JPS6196989A - Ｄ‐α‐アミノ酸アミドの相応するＤ‐α‐アミド酸への酵素加水分解法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｄ−α−アミノ−アミドの相応するＤ−α−
アミノ酸への酵素加水分解法に関する。

従来の技術 アルノベス・オブΦミクロバイオロ）−（Ａ−ｒｃｈｉ
ｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１３８巻
、第３１５〜３２０頁、１９８４年、スプリンジャ−（
Ｓｐｒ　ｉｎｇｅｒ　）版〕には、アミド基を有する基
質に対し加水分解作用を有する酵素の効果が記載されて
いる。酵素は、微生物のブレピノζクテリウム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ　ｓｐ−）から得られる。

米国特許第４００　ｔ　ｏ　ｓ’を号明細書によれば、
この微生物はモ／ペリエ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ）　
ｃＤｘコール・ナショナル拳アグロノミック（εｃｏｌ
ｅＮａｔｉｏｎａｌｅ　Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ　）の
遺伝学講座の収集物のＡ　Ｒ３１２及びデ／Ｌ＝７　ト
（Ｄｅｌｆｔ　＋　ノセントラル・ビューロ俸フール１
１７７メルカルチヤーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅ
ａｕ　ＶＯＯｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅ−Ｉｃｕｔｔｕｒｅｓ
　）でのＡ　ＣＢＳ　７１７．７３に登録されている。

基質のプロピオ／アミドに対しそは、酵素の最高相対比
活性度１００が記載されている。更にこの文献には、基
質のＤ−α−アミノプロピオ／アミ）’ＣＤ−アラニン
アミドフに対しては、相対比活性度２．５が記載されて
いる。

酵素の立体特異性作用に関しては記載されてはいない。

基質としての他のＤ−α−アミノ−アミドは、前記文献
には記載されていない。酵素はアセトアミダーゼと呼ば
れ、ＥＣ３，５，１，４，に分類されている（アシルア
ミドアミドヒドロラーゼＪ０ ジャーナル・オプ・ジ峻アメリカン・ケミカル・ソサイ
アテイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉ−
ｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　）、第７
９巻、第４５３８頁（１９５７年）からは、Ｄ−α−ア
ミノ−アミドを相応するＤ−α−アミノ酸に酸性又は塩
基性加水分解によって変換することは公知である。か−
る方法の欠点は、所望のアミノ酸のラセミ化及び／又は
熱分解が生じることである。化学的加水分解の付加的欠
点は、アミノ酸が生成し、これは酸性又は塩基性の中和
物に容易に溶解する場合に生じる。中和氷解物からの所
望のアミノ酸の有効な分離は極めて困難であることが判
明した。酸性又は塩基性加水分解後にこの分離問題を解
決する１つの方法は、強塩基性又は酸性のイオン交換剤
の使用である。使用し之酸又は塩基は大モルの過剰量で
使用されるので、相応する大モル量の高価なイオン交換
剤が必要である。

本発明の目的は、Ｄ−α−アミノ−アミドの相応するし
一α−アミノ酸への立体特異性加水分解が可能のα−ア
ミノアシルアミダーゼ活性を有する調製物を見出し、使
用することである。

α−アミノアシルアミダーゼ活性（アミダーゼ活性とも
呼ばれる）を有する多くの酵素は、クリーンシュタイン
及ヒビイニイソ（Ｇｒｅｅｎｓ−ｔｅｉｎ　＆、　Ｗｉ
ｎｉｔｚ　）　：”ケミ、Ｘトリーーオブ健ジ・アミノ
アシド（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔ、ｈｅ　Ａｍ１
ｎ。

Ａｃ１ｄン″、第３巻、第１７７８〜１７８１貞にュー
・Ｂ−り、１９６１年］に記載されている。しかしなが
らこれらの酵素は、Ｌ形のα−アミノ−アミドに対して
だけ加水分解作用を示す。

本発明によるＤ−α−アミノ−アミドの酵素力日永分解
法は、Ｄ−α−アミノはアミド水溶液を、アミノアシル
アミダーゼを含有しロドコクスΦエリトロポリス（Ｒｈ
ｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒ−ｏｐｏｌ　ｉｓ　
）又はその突然変異体の培養から得られた調製物と接触
させ、Ｄ−α−アミノ酸をこのようにして侍られた氷解
物から回収することを特徴とする。

この方法でＤ−α−アミノ−アミドの酵素加水分解は立
体特異性で進行し、生成したＤ−α−アミノ酸を氷解物
から簡単な方法で回収することが達成される。回収は公
知方法で、例えば蒸発によるか又はｍ規模では得られた
加水分解混合物のスプレー乾燥によって行なってもよい
。この方法で加水分解で生成したアンモニアは氷解物か
ら除去し、一定の時間後に所望のＤ−α−アミノ酸の結
晶が生成する。

Ｄ−α−アミノ酸は、例えは製薬生成物及び除草剤の合
成に使用することができる。

（Ａｂｅｒｄｅｅｎ　）在の例先代ナショナル・コレク
ション・オプ・インダストリアル・ノ々クチリア（Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　　１ｎｄ
ｕｓ−ｔｒｉａｌＢａｃｔｅｒ　ｉａ　Ｊ　　＜　ＮＣ
Ｉ　Ｂ　）　にＡ　１　１５　３　８　、１１５３９及
び１１５４０で登録されたロドコクス・エリトロポリス
（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏ＋　ｉ
ｓ）から得ることができる。

不発゛明によるα−アミノアシルアミダーゼ活性を有す
る調製物を製造するための特に適当な微生物は、ロドコ
クス・エリトロポリス（Ｒｈｏ−ｄｏｃｏｃｃｕｓ　　
ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌ　ｉｓ　）　ＮＣＩ　ＢのＡ　１
１５４０の突然変異体＜　ＮＣＩ　Ｂの茄１２０１９で
登録）である。

ロドコクスΦエリトロホリス＜　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌ　ｉｓ　）は、酵母−マルトグ
ルツースを含有しなかんずく痕跡量の元素を添加した培
地で培養することができる。

α−アミノアフルアミダーゼ活性を有する酵素は、細胞
内である。酵素を使用するためには、冷凍されていても
いなくても全細胞全使用することができる。その上、細
胞壁は、常法で加水分解が有効に進行するように浸透性
にすることができる。更に、細胞を有しない抽出物を使
用することができる。所望により、酵素は公知方法で細
胞を有しない抽出物から精製形で回収することができる
。酵素の前述の使用の場合には、例えばアプライド・ビ
オケミストリー・アミド・ビオエンジ＝　７１Ｊ　７グ
（Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ　ａ
ｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　）　（第１巻（
１９７６年〕及び第４巻（１９８３年）、アカデミ−プ
レス〕に記載されている公知固定技術を使用することが
できる。微生物又は精製酵素を固定形で使用する場合に
は、生触媒の回収は、例えば濾過によって比較的簡単で
ある。

加水分解は温度０〜６０℃、好ましくは２０〜４５℃及
びｐＨ６〜１０で行なうことができる。

それというのもこの条件下で加水分解が最も迅速に進行
するからである。

加水分解の時間は、例えば１〜２４時間で変動してもよ
い。

基質としては、好ましくはＣ原子３〜６個を有するＤ−
α−アミノ−アミド、特にＤ−アラニンアミド、Ｄ−バ
リンアミド、Ｄ−アミノ酪酸アミド、Ｄ−ロイシンアミ
ド、Ｄ−セリンアミド及びＤ−スレオニンアミドを使用
する。

実施例 本発明に使用した微生物は、地及び廃物から富化作用に
よって得られた。次の性質全測定した。

形態： １次菌糸体は、ＧＹＥＡ（グルコース−酵母−抽出物−
寒天）上で直ちに杆状体とコックス（Ｃ０Ｃ５）とに分
離する。

ジｘ７（ＧＹＥＡ　）及びソート／ズ（５ａｕｔｏｎｓ
＋寒天培地上のコロニーは形状が不規則で、色は橙赤色
である。微生物は好気性、不動性及び１部分耐酸性であ
り、内部胞子金肩しない。

温度の必要条件： ４−４０℃で生長。最適３０℃。

酵素活性： ウレアーゼ、ホスファターゼ、カタラーゼ、硝酸塩還元
、ニドｌ）ラーゼ陽性。更に、微生物はアミノアシルア
ミダーゼ活性を有する。

退化試１験： アデニ：ｙ　（０，５％重量／容量（Ｗ／ＶＪ）及びＬ
−チロシン（０，５係Ｗ／Ｖｌ陽性。

発酵試験： クリセロール、ノルピット、トレノ・ロース及びシュク
ロースから酸が生成するが、アドニノト、アラビノース
、セロビオース、ガラクトース、グリコーゲン、イヌリ
ン、メレジトース、ラムノース又はキシロースから酸は
生成しない。

ゾルのＣ−源（１チＷ／ＶＪ： エネルギー及び生長のためのゾルのＣ−源としてのグル
コース、グリセロール、メゾーイノジット、ソルビット
、トレハロース、イヌリン、マルトース、マンニット、
アシヘート、クルコ不−ト、ラクテート、マレエート、
ピルベート、セハ／／酸、サクンネート及びテストステ
ロンで生長するが、グリコーゲン、イノジット、ラムノ
ース、ベンズアミド、ｍ−０Ｈ−安息香酸、マロ、ｔ−
一ト又はタルトレートで生長アしない。

ゾルのＣ−及びＮ−源二 セリン又はトリメチレンジアミンで生長しない。

次のものべ存在で生長： クリスタルノ々イオレット（１ｐｐｍ　Ｗ／Ｖ　Ｊ及び
アジ化、ナトリウム（０，０２％Ｗ／Ｖ）陽性。

脂質の性質： 微生物はＣ原子３６〜４８個を有する遊離ミコリン酸を
有し、イソプレン単位８個及び水素添加二重結合１個を
有するメナキノンを有する。

ミコノ々クチン又はノコノζクチンは存在しない。

ＤＮＡのＧ十Ｃ組成： Ｇ＋Ｃは、Ｔｍで６１〜６７モルチである。

存在： 地及び廃物。

前述の特性に基づいて、単離菌株はグウドフエＯウ＜　
Ｍ、　Ｇｏｏｄｆｅｌ　ＩＯＷ　Ｊ及びアルダ／ｌｚ　
７７（Ｇ　、　Ａｌｄｅｒｓｏｎ　）　（：ジャーナル
・オブ・ゼネラル・アンド・アプライド・ミクロバイオ
ロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　　
ａｎｄ　Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｍｉｃ−ｒＯｂ！ＯｌＯｇ
）／Ｊｓ第１００巻（１９７７年）、第９９〜１２２頁
〕のロドコクス・エリトロポリス属 （Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌ　ｉ
ｓ）に屈する。単１離菌株は、ＮＣｌＢで屋ＮＣｌ８１
１５３８．１１５３９及び１１５４０によって登録され
ている。

高アミノアシルアミダーゼ活性を有するロドコクス・エ
リトロポリｙ、　（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙ−
ｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＮＣｌＢ　　１１５４０の突然変
異体菌株は、突然変異処理によって得られる。このため
に、Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジ
／（ＮＭＧ）の結晶を、グラフトプレート（酵母−炭素
基質で寒天１．５係を添加した１００ゴ当りＫＮＯ３０
，７８１を有する培地）の中心に置き、３０℃で６時間
培養した。このプレートからのコロニーを、自然のま＼
の系に記載したのと同じ特性に対して試験した。突然変
異体は、自然のまＸの系ＮＣｌ３　１１５４０と同じ特
性を有するが、著しく大きいアミノア・／ルアミダーゼ
活性を有していた。この突然変異体は、ＮＣｌＢでＡ　
１２０　ｔ　９で登録されている。

ロドコクスーエリトロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｒｙｔｈｒｏｐｏ＋　１ｓ）ＮＣＩ　Ｂ　　１１５４
０の培養物の調製。

本発明で使用した微生物は、傾斜管でいわゆる酵母−炭
素を基質〔ディフコ（ＤｉｆｃｏＪ）とし、１００ｍ１
当りにＮｏ３０．７８　ｒ　’に添加した寒天培地で１
０℃で保存した。

微生物を有する前記培地から予培養物２００ｍを、同じ
であるが、寒天を有しない培地にうえた。これを３０℃
で７２時間培養した。培地のｐＨは７．２であった。

１０Ｌの醗酵器を次のようにして満たした：（１）　２
ｔの蒸溜水（ｐＨ７，２）にとがした酷母抽出物５０　
ｆｔｌ　２０℃で２０分間滅菌し、冷却した。

（２）麦芽抽出物ｔｏｏｒ、バクトペプトンｓｏｙ。

ＫＮＯｓｙ、グルコース４０？及び痕跡元素〔ハントナ
ー金属（Ｈｕｎｔｎｅｒｓ　ｍｅｔａｌｓ）］１０−を
有する蒸溜水８ｔｆ添加した。最大ｐＨは７．２であっ
た。全体を更に１１０℃で３０分間滅菌した。

（３）予培養物全部を添加した。

（４）　　アセトニトリ＃　（０，０２％Ｗ／Ｖ）ｆ、
滅菌条件下に添加した。

醗酵器の培養物を、一定のｐＨ７，２で３０℃で４０時
間維持した。培養後の湿性細胞の収量は約２７０１であ
った。この細胞から、細胞懸濁液をセーレンセ／燐酸塩
緩衝液（ｐＨ７，２１で調製し、これに７０容量係のグ
リセロールを添加し、全体を一２０℃で保存した。

例１ グリセロール細胞懸濁液の遠心分離後に、細胞’ｉ　ｐ
）−１７，２の燐酸塩緩衝液（セーレノセン）で洗浄し
、次いで再び遠心分離した。ロドコクス＋＋ｊｌ−リト
ロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐ
ｏ−ｌｉｓ）に’）菌＃、Ｎｃ＋８　１１５４０から、
湿性細胞２００ｍｙ”ｋ、Ｄ−バリンアミド２ｐＨ７，
２の燐酸塩緩衝液（セーレ／セ／ンにとかした２０．０
重量係の溶液５ｒｎｌに加えた。６０分間の間培養を恒
温反応器中で３０℃で行なった。反応のｐＨ（７，２）
は殆んど変化しなかった。反応時間が経過した後に、反
応混合物からｔ、ｏ　ｒ　’ｉ取出し、蒸溜水ｔｏｏｙ
に添加した。ｌ０Ｎ−ＮａＯＨ１−の添加後、生成した
アノモニアの量を、オリオン（Ｏｒｉｏｎ＞アノモニア
選択電極で測定した。

アミダーゼ活性度（生成したアノモニアの量で表わされ
る）は、変換した基質の量に等しく、乾燥基質の２当り
９０単位（毎分のミクロ七ル）であった。

列２ ０ドコクス・エリトロ−リス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌ　ｉｓ　）　ｔＤ突然変異体菌株
ＮＧＩ８１２０１９の洗浄細胞を、列１のようにして試
験した。この突然変異体のＤ−パリノアミドの変換のア
ミダーゼ活性度は、乾燥基質１７当り２５０単位（毎分
のミクロモルノであった。

汐１］３ Ｄ−ノζす／アミド（比旋光度〔α）Ｄ＝−１１，５゜
（Ｃ＝＝　２．０　；　Ｈ２Ｏ）　）　４．Ｏ重ｔ％（
ｒ含有ｆ　ろ水溶液２００Ｐｅ、ロドコクス・エリトロ
ポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏ
ｌｉｓ　）ＮＣｌＢ　　１１５４０の遠心分離した洗浄
細胞１０２と室温て１５分間攪拌した。

次いで細胞を遠心分離し、水で洗浄し、再び遠心分離し
た。水層を合し、活囲炭０．５２で５０℃で脱色し、真
空下に４０℃で蒸発させた。

残渣を、真空乾燥オーブン中で４０℃で乾燥した。

純粋Ｄ−バリンの収量は、（薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣＩによって測定）　７．６　？であった。収率は
９５％であった。Ｄ−パリ／：〔α〕Ｄ＝　　−２８，
０°　（Ｃ＝８．Ｏ；　　６　　Ｎ　　−ＨＣｚ　　ン
。

囮ｊ４ ０トコクス・エリトロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）　ＮＧＩＢ　　１１５４０
ｔＤ細胞１０ｒ’ｉ、フルギン酸カルシウムに固定し、
このようにして得られた小球体（ｉ７、Ｄ−アラニノア
　ミ　ド　（〔α　）ｐ＝−７，１°（Ｑ＝２！、Ｑ　
　；　　）−１２０ン　ノの５．咳量係の水溶液２５０
グと室温で攪拌した。

２４時間後に、アルギン酸塩小球体を戸数し、水で洗浄
した。２つの水相を合し、次いで列３のようにして処理
した。得られた純粋のＤ−アラニ／の量（ＴＬＣで測定
）は、１１．９１　（収率＝９５．２係）であった。

比旋光度は〔α）Ｄ　＝　−１４，８°（Ｃ二１０：６
Ｎ−ＨＣＡＩであった。

例５ 砂に固定化したロドコクス・エリトロポリス（Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＮＣｌＢ
　　ｔ　ｔ５４０の細胞５２をカラムに装入し、Ｄ−ロ
イシンアミド（〔α’）０＝−７，５°（Ｃ＝２．０　
：Ｈ２Ｏ））の２．５重量係の水溶液３００？を、カラ
ムに室温で２０時間循環させた。その後に、溶液中には
Ｔ　Ｌ　Ｃ１ｇ１ｌ定によれば原料は存在していなかっ
た１、列３のようにして処理した後に、純粋のｌ）　−
。

イ／７７．０２（収率＝　９３．３係）（ＴＬＣにより
測定）が得られた。〔α〕υ””１５．０°（Ｃ＝４．
０；　　５　　＋’Ｊ　　−＋ｃｚ　　）。

比較列 Ｄ−パリ／アミド１１．６　ｉｉ’　（０，１モル）を
、水３６ｒｎｌにとかした溶液に９６重量係の硫酸２０
ゴを攪拌しながら添加し、溶液を攪拌しながら４時間加
熱（１００℃）した。４０℃に冷却後、酸性加水分解混
合吻全２５重量係のアノモニアで中和してｐＨ＝５．ｏ
の酸性度にすると共に、攪拌し、冷却した。中和後に、
水溶液の硫酸アンモニウム含量は４重量係であった。

このようにして東成した結晶性Ｄ　−Ａ　ＩＪンを、ガ
ラスフィルターで４０℃で濾過して単離した。

（洗液：水５ｒｎｌＸ３及びアセトン５ｍ１Ｘ３Ｊ。

乾燥（０，０１６パール；５０℃；８時間）後のＤ−バ
リンの収量＜ＴＬＣにより純粋；硫液塩を含まないノは
、７．９７（収率６７．５％）であった。Ｄ−バリンの
比旋光度：〔α：ｌ　□　＝　−２７，９゜（Ｃ＝８．
Ｏ：　６Ｎ−ＨＣＡ）。

ＴＬＣ測定によれば、９９チ以上のＤ−・々リンアミド
が加水分解してＤ−バリンが得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｄ−α−アミノ酸アミドの相応するＤ−α−アミノ
   酸への酵素加水分解法において、Ｄ−α−アミノ戚アミ
   ド水溶液を、アミノアシルアミダーゼを含有しロドコク
   ス・エリトロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙ
   ｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）又はその突然変異体の培養から得
   られた調製物と接触させ、Ｄ−α−アミノ酸をこのよう
   にして得られた水解物から回収することを特徴とする、
   Ｄ−α−アミノ酸アミドの相応するＤ−α−アミノ酸へ
   の酵素加水分解法。 ２、加水分解を、ｐＨ６〜１０及び温度２０〜４５℃で
   行なう、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、ロドコクス・エリトロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃ−
   ｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）又はその突然変異
   体を湿性細胞の形で使用する、特許請求の範囲第１項又
   は第２項記載の方法。 ４、適当なキャリアーに固定したロドコクス・エリトロ
   ポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐ−
   ｏｌｉｓ）又はその突然変異体を使用する、特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の方法。 ５、ＮＣｌＢのＮｏ．１１５３８、１１５３９又は１１
   ５４０で登録したロドコクス・エリトロポリス（Ｒｈｏ
   ｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）を使用
   する、特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか
   １項記載の方法。 ６、ＮＣｌＢのＮｏ．１２０１９で登録したロドコクス
   ・エリトロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔ
   −ｈｒｏｐｏｌｉｓ）の突然変異体を使用する、特許請
   求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項記載の方
   法。 ７、原子３〜６個を有するＤ−α−アミノ酸アミドを出
   発化合物として使用する、特許請求の範囲第１項から第
   ６項までのいずれか１項記載の方法。 ８、Ｄ−α−アミノ−アミドとして、Ｄ−アラニンアミ
   ド、Ｄ−バリンアミド、Ｄ−アミノ酪酸アミド、Ｄ−ロ
   イシンアミド、Ｄ−セリンアミド又はＤ−スレオニンア
   ミドを使用する、特許請求の範囲第１項から第７項まで
   のいずれか１項記載の方法。