JPH0737988B2 - イオン捕捉イムノアッセイ法および装置 - Google Patents

イオン捕捉イムノアッセイ法および装置

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JPH0737988B2
JPH0737988B2 JP1019408A JP1940889A JPH0737988B2 JP H0737988 B2 JPH0737988 B2 JP H0737988B2 JP 1019408 A JP1019408 A JP 1019408A JP 1940889 A JP1940889 A JP 1940889A JP H0737988 B2 JPH0737988 B2 JP H0737988B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般にイムノアッセイ装置および方法に関す
る。さらに詳しくは、本発明は、均一イムノアッセイを
行うのに有用な装置および方法に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 種々の分析手順および装置が、生物学的流体または他の
物質中に存在しているかもしれない興味の持たれるまた
は臨床的に重要な物質の存在および／または濃度を決定
するためのアッセイに一般に用いられている。そのよう
な物質は一般に「分析対象物」と称され、抗体、抗原、
医薬、ホルモンなどが含まれる。
イムノアッセイ法は高等生物の免疫系の機構を利用する
ものであり、その場合、生物にとって病原性または外来
の抗原の存在に対応して抗体が産生される。特定の抗原
に応答してその抗原と結合することのできる１種または
２種以上の抗体が産生され、そのことによって高度に特
異的な反応機構が生み出される。この反応機構は、生物
学的試料中の特定の抗原の存在または濃度を決定するた
めにインビボで用いることができる。
固相イムノアッセイ法は、一般に用いられているイムノ
アッセイ法である。数多くの固相イムノアッセイ法があ
り、それらにおいてはディップスティック（dipstic
k）、試験ストリップ、紙、ファイバーマトリックス、1
/4インチビーズまたは他の固体物質などの「固相」上で
の反応によって分析対象物の存在が示される。
従来の固相酵素イムノアッセイ形態の一つには、繊維性
マトリックスに結合したポリスチレンビーズやラテック
ス微細粒子のような不溶性固相物質に結合した抗分析対
象物抗体（捕捉抗体）が用いられている。第二の抗分析
対象物抗体は酵素で標識して可溶性の指示試薬を生成さ
せ、この酵素は酵素基質と反応して検出可能な生成物を
生成する（第二の抗体は、放射性同位体、蛍光団、化学
発光団、他の容易に検出可能なシグナル生成体で標識す
ることができる）。これら２つの抗体結合体は、試験試
料中に分析対象物が存在するときには分析対象物と不溶
性の３成分系免疫複合体（「サンドイッチ」）を生成す
る。酵素基質の添加および生成物の検出または測定に先
立って、反応混合物から固相に結合した免疫複合体を物
理的に除くことにより、免疫複合体を過剰の指示試薬お
よび他の妨害物質から分離する。酵素基質を加えると酵
素基質は指示体の酵素部分と反応し、その場合、固相結
合サンドイッチに付随する標識抗体の量は試験試料中の
分析対象物の量に正比例する。
他の方法は競合アッセイによるものである。この場合も
捕捉機構には不溶性固相に結合した抗分析対象物抗体を
用いるが、指示体として第二の抗体よりもむしろ酵素標
識分析対象物を用い、これを試験試料および固相ととも
に同時にインキュベートする。従って、競合アッセイに
おいては指示体は固相との結合については試料中に存在
する分析対象物と競合し、２成分系の免疫複合体、すな
わち固相／分析対象物結合体および固相／指示体結合体
を生成する。競合アッセイにおいては、捕捉された指示
試薬の量は試験試料中に存在する分析対象物の量と反比
例する。
上記アッセイ法は、その有用性が大きいにもかかわらず
幾つかの欠点を有する。第一に、可溶性および不溶性の
試薬および流体試料の反応混合物が不均一系であること
によって反応の速度が遅くなる。反応混合物中で不溶性
固相系、試験試料中の遊離の分析対象物、可溶性指示試
薬および新たに生成した不溶性複合体との間で平衡が達
せられるまでに長期のインキュベート期間が必要であ
る。第二に、捕捉試薬を固相物質に付着させるための吸
着などの従来の方法により、固相物質が分析対象物以外
の物質と容易に結合するようになる。このことは非特異
的結合と呼ばれ、明確な結果の検出を妨害する。第三
に、蛍光偏向イムノアッセイ（FPIA）や酵素多重（mult
iplied）イムノアッセイ技術（EMIT）などのある種の方
法では均一アッセイの利点が得られ固相競合結合イムノ
アッセイの幾つかの問題が克服されるが、試料のバック
グラウンドの存在下でシグナルを検出する点で欠点を有
する。
（課題を解決するための手段） 本発明は新規なアッセイ法および分離手順を提供するも
のである。本発明によれば、捕捉試薬および指示試薬の
両方を溶液中に存在させることができ、反応速度が遅い
という問題を回避することができる。
本発明の分離手順には、荷電物質に結合した可溶性の特
異的結合物質、すなわち捕捉試薬、および該荷電物質と
反対に荷電した不溶性の固相物質を用いる。分析対象物
を含んでいると思われる流体試料を溶液状態の捕捉試薬
と混合して荷電複合体を生成させる。結合が完了してか
らこの溶液を反対に荷電した固相物質と接触させて誘
引、付着し、新たに生成した複合体を流体試料から分離
する。
さらに指示試薬、すなわちシグナルを生成することが可
能な標識に結合させた第二の分析対象物特異的結合物質
を添加することによっても、流体試料中の分析対象物を
検出するために本発明を用いることができる。指示試薬
は競合アッセイまたはサンドイッチアッセイにおいて用
いることができ、その場合、指示試薬は分析対象物およ
び捕捉試薬と接触して標識されかつ荷電された捕捉試薬
／分析対象物／指示試薬複合体を生成する。ついでこの
複合体は反対に荷電した固相物質と接触させることによ
って溶液から分離することができ、分析対象物の存在ま
たは量は指示試薬の標識を検出することによりモニター
する。
さらに、反対に荷電した捕捉試薬およびアッセイ複合体
に誘引、付着させるために固相物質に結合させることの
できる特定の荷電分子種、とりわけポリマー性イオン性
物質と同様に、数多くの荷電固相物質を用いることがで
きる。荷電物質を用いることにより、分離方法が非常に
特異的であり、非特異的結合を最小に抑えることがで
き、かつ感度の高いアッセイ手順を得ることができる。
知られたアッセイ技術においては、捕捉試薬（一般には
抗体）を固相に結合させ、流体試験試料を固相を通して
または固相上を通過させて抗体が溶液中の分析対象物を
誘引、分離することができるようにする。従って、抗体
の分析対象物に対する親和性により試験試料から分析対
象物を捕捉する効率が制限され、反応混合物の不均一性
（すなわち、可溶性の分析対象物および固相上に固定化
された捕捉抗体）と相まって低い反応速度、および固相
中に試料を短い間「通過（pass−through）」させる間
の分離が不充分な結果となる。
本発明においては捕捉試薬および指示試薬の両者はとも
に可溶性であり、流体試験試料中に分散されて均一な反
応混合物を生成する。均一な反応混合物は、荷電捕捉抗
体および標識抗体が抗原分析対象物と複合体を形成する
機会を増加させると考えられている。溶液中に分散した
分析対象物および荷電捕捉抗体は、「通過」技術におけ
る結合に比べて反応速度と分析対象物／抗体の結合の確
率との両方を増大させると考えられている。
荷電捕捉抗体と分析対象物（および／または指示試薬）
の複合体が該荷電捕捉抗体とは反対に荷電した固相中を
通過するときには、複合体を溶液から分離する際の効率
を支配するものは、反対に荷電した分子種間でのイオン
性の引力である。イオン性の引力は、とりわけ複数のポ
リカチオン性およびポリアニオン性のものを使用する場
合に、他の分離技術における抗原に対する抗体の引力よ
りも大きな引力が得られるように選択することができ
る。本発明の他の利点は、「イオン捕捉」法により妨害
物質の固相物質上への非特異的吸着を最小限に抑えるこ
とができるため、分析の正確さが向上することである。
すなわち本発明は、流体試料中の分析対象物の検出方法
であって、 （ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物
質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬、 （ii）分析対象物に対して特異的で検出可能なシグナル
を生成することのできる標識に結合した第二の結合成分
からなる可溶性指示試薬、および （iii）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相
物質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬と接触させることによって
捕捉試薬を試料中の分析対象物と結合させて捕捉試薬／
分析対象物複合体を生成させ、 （ｃ）該捕捉試薬／分析対象物複合体を該指示試薬と接
触させることによって該指示試薬と分析対象物と結合さ
せて捕捉試薬／分析対象物／指示試薬サンドイッチ複合
体を生成させ、 （ｄ）試料を該固相物質と接触させることによって該固
相物質を該サンドイッチ複合体の該第一の荷電物質に誘
引、付着させて該サンドイッチ複合体を試料から分離
し、ついで （ｅ）試料中の分析対象物の存在または量の指標とし
て、該固相または未結合指示試薬に付随する該標識を検
出する ことを特徴とする方法、 および流体試料中の分析対象物の検出方法であって、 （ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物
質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬、 （ii）該第一の結合成分に対して特異的で検出可能なシ
グナルを生成することのできる標識に結合した第二の結
合成分からなる可溶性指示試薬、および （iii）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相
物質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬および該指示試薬と接触さ
せることによって、該捕捉試薬と結合することについて
試料中の分析対象物を該指示試薬と競合させて捕捉試薬
／分析対象物複合体および捕捉試薬／指示試薬複合体を
生成させ、 （ｃ）試料を該固相物質と接触させることによって該固
相物質を該第一の荷電物質に誘引、付着させて該複合体
を試料から分離し、ついで （ｄ）試料中の分析対象物の存在または量の指標とし
て、該固相または未結合指示試薬に付随する該標識を検
出する ことを特徴とする方法を提供するものである。
さらに本発明は、流体試料から分析対象物を分離する方
法であって、 （ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物
質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬、
および （ii）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相物
質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬と接触させることによって
捕捉試薬を試料中の分析対象物と結合させて捕捉試薬／
分析対象物複合体を生成させ、ついで （ｃ）試料を該固相物質と接触させることによって該固
相物質を該第一の荷電物質に誘引、付着させて該捕捉試
薬／分析対象物複合体を試料から分離する ことを特徴とする方法をも提供するものである。
本発明はまた、（ａ）分析対象物に対して特異的で第一
の荷電物質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕
捉試薬、（ｂ）分析対象物に対して特異的で検出可能な
シグナルを生成することのできる標識に結合した第二の
結合成分からなる可溶性指示試薬、および（ｃ）該第一
の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相物質からなるこ
とを特徴とする、流体試料中の分析対象物の存在または
量を決定するためのサンドイッチイムノアッセイキッ
ト、および（ａ）分析対象物に対して特異的で第一の荷
電物質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試
薬、（ｂ）捕捉試薬に対して特異的で検出可能なシグナ
ルを生成することのできる標識に結合した第二の結合成
分からなる可溶性指示試薬、および（ｃ）該第一の荷電
物質と反対に荷電した不溶性固相物質からなることを特
徴とする、流体試料中の分析対象物の存在または量を決
定するための競合イムノアッセイキットをも提供する。
さらに本発明は、第一の荷電物質に結合した特異的結合
成分、および該第一の荷電物質と反対に荷電した第二の
荷電物質からなり、該第一の荷電物質および該第二の荷
電物質は互いにイオン結合的に結合している配合物をも
提供する。
本発明のアッセイ方法および試薬は、種々の形態のイム
ノアッセイに用いることができる。しかしながら、本発
明は免疫反応アッセイに限られるものではない。特異的
結合成分を用いたあらゆるアッセイを行うことが可能で
ある。本明細書にいう「特異的結合成分」とは、特異的
結合ペア、すなわち一方の分子が科学的または物理的手
段により第二の分子と結合するような２つの異なる分子
のうちの一方をいう。従って、抗原と抗体との特異的結
合ペアに加えて、他の特異的結合ペアとしてはビチオン
とアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド
配列、エフェクター分子とレセプター分子、酵素補助因
子と酵素、酵素インヒビターと酵素などが含まれる。さ
らに特異的結合ペアには、もともとの特異的結合成分の
類似体、たとえば分析対象物類似体が含まれる。免疫反
応性の特異的結合成分には抗原、ハプテン、抗体および
これらの複合体が含まれ、また組換えDNA技術により生
成されたものも含まれる。
サンドイッチアッセイにおいては、アニオンまたはカチ
オンのような荷電物質と結合させた特異的結合成分を含
む可溶性捕捉試薬が用いられる。イオン性分子はモノマ
ーまたはポリマーであってよい。特異的結合成分が免疫
反応成分であるときは、分析対象物に特異的な抗体、抗
原またはこれらの複合体であってよく、また抗体を用い
るときには、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗
体、抗体断片、または組換え抗体、およびそれらの混合
物、または抗体と他の特異的結合成分との混合物であっ
てよい。指示試薬を、分析対象物を含有していると思わ
れる試験試料、およびシグナル生成化合物（たとえば酵
素、または蛍光もしくは化学発光化合物）で標識した第
二の特異的結合成分を含む指示試薬と接触させる。これ
らの試薬は、単独もしくは組み合わせて同時に混合する
かまたは逐次加えることができる。結合反応により捕捉
試薬／分析対象物／指示試薬複合体が生成される。アッ
セイにはまた、捕捉試薬とは反対に荷電しているかまた
はアニオン性もしくはカチオン性ポリマーのような反対
に荷電した物質を保持している固相物質を用いることに
より、得られた可溶性複合体を過剰の試薬および試験試
料から分離する工程が含まれる。反対に荷電した固相物
質は、反対の荷電間の相互作用により捕捉試薬／分析対
象物／指示試薬複合体に誘引、付着する。固相物質はい
かなる相当な物質であってもよいが、紙、ガラスマイク
ロファイバー物質などの多孔質物質が好ましい。
固相物質上に保持された複合体は、指示試薬について固
相を調べることにより検出する。試料中に分析対象物が
存在するときは、固相物質上には標識が存在するであろ
う。固相上の標識の量は、試料中の分析対象物の量に正
比例する。酵素標識は、酵素基質の添加のあとに視覚に
より検出するかまたは分光学的に測定することができ
る。または、用いた標識の種類に依存して、蛍光、化学
発光、放射能放射を測定することにより標識を検出する
ことができる。
本明細書において「分析対象物」とは、本発明を用いて
検出または試料から分離するための物質をいう。分析対
象物としては、天然に特異的結合成分（たとえば抗体）
が存在するかまたは特異的結合成分を調製することがで
きればいかなる物質であってもよい。従って、分析対象
物とは、アッセイ中の特異的結合成分の１種または２種
以上と結合することのできる物質である。「分析対象
物」にはまた、あらゆる抗原性物質、ハプテン、抗体お
よびこれらの組合わせが含まれる。特異的結合ペアの一
方として分析対象物は、ビタミンB12の決定のために捕
捉試薬および／または指示試薬中に内因子タンパク質を
用いること、または炭水化物の決定のために捕捉試薬お
よび／または指示試薬中にレクチンを用いることのよう
に、天然に存在する特異的結合ペアの他方により検出す
ることができる。分析対象物には、タンパク質、ペプチ
ド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、医薬
（治療目的で投与されるものおよび不法目的で投与され
るもとを含む）、細菌、ウイルス、およびこれらの代謝
産物またはこれらに対する抗体が含まれる。
本発明はまた競合アッセイを行うためにも用いることが
できる。競合アッセイ形態においても、可溶性捕捉試薬
は、アニオン性ポリマーまたはカチオン性ポリマーのよ
うな荷電物質に結合した特異的結合成分を含んでいる。
捕捉試薬を試験試料と指示試薬との両方に接触させる。
指示試薬にはシグナル生成化合物で標識した分析対象物
または分析対象物類似体が含まれている。反応が起こ
り、その結果、（１）捕捉試薬／試験試料分析対象、お
よび（２）捕捉試薬／指示試薬からなる可溶性複合体が
生成される。
ついで反応混合物を反対に荷電した固相物質と接触させ
ることにより、可溶性複合体を過剰の試薬および試験試
料から取り除く。複合体は、反対に荷電した捕捉試薬の
引力により固相上に保持されている。固相上に保持され
た複合体は指示試薬上の標識により検出される。競合ア
ッセイにおいては、固相上の標識の量は試料中の分析対
象物の量に反比例する。従って、陽性の試験試料からは
陰性のシグナルが得られる。
たとえばテオフィリンのアッセイにおいては、抗テオフ
ィリン抗体（モノクローナルかまたはポリクローナル）
をアニオン性物質に結合させて可溶性捕捉試薬を生成さ
せることができ、この抗体に対する結合を可溶性標識テ
オフィリン（すなわち指示試薬）と試験試料の非標識テ
オフィリンとの間で競合させることができる。インキュ
ベートした後、均一混合物をカチオンでコーティングし
た多孔質固相物質中に通すことができる。捕捉試薬と固
相の間における反対に荷電したイオン種間での引力によ
り、免疫複合体が反応混合物から分離される。ついで指
示試薬からのシグナルを検出することができる。この場
合、試験試料中のテオフィリンが高レベルであると固相
に付随するシグナル生成は減少するであろう。
同様に本発明は、捕捉試薬／分析対象物／指示試薬から
なる免疫複合体を生成するサンドイッチアッセイおよび
その変法、たとえば捕捉試薬／分析対象物／抗分析対象
物抗体／指示試薬からなる複合体を生成する間接イムノ
アッセイに用いることができる。従って、指示試薬は、
サンドイッチアッセイにおいては分析対象物に対する、
競合アッセイにおいては捕捉試薬に対する、間接アッセ
イにおいてはそれ自身分析対象物に対して特異的な補助
特異的結合成分に対する、特異的結合ペアの一方を含ん
でいる。同様に捕捉試薬は、サンドイッチアッセイにお
いては分析対象物に対する、競合アッセイにおいては分
析対象物および指示試薬に対する、間接アッセイにおい
てはそれ自身分析対象物に対して特異的な補助特異的結
合成分に対する、特異的結合ペアの一方を含んでいる。
本発明はまた、物質を溶液から分離するためにのみ用い
ることもできる。たとえば試験試料から分析対象物を分
離する目的のためには、指示試薬を用いることなく捕捉
試薬および固相物質を用いることができる。さらに捕捉
試薬を、捕捉試薬の荷電物質とは反対に荷電した第二の
可溶性荷電物質と接触させることができる。第二の可溶
性荷電物質は試料を固相物質に接触させる前は固相物質
上に保持されていないが、生成するアッセイ複合体が固
相上に保持されるように捕捉試薬に誘引、付着する。
指示試薬 指示試薬は、特異的結合成分に結合した標識からなる。
指示試薬は、試験試料中の分析対象物の量に比例したレ
ベルで検出可能なシグナルを生成する。一般に指示試薬
は固相物質上に捕捉された後に検出または測定される
が、未結合指示試薬もまた測定してアッセイの結果を決
定することができる。
指示試薬の特異的結合ペアの一方は抗体かまたは抗原で
ある場合の他に、ビオチンかまたはアビジン、炭水化物
かまたはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェク
ターかまたはレセプター分子、酵素補助因子かまたは酵
素、酵素インヒビターかまたは酵素などを含むいかなる
特異的結合ペアの一方であってよい。免疫反応性の特異
的結合成分は抗体、抗原または抗体／抗原複合体であっ
てよく、これらはサンドイッチアッセイの場合における
ように分析対象物に対してか、競合アッセイの場合にお
けるように捕捉試薬に対してか、または間接アッセイの
場合におけるように補助特異的結合成分に対して結合す
ることができる。抗体を用いる場合には、モノクローナ
ル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、組換え抗体、
それらの混合物、または抗体と他の特異的結合成分との
混合物であってよい。それら抗体の調製法および特異的
結合成分として使用する適合性については当業者によく
知られている。
指示試薬の標識は、外部手段により検出、測定が可能な
シグナルを生成することができる。種々の標識には、色
原体、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合
物、および直接目に見える標識が含まれる。特定の標識
を選択することは重要ではないが、それ自身でまたは１
または２以上の物質と組み合わせてシグナルを生成する
ことができる。
標識かまたは特異的結合成分を変えることにより種々の
異なった指示試薬を得ることができる。本発明の一実施
態様においては、指示試薬は酵素標識に結合したモノク
ローナル抗体、たとえば抗癌胎児性抗原抗体断面に結合
したアルカリホスファターゼからなる。
捕捉試薬 本発明の捕捉試薬は、二つの基本成分からなる。第一の
成分は特異的結合成分であり、これはサンドイッチアッ
セイの場合におけるように分析対象物に対して、競合ア
ッセイの場合におけるように指示試薬および分析対象物
に対して、または間接アッセイの場合におけるようにそ
れ自身分析対象物に対して特異的な補助特異的結合成分
に対して特異的である。第二の成分は第一の成分に結合
した荷電物質である。これら２成分の結合は本質的に不
可逆的であり、共有結合機構を含むことができる。
荷電物質としては、アニオン性またはカチオン性のモノ
マーまたはポリマーが挙げられる。たとえばアニオン性
ポリマーには、ポリグルタミン酸（PGA）、アルブミン
のようなアニオン性タンパク質または誘導タンパク質、
ヘパリンもしくはアルギン酸のようなアニオン性糖類、
ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸、および適当なpH
（たとえば４〜10のpH範囲）で正味の負の荷電を有する
ポリアミノ酸が含まれる。さらに特異的結合成分を２種
以上の荷電モノマーまたはポリマーと結合させて捕捉試
薬に付随する正味の荷電を増加させることができる。
捕捉試薬の特異的結合成分は、指示試薬の特異的結合成
分と同じように、他方と特異的に結合することのできる
いかなる分子であってもよい。捕捉試薬の特異的結合成
分は、抗体、抗原または抗体／抗原複合体などの免疫反
応性成分であってよい。抗体を用いる場合には、モノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、それら
の混合物、または抗体と他の特異的結合成分との混合物
であってもよい。
固相物質 本発明にはまた固相物質が含まれる。固相物質は固有の
荷電および捕捉試薬に対する誘引能により選択すること
ができ、たとえばメチル化ウール、ナイロン、正に荷電
した特定のガラスが含まれる。固相物質はまた、捕捉物
質の荷電物質とは反対に荷電した別の荷電物質を保持し
ていることができる。たとえば、アニオン性の物質を捕
捉試薬に結合させ固相物質上にはカチオン性の物質を保
持させることができるし、この逆にカチオン性の物質を
捕捉試薬に結合させアニオン性の物質を固相物質上に保
持させることもできる。
一旦複合体が生成されると、固相を分離手段として用い
る。すなわち、均一な反応混合物を固相物質と接触さ
せ、固相物質と捕捉試薬との反対の荷電間での引力によ
り新たに生成した複合体が固相物質上に保持される。
本発明のためのアッセイ装置は多くの形態を有している
ことができるが、そのうちの幾つかは固相物質として選
択した物質に依存している。固相物質にはあらゆる適当
な多孔質物質が含まれる。ここで「多孔質」とは、物質
が、その中を流体が流れるかまたは容易に通過すること
ができるものであることを意味する。本発明において、
固相物質には１種または２種以上のアッセイ試薬を含む
１または２以上の相を有するポーアンドフロースルー
（pour and flow−through）アッセイ装置に使用するた
めのファイバーガラス、セルロースまたはナイロンパッ
ド；ディップアンドリードアッセイのためのディップス
ティック；試薬の１種またはすべてが固相物質の単片の
別々のゾーン中に含まれているクロマトグラフ（たとえ
ばペーパークロマトグラフ）または薄層クロマトグラフ
（たとえばニトロセルロース）法に用いるための試験ス
トリップ；または当業者によく知られた他の多孔質物質
が含まれる。しかしながら、本発明の固相物質はこれら
の多孔質物質に限られるものではない。固相物質にはま
た、1/4インチビーズ、磁性ビーズ、ラテックス粒子、
ガラス試験管、または固有の荷電を有するかまたは荷電
物質を保持することのできる他の物質が含まれる。
天然の物質、合成物質、または合成的に修飾した天然物
質を固相物質に用いることができ、たとえば紙やセルロ
ース誘導体（酢酸セルロース、ニトロセルロースなど）
などのセルロース物質のような多糖類；シリカ；不活化
アルミナ、けいそう土、MgSO4、または多孔質ポリマー
マトリックス（ポリマーとしては塩化ビニル、塩化ビニ
ル−プロピレン共重合体および塩化ビニル−酢酸ビニル
共重合体など）中に均一に分散された他の無機細粉物質
のような無機物質；天然に存在す布（たとえば綿）およ
び合成の布（たとえばナイロン）；シリカゲル、アガロ
ース、デキストランおよびゼラチンのような多孔質ゲ
ル；ポリアクリルアミドのようなポリマーフィルムなど
が含まれる。固相物質は適度の強度を有しているかまた
は支持体によって強度が与えられなければならず、また
検出可能なシグナルの生成を妨害することがあってはな
らない。
好ましい固相物質には、名目上の厚さが0.33mmの「ファ
ットマン（Whatman）934−AH」、アボット・ラボラトリ
ーズ（アボットパーク、IL、60064）製の使捨てIMxTMウ
エッジおよびテストパック（Test Pack）TM（ファイバ
ーマトリックス）装置のような多孔質ファイバーガラス
物質が含まれる。そのような物質の厚さは重要ではな
く、アッセイしようとする試料または分析対象物の性
質、たとえば試験試料の流動性などに依存する選択の問
題に過ぎない。
固相物質の固有荷電を変化または増強させるために、荷
電物質を固相物質に直接コーティングするか、または荷
電物質を微細粒子上にコーティングした後に微細粒子を
固相ベース物質に保持させることができる。別法とし
て、微細粒子を単独で荷電固相物質として用いることが
できる。可能な荷電物質の一つはポリマーカチオンであ
り、これは固相物質により保持され、反対に荷電した分
子種を誘引、保持し、捕捉試薬を介してアッセイ複合体
の一部となる。
非常に多種の専売ポリカチオンが入手でき、その例とし
ては、ガフコート（Gaf Quat）TM（GAFコーポレーショ
ン、ウエイン、NJ、07470）、ジエチルアミノエチル−
デキストラン（シグマケミカル、セントルイス、M
o.）、およびセルコート（Celquat）TML−200およびセ
ルコートTMH−100（ナショナル・スターチ・アンド・ケ
ミカル・コーポレーション（National Starch ＆ Chemi
cal Corporation）、ブリッジウオーター、NJ、08807）
などが挙げられる。
補助物質 本発明にとって重大なことではないが、荷電物質はまた
粒子（たとえば「ビーズ」や「微細粒子」）上にコーテ
ィングすることもできる。これらの粒子は、カラム中に
保持することにより、または可溶性試薬と試験試料との
混合物中に懸濁させることによって固相としても働くこ
とができるし、粒子それ自身を固相ベース物質に保持お
よび固定化することができる。ここで「保持および固定
化」とは、粒子が一担固相物質上に置かれたら固相物質
内の他の位置へは実質的に移動できないことを意味す
る。粒子はポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリプ
ロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、
ポリアクリロニトリル、ポリカーボネートまたは同様の
物質からなる微細粒子物質のあらゆる適当なタイプから
当業者により選択することができる。粒子のサイズは重
大ではないが、粒子の平均直径は用いた固相ベース物質
の平均孔径よりも小さいのが好ましい。
「補助特異的結合成分」とは、捕捉試薬および指示試薬
の特異的結合成分に加えてアッセイまたは分離手順に用
いたあらゆる特異的結合ペアの一方をいう。以下の実施
例にも示すように、１種または２種以上の補助特異的結
合成分をアッセイに用いることができる。
つぎに本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、
本発明はこれらに限られるものではない。
実施例（癌胎児性抗原のサンドイッチアッセイ） （１）捕捉試薬の調製 以下に述べる工程に従って、抗体／ポリグルタミン酸
（PGA）結合体、すなわち抗体／アニオン性ポリマー捕
捉試薬を調製した。
（ａ）追跡可能なアニオン性ポリマーの調製 ツクダ（Tsukuda）らの方法（JNC1;73;721〜729、198
4）に以下のような修正を加えて、PGAのナトリウム塩
（1g;7.14×10-5モル；平均分子量14,000;シグマ・ケミ
カル、セントルイス、Mo.）を３−（２−ピリジルチ
オ）プロピオニル−PGA（PDP−PGA）に変えた。PDP−PG
Aは、チオプロピルセファロース6B単離の前は遊離のス
ルフヒドリルに還元しなかった。その代わり、PDP−PGA
を0.1Mリン酸ナトリウムおよび1mM EDTA（pH6.5）中に
溶解し、チオプロピルセファロース6B（60ml;30g;ファ
ルマシア・ケミカルズ、ウプサラ、スウェーデン）とと
もに攪拌した。透析および凍結乾燥した後、収量24％PD
P−PGA結合体が得られた（0.244g;1.72×10-5モル）。
以下の手順でジスルフィドが維持されるのを確実にする
ために、チオピリジル基を５−チオ−２−ニトロベンゾ
エート（TNB）保護基と交換した。0.1Mリン酸ナトリウ
ム（4ml;pH7）に溶解させたPDP−PGA（20mg;1.42×10-6
モル）の溶液に100モル過剰の1,4−ジチオトレイトール
（分子量154.2）を加え、40℃で１時間反応させた。混
合物を5mM酢酸ナトリウム、0.14M NaClおよび1mM EDT
A（pH5.5）で10mlに希釈し、2000分子量カットオフ（MW
CO）管中で希釈バッファーに対して透析した。さらに蒸
溜水に対して透析を続け、ついで凍結乾燥させた。チオ
プロピル−PGAの収量は13.5mgであった。HS−PGA（13.5
mg）を0.1Mリン酸ナトリウム（pH7;9.6×10-7モル）中
に溶解し、10モル過剰の5,5′ジチオビス（２−ニトロ
安息香酸）（DTNB）と室温で１時間反応させた。この混
合物を0.1Mリン酸ナトリウム（pH7）で10mlに希釈し、2
000MWCO管中で希釈バッファーに対して透析した。さら
に蒸溜水に対して透析を続け、ついで凍結乾燥して５−
（２−ニトロベンゾジチオ）プロピオニル−PGA（TNB−
PGA;8.5mg;6.07×10-7モル）を得た。
各捕捉試薬抗体に結合したアニオン性ポリマー分子の数
を追跡するために、ついでTNB−保護PGAをフルオレセイ
ンのエチレンジアミン誘導体で標識した。TNB−PGA（8.
5mg）を乾燥N,N−ジメチルホルムアミド（2ml）中に溶
解し、90モル過剰のＮ−メチルモルホリン（分子量101.
15）で処理し、温度を０℃に下げ、過剰のイソブチルク
ロロホルメート（分子量136.58）を加えることにより、
TNB−PGAにエチレンジアミン誘導体化フルオレセイン
（EDA−Fl;分子量532）を組み込んだ。この反応は０℃
で１時間行った。混合物を室温に温め、30モル過剰のED
A−Flを加え、室温で攪拌しながら反応を一夜行った。
混合物を0.1Mリン酸ナトリウム（pH7）で10mlに希釈
し、2000MWCO管中で希釈バッファーに対して透析した。
さらに透析を蒸溜水に対して続け、ついで凍結乾燥して
TNB−PGA/EDA−Fl結合対（7.8mg;5.6×10-7モル）を得
た。
TNB−PGA/EDA−Fl（7.8mg）を0.1Mリン酸ナトリウム（3
ml;pH7）中に溶解し、100モル過剰の1,4−ジチオトレイ
トールを用いて40℃で１時間処理することによりTNB基
を除いた。334nmから412nmへピークがシフトすることに
ついてはUV/VIS分光光度計上で反応をモニターした。物
質を蒸溜水で10mlに希釈し、2000MWCO管中で蒸溜水に対
して透析した。凍結乾燥後、チオプロピル−PGA/EDA−F
l（HS−PGA/EDA−Fl;8.4mg）を得た。この時点でPGA分
子当たりのフルオレセインの数（すなわちローディン
グ）を決定するためにUV/VISスキャンをとった。この調
製物からはPGA当たり0.81フルオレセインの値が計算さ
れた。
（ｂ）抗体の活性化 モノクローナル抗体である抗CEA抗体を、ツクダらの方
法（JNCl:73;721〜729、1984）に従い、下記の手順は例
外としてマレイミド活性化した。抗体の濃度は1mg/mlで
あり、150モル過剰のＮ−スクシンイミジルｍ−（Ｎ−
マレイミド）ベンゾエート（SMBE、分子量314.3;シグ
マ）を用いた。３〜５個のマレイミド基を抗CEA抗体に
導入するのに150モル過剰が必要であることが実験的に
決定された。メアレス（Meares）らの遠心分離法（アナ
リティカル・バイオケミストリー:1142;68〜78、1984）
により3ml洗浄カラム中のセファデックスＧ−50/80（シ
グマ）を用いて清浄化（clean−up）を行った。抗体当
たりのマレイミド数は、リウ（Liu）らの滴定法（バイ
オケミストリー:18;690〜696、1979）を用いて決定し
た。この抗体活性化の間に抗体当たりに導入されたマレ
イミドの数は4.6であるのがわかった。
ついで上記工程（１）（ａ）で得たチオプロピル−保護
フルオレセイン標識PGAをマレイミド誘導抗体と反応さ
せて、癌胎児性抗原イオン捕捉イムノアッセイに適した
抗体/PGA結合体を得た。0.1Mリン酸ナトリウム（１〜2m
l;pH7）中のマレイミド活性化抗体（1.0mg;6.25×10-9
モル）を、1N HClを用いてpH6.5に調節した。ついで0.
1Mリン酸ナトリウム（100μ）中の10モル過剰のHS−P
GA/EDA−Fl（約1mg）を活性化抗体調製物に加えた。室
温で穏やかに攪拌しながら結合を一夜行った。混合物を
0.1Mリン酸ナトリウム（pH7）中で10mlに希釈し、50,00
0MWCO管中で0.001Mリン酸ナトリウム（pH7）に対して透
析し、ついで凍結乾燥させた。凍結乾燥を蒸溜水（0.25
ml）中に再び溶解し、A280で最大のピークを得るために
高速液体クロマトグラフィー分画を行った。クロマトグ
ラフィーはBio−Sil TSK250（バイオ−ラド・ラボラト
リーズ、リッチモンド、カリフォルニア）300mm×7.5mm
カラムを用いて行い、50mM硫酸ナトリウム、20mMリン酸
ナトリウム、および0.3M NaCl（pH6.8）を用いて1ml/
分で溶出した。
最大ピークのアッセイは、ウシIgG標準を用いたバイオ
−ラドのブラッドフォード（Bradford）アッセイにより
タンパク質含量のために行った。ピークには95.5μg/ml
のタンパク質が含まれており、これは5.97×10-7モルタ
ンパク室（IgGの分子量160,000）に等しかった。UV/VIS
をスキャニングし494nmでの吸光度を取ることにより、
このフラクションにはまた2.12モルのフルオレセインが
含まれていることが決定された。モルフルオレセインの
等式から計算した抗体分子当たりのフルオレセイン数は
3.6であった。PGA分子当たりのフルオレセイン数が0.81
であることがわかっていたので、このことは各抗体に4.
4個のPGAが結合していることに相当した。ピークのフラ
クションを凍結し、引き続きアッセイに用いた。
上記工程で重要なものは、各ポリマーアニオンと抗体と
の間に付着部位が１個しか存在しないことである。両者
の間に共有結合が１個しか存在しないことにより、複数
の活性化基を有するポリマーアニオンを用いた場合に起
こるかもしれない分子内および分子間架橋の可能性を回
避することができる。
上記捕捉試薬の例の代わりに、アニオン性の固相物質と
組み合わせて用いるためにカチオン誘導抗体もまた調製
することができた。
（２）固相物質の調製 使い捨てIMxTMウエッジの固相繊維マトリックスをポリ
マー四級化合物でコーティングして固相物質に正の電荷
を与えた。セルコートTML−200（水溶性セルロース誘導
体）を用いた。セルコートTML−200（50μ）の１％水
溶液を固相物質に加え、ついで300mM NaCl、50mMトリ
スおよび0.1％NaN3を含有する希釈液（75μ;pH7.5）
で洗浄した。
（３）指示試薬 指示試薬はアルカリフォスファターゼと抗CEA抗体断面
との結合体からなっていたが、この抗体断面は上記工程
（１）（ｂ）の捕捉試薬で特定した抗体とは異なるエピ
トープに結合するものである。アルカリフォスファター
ゼ標識抗CEA抗体断片を50mMトリス、50mM NaCl、1mM
MgCl2、0.1mM ZnCl2、5mM酒石酸ナトリウム、0.5％ウ
シ皮膚ゼラチンおよび３％マウス血清を含有するバッフ
ァー中に入れておいた。
（４）イムノアッセイプロトコール;CEAの決定 イオン捕捉イムノアッセイプロトコールには上記工程
（２）で調製した固相物質を使用することが含まれて
た。上記工程（３）の指示試薬（70μ）を反応ウエル
中に置いた。ついで上記工程（１）のバッファー中の捕
捉試薬（50mM Na2SO4、20mMリン酸ナトリウムおよび30
mM NaCl（pH6.8）からなるバッファー中の抗CEA/PGA結
合体20μ）をウエルに加えた。CEAを含有する試料を
ウエルに加え、均一免疫反応混合物を34.5℃で20分間イ
ンキュベートした。４つの異なる試料をアッセイした
が、それぞれアボット・ラボラトリーズCEA酵素イムノ
アッセイキットからのCEAカリブレーターであった。各
反応混合物のアリコート（100μ）を四級化合物処理
固相物質に加え、ついで希釈液（75μ×３）で洗浄し
た。最後に酵素基質（70μ;100mM AMP、1mM MgC
l2、0.1％NaN3および4mMテトラミソルからなる溶液（pH
10.3）中の４−メチルウンベリフェリルホスフェート1.
2m）を34.5℃で加えて指示試薬と反応させ、得られた蛍
光の割合を測定した。アッセイの用量作用結果を第１表
に示す。
実施例２（マウス免疫グロブリンの競合抑制アッセイ） （１）捕捉試薬の調製 プロテインＡアフィニティー精製マウスモノクローナル
IgGを、以下の手順に従い水溶性カルボジイミド試薬
（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド;EDCI）を用いて負に荷電したPGAに結合さ
せた。
フルオレセイン標識PGA（10mg;Fl−PGA）を、リン酸バ
ッファー食塩水（PBS;75mM KH2PO4および300mM NaC
l、pH7.2）中の抗体（4.8mg/ml）の氷冷溶液に加えた。
この溶液に新たに調製したEDCI氷冷溶液（100μ;10mg
/ml）を加え、得られた反応混合物を2.5時間撹拌し続け
て室温に温めた。この反応混合物に、さらに新たに調製
したEDCIの氷冷溶液（50μ;100mg/ml）を急速に攪拌
しながら加えた。反応混合物をさらに1.5時間攪拌し
た。ついで混合物を、スフェロゲルTSK−Ｇガードカラ
ム（2.15cm×7.5cm;ベックマン・インスツルメンツ（Be
ckman Instruments,Inc.,）、フラートン、CA、92634）
を取り付けたスフェロゲルTSK−3000SWGカラム（2.15cm
×30cm）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより分
画した。カラムを5ml/分の流速で溶出した。これらプー
ルのPGA/抗体比を、抗体のFl−PGA結合体中の蛍光を定
量することにより決定した。結果を第２表に示す。
（２）固相物質の調製 固相物質をポリマー性四級アンモニウム化合物（ガフコ
ートTM755N;GAFコーポレーション）でコーティングし
た。0.5％ガフコートTMの水溶液（50μ）を固相物質
の表面に加え、ついで水（75μ）で洗浄した。
（３）指示試薬の捕捉試薬への結合 指示試薬である羊抗マウス免疫グロブリン（ジャクソン
・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Jackson ImmunoRe
search Laboratories,Inc.,）、ウエストグローブ、P
A、19390）のアルカリフォルファターゼ結合体を、１％
魚肉ゼラチンを含有するトリスバッファー食塩水［25mM
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび100mM
NaCl、pH7.5］中に希釈した。PGA/マウスモノクロー
ナル抗体結合体（上記工程（１）のプール１）の捕捉試
薬も同様に処理した。各試薬200μを一連の試験管に
加え、ついで37℃で30分間インキュベートした。反応混
合物のアリコート（75μ）を上記工程（２）の四級化
合物処理固相物質に加え、ついで直ちにトリスバッファ
ー食塩水（150μ×３）で洗浄した。最後に酵素基質
（70μ;100mM AMP、1mM MgCl2、0.1％NaN3および4m
Mテトラミソル、pH10.3からなる溶液中の４−メチルウ
ンベリフェリスホスフェート1.2mM）を32.7℃で固相物
質に加え、得られた蛍光の割合を測定した。実験結果を
第３表および第４表にまとめて示す。
（４）マウスIgGの競合抑制アッセイ 捕捉試薬および指示試薬を上記工程（３）のようにして
調製した。すべての試薬を１％魚肉ゼラチンを含有する
トリスバッファー食塩水中に希釈した。指示試薬をスト
ック溶液から1000倍に希釈し、捕捉試薬を10μg/mlに希
釈した。一連の試験管中で適当に希釈した指示試薬、捕
捉試薬、およびマウスモノクローナル抗体各150μを
混合した。混合物を37℃で30分間インキュベートした。
混合物のアルコート（75μ）を上記工程（２）の四級
化合物処理した固相物質に加え、ついで直ちにトリスバ
ッファー食塩水（150μ×３）で洗浄した。ついで酵
素基質（70μ;100mM AMP、1mM MgCl2、0.1％NaN3お
よび4mMテトラミソル、pH10.3からなる溶液中の４−メ
チルウンベリフェリルホスフェート1.2mM）を32.7℃で
固相物質に加え、得られた蛍光の割合を測定した。マウ
ス1gGの競合抑制アッセイを示すこの実施例の結果を第
５表に示す。
実施例３（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）のサン
ドイッチアッセイ） （１）捕捉試薬の調製 以下の手順に従い、大きく負に荷電したアルブミン誘導
体を調製して抗hCG抗体に結合させて捕捉試薬を生成し
た。
（ａ）ウサギ血清アルブミンの修飾による負に荷電した
タンパク質誘導体の調製 ジュー（Jou）らの手順（メソッズ・イン・エンジモロ
ジー:Vol.92、Part E、257〜276、アカデミックプレ
ス、1983）に従い、ウサギ血清アルブミン（RSA）を広
範囲にわたってスクシニル化しバパラベンゼンスルホネ
ートに結合させた。リン酸バッファー食塩水（PBS、14m
l、pH8）中の２％RSAを、パラジオキサン中の５％無水
コハク酸（2.28ml）と混合した。1N NaOHを加えること
によりpHを８に保った。反応混合物を室温で30分間撹拌
した。塩酸ヒドロキシルアミン（0.6g）を加え、5N Na
OHの適量を加えることにより溶液のpHを9.5に調節し
た。ついで混合物を水に対して透析した。得られたSUC
65−RSAを、以下の反応に従ってパラアゾベンゼンスル
ホネートに結合させた。
1N HCl（0.8ml）中のパラアゾベンゼンスルホン酸（0.
15ミルモル、26mg）の懸濁液を氷浴中で冷却し、急速に
攪拌しながら1N NaNO2（0.2ml）で30分間処理した。得
られたジアゾニウム塩溶液を、急速に攪拌しながら氷冷
SUC65−RSA溶液に滴下した。1N NaOHを加えることによ
り反応混合物のpHを11に保った。暗赤色の反応混合物を
攪拌し、１時間放置して室温に温めた後、水に対して広
範囲に透析した。得られたSp−SUC65−RSAアニオン性誘
導体化タンパク質を使用するときまで冷蔵して保存し
た。
（ｂ）抗hCGF（ab′）２断片の調製 ニソノフ（Nisonoff）らの方法（Arch.Biochem.Bioph
y.:89;230〜244、1960）に従い、アフィニティー精製ヤ
ギ抗hCG抗体から抗hCGF（ab′）２断片を調製した。リ
ン酸バッファー食塩水（pH7.2）中のアフィニティー精
製抗体溶液の一部を、酢酸を加えることによりpH4の酸
性にした。この時点での抗体の好ましい濃度は1mg/mlで
あった。ペプシンを加えて最終濃度を20μg/mlにした。
混合物を37℃で一夜インキュベートした。6N NaOHを添
加することにより反応を停止させて反応混合物のpHを7.
5にもっていった。消化した抗体断片溶液を20mg/mlまで
濃縮した。Ｆ（ab′）２断片の精製を、スフェロゲルTS
K−Ｇカードカラム（2.15cm×7.5cm）を取り付けたスフ
ェロゲルTSK−3000SWGカラム（2.15cm×30cm）を用いた
ゲル濾過高速液体クロマトグラフィーにより行った。
（ｃ）抗hCG TNB−Fab′断片の調製 パーハム（Parham）ら（J.Immunol.Method.:53:133〜17
3、1982）およびブレナン（Brennan）ら（サイエンス:2
29:81〜83、1985）の方法の変法に従い、抗hCG Fab′
断片を調製しチオール反応体に誘導体化した。攪拌しな
がら20mM EDTAを含有する0.1M NaAsO2の溶液（158μ
）を、PBS中の125I−Ｆ（ab′）２を痕跡量含有する
ヤギＦ（ab′）２（ヤギ抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
抗体断片、16mg/ml）（1.28ml）に加えた。0.1Mシステ
イン−HCl（158μ）を加えることにより還元的開裂反
応を開始させた。反応混合物を窒素ガス雰囲気下に攪拌
しながら37℃で１時間インキュベートした。ついで5,5
−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（19mg）を加え
ることにより反応を停止させた。室温で一夜撹拌した
後、混合物をPBSで前以て平衡化したPD−10カラム（フ
ァルマシア、ピスカタウエイ、NJ）上でクロマトグラフ
ィーにかけ、ついでサイズ排除高速液体クロマトグラフ
ィー［スフェロゲルTSK−Ｇガードカラム（2.15cm×7.5
cm）を取り付けたスフェロゲルTSK−2000SWGカラム（2.
15cm×30cm）］上のクロマトグラフィーにかけた。精製
Fab′チオニトロベンゾエート誘導体をCX−10限外濾過
ユニット（ミリポア、ベッドフォード、MMA）を用いて
7.9mg/mlに濃縮した。
（ｄ）抗hCG TNB−Fab′断片のSp−SUC65−RSAへの結
合 1Mジチオトレイトール（DTT;86μ）の溶液を、37.5mM
リン酸ナトリウム、150mM、NaClおよび2mM EDTA（pH6.
8）中にSp−SUC65−RSA（2.2mg/ml）を含有する溶液
（4.2ml）に加えた。混合物を37℃で３時間、ついで室
温で一夜イキュベートした。得られた反応混合物を、セ
ファデックスTMG−25（ファルマシア）を充填し75mMリ
ン酸ナトリウム、300mM NaClおよび2mM EDTA（pH6.
8）で前以て平衡化した2.5cm×20cmカラム上でクロマト
グラフィーにかけた。還元Sp−SUC65−RSA（0.48mg/m
l）のプールしたフラクションの２μを抗hCG TNB−F
ab′（0.15ml;7.9mg/ml）と混合した。混合物を室温で
一夜攪拌した。ついで反応混合物を100mMヨード酢酸（1
07μ）で処理し、室温で１時間攪拌した。Fab′−Sp
−SUC65−RSA結合体を、スフェロゲルTSK−Ｇガードカ
ラム（2.15cm×7.5cm）を取り付けたスフェロゲルTSK−
3000SWGカラム（2.15cm×30cm）を用いたサイズ排除液
体高速クロマトグラフィーにより精製した。
（ｅ）抗hCG抗体のSp−SUC65−RSAへの結合 N,N−ジエチルホルムアミド中の30mMスクシンイミジム
４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−
カルボキシレートの溶液（27μ）を、PBS中のアフイ
ニティー精製ヤギ抗hCG抗体（3mg/ml）（2.25ml）に加
えた。反抗混合物を室温で１時間攪拌し、ついで75mMリ
ン酸ナトリウム、300mM NaClおよび2mM EDTA（pH6.
8）で前以て平衡化したPD−10カラム上でクロマトグラ
フィーにかけた。修飾抗体（1.6mg/ml）のプールしたフ
ラクションの1.8mlを上記工程（ｄ）のDTT還元Sp−SUC
65−RSA（0.48mg/ml）（3ml）と混合した。室温で一夜
攪拌した後、100mMヨード酢酸（0.25ml）を加え室温で
１時間攪拌することにより反応を停止させた。抗体Sp−
SUC65−RSA結合体を、上記工程（ｄ）と同様にしてサイ
ズ排除高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
（２）指示試薬の調製 指示試薬は、25mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン、100mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、0.07
％NaN3および１％魚肉ゼラチンを含有するアッセイバッ
ファー（pH7.5）中のアルカリホスファターゼ−ヤギ抗h
CG抗体結合体からなっていた。
（３）hCGのサンドイッチイムノアッセイ イオン捕捉イムノアッセイプロトコールには、実施例２
の工程（２）で調製した固相物質、上記工程（２）の指
示試薬（アルカリホスファターゼ−ヤギ抗hCG抗体結合
体）、上記工程（１）（ｄ）および（ｅ）で調製した２
つの異なる捕捉試薬（ヤギ抗hCGFab′−Sp−SUC65−RSA
およびヤギ抗hCG IgG−Sp−SUC65−RSA）のうちの１
つ、および精製hCG標準溶液を使用することが含まれて
いた。すべての試薬はアッセイバッファー中に適当に希
釈した。等量（750μ）の指示試薬およびhCG標準溶液
を一連の試験管中に入れた。37℃で30分間インキュベー
トた後、各インキュベート混合物の125μアリコート
を別々の試験管中で等量の捕捉試薬と混合した。得られ
た混合物を30分間インキュベートした。ついでアッセイ
混合物（75μ）を各固相物質に加えた。ついで固相物
質を洗浄バッファー［25mMトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン、100mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl
2および0.07％NaN3、pH7.5］（150μ×３）で洗浄し
た。ついで酵素基質（70μ:100mM AMP、1mM MgC
l2、0.1％NaN3および4mMテトラミソル、pH10.3からなる
溶液中の４−メチルウンベリフェリルホスフェート1.2m
M）を固相物質に加えた。得られた蛍光の割合を32.7℃
で測定した。実験結果を第６表にまとめて示す。
（４）hCGの間接サンドイッチイムノアッセイ 間接イオン捕捉イムノアッセイには、実施例２の工程
（２）で調製した固相物質、アルカリホスファターゼ−
羊抗マウスIgG結合体（ジャクソン・イムノリサーチ・
ラボラトリーズ）の指示試薬、上記工程（１）（ｅ）で
調製したヤギ抗hCG Ｆ（Fab′−）−Sp−SUC65−RSA、
マウスモノクローナル抗hCG抗体の補助特異的結合成分
（イムノリサーチ：トーマスリバー、NJ、08753）およ
び精製hCG標準溶液を使用することが含まれていた。補
助特異的結合成分は、分析対象物および指示試薬と結合
させるために用いた。すべての試薬はアッセイバッファ
ー中に適切に希釈した。等量（150μ）の指示試薬、h
CG試料溶液および補助特異的結合成分を一連の試験管中
に入れた。37℃で５分間インキュベートした後、捕捉試
薬（150μ）を各試験管に加えた。得られた混合物を
５分間インキュベートした。ついでアッセイ混合物（20
0μ）を各調製固相物質に加えた。ついで上記工程
（３）と同様にして固相物質を洗浄バッファーで洗浄
し、酵素基質溶液で処理した。得られた蛍光の割合を3
2.7℃で測定した。アッセイの結果を第７表に示す。
（５）hCGの二重間接サンドイッチイムノアッセイ イオン捕捉イムノアッセイプロトコールには、実施例２
の工程（２）で調製した固相物質、アルカリホスファタ
ーゼ−羊抗マウスIgG結合体（ジャクソン・イムノリサ
ーチ・ラボラトリーズ）の指示試薬、マウスモノクロー
ナル抗hCG抗体の補助特異的結合成分（イムノリサー
チ：トーマスリバー、NJ、08753）および精製hCG標準溶
液を使用することが含まれていた。プロトコロールには
さらに、アフィニティー精製ヤギ抗hCG抗体の第二の補
助特異的結合成分およびウサギ抗ヤギIgG−Sp−SUC65−
RSAの捕捉試薬を使用することが含まれていた。補助特
異的結合成分の調製は、上記工程（１）（ｅ）に記載の
手順に従ってアフィニティー精製ヤギ抗IgG（カッペル
（Capel）；コクランビル、PA、19330）をSp−SUC65−R
SAに結合させることにより行った。すべての試薬はアッ
セイバッファー中に適切に希釈した。等量（100μ）
の指示試薬、hCG試料溶液および第一の補助特異的結合
成分を一連の試験管中に入れた。37℃で10分間インキュ
ベートした後、第二の補助特異的結合成分（100μ）
を加え、インキュベートを37℃でさらに５分間続けた。
最後に捕捉試薬（100μ）を各試験管に加えた。得ら
れた混合物を５分間インキュベートした。ついでアッセ
イ混合物（200μ）を各調製固相物質に加えた。つい
で上記工程（４）と同様にして固相物質を洗浄バッファ
ーで洗浄し、酵素基質溶液で処理し、蛍光の割合をで測
定した。アッセイの結果を第８表に示す。
実施例４（抗プロゲステロンおよびプロゲステロン） （１）捕捉試薬の調製 以下に述べる手順に従って、抗体／ポリグルタミン酸結
合体を調製した。
（ａ）PGAナトリウム塩の遊離酸への変換 PGAのナトリウム塩（200mg;1.47×10-5モル；水平分子
量13,600;シグマ・ケミカル、セントルイス、Mo.）を、
水（60ml）中で陽イオン交換樹脂（AG50W−X8;13g;バイ
オラド、リッチモンド、CA）とともに３時間攪拌した。
上澄み液をデカントし、濾過し、蒸発させてPGAの遊離
酸（137mg;平均分子量11,620）を白色粉末として80％の
収率で得た。
（ｂ）ITC−PAGの調製 ジメチルホルムアミド（DMF;2ml）中の遊離酸PGA（65m
g;5.6×10-6モル）の溶液に、トリエチルアミン（100μ
;7.2×10-4モル）および1,3−フェニレンジイソシア
ネート（110mg;5.7×10-4モル；アルドリッチ・ケミカ
ル、ミルウオーキー、WI）を加えた。室温で一夜攪拌し
た後、酢酸（100μ;1.7×10-3モル）を加え、ついで
反応混合物を蒸発させた。残渣に塩化メチレン（25ml）
を加え、混合物を２時間攪拌した後に濾過してITC−PGA
を白色粉末（101mg）として得た。
（ｃ）PGA標識ヤギ抗マウス捕捉試薬の調製ITC−PGA（2
95μg;2.5×10-8モル;20％DMF/0.1Mリン酸ナトリウム、
pH7.0（40μ）中）を、ヤギ抗マウスIgG（200μg;1.2
5×10-9モル；シグマ・ケミカル;0.1Mリン酸ナトリウ
ム、pH7（40μ）中）の緩衝溶液に加えてPGA標識ヤギ
抗マウス捕捉試薬を調製した。室温にて２日間攪拌した
後、0.1Mトリス（20μ;pH7.4）を加え、得られた混合
物を使用するときまで８℃で保存した。
（２）抗プロゲステロン抗体の間接イムノアッセイ 抗プロゲステロン抗体イオン捕捉イムノアッセイには、
実施例１工程（１）に記載のようにポリマー性四級化合
物でコーティングした固相物質、を使用することが含ま
れていた。試料（60μ）を反応ウエルに加えた。試料
にはリン酸バッファー食塩水（PBS;50mMリン酸ナトリウ
ム、99mM NaCl、0.1％NaN3、pH7.4）中にモノクローナ
ル抗プロオゲステロン抗体が０、５、50、100、250およ
び500ng/mlの濃度で含まれていた。ついでPBS（20μ
）を反応ウエルに加え、ついで指示試薬であるアルカ
リフォスファターゼ標識プロゲステロンの緩衝溶液（20
μ;50mMトリス、pH7.4、150mM NaCl、１％NaN3、1mM
MgCl2、0.1mM ZnCl2および１％BSAからなるトリスバ
ッファー中に３μg/ml）を加えた。混合物を34.5℃で10
分間インキュベートした後、捕捉試薬（20μ；上記工
程（１）に記載のようにPBSストック溶液中に1/100に希
釈したPGA標識ヤギ抗マウス抗体）を加えた。ついで混
合物を34.5℃でさらに10分間インキュベートした。つい
で混合物の100μアリコートを固相物質に加え、つい
で希釈液（75μ×３）で洗浄した。最後に酵素基質溶
液（70μ;100mM AMP、1mM MgCl2、0.1％NaN3および
4mMテトラミソル、pH10.3の溶液中の４−メチルウンベ
リフェリルホスフェート1.2mM）を固相物質に加え、得
られた蛍光の割合を測定した。アッセイの結果を第９表
に示す。
（３）プロゲステロンの間接競合イムノアッセイ 固相を実施例１工程（２）に記載のようにして調製し
た。PBS中にプロゲステロンを種々の濃度で含有する試
料（60μ）をプロゲステロン標識アルカリフォスファ
ターゼ指示試薬（上記工程（２）のトリスバッファー中
に0.4μg/ml）を混合した。混合物を34.5℃で10分間イ
ンキュベートした後、上記工程（２）に記載のようにし
てPGA標識ヤギ抗マウス抗体捕捉試薬（20μ）を加え
た。得られた混合物を34.5℃でさらに10分間インキュベ
ートした。ついで混合物の100μアリコートを固相物
質に加え、ついで希釈液で３回洗浄した。最後に酵素基
質溶液（上記工程（２）に記載のもの;70μ）を固相
物質に加え、得られた蛍光の割合を測定した。アッセイ
の結果を第10表に示す。
本発明の概念は種々のタイプの結合アッセイに適用する
ことができる。しかしながら、当業者には、本発明概念
を適用することができる他の多くのタイプのアッセイ
（抗体または抗原以外の分析対象物のアッセイを含む）
を想起することができるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スティーブン・ジェイ・クライン アメリカ合衆国イリノイ 60030、グレイ スレイク、ダブリュ・ヒッコリー・レイン 17556番 (72)発明者 スティーブン・ジョージ・シュルツ アメリカ合衆国イリノイ 60096、ウイン スロップ・ハーバー、ファンダーバーク・ ドライブ 2204番 (72)発明者 スティーブン・デンハム・ストロウプ アメリカ合衆国イリノイ 60048、リバテ ィビル、ルーズベルト 606番 (56)参考文献 特開 昭53−127823（ＪＰ，Ａ)

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】流体試料中の分析対象物の検出方法であっ
    て、 （ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物
    質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬、 （ii）分析対象物に対して特異的で検出可能なシグナル
    を生成することのできる標識に結合した第二の結合成分
    からなる可溶性指示試薬、および （iii）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相
    物質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬と接触させることによって
    捕捉試薬を試料中の分析対象物と結合させて捕捉試薬／
    分析対象物複合体を生成させ、 （ｃ）該捕捉試薬／分析対象物複合体を該指示試薬と接
    触させることによって該指示試薬と分析対象物と結合さ
    せて捕捉試薬／分析対象物／指示試薬サンドイッチ複合
    体を生成させ、 （ｄ）試料を該固相物質と接触させることによって該固
    相物質を該サンドイッチ複合体の該第一の荷電物質に誘
    引、付着させて該サンドイッチ複合体を試料から分離
    し、ついで （ｅ）試料中の分析対象物の存在または量の指標とし
    て、該固相または未結合指示試薬に付随する該標識を検
    出する ことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】捕捉試薬と指示試薬とを流体試料と同時に
    接触させる請求項（１）記載の方法。
  3. 【請求項３】捕捉試薬および指示試薬の少なくとも一方
    が、少なくとも１つの補助特異的結合成分に対して特異
    的であり、該補助特異的結合成分はサンドイッチ複合体
    の生成に必要なものである請求項（１）記載の方法。
  4. 【請求項４】流体試料中の分析対象物の検出方法であっ
    て、 （ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物
    質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬、 （ii）該第一の結合成分に対して特異的で検出可能なシ
    グナルを生成することのできる標識に結合した第二の結
    合成分からなる可溶性指示試薬、および （iii）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相
    物質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬および該指示試薬と接触さ
    せることによって、該捕捉試薬と結合することについて
    試料中の分析対象物を該指示試薬と競合させて捕捉試薬
    ／分析対象物複合体および捕捉試薬／指示試薬複合体を
    生成させ、 （ｃ）試料を該固相物質と接触させることによって該固
    相物質を該第一の荷電物質に誘引、付着させて該複合体
    を試料から分離し、ついで （ｄ）試料中の分析対象物の存在または量の指標とし
    て、該固相または未結合指示試薬に付随する該標識を検
    出する ことを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】捕捉試薬と指示試薬とを流体試料と逐次接
    触させる請求項（４）記載の方法。
  6. 【請求項６】捕捉試薬および指示試薬の少なくとも一方
    が、少なくとも１つの補助特異的結合成分に対して特異
    的であり、該補助特異的結合成分はサンドイッチ複合体
    の生成に必要なものである請求項（４）記載の方法。
  7. 【請求項７】流体試料から分析対象物を分離する方法で
    あって、 （ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物
    質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬、
    および （ii）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相物
    質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬と接触させることによって
    捕捉試薬を試料中の分析対象物と結合させて捕捉試薬／
    分析対象物複合体を生成させ、ついで （ｃ）試料を該固相物質と接触させることによって該固
    相物質を該第一の荷電物質に誘引、付着させて該捕捉試
    薬／分析対象物複合体を試料から分離する ことを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】第一の荷電物質と反対に荷電した第二の荷
    電物質を固相物質上に保持させることにより第二の荷電
    物質が該第一の荷電物質に誘引、付着する請求項
    （１）、（４）または（７）記載の方法。
  9. 【請求項９】第一の荷電物質と反対に荷電した第二の荷
    電物質に捕捉試薬を接触させる工程をさらに含み、その
    ことによって捕捉試薬を固相物質と接触させる前に第二
    の荷電物質が第一の荷電物質に誘引、付着するようにす
    る請求項（１）、（４）または（７）記載の方法。
  10. 【請求項１０】第一の荷電物質がアニオン性物質であ
    り、第二の荷電物質がカチオン性物質である請求項
    （８）記載の方法。
  11. 【請求項１１】第一の荷電物質と反対に荷電した多数の
    荷電微細粒子が固相物質に保持されている請求項
    （１）、（４）または（７）記載の方法。
  12. 【請求項１２】捕捉試薬が補助特異的結合成分の少なく
    とも１つに対し特異的であり該補助特異的結合成分は分
    析対象物に対し特異的である請求項（１）、（４）また
    は（７）記載の方法。
  13. 【請求項１３】（ａ）分析対象物に対して特異的で第一
    の荷電物質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕
    捉試薬、 （ｂ）分析対象物に対して特異的で検出可能なシグナル
    を生成することのできる標識に結合した第二の結合成分
    からなる可溶性指示試薬、および （ｃ）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相物
    質 からなることを特徴とする、流体試料中の分析対象物の
    存在または量を決定するためのサンドイッチイムノアッ
    セイキット。
  14. 【請求項１４】（ａ）分析対象物に対して特異的で第一
    の荷電物質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕
    捉試薬、 （ｂ）捕捉試薬に対して特異的で検出可能なシグナルを
    生成することのできる標識に結合した第二の結合成分か
    らなる可溶性指示試薬、および （ｃ）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相物
    質 からなることを特徴とする、流体試料中の分析対象物の
    存在または量を決定するための競合イムノアッセイキッ
    ト。
  15. 【請求項１５】第一の荷電物質と反対に荷電され固相物
    質上に保持された第二の荷電物質をさらに含む請求項
    （13）または（14）記載のキット。
  16. 【請求項１６】第一の荷電物質に結合した特異的結合成
    分、および該第一の荷電物質と反対に荷電した第二の荷
    電物質からなり、該第一の荷電物質および該第二の荷電
    物質は互いにイオン結合的に結合している配合物。
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