されたモノクローナル抗体からそれ自体公
知の方法により、例えばペプシンもしくはノぐノ臂イン
のごとき酵素で消化することにより及び／又は化学還元
によりラスルフィド結合を切断することにより得ること
ができる。

放射性ヨウ素によりラベルされたモノクローナル抗体は
、当業界において知られているヨウ素化法により、例え
ばモノクローナル抗体を放射性ヨウ化ナトリウム又はカ
リウム及び化学酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、
クロラミンＴ等、あるいは酵素性酸化剤、例えばラフト
ノ平−オキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ及びグ
ルコースによりラペルすることにより製造される。この
発明の放射性標識されたモノクローナル抗体はまた、段
階ａ）のイン−ビトロ培養の培地に、放射性ラベル核種
を加えることにより製造される。このようにラベルされ
た栄養素は、例えば放射性炭素（１４Ｃ）、トリチウム
（３Ｈ）、硫黄（３５Ｓ）又はこれに類するものを含有
し、そして例えばＬ−（１４Ｃ）−ロイシン、Ｌ−（’
Ｈ）−ロイシン又はＬ−（３５ｓ）−メチオニンである
。

この発明のモノクローナル抗体の接合体は、当業界にお
いてそれ自体公知の方法により、例えば方法ａ）もしく
はｂ）Ｋよ）製造されたモノクローナル抗体又は前記の
方法によって製造されたその断片を、接合の相手、例え
ば細胞毒性もしくは制癌性化合物、錯化金属キレート、
又は酵素と、カップリング剤、例えばグルタルアルデヒ
ド、過ヨウ素酸塩、Ｎ、Ｎ’　−ｏ−フェニレンジマレ
イミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−サ
クシンイミド、Ｎ−（３−（２’−ピリジルジチオ〕−
ゾロピオノキシ）−サクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’
−（３−ジメチルアミノゾロビル）、−カルがジイミド
、又はこれらに類似するものの存在下で反応せしめるこ
とにより製造される。モノクローナル抗体と、血清成分
酵素のいずれかによる切断に対して感受性のリンカ−を
介して連結された細胞毒剤との好ましい接合体を製造す
るためには、ヨーコツ／４特許出願第８８６９５号に記
載されている方法のいずれかが使用される。

この発明はさらに、上皮細胞により産生される中性グリ
コスフィンゴリピドに結合するモノクローナル抗体を分
泌することを特徴とするノ１イブリドーマセルラインに
関する。

この発明は特に、骨髄腫細胞とグリコスフィンゴリピド
により免疫された哺乳類動物の８９７２球とのハイブリ
ドであるセルラインに関する。好ましくは、これらのセ
ルラインは、マウス又はラット骨髄腫細胞とグリコスフ
ィンがリピドで免疫された同系マウス又はラットのＢリ
ンノ母球とのノ１イブリドである。

１９８４年８月１６日に寄託された１０１８８１９．１
１．１０２２Ｓ２５．１７．１０２１Ｓ１１．２８及び
１０１８Ｓ６９．４と称するハイブリドセルライン、並
びに１９８５年５月３１日に寄託されたハイブリドセル
ライン１０２２Ｓ２８．２４が特に好ましく、これらは
それぞれ―コレクチオン・ナチオナレ・デ・クルツレス
・デ・ミクロオルガニスメス（Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＮ
ａｔｉｏｎａｌｓ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｌｓｍｅｓ）７パスツール研究所、
パリ、にＮｏ．Ｉ−３３１、ｌ−３３２、ｌ−３３３、
ｌ−３３４、及び工４５３として寄託されている。これ
らのハイブリドセルラインは、マウス骨髄腫セルライン
ＳＰ　２１０−　Ａｇ　１４　トグリコスフインゴリピ
ドにより免疫されたＢａ１ｂ／ｅマウスの膵臓の８９７
２球とのハイブリドである。これらは安定なセルライン
であシ、それぞれ１０１８Ｓ１９．１１．１０２２Ｓ２
５．１７．１０２１８１１．２８．１０１８Ｓ６９．４
、及び１０２２８２８．２４と称するモノクローナル抗
体を分泌する。これらのセルラインは深冷凍結培養物中
に保持することができ、そして解凍及び場合によつては
再クローニングにより再活性化することができる。

この発明はさらに、上皮細胞により産生される中性グリ
コスフィンゴリピドに結合するモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマセルラインの製造方法に関し、こ
の方法は、適当な哺乳類動物をグリコスフィンゴリピド
混合物又はその抗原性誘導体により免疫し、この補乳類
動物の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、この融
合において得られたハイブリド細胞をクローン化し、そ
して目的とする抗体を分泌する細胞クローンを選択する
ことを特徴とする。

この発明の方法において哺乳類動物の免疫のために適当
な抗原はグリコスフィンゴリピド（ＧＳＬ）混合物及び
／又は免疫原性担体とこれらのＧＳＬ混合物との接合体
である。ＧＳＬ混合物は、公知の方法により、例えば低
級アルカノール、例えばメタノール、及びノ・ロダン化
低級アルカン、例えばクロロホルムを含有する溶剤混合
物による溶剤抽出により、場合によりては水の存在下で
、種々の組織、例えば乳房、肝臓、腎臓、膵臓、扁桃腺
組織、さらには腫瘍組織、例えば乳癌、肺癌及びこれら
に類似するものから、赤血球及び他の細胞性分離源、例
えば胎便、例えば新生児の便から得られる。

これらは場合によってはアセトンのごとき有機溶剤で前
処理することにより貯蔵脂肪を除去する。

ＧＳＬ混合物の好ましい分離源はヒトの器官の組織、特
に悪性組織、例えば乳癌生検材料、又は胎便である。場
合によっては、粗ＧＳＬ抽出物を、無機塩、例えば塩化
ナトリウム又は塩化カリウムを含有する水と、メタノー
ルのごとき低級アルコール及びクロロホルムのごときハ
ロゲン化低級アルカンを含有する有機溶剤混合物との間
での溶剤分配、及び／又はクロマトグラフ法、例えば順
相又は逆相シリカゲル、イオン交換樹脂及びこれらの類
似するもの上でのカラムクロマトグラフィーにより濃縮
及び精製する。

アセトンにより前処理された乳癌から又は胎便から、メ
タノール／クロロホルム／水混合物による抽出、水とメ
タノ−／Ｉ／／クロロホルムとの間の溶剤分配、及びシ
リカダル逆相クロマトグラフィーにより得られるＧＳＬ
混合物が好ましい。

ＧＳＬ混合物と免疫原性担体との抗原性接合体は、例え
ば高分子ポリペプチド、例えば血清アルブミン、ラテ、
クス粒子、全細胞又は細菌との接合体である。これらは
公知の方法により、ＧＳＬを担体に吸着させるか、又は
カルがジイミド、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、
Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マ
レイミドベンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ−（
３−（２’−ピリジルジチオツープロピオンオキシ）−
サクシンイミド又はこれらに類似するものを用いて連結
（カッ！リング）することにより製造される。

好ましい抗原は、細菌、特に親脂性表面を有する細菌、
例えばサルモネラ・ミネノタ（ハｂユｍｌハｍ１ｎｎ＠
５ｏｔａ　）　Ｒ５９５ラフ変異株細菌上に吸着し九〇
ＳＬ混合物である。サルモネラ・ミネソタＲ５９５の乾
燥重量とＧＳＬ混合物の重量との比率は好ましくは２：
１〜１０：１の間である。

免疫化の邂めの好ましい哺乳動物はマウス又はラットで
ある。Ｂａｌｂ／ｃマウスが特に好ましい。

免疫化は、例えば、ＧＳＬ接合体を３〜８回非経腸的に
、例えば腹腔内に及び／又は皮下に、１〜１０日の間隔
で、純粋なＧＳＬ混合物を基礎に計算した約１００μＶ
〜約５００μｇの量において注射し、そして次に２〜８
週間後に約３００μｇ〜約６００μｆのＧＥＬを追加免
疫注射することＫよシ行なわれる。注射は場合によって
はリンパ球生産を刺激するアジュバント、例えば完全又
は不完全フロインドアジュバントを含み、このアジュバ
ントは、ＧＳＬ接合体の代シに接合体化されていないＧ
ＳＬ混合物が注射される場合必須である。細菌上に吸着
し九〇ＳＬ混合物を注射する場合、追加のアジュバント
は与えられない。

最後の追加免疫注射の後２〜５日目日日取された免疫さ
れた哺乳類動物の抗体産生細胞、好ましくは肺臓細胞を
、融合側の存在下で、適当なセルラインの骨髄腫細胞と
融合せしめる。幾つかの適当外骨髄腫セルラインが当業
界において知られてイル。酵素ヒ？キサンチングアニン
ホスホリ一シルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ　）又
は酵素チミジンキナーゼ（ＴＫ）を欠失しておシ、従っ
てヒポキサンチン、アミノゾテリン及びチミジンを含有
する選択培地（ＨＡＴ培地）中で生存しない骨髄腫セル
ラインが好ましい。ＨＡＴ培地中で生存せずそして免疫
グロブリン又はその断片を分泌しない骨髄腫細胞及び誘
導されたセルライン、例えばセルラインＸ６３−Ａｇ８
．６５３又はＳｐ　ＶＯ−Ａｇ　１４が特に好ましい。

考慮される融合促進剤は、場合によってはＵＶ−不活性
化形であるセンダイウィルス又は他のノぐラミクツウィ
ルス、カルシウムイオン、リンレシチンのごとき界面活
性リピド、又はポリエチレングリコールである。好まし
くは、骨髄腫細胞を、１０００〜４０００の分子量の約
３０％〜約６０％のポリエチレングリコールを含有する
溶液中で、免疫された哺乳類動物の肺臓細胞の３〜２０
倍過剰量と融合せしめる。

融合の後、細胞を選択培地中に再懸濁しそして培養する
。これによりハイブリドーマ細胞のみが生存する。なぜ
なら、これらは、骨髄腫細胞に由来するイン−ビトロで
成育及び増殖する能力と、免疫された哺乳類動物の抗体
産生肺臓細胞に由来するＨＡＴ培地中で生存するために
必須の欠落した）ＩＧＰＲＴ遺伝子及びＴＫ遺伝子を合
わせ持つからである。

ハイブリドーマ細胞の拡大のための適当な培地は標準的
培地、例えばドルベコ改変イーグル培地、最少必須培地
ＲＰＭＩ　１６４０培地等であシ、場合によっては血清
、例えば５〜１５％のウシ胎児血清が補充される。好ま
しくは、細胞増殖の初期においてフィーダー細胞、例え
ば正常マウス腹腔内滲出細胞、肺臓細胞、骨髄マクロフ
ァージ、又はこれらに類似するものを添加する。培地に
規則的な間隔で選択ＨＡＴ培地を補充することにより正
常骨髄腫細胞がハイブリドーマ細胞上に増殖するのを防
止する。

ハイブリドーマ細胞培養上清を、好ましくはエンデイム
イムノア、セイ又はラジオイムノア、セイを用いて、例
えばＧＳＬプロッティングにより目的とするモノクロー
ナル抗体についてスクリーニングする。陽性ハイブリド
ーマ細胞を、例えば限界稀釈法により、好ましくは２回
以上クローニングする。クローン化されたセルラインは
常法に従って凍結することができる。

この発明のモノクローナル抗体及び／又はその誘導体は
、上皮細胞膜からのグリココン＝）：、ダートの定性及
び定量測定及び／又は精製のために有用である。

例えば、モノクローナル抗体又はその誘導体、例えば酵
素接合体又は放射性誘導体は、例えばグリコスフィンゴ
リピドの抗原決定基とモノクローナル抗体との間の結合
相互作用に基く任意の公知のイムノア、セイにおいて使
用することができる。

これらのアッセイの例として、ラジオイムノアッセイ、
エンデイムイムノアッセイ、イムノフルオレッセンス、
ラテックス凝集、及び血球凝集を挙げることができる。

これらのイムノア、セイは、例えば、上皮細胞膜のグリ
ココンシュダート含量の定性的及び定世的変化をもたら
す発癌性形質転換の診断において有用である。

上皮細胞膜からのグリココンジュゲート、例えば糖蛋白
質は、この発明のモノクローナル抗体を用いるイムノア
フィニティークロマトグラフィーにより精製することが
できる。モノクローナル抗体又はその断片を有機又は無
機性の適当な担体、例えば架橋されたアガロース、適当
に官能化された形のデキストラン又はポリアクリルアミ
ドに、場合によっては活性化した後に、画業界において
知られている一般的方法を適用して結合せしめる。

例えば、活性化されたエステル官能基を担持する担体を
水性緩衝液に懸濁し、モノクローナル抗体又はその断片
の溶液と混合し、デ過し、再懸濁し、洗浄して過剰のモ
ノクローナル抗体を洗浄し、そして無関係の溶液で処理
して担体の遊離反応性部位をプロ、りする。この抗体被
覆担体を用いて上皮細胞膜からのグリココン−）ユグー
トを選択的に結合せしめる。次に、場合によっては追加
の無機塩を含有する種々の緩衝液により脱着することに
よって精製された形で注目のグリココフジ５Ｌダートを
含有する画分を得る。

この発明のモノクローナル抗体及び／又はその誘導体は
さらに癌の診断及び治療に有用である。

例えば、との発明のモノクローナル抗体の放射性標識さ
れた誘導体は、ラジオスキャニング法により哺乳動物に
おける一次腫瘍及び転移腫瘍を見出するために使用する
ことができる。この目的のために、放射性抗体を例えば
静脈内に注射し、そしてとの哺乳類動物をガンマ−イメ
ージヤニを用いて一定間隔でスキャニングする。抗原性
ＧＳＬを発現する腫瘍は他の組織よシも多くの放射性抗
体を取シ込み、そしてガンマ−イメージングカメラで明
瞭に認識されるであろう。好ましくは１３１１でラベル
されたモノクローナル抗体を、体重１に９３シ１５〜３
０μＣ１を示す３〜８μｆの量においてラジオスキャン
ニングのために使用する。

さらに、モノクローナル抗体それ自体及び特にその誘導
体、例えば細胞毒性化合物又は制癌化合物との接合体は
、癌、特に抗原性ＧＳＬを発現する乳癌の治療のために
使用することができる。哺乳類動物のための薬用量は、
患者の状態及び投与方法に依存して、モノクローナル抗
体自体については体重ｋｇ当クシ約１ダ〜１０ダあ仄そ
して細胞毒性剤との接合体については体重ｂａす０．１
〜〜１０ダである。

モノクローナル抗体及び／又はその誘導体はまた、骨髄
自己移植片中の癌細胞の免疫的除去においても有用であ
る。この目的のため、多量の薬剤及び／又は対照処理を
受ける患者の骨髄吸引採取物を補体の存在下でこの発明
のモノクローナル抗体とインキュベートし、細胞毒性剤
とのモノクローナル抗体接合体とインキュベートし、又
はＴ、Ｇ、）リレーペン等〔ランセｙ　）　（Ｌａｎｃ
ｅｔ　）　１９８４　、７０）により記載されているよ
うにしてマグネ、ト微粒球（ｍａｇｎｅｔｉｃｍｉｃｒ
ｏｇｐｈｅｒｅｓ　）と接合したモノクローナル抗体で
処理する。この処理は、骨髄幹細胞を害することなく腫
瘍細胞を溶解し又は除去し、従りてこれを自己移植のた
めに使用することができる。

この発明はさらに、上皮細胞により産生される中性グリ
コスフィンゴリピドに結合するモノクローナル抗体、又
はその誘導体を医療的に有効な量において固体又は液体
の有機又は無機の医療担体と供に含んで成る医薬に関す
る。

非経腸的投与のための医薬が好ましい。筋肉内、皮下又
は静脈内投与のための製剤は、例えば等張水性溶液又は
懸濁液であつて、場合によっては使用直前に凍結乾燥製
剤又は濃縮製剤から調製される。医薬製剤は無菌化する
ことができ、そして例えば成分を防腐、安定化、湿潤、
乳化又は可溶化するための添加物、浸透圧調整塩、緩衝
剤及び／又は粘度調整用化合物、例えばす）　ＩＪウム
カルデキシセルロース、デキストラン、ホリヒニＡ／　
ヒ。

リドン、又はゼラチンを含有することができる。

この医薬は当業界において公知の技法により、例えば常
用の混合、溶解又は凍結乾燥によフ製造され、そして約
０．Ｏ１％〜約５０−の活性成分を含有する。注射剤は
処理され、アングル又は／ぐイアルに充填され、そして
当業界において公知の方法に従い無菌条件下で密封され
る。

次に例によりこの発明を説明する。但し、これによりこ
の発明の範囲を限定するものではない。

例において使用される略号は次の意味を有する。

ＡＢＣ３−アミノ−９−エチルカルバゾールＧＳＬ　　
　グリコスフィンゴ９リピドＨＡＴ　　　ヒポキサンチ
ン／アミノグテリイ／チミジンＨＰＴＬＣ高性能薄層ク
ロマトグラフィーＰＢＳ　　　リン酸緩衝化塩溶液 ＴＢＳ　　　）リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン緩衝化塩溶液 Ｔｒｉｍ　　　）リス−（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン１．１、抽出 ニストロダン受容体決定のために採取した生検組織サン
プル由来の細胞性沈降物を、乳癌を有することが組織学
的に確定診断された多数患者から得る。

典型的な実験において、１９０個の個々のサンプルをポ
リスチレンチューブ中の凍結塊として得、ドライアイス
中でさらに冷却し、そしてプラスチックをハンマーで破
砕する。集められた沈降物（湿重量１６９ｆ）を凍結乾
燥し、そして３３ｆの乾燥重量を得る。ツルパル組織プ
レンダーを用いて４℃にてアセトン中で繰シ返しホモジ
ナイズし、そして次にヂ遇することにより、前記の乾燥
物から貯蔵脂肪を除去する。残留固形物はなお多量の極
性脂質、例えばリン脂質及びグリコスフィンゴリピドを
含有する。これらを、クロロホルンメタノ−＃２　：　
１　（Ｖ／Ｖ）　２００ｍ／を用いて３回、ソシてクロ
ロホルム／メタノール／水１：１：０．２（Ｖ／Ｖ／Ｖ
）　２００ｍ７！を用いて２回抽出する。

１．２．フォルシ、　（Ｆ６１ｃｈ　）分配多量のリン
脂質、及びオリがサツカライド鎖中に４個よシ少ない糖
を有するグリコスフィンゴリピドを、７オルシユ〔Ｔ、
サイト、及びＳ、ハコモリ、ジャーナル・オツ・リピド
・リサーチ（Ｊ。

Ｌｌｐｌｄ　Ｒａｇ、　）ユ主、２５７（１９７１）：
ＩＫ従う変法によって、極性グリコスフィンゴリピドか
ら分離する。例１．１からの集められた抽出物を減圧下
４０℃にて蒸発せしめ、そしてスト、バー付ガラスシリ
ンダー中でクロロホルム／メタノール２：１　（Ｖ／Ｖ
　）　９０ｍＪ中に再溶解する。１５ｍＪ？の水を加え
、そして溶液を激しく撹拌する。１５分分間−た後、相
を分離する。クロロホルムを主とする下相をクロロホル
ム／メタノール／　０．１％ＫＣ１水溶ｉｆ　：　１０
　：　１０　（Ｖ／Ｖ／Ｖ＞によ＃）３回抽出する。

ｌ、３１皿皿ヱ旦二上ｒｙｙユニ 塩及びその他の水溶性汚染物を除去するため、例１．２
からの一緒にした上相を蒸発せしめ、水に入れ、そして
７−のりクロプルプ（Ｌｉｃｈｒｏｐｒｓｐ）（商標）
　ＲＰ１８　（メルクＦ、Ｒ，Ｇ、）を含むガラスカラ
ムに適用する。水で水分に洗浄した後、極性グリコスフ
ィンゴリぎド画分を１０−のメタノールで溶出し、そし
て次にクロロホルム／メタノール２　：　１　（Ｖ／’
Ｖ　）　１０１１１１ｆ溶出スル。収Ｊｌカ約３゜即、
すなわち組織乾重量の０．１チである。

１．４　　薄層クロマトグラフ　− ＧＳＬ調製物の純度をシリカダル薄薄層クロマトグラフ
イーより試験し、そして次に、プレートにオルシノール
／硫酸試薬を噴霧して糖含有化合物全可視化し〔Ｌ、ス
ベンナーホルム、ジャーナル・オｆ−二、　−”ケミス
トリー（Ｊ、　Ｎｓｕｒｏｃｈｅｍ、）１．４２（１９
５６）、又は７オスプレイ（Ｐｈｏｓｐｒａｙ　）（ｉ
ｎ）（スベルコ社、ヘレ７オ／テｒ　Ｐａｔ　米国：Ｊ
、Ｃ，ディトマー及びＲ，Ｌ、レスター、ジャーナル・
オプ・リピド・リサーチ（Ｊ、Ｌｉｐｉｄ　Ｒ＠Ｉ　）
　、旦：１２６（１９６４）］を噴霧してリン脂質を検
出する・シリカゲル６０　ＨＰＴＩ、Ｃプレート（サイ
ズ５×５圀。

ソルベント層の厚さ０．２４餌、メルク、　Ｆ、Ｒ，Ｇ
、）を用いる。脂質サンプルをクロロホルム／メタノー
ル２　：　１　（Ｖ／Ｖ）　１０〜２０　ｔｓｌに溶解
し、そして自動サンプルアプリケーター・モデル・リノ
マ）Ｉｌｌ（カマグ、スイス）を用いて４副の長さのス
トリークとしてプレートに適用する。溶媒系は、１　ｍ
Ｍ　ＣａＣＡ２　’５ｒ　含有するクロロホルム／メタ
ノール／水５５　：　４５　：　１０　（Ｖ／Ｖｙ’Ｖ
　）　ｆある。展開されたプレートは、種々のモノサッ
カライド含量の炭水化物残基を有するＧＳＬ混合物の典
型的なノ（ターンを示す。非−グリコスフィンゴリピド
物質は痕跡のみ存在する。

以下余白 例２．胎便からのグリコスフィンゴリピドの単離種々の
個体からの新生児の便をおしめからかきとシ、そして例
１に記載したのと正確に同じ方法により処理する。但し
、例１．１のアセトン抽出段階を省略する。収率は乾重
量の約０．２％である。

グリコスフィンゴリピド（ＧＳＩ、　）の組成及び純度
を例１．４に記載したようにして決定する。

例１又は２からの′！ｌｌ製されたＧＳＬを凍結乾燥及
び酢酸処理したサルモネラ・ミネソタＲ−５９５細菌［
Ｃ，ガラレス、０．リュデリッチ及び０・ウエストファ
ル、ヨーロピアン・ジャーナル・オプ・ビオケミストリ
ー（Ｅｕｒ　、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ−）　２４　＊　１
１６（１９７１）に吸着せしめて脂質抗原の免疫原性を
増強する。この目的のため、５０ｍｇの細菌（乾燥重量
）を、２５０ｍの丸底フラスコ中で、１０■のＧＳＬを
含有するクロロホルム／メタノール２：１（Ｖ／Ｖ）　
１００　ｍ７に懸濁する。最高速度で回転するロータリ
ーエバポレーターを用いて、溶剤を室温にて蒸発せしめ
る。ＧＳＬで覆われた細菌をガラス壁からかき取り、そ
してリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中に２．４〜毬の濃
度で懸濁する。顕微鏡的評価において不定形の塊及び単
一細菌が観察される。

８．２，２１１１作 ４匹の雌性Ｂａ１ｂ／ｃマウスに、それぞれ、０日にｌ
ｏＯμ？、４日に２００　ｐｆ、７日に３００μｒ。

そして１１日に４００μｆのＧＳＬを含有するＧＳＬ被
覆細菌を腹腔的注射する。１９日目にマウスから眼窩採
取し、そして例６に記Ｊ威したＧＳＬ−プロッティング
系を用いて、抗−〇ＳＬ血清活性について試験する。３
６日目に４００μｇのＧＥｉＬを含有するサンプルの追
加免疫注射を行い、そして４日後にマウスを殺す。

８．８．細胞融合 すべての融合実験は、Ｇ、ケラ−及びＣ，ミリスタイン
〔ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ　）　２５６　、４９５
（１９７５））（７）方法に従−＞−ｃ、非分泌性ＳＰ
２１０−Ａｇ１４骨髄腫系（Ｍ、シュルマン、Ｃ，Ｄ、
ウイルデ及びＧ、ケラ−、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ
）２７６゜２６９（１９７８））を用いて行う。１０８
個の膵臓細胞を１０個の骨髄腫細胞と、１ｄの５０チポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ１５００．セルパ）の存
在下で行う。洗浄した後、細胞を４８１１Ｌｌの標準ド
ルベコ最少必須培地（ギブコム０４２２５０１）Ｋ再ａ
濁する。１５％ウシ胎児血清及び融合当たシ３ＸＩＯ個
の正常マウス腹腔滲出細胞をフィーダー細胞として加え
る。細胞を４８Ｘ１ｍのコスタ−ウェルに分配し、そし
て１週間に３〜４回、３〜６週間にわたりて、標準ＨＡ
Ｔ選択培地を供給する。

ハイブリドーマ細胞の増殖が可視的になったとき、上清
液をＧＳＬへの結合について試験する（例６）。

ハイブリドーマ細胞のクローニングを、ミクロタイター
プレート中での限界稀釈法により行う。上清を、例７に
記載されている固相エンデイムイムノアッセイにおいて
、ＧＳＬへの結合について試験する。すべてのハイブリ
ドーマ系を少なくとも１回クローン化する。

ｆｌＪ４．　　モノクローナル抗体の　離及び精製８〜
１０週齢のＢａ１ｂ／ｅマウス（ティーファームシセル
ン、スイス）を０．３コのプリスタン（アルドリッチ）
を腹腔内投与することにより前処理する。

２〜３週間後、２〜５Ｘ１０’個のクローン化ハイブリ
ドーマ細胞及び０．２　ｘｉのプリスタンを腹腔内接種
する。８〜１０日後、腹水を集め、８００Ｘｔで遠心分
離し、そして−２０℃にて貯蔵する。

解凍した腹水を５０００ｘｒにて６０分間遠心分離する
。表面に浮かぶ脂肪層を注意深く除去し、そして蛋白質
濃度を１０〜１２−の濃度に調整する。０℃にて０．９
容量の飽和硫酸アンモニウムを滴加することによって粗
免疫グロブリンを沈減せしめ、そして２０ｍＭ　Ｔ　ｒ
ｉｍ　−ＨＣ２１５０ｍＭ　ＮａＣｔ（ｐＨ７，９）に
溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析する。２０　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣＬ／　２５〜４００ｍＭＮａＣｔ
（ｐＨ７，９）の緩衝液グラジェント系を用いルＤＥＡ
Ｅ−セルロース（ワットマン）クロマトグラフィーによ
り免疫グロブリンＧ画分を得る。この免疫グロブリンＧ
を硫酸アンモニウムにより再び沈澱せしめ、そして１０
１ｎν寥の濃度でＰＢＳに溶解する。

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドドル電気泳
動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ　）は、モノクローナル抗体１０
１８Ｓ１９．１１．１０１８Ｓ６９．４．１０２１Ｓ１
１．２８．１０２２Ｓ２５．１７、及び１０２２８２８
．２４について、９５チよシ高い純度を示す。

Δ玉　モノクローナル　　のクラス　°サブ　−スの決
定 クローン化されたハイブリドーマ細胞にょシ産生される
モノクローナル抗体のクラス及びす“プリラスをエンデ
イムイムノアッセイにおいて決定する。５０μ１ＯＰＢ
Ｓ中クラス−又はｔｆクラス特異的血清のラビット免疫
グロブリン標品１μｆ／ウェルで被覆する。グレートの
遊離結合容量を、０．２％（Ｗ／’／）のＮａＮ　３を
含有するＰＢＳ　（ｐＨ７，４）中１％ウシ血清アルブ
ミンの緩衝液にょシ飽和する。モノクローナル抗体を含
有するサンプル１°ｏ。

μｌをウェル中で３７℃にて１時間インキ−ベートする
。グレートをＰＢＳで洗浄し、そしてグレートを被覆す
るのに使用したのと同じ特異性を有する、ホスファータ
ーゼに接合したラビット免疫グロブリン標品と共に３７
℃にて１時間インキュベートスル。酵ＩＡ基質ｐ−ニト
ロフェニルホスフェートＣＯ，５ｒｎＮｉ　ＭｇＣｌ２
及び０．０２％（ｗ／Ｖ　）のＮａＮ３を含有するジェ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ９，８）中１　ｍｇ／ｒｎ
ｌ　］の溶液と共にインキュベートすることにより、固
定化された酵素を発色させ、そして４０５ｎｍにおいて
光学濃度を測定する。

例１．４に記載したようにして、ＨＰＴＩＣプレート上
での薄層クロマトグラフィーによ、！７　ＧＳＬ混合物
を分離し、そして分離されたＧＳＬの全パターンをニト
ロセルロースに移すことによりブレートからレプリカを
調製する。とのＧＳＬ−プロ、ティングアッセイはスク
リーニング目的のために特に便利である。具体的には、
例１に従りて調製したヒト乳房生検体ＧＳＬ　１００μ
ｇを１０側の長さのストリークとして５×１０ｃＩｎサ
イズのＨＰＴＬＣプレートに適用する。例１．４の溶媒
系で分離した後、プレートを乾燥する。軟質の鉛筆を用
いて、後で方向付けするためのマーカーとして線を引く
。表面に液滴を形成することなく湿シが調度見えるよう
になるまで、グレートにインゾロパノール／水（２：１
）の溶液を噴霧する。このプレートをすぐに１、ｔｑ　
リエチレンシートに支持されたわずかに大きなニトロセ
ルロースシートＣＨＡＷＰＯＯ（商標）　、　ミ＋）ボ
ア〕上に１分間にわたシ圧し付ける。余ったニトロセル
ロースを切除し、そしてレプリカを自然乾燥する。この
シートを、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｔ／１５０　
ｍＭ　ＮａＣｔ／　５　ｍＭ　ＭｇＣＬ２／　０．１５
　ｍＭｃａ（ｔ２を含有する緩衝液（ＰＨ７，４ＴＢＳ
）中で再加水する。

次に、シートをＴＢＳ中１０チウマ血清と共に４０℃に
て１時間インキュベートして過剰の結合容量をブロック
する。

シートを、それぞれが分離されたＧＳＬの同じパターン
を担持する２ｍ幅のストリップに切断する。

ストリップを、適轟なインキュページ、ントレイとして
機能するマルチピぜッ）　ＩＪデー？イヤーインサート
（グイナテクラがラドリーズ社、アレキサント９リア、
Ｖａ＋米国）中で、例えば例８．３からのハイブリドー
マ上清液と共に２時間インキュベートする。ストリップ
をＴＢＳで５分間３回洗浄し、そしてホースラディツシ
ュパーオキシダーゼとマウスＩｇＧに対して向けられた
ヒツジ免疫グロブリントノ接合体（カベルラデラトリー
ズ社、コクランビレ、米国）　［ＴＢＳ中１０　％　（
Ｖ／Ｖ）　ｒ）−ｙ血清によりラ００倍稀釈されたもの
〕と共にさらに１時間インキュベートする。ＴＢＳ中で
前記のようＫして洗浄した後、結合した接合体を、４−
クロロ−１−す７）−ルのパーオキシダーゼで触媒され
る酸化により、青色不溶性沈着物に可視化する。

基質４−クロロ−１−ナフト−／Ｉ／はジメチルホルム
アミド中１　％　（ｗ／Ｖ　）溶液からＴＢＳ中に５０
倍に稀釈し、そして過酸化水素を、最終濃度がｏ、ｏｏ
ｓ％（ｗ／Ｖ）となるように加える。２０分間後、水で
洗浄することにより反応を停止する。陽。

性反応の場合には１〜複数個のバンドが見られる。

異る染色パターンは異る抗体の存在を示唆する。

個々の抗体の特徴付けにおいて使用されるＧＳＬ−ブロ
ッティングアッセイのため、１人の患者からの組織サン
プルからのヒト乳房生検体ＧＳＬ　５μｆをＨＰＴＬＣ
グレートに適用し、そして上記のようにして処理・する
。

９６ウエルポリ塩化ビニルミクロタイタープレートに、
例１に従って調製された乳房痛止検体サンプルからのＧ
ＳＬ抽出物２５μｌのエタノール中つェル当り２００ｎ
Ｆにより被覆する。ウェルを自然乾燥し、そしてＴＢＳ
　（ＴＢＳの組成は例６を参照のこと）中１％（Ｖ／Ｖ
）のウマ血清により完全に満たす。１時間後、プレート
をＴＢＳにより洗浄し、そしてモノクローナル抗体につ
いて試験すべき溶液５０μｌを加える。３時間後、プレ
ートを洗浄し、そして酵素を連結した第２抗体を含有す
る試薬５０μｌを加える。仁の試薬は、アルカリホスフ
ァターゼが接合したマウス免疫グロブリンに対するヤギ
抗体ＣＴＢＳ中１　％　（Ｖ／Ｖ　’）ウマ血清中に１
０００倍稀釈したもの〕から成る。１時間後、プレート
を４回ＴＢＳで洗浄し、そして例５に記載されているよ
うにして、１０チジ工タノールアミンＭ、衝液中酵素基
質ｐ−二トロフェニルホス７エートにより発色する。

寒冷保存された、又はホルマリン固定された正常乳房、
肝臓、腎臓、膵臓、肺、結腸及び扁桃腺組織から、並び
に結腸直腸、乳房及び肺癌又は上皮のう腫から常法によ
り５〜１０μｍの寒冷切片を調製する。パラフィン封入
した組織は適当でない。

アルコールを含有する溶剤中でのインキュページジン中
にＧＳＬが失われる危険があるからである。

寒冷切片を５０℃にて５分間乾燥し、氷冷アセトン中で
５分間脱脂し、再び乾燥し、そしてＰＢＳ中１０％（Ｖ
／Ｖ）クマ血清と共に前インキュベートする。３０分間
後にスライドをＰＢＳにより５分間洗浄する。モノクロ
ーナル抗体について試験すべきハイブリドーマ上清液又
は他のサンプル（約４００μ１１組織切片を覆うのに十
分な量）を加える。１時間後、スライドをＰＢＳにより
３回洗浄し、そして例６に記載されているパーオキシダ
ーゼ接合第２抗体を加える。３０分後、スライドを上記
のように洗浄し、そして３−アミノ−９−エチルカルバ
ゾール（ＡＥＣ）で発色させて赤色沈着物を得る。ト１
γ素基質溶液は、１００部の０．１Ｍ酢酸ナトリウム水
溶液及び４０部の０．１Ｍ酢酸水溶液を混合することに
より調製された酢酸ナトリウム緩衝液により２０倍稀釈
されたジメチルホルムアミド中４■／ａのＡＥＣの新し
く調製されそして濾過された溶液から成る。過酸化水垢
濃度を０．０１４％（Ｗ／Ｖ）に調整する。スライドを
暗中１５分間インキュベートし、酢酸緩衝液で３回洗浄
し、そして乾燥する。切片をグリセリン−ゼラチン（２
５，０）中に入れ、そして顕微鏡で観察する。第２抗体
のみとインキュベートした切片、無関係な第１抗体とイ
ンキュベートした切片、及び内在性パーオキシダーゼ活
性を評価するために抗体と全くインキ−ベートしなかり
た切片から成る適当な対照を含めなければならない。

一倒」ユ　生細胞上細胞表面染色 乳房、結腸直腸及び肺由来の付着性癌セルラインを、標
準的培養法に従って９６ウ工ル組織培養プレート中で増
殖せしめる。細胞を、モノクローナル抗体について試験
すべきハイブリドーマ上精液又は他のサンゾル１００μ
ノとインキュベートし、そして洗浄し、パーオキシダー
ゼ接合第２抗体と・共にインキ−ベートし、そして例８
に記載されているようにしてＡＢＣにより発色させる。

細胞が失われるのを防止するため、洗浄段階は液を完全
に除去しないで注意深く行う。染色された細胞を、ＡＥ
Ｃによる発色に続く最終洗浄段階の直後に倒立顕微鏡に
より観察する。

試験されたセルラインの詳細は次の文献中に見ることが
できる。

ゴＴ−２０：　Ｅ、Ｙ、ラスファルダース及びり、オセ
ロ。

ジャーナル・オブ・デ・ナショナル・キャンサー・イン
スティテユート（Ｊ。

Ｎａｔｌ　−Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、）　２１　、１
１３１　（１９５８）”。

ＭＣＦ−７：　Ｈ，Ｄ、ソール等、ジャーナル・オプ・
デ・ナショナル・キャンサー・インスティテ、　−）　
（Ｊ−Ｎ’ａｔ１．　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｉｎ５ｔ・）５
Ｌ１４０９（１９７３）； ＺＲ−７５−１二Ｒ，カイリュー等、ジャーナル・オブ
・デ・ナショナル・キャンサー・インスティテｚ　　）
　（Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎａｔ→旦、６６
１（１９７４）： ＭＤＡ−ＭＢ２３１　：　Ｌ、Ｗ、　ｘ　ン）ｔ’ル等
、キャ７サー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ＠ｓ−）　
３８　＋３３５２（１９７８）：５Ｗ１２２２ＮＵ及び
５Ｗ９４８ＮＵ　：　Ａ、ライゴピッッ、ヒユーマンチ
ューモア・セルス・イン−ビトロ（Ｈｌｍａｎ　ｔｕｍ
ｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）＋（Ｊ、フォグ
［集）、プレナムプレス、ニューヨーク、１９７５．２
３頁； Ａ　５４９　：　Ｍ、リーベル等、インターナショナル
・ジャーナル・オツ・キャンサー（Ｉｎｔ−Ｊ−Ｃａｎ
ｃｓｒ　）　１７　、６２（１９７６）：ＭＢＡ９８１
２　：　Ｇ、Ｊ、　）グロ、Ｃ，フライリング及びＪ、
Ｅ、デラクロ、プロシーデインダス・の放射能の直接計
数及び他の組織の放射能との比較によって決定する。例
１３に記載されているようにして処理された動物の器官
及び液中に存在する比放射能（組織の重量当たシ放射能
ｅｐｍ／１９　）は１０５０（乳房癌）、７０（膵臓）
、１０７（腎臓）、１８２（肺）、５８（腸）、１０６
（肝臓）、及び４８８（血液）である。これらの状態を
さらに、無関係な放射性ラベルされた抗体で処理された
動物からの器官及び血液中の比放射能と比較する。

均一な厚さく１０〜４０μｍ）の寒冷切片を、切株した
器官及び腫瘍から調製する。スライドを５０℃にて５分
間乾燥し、ＰＢＳ中で５分間洗浄し、乾燥し、そしてＸ
線フィルム（クルトロフィルム−３Ｈ１商標、ＬＫＢ、
プロンマ、スウェーデン）に接触せしめる。腫瘍の局在
の程度が、現像されたフィルムの黒化を、正常な組織に
、及び無関係な放射性ラベルされた抗体で処理された動
物からの組織に暴露されたフィルムと比較することによ
り判定される。典型的には、正常な組織に暴露されたフ
ィルム上では均一なわずかな黒化が観察され、そして例
１８．１に記載したようにして処理された動物の腫瘍組
織に暴露されたフィルム上では強い、しばしば不規則な
黒化が観察される。

例１４．注射用溶液 例４に従って調製された１２０叩のモノクローナル抗体
１０１８８１９．１１を５−の生理的塩溶液に溶解する
。溶液を細菌学的フィルターに通し、そしてＦ液を無菌
条件下でアンプルに充填する。このアンプルを、好まし
くは冷却下、例えば−２０℃にて貯蔵する。

モノクローナル抗体１０１８Ｓ６９．４．１０２１８１
１．２８．１０２２Ｓ２５．１７．１０２２８２８．２
４、又は抗体１０１８８１９．１１とりシンＡとの接合
体（例１１）を含有するアンプルを同様にして製造する
ことができる。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、上皮細胞によって産生される中性グリコスフィンゴ
   リピドに結合することを特徴とするモノクローナル抗体
   及びその誘導体。 ２、悪性上皮細胞により産生される中性グリコスフィン
   ゴリピドに結合することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載のモノクローナル抗体及びその誘導体。 ３、哺乳類動物癌細胞により産生される中性グリコスフ
   ィンゴリピドに結合することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載のモノクローナル抗体及びその誘導体。 ４、胎便から得られる中性グリコスフィンゴリピドに結
   合することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のモ
   ノクローナル抗体及びその誘導体。 ５、１０１８Ｓ１９．１１、１０１８Ｓ６９．４、１０
   ２１Ｓ１１．２８、１０２２Ｓ２５．１７及び１０２２
   Ｓ２３．２４と称する特許請求の範囲第１項記載のモノ
   クローナル抗体及びその誘導体。 ６、１０１８Ｓ１９．１１、１０１８Ｓ６９．４、１０
   ２１Ｓ１１．２８、１０２２Ｓ２５．１７及び１０２２
   Ｓ２３．２４と称する特許請求の範囲第１項記載のモノ
   クローナル抗体。 ７、上皮細胞によって産生される中性グリコスフィンゴ
   リピドに結合するモノクローナル抗体及びその誘導体の
   製造方法であって、該モノクローナル抗体を分泌するハ
   イブリドーマ細胞を、ａ）イン−ビトロ培養し、そして
   培養上清液から前記モノクローナル抗体を単離し、又は ｂ）適当な哺乳類動物中でイン−ピボ増殖せしめ、そし
   て該哺乳類動物の体液から前記モノクローナル抗体を回
   収し、そして所望により、 ｃ）得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換す
   る、 ことを特徴とする方法。 ８、目的の抗体を分泌するＢａｌｂ／ｃマウスに由来す
   るハイブリドーマ細胞を炭化水素で前処理されている場
   合があるＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、１〜２週
   間後これらのマウスの腹水を集め、そして硫酸アンモニ
   ウムによる沈澱により及び／又は標準的クロマトグラフ
   法により前記腹水からモノクローナル抗体を単離するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、上皮細胞によって産生される中性グリコスフィンゴ
   リピドに結合するモノクローナル抗体を分泌することを
   特徴とするハイブリドーマセルライン。 １０、マウス又はラットの骨髄腫細胞とグリコスフィン
   ゴリピドで免疫された同系マウス又はラットのＢリンパ
   球とのハイブリドである特許請求の範囲第９項記載のハ
   イブリドーマセルライン。 １１、マウス骨髄腫セルラインＳｐ２／０−Ａｇ１４と
   グリコスフィンゴリピドにより免疫されたＢａｌｂ／ｃ
   マウスの脾細胞のＢリンパ球とのハイブリドである特許
   請求の範囲第９項記載のハイブリドーマセルライン。 １２、１０１８Ｓ１９．１１、１０２２Ｓ２５．１７、
   １０２１Ｓ１１．２８、１０１８Ｓ６９．４、及び１０
   ２２Ｓ２３．２４と称し、パリのパスツール研究所“コ
   レクチオン・ナチオナール・デ・クルツレス・デ・ミク
   ロオルガニスメス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏ
   ｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ
   ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）に、それぞれＮｏ． I −３３
   １、Ｉ−３３２、 I −３３３、 I −３３４、及び I
   −４５３として寄託されている特許請求の範囲第９項記
   載のハイブリドーマセルライン。 １３、上皮細胞により産生される中性グリコスフィンゴ
   リピドに結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブ
   リドーマセルラインの製造方法であって、適当な哺乳類
   動物をグリコスフィンゴリピド混合物又はその抗原性誘
   導体によって免疫し、この哺乳類動物の抗原産生細胞を
   骨髄腫細胞と融合せしめ、融合中に得られたハイブリド
   細胞をクロー化し、そして目的の抗体を分泌する細胞ク
   ローンを選択することを特徴とする方法。 １４、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、サルモネラ・ミネソタ（
   Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ　５９
   ５ラフ変異株上に吸着されたグリコスフィンゴリピド混
   合物によって、１００μｇ〜５００μｇのグリコスフィ
   ンゴリピド混合物を含む３〜８回の非経腸的注射により
   １〜１０日の間隔で免疫し、免疫されたマウスの脾細胞
   を最終追加免疫注射の後２〜５日に採取し、そしてこの
   細胞を融合促進剤の存在下で適当なセルラインの骨髄腫
   細胞と融合せしめることを特徴とする特許請求の範囲第
   １３項記載の方法。 １５、免疫されたＢａｌｂ／ｃマウス由来の抗体産生細
   胞をセルラインＸ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／０
   −Ａｇ１４の骨髄腫細胞と融合せしめる特許請求の範囲
   第１３項記載の方法。 １６、骨髄腫細胞を３〜２０倍過剰の免疫された哺乳類
   動物由来脾臓細胞と、１０００〜４０００の分子量のポ
   リエチレングリコール約３０％〜約６０％を含有する溶
   液中で融合せしめることを特徴とする特許請求の範囲第
   １３項記載の方法。 １７、ハイブリドーマ細胞培養上清液を、グリコスフィ
   ンゴリピドブロッティングにより、グリコスフィンゴリ
   ピドに結合するモノクローナル抗体についてスクリーニ
   ングし、そして陽性ハイブリドーマ細胞を限界希釈法に
   より１回又は複数回クローン化する特許請求の範囲第１
   ３項記載の方法。 １８、上皮細胞によって産生される中性グリコスフィン
   ゴリピドに結合するモノクローナル抗体及び／又はその
   誘導体の、上皮細胞膜由来のグリココンジュゲートの定
   性的及び定量的決定及び／又は精製のための使用。 １９、上皮細胞により産生される中性グリコスフィンゴ
   リピドに結合するモノクローナル抗体及び／又はその誘
   導体の、癌の診断又は治療のための使用。 ２０、上皮細胞により産生される中性グリコスフィンゴ
   リピドに結合するモノクローナル抗体及び／又はその誘
   導体を含有する医薬。 ２１、上皮細胞により産生される中性グリコスフィンゴ
   リピドに結合するモノクローナル抗体及び／又はその誘
   導体の、哺乳類動物の癌の治療剤の製造のための使用。