JPS6212792B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は強い突然変異阻害活性を有する新規物
質環状イミノ酸およびその製造方法に関する。 本発明者らは微生物の代謝産物中に突然変異阻
害物質（以下阻害物質と略記する）を系統的にジ
ヤーナル・オブ・アンチバイオチツクス
（Journal of Antibiotics）第32巻、第1118頁
（1979年）に記載された方法により探索し、フア
ボラス・ブラジリエンシス（Fr.）Fr.〔Favolus
brasiliensis（Fr.）Fr.（日本名ミナミアシグロ
タケ）〕K2013株の培養液から、一般式 （式中ｎは２または３である） で示される２種類の阻害物質を採取し、これらの
理化学的性状およびＸ線結晶回析により、物質の
構造を式 の５−シアノプロリン（以下と略記する）およ
び式 の６−シアノピペコリン酸（以下と略記する）
と決定し、これらの化合物は新規化合物であるこ
とを確認した。 本発明によつて得られる環状イミノ酸は細菌な
ど微生物の突然変異を阻害する性質により、有用
微生物（例えば抗生物質、生理活性物質、酵素、
アミノ酸等の生産能力を有する微生物）の突然変
異による生産能力の低下あるいは喪失を阻止し、
有用な性質を保持させるのに有効な物質であり、
さらに、ニワトリ肉腫ウイルスによるニワトリ胎
児線維芽細胞の腫瘍化を阻害する性質により、発
癌の予防剤としての有用性が期待される。 本発明により得られる環状イミノ酸および
の理化学的性状は次に示すとおりである。 は無色針状結晶として得られ、160℃以上で
徐々に褐変分解するが融解しない。水に溶けるが
有機溶媒にはほとんど溶けない。pKa′は2.3およ
び5.5に観察された。比旋光度は〔α〕^２６ _Ｄ＝−93゜
（C1.0、H₂O）である。呈色反応ではニンヒドリ
ン反応、ライドン・スミス反応およびテトラゾリ
ウム反応に陽性であり、また、過マンガン酸カリ
ウムを脱色する。紫外部吸収は末端吸収のみを示
す。赤外部吸収曲線は第１図に示すごとくであ
り、波数3450、3060、2950、2250、2100、1620、
1500、1445、1390、1320、1285、1150、1060、
1025、940、880、760および675に主な吸収帯を示
す。元素分析値は下記のとおりであつた。 C₆H₈N₂O₂として 計算値：
Ｃ 51.42％、Ｈ 5.75％、Ｎ 19.99％ 実測値：
Ｃ 51.54％、Ｈ 5.77％、Ｎ 19.76％ マススペクトルは第２図に示す如くである。こ
れらのデータから分子式C₆H₈N₂O₂が決定され、
Ｘ線結晶回析の結果は５−シアノプロリンと決
定された。 は無色針状結晶として得られ、160℃以上で
徐々に褐変するが融解しない。水に溶けるが有機
溶媒にはほとんど溶けない。比旋光度は〔α〕^２６ _Ｄ
＝−45゜（C1.0、H₂O）である。呈色反応ではニ
ンヒドリン反応、ライドン・スミス反応およびテ
トラゾリウム反応に陽性であり、また、過マンガ
ンカリウムを脱色する。紫外部吸収は末端吸収の
みを示す。赤外部吸収曲線は第３図に示すごとく
であり、波数3430、2950、2700、2500、2100、
1625、1590、1440、1405、1330、1305、1285、
1195、1165、1120、1090、1050、1030、985、
920、800および780に主な吸収帯を示す。元素分
析値は下記のとおりであつた。 C₇H₁₀N₂O₂として 計算値：
Ｃ 53.84％、Ｈ 6.35％、Ｎ 18.12％ 実測値：
Ｃ 54.12％、Ｈ 6.45％、Ｎ 18.17％ マススペクトルは第４図に示す如くである。こ
れらのデータから分子式C₇H₁₀N₂O₂が決定され、
Ｘ線結晶回析の結果は６−シアノペピコリン酸
と決定された。 本発明に使用される環状イミノ酸生産菌の１例
としてフアボラス・ブラジリエンシス（Fr.）Fr.
（日本名ミナミアシグロタケ）K2013株がある。
本菌株は昭和50年沖縄県において採取され培養さ
れた。本菌株の子実体は有茎（まれに茎が少な
い）、傘形、単生または集合して生ずる。生時肉
質であるが、乾燥するとコルク質となり脆くな
る。茎はコルク質で淡黄桃色ないし桃褐色、平滑
で輪紋はない。肉は桃黄色、コルク質、厚さ約２
mm、子実層の表面は淡黄褐色で孔は大きく、１〜
３μ×0.5〜1.5μ。孔壁は薄い。担子基は棍棒
状、幅５〜７μ。担子胞子は無色透明、薄膜、長
橢円型、内部に１〜２個の油滴があり、その大き
さは８〜10μ×３〜4.5μである。以上のような
菌学的性質から本菌株はバクシ（Bakshi）著
「インデイアン・ポリポアーズ（Indian
Polypores）」〔1970年、インデイアン・アグリカ
ルチヤー・リサーチ（Indian Agriculture
Research）発行〕第21〜22頁に記載されたフア
ボラス・ブラジリエンシス（Fr.）Fr.と同定さ
れ、K2013の菌株番号が与えられた。本菌株は昭
和55年３月22日に工業技術院微生物工業技術研究
所に保管委託を申請し、その寄託番号は第5458号
である。 本発明の環状イミノ酸の製造方法を実施するに
当つては、フアボラス属に属する当該物質生産菌
をキノコの公知の培養法で好気的に培養し、培養
物中に目的物質を生産せしめればよい。生産菌の
１例としてフアボラス・ブラジリエンシス（Fr.
）Fr.K2013株を用いた場合の培養法について以
下に説明する。 本発明では、生産培養法として固体培養法を用
いることもできるが、大量生産のためには液体培
養法を用いるのが有利である。接種源としては、
馬鈴薯寒天培地に断代培養されたK2013株の生育
した菌糸をそのまま用いても良いが、これを生産
培地に接種後２〜20日間静置培養し、菌糸の発育
を待つてから振盪培養したものを接種源とするほ
うが好ましい。K2013株は15〜45℃で発育する
が、培養温度は25〜30℃が好ましい。培地の栄養
源としては、キノコその他の微生物の培養に公知
の栄養源であり、K2013株が利用できるものがす
べて使用できる。炭素源としては、例えば、グル
コース、マルトース、サツカロース、デキストリ
ンおよび澱粉などを使用できる。さらに大豆油等
の植物油やラード等の動物性脂肪も消泡剤として
ばかりでなく炭素源として用いられる。窒素源と
しては、例えば、ペプトン、肉エキス、乾燥酵
母、酵母エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スチ
ープ・リカー、米糠および無機窒素などを使用で
きる。その外に、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウムなどの無機塩類や必要に応じて微量の
金属塩類を用いればよい。 培養条件は、通常の微生物の培養に用いられる
条件でよく、培養時間は環状イミノ酸が実質的に
蓄積される時間を選べばよい。例えば、グルコー
ス２％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.3％、リン
酸二水素カリウム0.3％、硫酸マグネシウム７水
和物0.1％の培地にK2013株を接種して28℃で好
気的に培養した場合の培養時間は３〜６日間であ
つた。 培養終了液は過あるいは遠心分離などの手段
により菌体を除き、得られた培養液は環状イミ
ノ酸を採取するための材料に用いられる。 培養液より環状イミノ酸を採取するには、イ
オン交換樹脂を用いたクロマトグラフイーによる
のが有利である。およびを結晶として単離す
る方法について以下に説明する。K2013の培養
液に活性炭を加え不純物を吸着させた後、活性炭
を別し、液を得る。液をダウエツクス１×
４（酢酸型、ダウケミカル社製）のカラムにとお
し、阻害物質を吸着させ、樹脂を水洗した後、
0.5規定酢酸で溶出する。活性画分を減圧下で濃
縮乾固し、得られる飴状物質を水に溶解する。溶
解液をアンバーライトIRA68（酢酸型、オルガノ
株式会社製）のカラムにとおし阻害物質を吸着さ
せ、０〜0.2規定まで直線的に濃度を高めた酢酸
で溶出する。活性画分を減圧下で濃縮乾固し、得
られる飴状物質を0.01モル酢酸ソーダに溶解す
る。溶解液を0.01モル酢酸ソーダで平衡化したダ
ウエツクス１×４のカラムにとおし阻害物質を吸
着させ、0.01モル酢酸ソーダで樹脂を洗浄した
後、0.15モル酢酸ソーダで溶出する。このとき、
先にが溶出され、続いてが溶出されるので
各々の画分に分取する。またはを含む画分
は、それぞれ別にダウエツクス１×４（OH型）
のカラムにとおし、阻害物質を吸着させ、0.1規
定酢酸で溶出する。活性画分を減圧下で濃縮乾固
し、得られる飴状物質を温水に溶解し、冷蔵庫に
放置するとき生じる結晶を過して集め、乾燥す
るとまたはの純粋な結晶が得られる。 上述したイオン交換クロマトグラフイー以外の
精製手段としては高速液体クロマトグラフイーが
有効であり、これによればさらに容易に収率よく
精製できる。 以上述べたように本発明によりおよびはイ
オン交換クロマトグラフイー等の手段により抽
出、精製され、粗製の固体あるいは溶液として、
純粋の結晶あるいは溶液として、あるいはその塩
として純粋または粗製の状態で採取される。 次に、本発明により明らかにされたおよび
の生物学的活性について記載する。活性の測定
は、前述のジヤーナル・オブ・アンチバイオチツ
クスに記載された方法により行なつた。および
は化学変異剤によるサルモネラ・チフイムリウ
ム（Salmonella typhimurium）TA1535あるいは
サルモネラ・チフイムリウム（Salmonella
typhimurium）TA100の突然変異を強く阻害し、
さらにニワトリ肉腫ウイルスによるニワトリ胎児
線維芽細胞の腫瘍化を阻害する化合物である。

【表】 表１に示すようにおよびはＮ−エチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ENNG）
によるサルモネラ・チフイムリウムTA1535に突
然変異を阻害し、一方、1mcg／mlの濃度では菌
の生育をほとんど阻害しない。また、および
はアルキル化剤による置換型変異ばかりでなく、
４−ニトロキノリン−１−オキシドまたは２（２
−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アク
リルアミド（AF−２）によるフレイムシフト型
変異も阻害する。即ち、は8mcg／mlで４−ニ
トロキノリン−１−オキシドおよびAF−２によ
るサルモネラ・チフイムリウムTA100の突然変
異をそれぞれ55％および66％阻害し、この濃度で
は菌の生育をほとんど阻害しない。 さらに、およびは細菌の突然変異ばかりで
はなく、ニワトリ肉腫ウイルスによるニワトリ胎
児線維芽細胞の腫瘍化を阻害する。

【表】 表２に示すようにおよびはニワトリ胎児線
維芽細胞に対し、生育をほとんど阻害しない濃度
でニワトリ肉腫ウイルスによる腫瘍化を阻害す
る。 およびのマウスに対する毒性は静注で25
mg／Kgでは全く異常をみとめなかつた。 以上記したように、およびこれらの関連化
合物は細菌など微生物の突然変異を阻害すること
により、微生物の有する有用な特性を安定的に保
持させるのに有効な物質である。 以下およびの製造方法について実施例を示
すが、本発明によりおよびの性状、生産方
法、抽出精製法が明らかにされたのでこの明細書
に書かれた方法を修飾した方法が容易に設定され
る。本発明はそのすべての修飾法を包括し、実施
例に限定されるものではない。 実施例 １ フアボラス・ブラジリエンシス（Fr.）Fr.
K2013株の寒天斜面（馬鈴薯−グルコース培地）
培養の生育した菌糸を約0.2〜0.3cm²かきとり、こ
れをグルコース2.0％、ペプトン0.5％、酵母エキ
ス0.3％、リン酸二水素カリウム0.3％、硫酸マグ
ネシウム７水和物0.1％（PHは修正せず、通常5.6
〜5.8）を含む液体培地（500ml容坂口フラスコに
培地125mlを入れる）に接種し、28℃で４日間静
置培養後、さらに４日間振盪培養（130回転往復
振盪／分、振幅８cm）したものを接種源とした。
500ml容坂口フラスコに上記組成の液体培地125ml
ずつ分注し、120℃、20分間滅菌し、これに上記
接種源５mlずつを接種して、28℃、６日間上記と
同様振盪培養した。培養後、菌体を別し、この
液10に100ｇの活性炭を加え、ゆつくり撹拌
しながら30分間放置した。活性炭を別後、得ら
れた液を強塩基性アニオン交換樹脂ダウエツク
ス１×４（酢酸型、50〜100メツシユ、ダウケミ
カル社製）１を詰めたカラムにとおし、およ
びを吸着させた。水洗後、0.5規定酢酸で溶出
し、活性画分を減圧濃縮、乾固した。得られた飴
状の粗物質1.4ｇを水200mlに溶解し、PH6.0に調
節後、中塩基性アニオン交換樹脂アンバーライト
IRA68（酢酸型、オルガノ株式会社製）200mlを
詰めたカラムにとおし、阻害物質を吸着させた。
水洗後、０（１）〜0.2（１）規定の範囲で
直線的に酢酸の濃度を上げつつ溶出した。活性画
分を減圧濃縮、乾固し、およびの混合物595
mgを得た。これを水100mlに溶解し、PH6.0に調節
後0.01モル酢酸ソーダで平衡化したダウエツクス
１×４（100〜200メツシユ）200mlのカラムにと
おし阻害物質を吸着させ、0.15モル酢酸ソーダで
溶出した。先に溶出される活性画分はを含み、
後で溶出される活性画分はを含む。両画分を
別々にダウエツクス１×４（OH型、50〜100メ
ツシユ）500mlを詰めたカラムにとおし、また
はを吸着させ、水洗後、0.1規定酢酸で溶出し
た。活性画分を減圧濃縮、乾固し、得られた飴状
物質を温水に溶解後、冷蔵庫に放置しておよび
の針状結晶をそれぞれ117mgおよび10mgを得
た。 実施例 ２ 実施例１と同様にして得られた培養液40に
活性炭200ｇを加え、30分間放置後、活性炭を
別し、液をダウエツクス１×４（酢酸型、50〜
100メツシユ）４を詰めたカラムにとおした。
0.5規定酢酸で溶出し、活性画分を減圧濃縮、乾
固した。得られた飴状物質６ｇを１の水に溶解
し、PH6.0に調節後、ダウエツクス１×４（酢酸
型、100〜200メツシユ）600mlを詰めたカラムに
とおし、0.2規定酢酸で溶出した。活性画分を減
圧濃縮、乾固して得られた淡黄色飴状物質を水10
mlに溶解し、高速液体クロマトグラフイー（ウオ
ータース社製システム500、逆相シリカゲル、展
開溶媒は水）を行ない、およびの針状結晶を
それぞれ810mgおよび885mg得た。 実施例 ３ 30容ジヤーフアーメンターに実施例１の組成
の液体培地10を入れ、120℃、20分間滅菌後、
これに実施例１と同様にして得た接種源600mlを
接種し、28℃、通気量５／分、撹拌回転数250
回転／分で４日間培養後、実施例１と同様の操作
を行ない、の結晶105mg、の結晶７mgを得
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は５−シアノプロリンを臭化カリ錠とし
てとつた赤外部吸収スペクトル曲線を示し、第２
図は１−アセチル−５−シアノプロリンと１−ア
セチル−５−シアノプロリンメチルエステル混合
物のマススペクトルを示し、第３図は６−シアノ
ピペコリン酸を臭化カリ錠としてとつた赤外部吸
収スペクトル曲線を示し、第４図は１−アセチル
−６−シアノピペコリン酸と１−アセチル−６−
シアノピペコリン酸メチルエステルの混合物のマ
ススペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中ｎは２または３である） で示される環状イミノ酸。 ２ 式 で示される特許請求の範囲第１項記載の環状イミ
   ノ酸。 ３ 式 で示される特許請求の範囲第１項記載の環状イミ
   ノ酸。 ４ フアボラス属に属し、一般式 （式中ｎは２または３である） で示される環状イミノ酸を生産する能力を有する
   菌を好気的に培養し、培養物より環状イミノ酸を
   採取することを特徴とする一般式 （式中ｎは２または３である） で示される環状イミノ酸の製造方法。 ５ 環状イミノ酸の生産菌がフアボラス・ブラジ
   リエンシス（Fr.）Fr.（日本名ミナミアシグロタ
   ケ）K2013株である特許請求の範囲第４項記載の
   製造方法。 ６ 環状イミノ酸が５−シアノプロリンである特
   許請求の範囲第４項または第５項記載の製造方
   法。 ７ 環状イミノ酸が６−シアノピペコリン酸であ
   る特許請求の範囲第４項または第５項記載の製造
   方法。 ８ フアボラス属に属する環状イミノ酸生産菌の
   培養物より環状イミノ酸を採取するに当り、塩基
   性アニオン交換樹脂を用いて５−シアノプロリン
   および６−シアノピペコリン酸を分別する採取方
   法。