JPS62115288A - 単純ヘルペスウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａ、形質転換動物細胞および単純ヘルペスウイルス蛋白質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は動物細胞に作用させて形質転換させるのに適し
た単純ヘルペスウィルス（Ｅ（Ｓ■）糖蛋白質遺伝子を
組込んだ組換えＤＮＡ、それを用いて形質転換を行なっ
た動物細胞、およびそれを用いたＨ３Ｖ糖タンパク質の
製法に関する。

さらに詳しくは、動物細胞発現用プロモーターをもつ大
腸菌プラスミドを用い、これにＩ（ＳＶ糖タンパク質遺
伝子を組込んだ新規な組換えＤＮＡを得、これを動物細
胞に作用させて形質転換細胞とし、この形質転換細胞を
培養してＨ３Ｖ糖蛋白質を大量に生産する方法に関する
。

最近、先進国においてはＨＳＶに対する抗体保有人口が
減少してきており、そのような国では、性器ヘルペス、
新生児ヘルペス、ヘルベヌ脳炎などのＥ（ＳＶ感染症が
大きな問題となシつつある。このようなＨ８Ｖ感染症の
防御にはワクチンが有効であシ、すでに弱毒化Ｈ８■か
らなる弱毒化ワクチンやＨ３ＶＤＮＡを含む不活化ワク
チンが提案されている。

しかしながら、ＨＳＶには潜伏感染や発癌性の危険があ
る成分が存在することが知られており、従来の弱毒化ワ
クチンや不活化ワクチンではかかる副作用の危険が残如
実用上問題がある。

一方、ＨＳＶが細胞に感染すると数種の糖蛋白質ＣｇＢ
、ｇｃ、、ｇＤ、ｇＥなど。々お、従来のｇＡ、ｇＢの
称呼は１９８３年Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｅｒ
ｐｅｓ　Ｖｉｒｕｓ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ（オックスフォ
ード、英国）にてｇＢと統一された〕が産生され、これ
らの糖蛋白質がＨＳＶの感染防御抗原として重要なこと
が明らかにされるとともに、これら糖蛋白質を成分とす
るいわゆるコンポーネントワクチンについての研究が行
なわれている。例えば、キャベルらはＨ３Ｖ感染細胞ま
たはＨ８Ｖ粒子より抽出して得られる糖蛋白質が感染防
御抗原とＣ して有効であることを報告している（：９ａｐｐｅｌｅ
ｔ　ａｌ、　、　Ａｒｃｈ、　Ｖｊ−ｒｏｌ、　、　７
３．６１　（１９８２））。

しかしながら、かかるＨ８Ｖ感染細胞やウィルス粒子か
ら抽出した糖蛋白質からなるコンポーネントワクチンで
は、現在適用し得る精製方法では十分な精製が困難で、
以下に述べる如く宿主細胞の多くの蛋白質を含み得るた
め、それら不要な蛋白質に起因する副作用が問題である
。したがって、副作用のないコンポーネントワクチンを
得るためには、高度に精製された糖蛋白質を用いる必要
がある。このような観点から、以前に、本発明者らはＨ
８■のこれら糖蛋白質について検討し、それを高度に精
製したｇＢにおいてマウスでの実験でその有効性を確認
している〔城野、細胞工学、３．１２０（１９８４））
。

ところでこのような糖蛋白質ｇＢを得るには培養細胞に
ウィルスを接種し、それを培養することによって産生さ
せる方法が採られるが、かかる方法では、感染性の因子
を扱うためその操作が極めて危険であり工程もきわめて
煩雑となるうえ、発癌遺伝子を担うＤＮ４を完全に除去
したことを証明することは不可能に近く、結局、かかる
天然の糖蛋白質ｇＢを用いて実用性のある安全なコンポ
ーネントワクチンを製造することはきわめて困難である
。

発明の概要 このような天然Ｈ８Ｖ糖蛋白成分の精製の難しさに鑑み
、本発明者等は、先に、遺伝子工学的手法によるＨ３Ｖ
糖蛋白質特にＨ３ＶｇＢの産生に成功している（特願昭
５９−１２７１５２号）。

この方法によれば、チミジンキナーゼ遺伝子を挿入した
大腸菌プラスミドベクターにＨ８■遺伝子を組込んだ組
換えＤＮＡを動物細胞に作用させ、形質転換動物細胞を
得、これを培養してＨ３Ｖ糖蛋白質を産生させ、それを
収集することにより所望のＨ３Ｖ糖蛋白質を得ている。

本発明は、この方法の変形あるいは改良に関するもので
新しい形質転換動物細胞を用いてＨ３Ｖ糖蛋白質の量産
を目的とする。

即ち、本発明は大腸菌プラスミドに動物細胞用プロモー
ター領域を挿入したベクターにＨＳＶ糖蛋白遺伝子を組
込んだＤＮＡ、この組換えＤＮＡを動物細胞に作用させ
て形質転換させた形質転換動物細胞およびこの形質転換
動物細胞を培養してＨ３Ｖ糖蛋白質を産生それを収集す
ることからなるＩ（ＳＶ糖蛋白質の製造方法にある。

さらに本発明においては大腸菌プラスミドに組込むべき
Ｈ８Ｖ糖蛋白遺伝子としてＨ３■糖蛋白質のカルボキシ
末端側の疎水性の強い領域、即ち、Ｈ３Ｖ細胞膜に結合
した部分をコードするＤＮＡを欠失させた遺伝子を用い
ることによって、形質転換動物細胞を培養中にＨ８Ｖ糖
蛋白質が細胞外産生即ち分泌型として産生されることを
見い出した。従って　９一 本発明のこの実施態様によれば、遺伝子組換え法によシ
産生させたＨ８Ｖ糖蛋白質を培養上滑中より直接回収で
きるのでＨ３Ｖ糖蛋白質を簡単かつより純粋な形で精製
取得できるという利点がある。

本発明の新規な組換えＤＮＡの調製は動物細胞用プロモ
ーター（例えばＳＶ４０初期プロモーター、アデノウィ
ルス由来プロモーター等）をもつ大腸菌プラスミド（例
えばｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹｏ　１７７等）を用い、こ
れにＨ３■糖蛋白質の遺伝子を組込むことにより行なわ
れる。更には、該組込むＨ３Ｖ糖蛋白の遺伝子のうち、
Ｈ３Ｖ糖蛋白質のカルボキシ末端側の疎水性の強い領域
をコードするＤＮＡを欠失させ、この遺伝子を同様に動
物細胞用プロモーターを担った大腸菌プラスミドに組込
むことにより行なわれる。このような］（Ｓ■糖蛋白質
遺伝子を組込む動物細胞用プロモーター領域を担った大
腸菌プラスミドベクターの具体的な例としては後述する
ようなＳ■４０初期プロモーターを担ったＰＢＲ３２２
プラスミドがある。このようにして得られる新規な組換
えＤＮＡを動物細胞、好ましくはデヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ欠損（以下ＤＨＦＲ−と略す）又はチミジンキナー
ゼ欠損（以下ＴＫ−と略す）の動物細胞、例えばＣＨＯ
ＤＨＦＲ−細胞あるいはマウスＬＴＫ−細胞に作用させ
て形質転換細胞を得る。この形質転換細胞を所定の培養
条件下に培養することによシ所望のＨ３Ｖ糖蛋白質が量
産され得るが、さらに本発明の前記記載の好ましい態様
によればｇＢを細胞内のみならず培養上清中に分泌させ
ることによりｇＢを産生させることも可能となる。

以下に本発明の組換えＤＮＡ、形質転換細胞、およびそ
れによるＨ３Ｖ糖蛋白質の生産についてＨＳ　Ｖ　ｇＢ
を例として詳細に説明する。

（１）Ｉ（ＳＶｇＢ遺伝子 本発明で用いられるＨ３ＶｇＢ遺伝子は大腸菌によシク
ローニングされたＨ３ＶｇＥＤＮＡである。

Ｈ８ＶＤＮＡは約１６０　Ｋりｌ　）　ｙノＤＮＡで、
ｇＢの遺伝子はとのＨ３ＶＤＮＡを制限酵素の一種であ
るＢａｍ　ＨＩで処理して切り出される約８Ｋｂ（０，
３４５〜０３９９マツプユニツト　）のフラグメント（
ＢａｍＨＩＧフラグメントという）の中に存在する。こ
のＢａｍＨＩＧフラグメントは第１図に示すような各種
の制限酵素（Ｓａｌ　Ｉ、　ＳＳＴ　Ｉ、　Ｋｐｎ　Ｉ
。

ＢｓｔＥ　ＩＩ、Ｘｈｏ　ＬＰｓｔ　Ｉ　）による切断
部位を有する。したがって、Ｅ（ＳＶｇＢ遺伝子として
は、ＢａｍＨｒＯフラグメントのほか、これをさらに他
の制限酵素で処理したもの、好ましくはＸｈｏ　Ｉ　　
で処理して得られる約３５　Ｋｌ）のフラグメントが用
いられる。

このようなフラグメントの調製には、まずＨ３ＶＤＮＡ
をＢａｍＨＩで処理して切断し、アガロースゲル電気泳
動でＢａｍＥ（ＩＧフラグメントを単離し、これを大腸
菌によシクローニングして増幅したのち、好ましくはさ
らにＸｈＯＩ　　などの制限酵素処理して所定のフラグ
メントを得る。このようにして得られるフラグメント（
Ｘｈｏ　Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメント）をそのまま後述
の組換えＤＮＡの構築に供することができる。

また、分泌型のＨＳ　Ｖ　ｇＢを得るには、このＨ３Ｖ
ｇＢ遺伝子ｘｈｏ　Ｉ−ＢａｍＨＩ　７ラグメントに含
まれるｇＢ構造遺伝子のうちｇＢのカルボキシ末端の疎
水性の強い領域（第１図参照）をコードする遺伝子を除
いて得られるｇＢ遺伝子を用いることにより、ｇＢを動
物細胞の培養上清中に分泌させうる形質転換動物細胞を
構築することができる。そのよりなｇＢ遺伝子の構築方
法としては、除去すべき疎水性の強い領域をコードする
遺伝子の上流と下流の適当な制限酵素部位（例えばその
領域上流のＴｔｈｌ＋−１部位および下流のＴｔｈｌｌ
ｌ−１部位）にてこのｇＢ遺伝子を切断し、所定の領域
を除去す、る方法、またはｇＢの疎水性の強い領域をコ
ードする遺伝子の内部もしくはその近くにある制限酵素
部位でとのｇＢ遺伝子を切断しエキソヌクレアーゼＢａ
１３１等の酵素で除去すべき遺伝子を削り取る方法など
がある。これらいずれの場合も再度ｇＢの構造遺伝子を
つなぐ場合、除いたＤＮＡ下流のＤＮＡ断片がインフレ
ームするようにＤＮＡコドンを合わせて結合させること
によって再結合できる。

（２）プラスミドベクタ一 本発明で用いられるベクターは大腸菌プラスミドに動物
細胞用プロモーター領域を挿入したものである。

その大腸菌プラスミドとしてはＣＯ工Ｅｌ。

１ｓ″ ｐＭＢ　Ｌ　１１→Ａに由来するプラスミドなどが含ま
れ、その代表例としてはｐＢＲ３２２が用いられる。ま
た動物細胞用プロモーターとしては、ＳＶ４０のプロモ
ーターやアデノウイルヌ、レトロウィルス由来のプロモ
ーターなどが含まれるが、強力なプロモーター活性を持
つとして知られるＳＶ４０初期プロモーターを用いるこ
とが好ましい。

この大腸菌プラスミドに挿入されるＳ　Ｖ　４．０ＤＮ
Ａとはサルに感染してガンを惹起するウィルスの一種で
哺乳動物のガンウィルスとしてよく研究されているウィ
ルスのＤＮＡであって、遺伝子操作の分野においてこの
ウイルヌＤＮＡを他のＤＮＡ（例えばグロビン遺伝子）
を結合させて組換えＤＮＡとし、サル培養細胞へ感染さ
せてグロビンを作らせることなどに利用されている。本
発明においてはこのよりな５Ｖ４ＱＤＮＡのプロモータ
ーを大腸菌プラスミドに挿入し、これをＨＳＶｇＢ遺伝
子による組換えＤＮＡの調製に適用したものである。上
記５Ｖ４０ＤＮＡプロモーターを挿入した大腸菌プラス
ミドは、例えば、ファルマシア・ジャパン社よりＰＫＳ
Ｖ−１０として市販されており、商業的に入手可能であ
る。

（３）組換えＤＮＡ　（Ｈ３Ｖ−ｇＢ発現ベクター）の
構築 前記プラスミドベクターの動物細胞用プロモーター下流
の適当な制限酵素部位で開裂させて得られるフラグメン
トと前記ＨＳ　Ｖ　ｇＢ遺伝子の両端に適切なリンカ−
を付加したＤＮＡとを適当な割合にて結合反応を付する
ことにより所望の組換えＤＮＡが得られる。このような
組換えＤＮＡは第２図に示すような構造であり、第２図
ではベクターＤＮＡのＳＶ４０プロモーター下流にＨ５
ＶｇＢＤＮＡが挿入されている。

（４）動物細胞の形質転換 前記のＨ８ＶｇＢ遺伝子を組込んだ組換えＤＮＡ（ｉ−
動物細胞に作用させて培養することにより動物細胞の形
質転換が行なわれる。

用いられる動物細胞としてはＴＫ−動物細胞、例えばマ
ウヌＬＴＫ−細胞またはＤＨＦＲ−動物細胞、例えばチ
ャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）ＤＨＦＲ−細胞を好
ましく用い得る。

つぎに動物細胞としてマウスＬＴＫ−細胞を用いた場合
の形質転換操作をさらに具体的に述べる。

例えば、マウスＬＴＫ−細胞を１０％牛血清を含むダル
ベツコ改良イーグル培地（ＤｕｌｂｅＣＣＯｌｓ　ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ、以下Ｄ
ＭＥＭと略す）　（Ｄｕｌ’ｂｅｃｃｏ　、Ｂ、　＆　
Ｆｒｅｅｍａｎ。

Ｇ、ＨＶｉｒｏｌｏｇｙ、８，３９６．１９５９）にて
培養し、これに組換えＤＮＡをリン酸カルシウム溶液中
に混合した溶液を加えて室温で数十分間、通常約３０分
間放置したのち、ＤＭ　ＥＭを加えて４〜５時間培養し
、培地を交換し、さらに１２〜２４時間ＤＭＥＭにて培
養する。

ついで、ヒボキサンチン（１５μｇ／九１）、アミノプ
テリン（１μｇ／−１）およびチミジン（５μｇ／−ａ
−’）を含む培地（以下、ＨＡＴ培地という　　）　　
　［Ｌｉｔｔｌｅ、１１ｅｌｄ　　：　　　Ｊ、　　Ｐ
ｒｏａ、　　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　７２　、３９６１
〜３９６５（１９６３）〕で培養して所望の形質転換マ
ウスＬ細胞を得る。なお、この場合、出発マウスＬＴＫ
−細胞はＴＫ遺伝子を欠損しているためＨＡＴ培地では
成育できないが、ＴＫ遺伝子を導入した組換えＤＮＡで
形質転換したマウスＬ細胞はチミジンキナーゼ合成能を
有しＨＡＴ培地で成育するため、上記ＨＡＴ培地での培
養によシ所望の形質転換細胞のみが選択的に得られる。

（５）形質転換細胞の培養およびＨ３ＶｇＢの生産 前記の方法で得られた形質転換動物細胞を常法に従って
培養することによシ生育細胞内又は培養上清中に大量の
ＨＳ　Ｖ　ｇＢが産生される。

細胞内のＨＳ　Ｖ　ｇＢの分離は、生育動物細胞を分離
し、界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００、ノリプツ
トＰ−４０など）や有機溶媒（例えば、四塩化炭素、エ
チルエーテルなど）で処理して細胞膜を破壊し、ｇＢを
通常の蛋白質精製法により精製する。例えば、抗ｇＢ抗
体を結合したゲルを充填したカラムに該ｇＢ含有抽出液
を通し、３　ＭＫ　Ｓ　ＣＮで溶出してｇＢを単離する
。

一方、培養上清中に分泌した型で産生されたＨ　Ｓ　Ｖ
　ｇＢの分離は得られた培養液の上清を回収し、その後
通常の蛋白質精製法により培地由来の成分を除くことで
容易にかつ効率よ＜　ｇＢを精製することができる。

上記の方法で得られるｇＢは免疫学的にＨＳＶ感染細胞
から得られる天然ｇＢと全く同一であり、Ｈ８■ワクチ
ンまたは診断用試薬として利用し得る。

つぎに実施例を挙げて本発明の組換えＤＮＡ、形質転換
動物細胞、およびＨＳ　Ｖ　ｇＥｌの生産についてさら
に具体的に説明する。

実施例 （１）Ｈ３ＶｇＢ遺伝子含有ＤＮＡのクローニングと塩
基配列 （ｉ）　ＨＳ　Ｖ　−Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａの調製ｖｅｒｏ細
胞（アフリカミドリザル腎細胞）（約５Ｘ１８８ｃｅｌ
ｌｓ　）に単純ヘルペスウィルス１型（Ｈ６Ｖ−１）（
Ｋ２Ｓ株）を０．５〜Ｉ　Ｐ　Ｆ　Ｕ／ｃｅ工１の量で
感染させ、３７°Ｃで２０〜２４時間培養して、細胞変
性が充分に起きた時点で２８．００　Ｏｒｐｍにて１時
間遠心して感染細胞と上清を分離して、感染細胞のペレ
ット（２〜３ｍＡ）を得る。これをリン酸緩衝液−生理
食塩液（ｐＨ７，２）　Ｃ以下、ＰＢＳと略記する）５
．Ｑｙ＋４に懸濁し、この懸濁液を超音波処理（９ＫＨ
２，２００Ｗ、５分間処理）または凍結融解（−５０℃
（アセトン−ドライアイス）と３７°Ｃにて３回凍結融
解を繰返す）を行って細胞を破壊し、細胞残渣を低速遠
心分離（３，０００ｒｌ）ｍ、２０分間）によシ除去す
る。

得られる溶液をグリセロールクッション（５％、４０％
）に重層し、３５．ＯＯＯｒｐｍにて１時間遠心分離す
る。得られたベレット０５〜ｌ−ｎ、１をＰＢＳＩ〜２
　ｍｌに懸濁し、これにＤ　Ｎａｓ　ｅ　１０　μｇ／
−’およびＲＮａＳ　ｅ　０．３　ｍ　ｇ　７〜Ｉを３
７°Ｃで１時間作用させ、ついで、１１５量の５　Ｘ　
Ｓ　Ｔ　Ｅ　Ｐ　（０，５％ＳＤＳ、５０ｍＭＴｒｉＳ
−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，０，４ＭＥＤＴＡ、０．１％プ
ロティナーゼＫ）を加え、５０°Ｃで３０分間作用させ
る。この処理液を等量のフェノール、フェノール−クロ
ロホルム（１：１）およびクロロホルムで順に抽出し、
ＤＮＡを含む水層を得る。

コノ水層をＴＥ緩衝液（２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−Ｈ（
Ｊ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）に誘析したのち、
冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。このＤＮＡ
を濾取し、真空下乾燥後、塩化セシウム水溶液（Ｒｆ　
１．３８８５、エチジウムブロマイド０．０４％、ラウ
ロイルサルコシネート０．４％を添加）５ｍＪ−に溶解
し、４０００ｒｐｍで７２時間遠心分離し、Ｈ３Ｖ−Ｉ
ＤＮＡのバンドを形成させる。このバンドを回収し、イ
ソプロピルアルコールで洗浄してエチジウムブロマイド
を除去後、ＴＥ緩衝液に誘析する。これに冷エタノール
を加えて沈殿させてＨ３Ｖ−ＩＤＮＡを得る。

（ｊｉ）Ｈ３Ｖ　−Ｉ　ＤＮＡノＢａｍＨＩ切断Ｇフラ
グメントのクローン化 上記の方法で調製したＨ３Ｖ−ＩＤ’Ｎ、Ａ約１００　
μｇを、７３　ｍＭ　Ｔｒｉ−ｓ　−Ｈ（Ｊ、　（ｐＨ
８，０）、７ｍＭ　ＭｇＣ２２，１００ｍＭ　ＭａＣｆ
、２ｍＭ２−メルカプトエタノールの混液０７５ｍＪ−
中で、制限酵素ＢａｍＨＩによシ３７°Ｃ，６時間処理
したのち、０．７％アガロース電気泳動によって各断片
を分離し、Ｇフラグメント（０，３４５〜０３９９マツ
プユニツト）に相当する部分のゲルを切シ取シ、電気泳
動的にＧフラグメントを回収する。

前記と同様にして制限酵素ＢａｍＨＩによシ開裂された
ｐＢＲ３２２プラ入ミド１：／１Ｏモル量と上記Ｇフラ
グメント約２μｇとを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ、、
ｐＨ７，９，１０ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ２．２０ｍＭジチオ７
、ｖイトール、１ｍＭＡＴＰ混液中にて、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて１６°Ｃで約１６時間反応させる。

高木康敬編著「遺伝子操作実験法」第１６１頁に記載の
方法で大腸菌χ１７７６の培養液を調製し、その菌液０
．１ｍＪ−に上記反応液を加えてよく混合させ、０°Ｃ
で４５分間放置したのち、アンピシリン１００μｇ／−
ｒ−Ａを含む寒天プレート上に塗抹し、３７°Ｃで一夜
培養する。

出現したコロニーについて、アンピシリン１００μｇ／
ｍＪ−を含む寒天プレートとテトラサイクリン１００μ
ｇ／−Ｊを含む寒天プレートにそれぞれ塗抹し、同様に
培養してアンピシリンを含む寒天プレートでのみ増殖し
たコロニーを選択する。１）ＢＲ３２２はアンピシリン
耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するが、
テトラサイクリン耐性遺伝子中にあるＢａｍ　Ｈ１部位
にＨ３Ｖ−ＩＤＮＡ断片が挿入されることによりテトラ
サイクリン耐性が消失されるため、上記選択されたコロ
ニーはｐＢＲ３２２−Ｈ８Ｖ　ＤＮＡのＢａｍＨＩ　Ｃ
７ラグメントの組換えＤＮＡを保持していることになる
。

上記の方法で得られたコロニーについて、「代謝」第１
７巻、第４号、第８１〜８９頁（１９８０）ｒプラスミ
ドＤＮＡの調製」に記載される方法にしたがってプラス
ミドを調製する。得られたプラスミドを種々の制限酵素
（Ｂａｍ　ＨＩ　、　ＢｓｔＥ　Ｉ　Ｉ、　Ｋｐｎ　Ｉ
、　Ｓａｌ　Ｉ。

ｓｓｔ　１．　ＸｈＯＩ　）にてその切断パターンを分
析することにより、Ｈ８Ｖ−ＩＤＮＡのＢａｍＨＩＧフ
ラグメントがｐＢＲ３２２に組込まれたｐＢＲ３２２−
ＢａｍＨＩ−Ｇ７ラグメントノ組換えＤＮＡ（プラスミ
ドｐＧ）を得る。

（ｉｊｊ−）　ＨＳ　Ｖ　ｇＢ遺伝子の塩基配列上記Ｈ
Ｓ　Ｖ　ｇＢ遺伝子を含むプラスミドｐＧの塩基配列を
以下のようにして決定する。

プラスミドｐ０１０μｇをＳｍａ　Ｉとｓａｃ　１の制
限酵素反応混液１００μｍにとかし、これに制限酵素Ｓ
ｍａｌｌＯ単位およびＳａｃ　１１０単位を作用させて
該ｇＢ遺伝子を含むＳｍａ　１−５ａｃｌ領域のフラグ
メントを得る。

このＳｍａ　ｌ−３ａｃ　Ｉフラグメントを各制限酵素
反応液中にて、各種の制限酵素、５ａｃ１、　　Ｓａｃ
　　ＩＩ、Ｅｍａ　　Ｉ、Ｐｓｔ　　Ｉ　、　　Ｓａｌ
　　Ｉ　、Ｐｖｕ　ＩＩ、　５ａｕ３ＡおよびＮａｒ　
Ｉを作用させて小断片に分解し、これら各小断片をクロ
ーニングベクターＭ　ｔ３ｍｐ　１１　（ファルマシア
・ジャパン（株）販売）のＳａｌ　１部位に挿入し、ジ
デオキシ法（蛋白質・核酸・酵素、■０工。

２９、煮４．２９４〜３０６（１９８４）ｒジデオキシ
法によるＤＮＡの塩基配列決定法」を参照）によシその
塩基配列を調べたところ、第３図に示すような塩基配列
およびそれによってコードされるｇＢ蛋白質のアミノ酸
配列が判明した。これによると該ｇＥ遺伝子は９０３個
のアミノ酸からなることがわかる。

（財）プラスミドｐＧＢＸの調製 上記の方法で得られたプラスミドｐＧ１０μｇ　を、　
　６ｍＭ）　　リ　ス　−　ＨＣ１（ｐＨ７，５）、　
５ｍＭＭｇＣ−’２．５　ｍＭ　２−メルカプトエタノ
ール、１５０ｍＭＮａＣｆの混液１００μｍ’に加え、
これに制限酵素ＢａｍＨＩＩＯ単位およびｘｈｏ　１１
０単位を加えて、３７°Ｃで２時間反応させる。この反
応液を、高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」３３〜３
４頁に記載の方法により、１％アガロースゲルにて電気
泳動により３，５ｋｂフラグメントＤＮ’Ａを分離、抽
出する。

得られた３、５ｋｔ）７ラグメントＤ　Ｎ　Ａ　１１０
０ｎと大腸菌ブーｙスミドｐＡｃＹＯ１７７（ＢａｍＨ
ＩおよびＸｈＯＩで処理して開裂したもの）１０ｎｇと
を、Ｔ４リガーゼ０．１単位、６６ｍＭ　）す：ｙ、、
　−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，６）、６．６ｍＭＭｇＣＡ２、
ｌＱｍＭジチオスレイトールとの混液１０μｍを用いて
１６°Ｃで８時間反応させる。この反応液を用い、高木
康敬編著「遺伝子操作実験法」１６１〜１６２頁に記載
の方法により、大腸菌χ１７７６を形質転換させ、その
形質転換体からアンピシリン耐性菌を選択し、この菌か
ら、上記「代謝」第１７巻、第４号、第８１〜８９頁（
１９８０）に記載の方法にしたがってｇＢ　遺伝子を含
むプラスミドｐＧＢＸ第４図を得る。

（Ｖ）プラスミドｐＧＢＸ（Ｅ９およびｐＧＢＸＴの調
製 上記の方法で得られたプラスミドｐＧＢＸ１０　　μｇ
　　を　１０ｍＭ）　　リ　ス　−ＨＣＩ　（ｐ　Ｈ７
，５）　、　７ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１２、１００ｍＭ　
　Ｍａ０２　７ｍＭ　　２−　　メ　／Ｌ／カプトエタ
ノールの混液１００μｍに加見これに制限酵素ｘｈｏ　
Ｉ　１０単位を加えて３７°Ｃで２時間反応させる。

その後、通常のフェノール処理、エタノール沈殿法によ
ＪＤＮ’Ａを回収し、これを６７ｍＭリン酸カリウム（
１；ｌＨ７，４）６．７ｍＭＭｇＣｕ□１ｍＭ２−メル
カプトエタノ−／ｌ／、２０μＭ　α（Ａ−Ｔ）コポリ
マー、３３μＭｄＡＴＰ、３３μＭ〔３Ｈ〕−６ＴＴＰ
混液に溶解し、ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆ
ｖａｇｍｅ％Ｌｔ）を作用させることにより、とのＸｈ
ｏ　Ｉ末端を平滑末端（ｆｌｕｓｈｅｎｄ）にする。そ
の後、と（ＩＤＤＮＡを５０ｍＭ）　！Ｊ　ス−ＨＣ−
Ａ　（１１）Ｈ７，６）、１０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール、Ｏ，ＯＣＥ　ｌｉ　Ｂ　Ｓ　Ａ混液中で、Ｂａ
ｍＨＩリンカ−とＴ、４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いて
この平滑末端にＥａｍＨＩリンカ−を付加す。

る。この反応液を１０ｍＭ　）　リス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ８
，０）、７ｍＭ　　ＭｇＣｉ２　、１００ｍＭ　　Ｎａ
Ｃｆｆ１、２ｍＭ２）ノｖカプトエタノール、０．０１
％ＢＳＡの混液中で制限酵素ＢａｍＨＩを作用させたあ
と、Ｔ　４　Ｄ゛ＮＡＮＡリガーゼて、このＤＮＡを再
環状化する。

この反応液を用い高木康敬編著「遺伝子操作実験法」１
６１〜１６２頁に記載の方法により、大腸菌χ１７７６
を形質転換させ、その形質転換体からアンピシリン耐性
菌を選択し、この菌から、上記「代謝」第１７巻、第４
号、第１８１〜８９頁（１９８０）に記載の方法にした
がって、プラスミドｐＧＢＸ（ト）を得る。（第５図）
さらに、このプラスミドを２０ｍＭ　　）リス−ＨＣＪ
（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｆｆ１２．５０ｍＭ
Ｎａｃ！、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール混液中で
制限酵素Ｔｔｈｌ−１を作用させる。これを前記方法と
同様にＤＮＡポリメラーゼ（ＫｌｅｎＯＷ　Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ）を用いてＴｔｈ　ｍ　−ｒ末端を平滑末端にし
、Ｂｇ工■リンカ−を付加したあとＴ４ＤＮ、Ａリガー
ゼを用いてプラスミドを再環状化する。その後、この反
応液を用いて前記と同様の方法で大腸菌を形質転換し、
プラスミドを分離・選択して、約４７０１）ｐのＴｔｈ
■−■ＤＮＡ断片を欠失１．［Ｈ８ＶｇＢ　遺伝子を含
むプラスミドｐＧＢＸＴ（第６図）を得る。

（２）Ｈ３ＶｇＢ発現ベクターの構築 前記のプラスミドｐＧＢＸ日５μｇｅｌｏｒｌ１Ｍ）　
　リ　ス　−ＨＣＪＮ　ｐＨ８，Ｏ）　　　７ｍＭ　　
Ｍｇ　ＣＡ２、１００ｍＭＮａｃ−１！、２ｍＭ　２−
、＋＋ｙｖカプトｘ−タ／−ｚＶ、００１％ＢＳＡの混
液５０μｍに加えこれに制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ　１０単
位を加えて３７°Ｃで２時間反応させたのち、１８０％
アガロースゲル電気泳動によって各断片を分離し、ｇＢ
遺伝子に相当する部分を切シ取り、電気泳動的にこのフ
ラグメントを回収する。

一方、プラスミドｐＫＳＶ−１０（ファルマシア・ジャ
パン株式会社）５μｇを１０ｍＭ　）リ　ｙ、　　−Ｈ
Ｃｆ（ｐＨ７，５）　　、　　７ｍＭ　　Ｍｇ：　ＣＡ
　２、１００ｍＭＮａｃ２．７ｍＭ２−メルカプトエタ
ノールの混液５０μｍに加え、これに制限酵素Ｂｇ工■
１０単位を加えて３７°Ｃ２時間反応させる。

このようにして得られたＨ８ＶｇＢ−ＤＮＡ０５μｇと
Ｂｇ工工部部位よシ開かれたｐＫＳＶ−１００，０５μ
ｇを６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（、Ｍ　（ｐＨ７，６）６
．６ｍＭ　ＭｇＣｆｆ１２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、　１ｍ
ＭＡＴＰの混液中にてＴ４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼを用い
て１６°Ｃで約１６時間反応させる。

この反応液を用いて、高木康敬編著「遺伝子操作実験法
」１６１〜１６２頁に記載の方法によシ、大腸菌を形質
転換させ、その形質転換体からアンピシリン耐性菌を選
択し、この菌から上記の方法に従ってプラスミドを分離
し、ｐＫＳＶｌｏの５ｖ４０プロモーター下流に、ｇＢ
遺伝子が正しい向きに挿入されたプラスミドｐＫＳｖｇ
Ｂ（第７図）を得る。

また、プラスミドｐＧＢＸＴを用いた場合も同様の操作
を行なうことによりｇＢ発現ベクターｐＫｓＶｇ；ＢＴ
（第８図）を得る。

（３）マウスＬＴＫ−細胞の形質転換 下記のＡ液およびＢ液を調製する。

Ａ液：　５０ｍＭヘベス（Ｎ　−２−ヒドロキシエチル
ヒベラジンーＮ−２−エタン スルホン酸）、２８０ｍＭ　ＮａＣｆ、１５ｍＭ　　Ｎ
ａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２０からなる溶液１．２５ｍ１（
ｐＨ７，１’） Ｂ液：　５０　ｔｉｇ、　ｐＫＳＶ　ｇＥ又はｐＫＳＶ
ｇＢＴ。

２５μｇ　　ｐＴＫ（チミジンキナーゼ遺伝子）および
５０μｇサケ精子ＤＮＡ　（キャリアーＤＮＡ　）から
なるＤＮＡ溶液 １１ｍ１と２　Ｍ　ＣａＣＪ２０．１５ｍ４　（Ｄ混合
液 上記Ａ液にＢ液を攪拌しなからゆつくシ滴下し、室温で
３０分放置する。充分ピベツテイグしたのち、その混合
液０．５　ｍｌをマウスＬＴＫ−細胞の単一層（約１ｏ
５ｃｅ工１＋ｓ／フラス：＋）に滴下する。このまま室
温にて３０分間細胞に吸着させたのち、ＤＭＥＭ５−１
を添加し、５％ＣＯ２，３７°Ｃで約５時間培養する。

ＤＭＥＭを交換後、さらに約２４時間培養し、ついでＨ
ＡＴ培地に交換する。２〜３日毎にＨＡＴ培地を交換し
て培養を続ける。４週間後に出現してくるＴＫ＋になっ
た細胞の集落を分離して形質転換細胞を得る。

（４）　ＨＳ　Ｖ　−１表面糖蛋白ｇＢの産生これによ
り得られた形質転換マウスＬ細胞（発現ベクターｐＫＳ
ＶｇＢを用いた形質転換ｍ胞をＬｇＥ、およびｐＫＳｖ
ｇＢＴを用イタ形質転換体をＬ　ｇＢ　Ｔとする）の培
養上清を回収する。一方、この形質転換細胞を１％トリ
トン水溶液に浸すことによシ細胞内に産生されたｇＢを
細胞抽出液として回収する。

ＬｇＢおよびＬｇＢＴについての培養液と細胞抽出液を
Ｈ８■−１ｇＢに対する抗体を用い表１．ｇＢの産生量
（ｎｇ／ｌｎＪ−）ＬｇＢクローン ＬｇＢＴクローン この結果に示されるとおり、ＬｇＢにおいては細胞内の
みにＬ　ｇＢ　Ｔにおいては細胞内のみならずその培養
上清中にもｇＢの産生が確認された。

次にｇＢが産生されたＬｇＢの細胞抽出液とＬｇＢＴの
培養液のｇＢ量で３００ｎｇ相当量を各々モルモット１
０匹に１週問おきに３回皮下接種した。１ケ月後にそれ
らの血清についてｇＢ抗体産生量を酵素抗体法において
調べ一３３＝ たところすべてのモルモット血清中に中和抗体価の上昇
が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｈ３ＶｇＢのアミノ酸配列において疎水性の
強い領域を示し、第２図は、ＩｓＶｇＢ遺伝子を組込ん
だ組換えＤＮＡを示す。 第３図は、ＨＳ　Ｖ　ｇＢ遺伝子の塩基配列とそれによ
ってコードされるアミノ酸配列とを示す。第４図は、プ
ラスミドｐＧＢＸ、第５図は、プラスミドｐＧＢＸ（Ｅ
９および第６図は、プラスミドｐＧＢＸＴを示す。第７
図、第８図は、動物細胞の形質転換に用いられる組換え
ＤＮＡであるＩ）ＫＳＶｇＢ（１７図）とｐＫＳＶｇＢ
Ｔ（第８図）を示す。 工 区　　　　２ ０コ 駁　　　　　　　　　゛ １．４５４−ＴＩＣＵｒｆＪＣＴＣＴ口ＣＧ：　ＧＴＧ
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Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）大腸菌プラスミドに動物細胞用プロモーター領域
   を挿入したベクターにＨＳＶ糖蛋 白質遺伝子を組込んだ組換えＤＮＡ。
2. （２）組込まれたＨＳＶ糖蛋白質遺伝子が該糖蛋白質の
   カルボキシ末端側の疎水性の強い 領域をコードする部分を欠失させた遺伝子 である前記第（１）項記載の組換えＤＮＡ。
3. （３）組込まれたＨＳＶ糖タンパク質遺伝子がＨＳＶｇ
   Ｂ遺伝子である前記第（１）項記載の組換えＤＮＡ。
4. （４）組込まれたＨＳＶｇＢ遺伝子が、その下流（３′
   ）側の２ケ所のＴｔｈIII− I 部位によってはさまれる
   約４７０塩基のＤＮＡを欠失さ せた遺伝子である前記第（３）項記載の組換えＤＮＡ。
5. （５）組込まれたＨＳＶｇＢ遺伝子がｇＢのカルボキシ
   末端側の疎水性の強い領域および その下流からカルボキシ末端までの親水性 の領域の一部または全部をコードするＤＮ Ａを欠失させた遺伝子である前記第（３）項記載の組換
   えＤＮＡ。
6. （６）組込まれたＨＳＶｇＢ遺伝子がｇＢのカルボキシ
   末端側の疎水性の強い領域をコー ドするＤＮＡおよびその上流（１〜２００ｂｐ程度）と
   下流（１〜２００ｂｐ程度）のＤＮＡを欠失させた遺伝
   子である前記第（３）項記載の組換えＤＮＡ。
7. （７）該ＨＳＶ遺伝子がＨＳＶタイプ I 　ＫＯＳ株の
   遺伝子である前記第（１）項記載の組換えＤＮＡ。
8. （８）該ベクターが大腸菌プラスミドｐＢＲ＿３＿２＿
   ２にＳＶ＿４＿０ＤＮＡのプロモーター領域を挿入した
   ベクターである前記第（１）項記載の組換えＤＮＡ。
9. （９）該組換えＤＮＡがさらにチミジンキナーゼ（ＴＫ
   ）ＤＮＡを組込んでなる前記第（１）項記載の組換えＤ
   ＮＡ。
10. （１０）該組換えＤＮＡがさらにデヒドロ葉酸リダクタ
    ーゼ（ＤＨＦＲ）ＤＮＡを組込んで なる前記第（１）項記載の組換えＤＮＡ。
11. （１１）動物細胞に前記第（１）項記載の組換えＤＮＡ
    を作用させて形質転換させてなる形質転 換動物細胞。
12. （１２）該動物細胞がチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ＾−
    ）動物細胞である前記第（１１）項記載の形質転換動物
    細胞。
13. （１３）該動物細胞がＤＨＦＲ欠損（ＤＨＦＲ＾−）動
    物細胞である前記第（１１）項記載の形質転換動物細胞
    。
14. （１４）該動物細胞がマウスＬ、ＴＫ＾−細胞である前
    記第（１１）項記載の形質転換動物細胞。
15. （１５）該動物細胞がチャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨ
    Ｏ）、ＤＨＦＲ＾−細胞である前記第（１１）項記載の
    形質転換動物細胞。
16. （１６）該組換えＤＮＡをチミジンキナーゼＤＮＡと共
    に作用させてなる前記第（１４）項記載の形質転換動物
    細胞。
17. （１７）該組換えＤＮＡをＤＨＦＲ　ＤＮＡと共に作用
    させてなる前記第（１５）項記載の形質転換動物細胞。
18. （１８）前記第（１１）項記載の形質転換動物細胞を培
    養してＨＳＶ糖蛋白質を産生させ、それを 収集することを特徴とするＨＳＶ糖蛋白質 の製法。
19. （１９）該ＨＳＶ糖蛋白質がＨＳＶｇＢである前記第（
    １８）項記載の製法。
20. （２０）該ＨＳＶｇＢが形質転換動物細胞内に産生され
    るｇＢである前記第（１９）項の製法。
21. （２１）該ＨＳＶｇＢが形質転換動物細胞培養上清に分
    泌蛋白として産生されるｇＢである 前記第（１９）項の製法。