JPS6219837B2

JPS6219837B2 -

Info

Publication number: JPS6219837B2
Application number: JP57118476A
Authority: JP
Inventors: Eiichi Hasegawa; Kozo Iida; Masahiro Sakamoto
Original assignee: Kansai Paint Co Ltd
Current assignee: Kansai Paint Co Ltd
Priority date: 1982-07-09
Filing date: 1982-07-09
Publication date: 1987-05-01
Also published as: JPS5911182A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は酵素又は微生物菌体の固定化法に関
し、さらに詳しくは酵素又は微生物菌体を粒状成
形物として固定化する方法に関する。

酵素又は微生物の固定化法としては、従来か
ら、包括法、物理的吸着法、共有結合法等多くの
方法が知られている。これらの方法によつて得ら
れる塊状あるいはシート状の固定化物は、微生物
反応や酵素反応に使用する場合には、細かく切断
したり磨砕したりした後カラムに充填するのが普
通である。しかしその場合固定化物は面同志で密
着することが多く、微生物反応や、酵素反応の効
率が悪くなり、また、屡々チヤネリング現象を起
こしてカラムを閉塞する等の欠点もある。

本発明者らは酵素又は微生物菌体を粒状成形物
として固定化することができれば、流動しやすく
カラムへの充填作業が容易で、粒子同志の接触面
積も少なく微生物反応や酵素反応の効率をアツプ
することができると考え、酵素又は微生物菌体を
粒状組成物として固定化する方法について鋭意研
究を行なつた結果、固定化担体として或る種の親
水性光硬化性樹脂と多価金属イオンとの接触によ
りゲル化する能力のある水溶性高分子多糖類との
組合わせを使用すれば、水性媒体から極めて簡単
に、酵素又は微生物菌体のロスもなく、機械的強
度の大きい粒状固定化物を製造することができる
ことを見い出し本発明を完成するに至つた。

しかして、本発明によれば、 (a) １分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽
和結合を有する親水性光硬化性樹脂、 (b) 光重合開始剤、 (c) 多価金属イオンとの接触によりゲル化する能
力のある水溶性高分子多糖類、及び (d) 酵素、又はアルコール発酵力を有する酵母以
外の微生物菌体を含んでなる液状組成物を、多価金属イオンを含
有する水性媒体中に滴下して該組成物を粒状にゲ
ル化させ、次いで得られる粒状ゲルに活性光線を
照射して該粒状ゲル中の光硬化性樹脂を硬化させ
ることを特徴とする酵素又は微生物菌体の粒状固
定化成形物の製造方法が提供される。

以下本発明の方法についてさらに詳しく説明す
る。

(a) 親水性光硬化性樹脂本発明の方法においては、固定化担体の１つ
として、１分子中に少なくとも２個のエチレン
性不飽和結合を有する親水性光硬化性樹脂を使
用する。該光硬化性樹脂としては、一般に300
〜30000、好ましくは500〜20000の範囲内の数
平均分子量を有することができ、また、酵素又
は微生物菌体を懸濁させた水性媒体中に均一に
分散するに充分なイオン性又は非イオン性の親
水性基、例えば水酸基、カルボキシル基、リン
酸基、スルホン酸基、アミノ基、エーテル結合
などを含み、且つ波長が約250〜約600nｍの範
囲内の活性光線を照射したとき、硬化して水に
実質的に不溶性の樹脂に変わるものが好適に使
用される。そのような光硬化性樹脂は酵素又は
微生物菌体の固定化担体として既に知られてお
り（例えば、特公昭55−40号公報、特公昭55−
20676号公報等参照）、代表的なものとして以下
に記載するものを挙げることができる： (i) 高酸価不飽和ポリエステル類：例えば、無
水マレイン酸、マレイン酸、フマル酸、イタ
コン酸、無水イタコン酸などの不飽和多価カ
ルボン酸の少なくとも１種と、トリメリツト
酸、無水トリメリツト酸、ピロメリツト酸、
無水ピロメリツト酸などの飽和多価カルボン
酸の少なくとも１種とからなる多価カルボン
酸成分と、多価アルコールとのエステル化に
より得られる酸価が40〜200の範囲内の不飽
和ポリエステルの塩類；無水マレイン酸、マ
レイン酸、フマル酸、イタコン酸、無水イタ
コン酸などの不飽和多価カルボン酸の少なく
とも１種と、１分子中に３個より多いヒドロ
キシル基を有する多価アルコールを少なくと
も５重量％含む多価アルコール成分とのエス
テル化物中の残存ヒドロキシル基に酸無水物
を反応させて得られる酸価が40〜200の範囲
内の不飽和ポリエステル類など。

(ii) 高酸化不飽和エポキシド類：ポリグリシジ
ル化合物例えばシエルケミカル社製のエピコ
ート828、エピコート1001、エピコート1004
などのｎ当量と多価カルボン酸、例えばマレ
イン酸、アジピン酸、トリメリツト酸などの
（ｎ−１）当量と（メタ）アクリル酸などの
不飽和カルボキシル化合物２当量との付加反
応物に残存するヒドロキシル基に酸無水物を
付加して得られる酸価が40〜200の範囲内の
不飽和エポキシド類；上記の如きポリグリシ
ジル化合物ｎ当量と上記の如き多価カルボン
酸（ｎ＋２）当量との付加反応物に残存する
ヒドロキシル基に酸無水物を付加させて得ら
れる化合物に（メタ）アクリル酸グリシジル
などの不飽和グリシジル化合物を反応させて
得られる酸価が40〜200の不飽和エポキシド
類など。

(iii) アニオン性不飽和アクリル樹脂類：こゝで
アニオン性不飽和アクリル樹脂とは、（メ
タ）アクリル酸及び（メタ）アクリル酸エス
テルから選ばれる少なくとも２種の（メタ）
アクリル系モノマーを共重合させて得られる
カルボキシル基、リン酸基及び／又はスルホ
ン酸基を含有する共重合体に光重合可能なエ
チレン性不飽和基を導入した樹脂であり且つ
下記式Ｃ＋5P＋10S＝Ａ (1) 〔式中、Ｃは樹脂中のカルボキシル基の濃度
（mol／Kg）であり、Ｐは樹脂中のリン酸基
濃度（mol／Kg）であり、Ｓは樹脂中のスル
ホン酸基濃度（mol／Kg）である〕によつて算出されるＡの値が0.8〜５（mol
Kg）の範囲内にあり、そて該樹脂中の光重合
可能なエチレン性不飽和基の濃度が0.1〜５
（mol／Kg）の範囲内にある樹脂をいう。か
かる共重合体は公知の方法を合成することが
でき、その際、コモノマーとしてアクリル
酸、メタクリル酸などの不飽和カルボン酸を
使用すればカルボキシル基を含有する共重合
体が得られ、コモノマーとしてホスマーＭ、
ホスマーCl〔両者とも油脂製品(株)製〕など
の不飽和リン酸エステルを用いればリン酸基
を含有する共重合体が得られ、また、コモノ
マーとして（メタ）アクリル酸−２−スルホ
エチル、（メタ）アクリル酸−３−スルホプ
ロピルなどの不飽和スルホン酸エステルを使
用すればスルホン酸基を含有する共重合体が
得られる。かくして得られる共重合体に光重
合可能なエチレン性不飽和基を導入するため
には、該共重合体中に存在するカルボキシル
基、リン酸基又はスルホン酸基に（メタ）ア
クリル酸グリシジルなどの不飽和グリシジル
化合物を反応させることによつて可能とな
る。

(iv) カチオン性不飽和アクリル樹脂：例えば、
（メタ）アルリル酸−２−ジエチルアミノエ
チル、（メタ）アクリル酸−tert−ブチルア
ミノエチル、ビニルピリジンなどの不飽和ア
ミノ化合物を５重量％より多い量を含む（メ
タ）アクリル酸エステルの共重合体に、（メ
タ）アクリル酸グリシジルなどの不飽和グリ
シジル化合物を反応させて得られる不飽和ア
クリル樹脂；ポリスチレンをクロロメチル化
後、不飽和アミノ化合物で第４級化して得ら
れる不飽和アクリル樹脂；ポリエチレンイミ
ンと不飽和グリシジル化合物との付加物な
ど。

(v) ポリエチレングリコールと（メタ）アクリ
ル酸とのポリエステル類：例えば、分子量
400〜10000で30重量％未満のプロピレンオキ
シド基を含むポリエチレングリコールの（メ
タ）アクリル酸などの不飽和モノカルボン酸
のジエステル；ｎモルの無水マレイン酸など
の２塩基酸と（ｎ＋１）モルの分子量600〜
10000のポリエチレングリコールおよび２モ
ルの（メタ）アクリル酸などの不飽和モノカ
ルボン酸のエステル化物；ｎモルのトリメリ
ツト酸などの３塩寒酸とｎ＋２モルの分子量
600〜10000のポリエチレングリコールおよび
３モルの（メタ）アクリル酸などの不飽和カ
ルボン酸のエステル化物など。

(vi) ポリエチレングリコールと（メタ）アクリ
ル酸２−ヒドロキシエチルとのウレタン化付
加物類：例えば、ｎモルのトリレンジイソシ
アネート、キシリレンジイソシアネート、ヘ
キサメチレンジイソシアネートなどのジイソ
シアネートと（ｎ−１）モルの分子量800〜
10000のポリエチレングリコールおよび２モ
ルの（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチ
ルなどの不飽和モノヒドロキシ化合物とのウ
レタン化物；ｎモルのデスモジユールＬ（バ
イエル社製）などのトリイソシアネートと
（ｎ−１）モルの分子量800〜10000のポリエ
チレングリコールおよび（ｎ＋２）モルの
（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルな
どの不飽和モノヒドロキシ化合物とのウレタ
ン化物；１モルのトリメチロールプロパンな
どの３官能性ヒドロキシ化合物と４モルのジ
イソシアネートと２モルの分子量400〜10000
のポリエチレングリコールおよび２モルの
（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルな
どの不飽和モノヒドロキシ化合物とのウレタ
ン化物など。

(vii) 不飽和セルロース類：例えば、セルロース
アセテートフタレート、ヒドロキシプロピル
メチルセルロースフタレート、ヒドロキシエ
チルセルロースなどの水溶性のセルロースと
（メタ）アクリル酸グリシジルなどの不飽和
グリシジル化合物又は無水イタコン酸、無水
マレイン酸などの不飽和酸無水物との付加反
応物。

(viii) 不飽和ポリアミド：例えば、１モルのトリ
レンジイソシアネート、キシリレンジイソシ
アネートなどのジイソシアネートと１モルの
アクリル酸２−ヒドロキシエチルなどの不飽
和ヒドロキシ化合物との付加物をゼラチンな
どの水溶性ポリアミドに付加反応させた不飽
和ポリアミド。

以上に例示した如き光硬化性樹脂はそれぞれ
単独で使用することができ、或いは２種もしく
はそれ以上組み合わせて使用してもよい。これ
光硬化性樹脂のうち、本発明において特に有利
に使用しうるものとしては、前記(v)のポリエチ
レングリコールと（メタ）アクリル酸とのポリ
エステル類及び(vi)のポリエチレングリコールと
（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルとの
ウレタン化付加物を挙げることができる。

(b) 光重合開始剤上記(a)に述べた光硬化性樹脂の光重合反応を
促進する目的で、本発明に従う液状組成物には
光重合開始剤（光増感剤）を含ませる。使用し
うる光重合開始剤は光照射により分解してラジ
カルを生成し、このものが重合開始種となつて
重合性不飽和基を有する樹脂間に橋かけ反応を
起こさせるもので、例えばベンゾイン、アセト
インなどのα−カルボニルアルコール類；ベン
ゾインメチルエーテル、ベンゾイルエチルエー
テル、ベンゾインプロピルエーテル、アニソイ
ンエチルエーテル、ピバロインエチルエーテル
等のアシロインエーテル類；ナフトール、ヒド
ロキシアントラセンなどの多環芳香族化合物
類；メチルベンゾイン、α−メトキシベンゾイ
ンなどのα−置換アシロイン類；２−シアノ−
２−ブチルアゾホルムアミドなどのアゾアミド
化合物類；硝酸ラウニル、塩化第２鉄などの金
属塩類；メルカプタン類；ジスルフイド類；ハ
ロゲン化合物類；染料類等をあげることができ
る。

これらの光重合開始剤は単独又は２種以上組
合わせて通常0.01〜10pHR（per hundred
Resin）の割合で使用できる。

(c) 水溶性高分子多糖類本発明の方法は、酵素又は微生物菌体の固定
化担体の水性媒体中でのゲル化を達成するため
に、固定化担体として、前(a)項に述べた光硬化
性樹脂と組合わせて水溶性高分子多糖類を使用
することに１つの大きな特徴がある。

本発明において使用する水溶性高分子多糖類
は、水溶性であり、水性媒体中で多価金属イオ
ンと接触したときに水に不溶性又は難溶性のゲ
ルに変化する能力のある高分子多糖類で、一般
に約3000〜約2000000の分子量を有し、また、
多価金属イオンと接触させる前の水溶性の状態
で通常少なくとも約10ｇ／（25℃）の溶解度
を示すものが好適に使用される。

かかる特性をもつ水溶性高分子多糖類の具体
例としては、アルギン酸のアルカリ金属塩、カ
ラギーナン、コンニヤクマンナン等が包含され
る。

これら水溶性高分子多糖類は水性媒体中に溶
解した状態で、多価金属イオン、例えばマグネ
シウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチ
ウムイオン、バリウムイオン等のアルカリ土類
金属イオン或いはアルミニウムイオン、セリウ
ムイオン、ニツケルイオン等の他の多価金属イ
オンのうちの少なくとも１種の多価金属イオン
と接触するとゲル化しうる。なお、本発明にお
いて使用しうる水溶性高分子多糖類は、すべて
の多価金属イオンの接触に対してゲル化能を有
している必要はなく、少なくとも１種の多価金
属イオン、好ましくはアルカリ土類金属イオン
と接触した時にゲル化する能力を有していれば
充分である。ゲル化が起る多価金属イオンの濃
度は水溶性高分子多糖類の種類等により異なる
が、一般には少なくとも0.01mol／である。

(d) 酵素又は微生物菌体本発明の方法により固定化しうる酵素又は微
生物菌体の種類には特に制約はなく、本発明の
方法によれば、どのような種類の酵素又は細菌
類及び真菌類から選ばれる微生物菌体でも、そ
の酵素活性を実質的に失活させることなく固定
化することができる。

しかして、本発明の方法によつて固定化しう
る酵素及び微生物菌体の代表例を示せば次のと
おりである。

(イ) 酵素の例ラクテートヒドロゲナーゼ（１・１・２・
３・）、ラクテートオキシダーゼ（１・１・３・
２）、グルコールオキシターゼ（１・１・３・
４）、ホルメートデヒドロゲナーゼ（１・２・
１・２）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（１・２・
１・３）、アルデヒドオキシダーゼ（１・２・３・
１）、キサンチンオキシダーゼ（１・２・３・
２）、ピルビン酸オキシダーゼ（１・２・３・
３）、ピルビン酸リダクターゼ（１・２・４・
１）、コルチゾン−α−リダクターゼ（１・3′・
１・４）、アシルCoA−デヒドロゲナーゼ（13・99・
３）、３−ケトステロイド△^１−デヒドロゲナー
ゼ（１・３・99・４）、３−ケトステロイド△^４−デヒドロゲナー
ゼ（１・３・99・５）、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ（１・４・
１・１）、Ｌ−グリタミン酸デヒドロゲナーゼ（１・
４・１・３）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（１・４・３・
２）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（１・４・３・
３）、ピリドキサールリン酸オキシダーゼ（１・
４・３・５）、カタラーゼ（１・11・１・６）、カテコールメチルトランスフエラーゼ
（２・１・１・６）、カルニチンアセチルトランスフエラーゼ
（２・３・１・７）、アセチルCoAアセチルトランスフエラーゼ
（２・３・１・９）、アスペルテ−トアミノトランスフエラーゼ
（２・６・１・１）、アラニンアミノトランスフエラーゼ（２・
６・１・２）、ピリドキサミンピルベートトランスフエラ
ーゼ（２・６・１）、ヘキソキナーゼ（２・７・11）、グルコキナーゼ（２・７・１・２）、フルクトキナーゼ（２・７・１・４）、ホスグルコキナーゼ（２・７・１・10）、ホスホフルクトキナーゼ（２・７・１・
11）、ピルベートキナーゼ（２・７・１・40）、カルボキシエステラーゼ（３・１・１・
１）、アリールエステラーゼ（３・１・１・
２）、リパーゼ（３・１・１・３）、ホスホリパーゼＡ（３・１・１・４）、アセチルエステラーゼ（３・１・１・
６）、コレステロールエステラーゼ（３・１・
１・13）、グルコアミラーゼ（３・２・１・３）、セルラーゼ（３・２・１・４）、イヌラーゼ（３・２・１・７）、 α−グリコシダーゼ（３・２・１・20）、 β−グリコシダーゼ（３・２・１・21）、 α−ガラクトシダーゼ（３・２・１・
22）、 β−ガラクトシダーゼ（３・２・１・
23）、インベルターゼ（３・２・１・26）、ペプシン（３・４・４・１）、トリプシン（３・４・４・４）、キモトリプシンＡ（３・４・４・５）、カテプシンＡ（３・４）、パパイン（３・４・４・10）、トロンビン（３・４・４・13）、アミダーゼ（３・５・１・４）、ウレアーゼ（３・５・１・５）、ペニシリンアシダーゼ（３・５・１・
11）、アミノアシラーゼ（３・５・１・14）、アデニンデアミナーゼ（３・５・４・
２）、 A.T.P.アーゼ（３・６・１・３）、ピルベートデカルボキシラーゼ（４・１・
１・１）、オキザレートデカルボキシラーゼ（４・
１・１・２）、トリプトフアンデカルボキシラーゼ（４・
１・１・27）、アルドラーゼ（４・１・２・13）、マレートシユターゼ（４・１・３・２）、トリプトフアンターゼ（４・２・１・
20）、アスペルターゼ（４・３・１・１）、リジンラセマーゼ（５・１・１・５）、グリコール−６−リン酸イソメラーゼ
（５・３・１・９）、ステロイド△−イソメラーゼ（５・３・
３・１）、マクシニルCoAシンセターゼ（６・２・
１・５）、など。

（註）カツコ内の数字は酵素番号を表わす。

(ロ) 微生物菌体の例：ラクトバチルス・ブルガリクス
（Lactbacillus bilgaruicus）、アエロバクター・アエロゲネス
（Aerobacter aerogenes）、バチルス・ズブチリス（Bacillus
subtulis）、アゾトバクター・ビネランデイ
（Azotobacter vinelandii）、プロテウス・ブルガリス（Proteus
vulgaria）、アースロバクター・シンプレツクス
（Arthrobacter simplex）、エツシエリシア・コリー（Escherichia
coli）、シユードモナス・プチダ（Pseudomonas
putida）、アクロモバクター・リクイダム
（Actromobacter liquidum）、クルブラリア・ルナータ（Curvularia
lunata）、コリネバクテリウム・グルタミカム
（Corynebaterium glutamicum）、ノカルデイア・ロドクラス（Nocardia
rhodcrous）など。

液状組成物の調製：以上に述べた(a)、(b)、(c)及び(d)の各成分は、水
性媒体中で相互に充分に混合することにより液状
組成物にすることができる。使用しうる水性媒体
としては、水又は緩衝水溶液が好適であるが、場
合によつては水溶性アルコール類と水又は緩衝水
溶液との混合液、水溶性ケトン類と水又は緩衝水
溶液との混合液、水や緩衝水溶液と均一に混合し
うるエステル系溶剤溶液などを使用することもで
きる。

上記(a)、(b)、(c)及び(d)の各成分の相互の使用割
合は厳密に制限されるものではなく、各成分の種
類等に応じて広範にわたつて変えることができる
が、一般には、(a)成分の親水性光硬化性樹脂100
重量部に対し、下記の割合で使用するのが適当で
ある（カツコ内は好適範囲である）。

(b) 光重合開始剤：0.5〜５重量部（１〜３重量
部） (c) 水溶性高分子多糖類：0.5〜15重量部（１〜
８重量部） (d) 酵素又は微生物菌体：0.001〜50重量部
（0.01〜20重量部）また、水性媒体は上記(a)〜(d)の合計に対して10
〜1500重量部（50〜900重量部）の範囲で使用す
ることができる。

ゲル化：上記の如くして調製された液状組成物は次いで
多価金属イオンを含有する水性媒体中に滴下する
ことにより粒状にゲル化される。

上記水性媒体中に含ませうる多価金属イオンと
しては、該液状組成物中の水溶性高分子多糖類を
ゲル化させる能力のあるものが選ばれる。その
際、該多価金属イオンが該水溶性高分子多糖類を
ゲル化させる能力を有しているか否かは、例え
ば、親水性光硬化性樹脂と水溶性高分子多糖類を
均一に含む混合水溶液を該多価金属イオン液に滴
下して液状にゲル化するかどうか観察することに
より容易に決定することができる。

選ばれた多価金属イオンを含有する水性媒体の
調製は、水性媒体中に、該多価金属の水溶性化合
物、例えば該多価金属のハロゲン化物、炭酸塩、
炭酸水素塩、硫酸塩、硝酸塩等を溶解することに
より行なうことができる。その際の水性媒体中の
多価金属イオンの濃度は、一般に0.01〜5mol／
、好ましくは0.1〜2mol／の範囲内とするこ
とができる。

かかる多価金属イオンを含有する水性媒体中へ
の前記液状組成物の滴下は、例えば、注射針のよ
うな先の細い管の先端から該液状組成物を滴下す
る方法、遠心力を利用して該液状組成物を粒状に
飛散させる方法、スプレーノズル先端から、該液
状組成物を霧化して粒状とし滴下する方法などの
方法により行なうことができる。滴下する液滴の
大きさは最終の粒状固定化物に望まれる粒径に応
じて自由に変えることができるが、通常は直径が
約0.1〜約５mm、好ましくは約0.5〜約３mmの液滴
として滴下させるのが好都合である。

滴下した液状組成物は水性媒体中で多価金属イ
オンと接触し、直ちにゲル化して、粒状のゲルと
なる。その際のゲル化の機構は正確にはわからな
いが、水溶性高分子多糖類がハロゲン化物又は塩
溶液により凝集し、ついで水溶性高分子多糖類に
含まれるアニオン基が多価金属イオンを介して、
イオン結合することにより三次元的に架橋してゲ
ル化するものと推定される。

上記ゲル化の温度は通常室温で充分であるが、
必要により、酵素又は微生物菌体が失活しない程
度の加温下にゲル化を行なつてもよく、或いは冷
却下に行なつてもよい。

光硬化：上記の如くして生成せしめた粒状ゲルは、その
まま水性媒体中に分散させた状態で、或いは水性
媒体から分離した後活性光線を照射することによ
り、該粒状ゲル中の親水性光硬化性樹脂を硬化せ
しめる。これにより粒状ゲルは水に実質的に不溶
性で機械的強度の大きい酵素又は微生物菌体の粒
状固定化物が得られる。

上記の光硬化に使用しうる活性光線の波長は該
粒状ゲル中に含まれる光硬化性樹脂の種類等に応
じて異なるが、一般に約250〜約600nｍの範囲内
の波長の光を発する光源を照射に使用するのが有
利である。そのような光源の例としては、低圧水
銀灯、高圧水銀灯、螢光灯、キセノンランプ、カ
ーボンアーク灯、太陽光等が挙げられる。照射時
間は光源の光の強さ、光源からの距離等に応じて
変える必要があるが、一般には約0.5〜約10分間
の範囲内とすることができる。なお、照射を不活
性ガス雰囲気中で行なうと、照射時間が短縮され
ることがある。

照射は生成せしめた全粒状ゲルに活性光線が出
来るだけ満遍無く行きわたるようにすべきであ
り、例えば、水性媒体から分離した粒状ゲルに活
性光線を照射する場合には、該分離した粒状ゲル
を適当な透明ガラス板又はガラス容器中に実質的
に単層をなすようにして配し、そのガラス板又は
ガラス容器の上方及び下方の両方から照射するこ
とが好都合である。

このように照射処理が終つた粒状ゲルは水ある
いは、緩衝水溶液で洗浄し、そのまゝ保存に供し
たりあるいは粒状ゲルを凍結乾燥して保存するこ
とができる。

かくして本発明により粒径が約0.5〜約５mmの
酵素又は微生物菌体の粒状固定化物が、極めて簡
単な操作で製造することができ、連続的生産も可
能である。

本発明の方法によればこれまで困難であつた合
成担体による酵素又は微生物菌体の粒状固定化が
可能になつたこと、水溶性高分子多糖類を使用す
ることによる酵素や微生物菌体の活性の保護効果
が得られること、水溶性高分子多糖類の解こう時
に粒状固定化物中に微細な多孔性を付与されるこ
とによる基質透過性の増大に基づく反応速度の向
上を達成しうるなどの利点が得られる。

また、これらの粒状固定化物は、特に反応装置
規模が余り大きくないリアクター、流動床型のリ
アクターなどに簡便に用いることができる。

次に実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１分子量約4000のポリエチレングリコール2000ｇ
とイソホロンジイソシアネート１モル（222ｇ）
およびメタクリル酸２−ヒドロキシエチル１モル
（130ｇ）の混合物からなる光硬化性（樹脂）プレ
ポリマー100重量部と、ベンゾインイソブチルエ
ーテル２重量部および蒸留水100重量部をよく混
合する。これに２％アルギン酸ナトリウム水溶液
100重量部および0.1M−リン酸緩衝液（PH５）に
とかした酵素インベルターゼ（0.1％濃度）100重
量部に加えると共によく混合し、得られる光硬化
性樹脂−酵素混合液を1M−塩化カルシウム溶液
中に、注射器先端の注射針から液面高さ10cmより
滴下したところ、粒径約２mmの粒状物が得られ
た。

この粒状物を平らな底面を有するペトリ皿にと
り、ペトリ皿の上面及び下面から波長300〜400n
ｍの活性光線を３分照射したところ圧縮強度20
Kg／cm²の粒状固定化酵素が得られた。

この粒子のインベルターゼ活性をシヨ糖を基質
として測定したところ、固定化しないインベルタ
ーゼに対する比活性が65％であつた。

実施例２ポリエチレングリコール2000（分子量2000）
1000ｇとメチルメタクリレートモルとからなる光
硬化性（樹脂）プレポリマー100重量部に蒸留水
100重量部を加えてから約50℃に加温してよく混
合して均一な樹脂水溶液とし、これにベンゾイン
エチルエーテル２重量部を加えて混合溶解した。

この樹脂混合液に３％ｋ−カラギーナン水溶液
75重量部、２％グリコースイソメラーゼ菌体酵素
液（重炭酸ナトリウム緩衝液PH８）25重量部を加
えて均一な混合液を作成した。この均一な混合液
を注射針先端から５％塩化カリウム水溶液中に液
面より20cmの位置から滴下したところ粒径1.5mm
の粒状物が得られた。

この粒状物を平らな底面を有するペトリ皿に単
層となる様に塩化カリウム液と共に移し、深さ２
mmの水溶液中に粒状物が存在するようにして上面
より３分及び下面より３分間波長300〜400nｍの
活性光線を照射したところ圧縮強度30Kg／cm²の粒
状固定化酵素が得られた。

この粒状グルコースイソメラーゼの活性をブド
ウ糖を基質としてPH８の重炭酸ナトリウム緩衝液
中で60℃にて測定したところ固定化しないグルコ
ースイソメラーゼに対する比活性が80％であつ
た。

実施例３エピコート1001樹脂（分子量約900、エポキシ
当量約475、シエルケミカル社製、商品名）１モ
ルにアジピン酸1.5モルを反応させ、次いで無水
コハク酸4.5モルでエステル化した後、グリシジ
ルメタクリレート2.75モルを反応させることによ
り生成せしめた酸価が75の光硬化性樹脂（数平均
分子量約4100）を苛性ソーダで中和して得た樹脂
液（固形分50％）100重量部にベンゾインエチル
エーテル１重量部を均一に混合し、更に３％アル
ギン酸ソーダ水溶液50重量部及びアースロバクタ
ー・シンプレツクス（ATCC694）のアセトン処
理菌体0.5重量部を均一に混合分散した。しかる
後その分散液を注射器先端から1.0M塩化アルミ
ニウム溶液へ滴下したところ、球状にゲル化し
た。その球状ゲルをペトリ皿に移し、ペトリ皿の
上面及び下面から波長300〜400nｍの活性光線を
それぞれ３分ずつ照射したところ、直径約３mmお
よび圧縮強度15Kg／cm²の球状固定化微生物が得ら
れた。

この球状固定化アセトン処理菌体を用いて、ヒ
ドロコルチゾンの△^１−脱水素反応を行なつたと
ころ、プレドニソロンが生成し、固定化しない場
合に対する比活性な50％であつた。

実施例４アクリル酸エチル300重量部、メタアクリル酸
100重量部、スチレン80重量部、ホスマーＭ〔メ
タクリレート系リン酸モノエステル、油脂製品
(株)〕20重量部及びメタクリル酸グリシジル50重量
部の共重合物よりなる数平均分子量が約2500の光
硬化性樹脂を苛性カリで中和して得た樹脂液（固
形分75％）90重量部にベンゾインイソブチルエー
テル２重量部を加えて均一に混合した。この混合
液に３％アルギン酸ナトリウム水溶液50重量部及
び0.1M酢酸緩衝液（PH5.6）にとかした0.5％グル
コースオキシダーゼ水溶液50重量部を均一に混合
し、得られるこの樹脂混合液を注射器の先端から
10％アンモニアミヨウバン水溶液を入れたペトリ
皿に滴下したところ粒状にゲル化した。この粒状
ゲルに上面及び下面より波長300〜400nｍの活性
光線を各３分間照射したところ、直径約２mmおよ
び圧縮度17Kg／cm²の粒状固定化酵素が得られた。

この粒状固定化グリコールオキシダーゼの活性
をグリコースを基質として測定したところ、固定
化しないグリコースオキシダーゼに対する比活性
が85％であつた。

実施例５重合度が500のポリビニルアルコール500ｇに、
1.0モルのＮ−メチロールアクリルアミドを付加
して得た光硬化性樹脂の25％水溶液100重量部に
ベンゾインイソブチルエーテル0.5重量部を均一
に混合し、３％ｋ−カラギーナン水溶液100重量
部及びエツセリシア・コリー菌体懸濁液10重量部
を均一に混合分散した。かくして得られた光硬化
性樹脂−菌体混合液を回転する円板上に供給し、
その遠心力で混合樹脂液を飛散させ、その飛散し
た粒子を0.5モル濃度の塩化カリウム溶液中に落
下させ、粒状にゲル化させた。これをペトリ皿に
入れ、上面及び下面より同時に300〜400nｍの光
を３分間照射して粒径３mmおよび圧縮強度10Kg／
cm²の固定化菌体を作ることができた。

この粒状固定化エツセリシア・コリー菌体を用
いグルコースを基質として醗酵を行なつたとこ
ろ、固定化しない場合に比較して1.5倍の速度で
二酸化炭素を生成した。

実施例６分子量4000のポリエチレングリコール2000ｇと
イソホロンジイソシアネート１モル（222ｇ）お
よびメタクリル酸２−ヒドロキシエチル１モル
（130ｇ）の混合物からなる光硬化性（樹脂）プレ
ポリマー100重量部と、ベンゾインイソブチルエ
ーテル１重量部および蒸留水20重量部をよく混合
する。これに３％アルギン酸ナトリウム水溶液50
重量部および0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）
に懸濁した糸状菌クルブラリア・ルナータ
（ATCC12017）の胞子懸濁液10重量部を均一に混
合分散した。しかる後、その分散液を注射器先端
から、0.2M塩化カルシウム溶液に滴下したとこ
ろ液状にゲル化した。その球状ゲルをペトリ皿に
移し、ペトリ皿の上面及び下面から波長300〜
400nｍの活性光線を３分照射したところ、直径
３mm、圧縮強度20Kg／cm²の粒状固定化胞子が得ら
れた。

この粒状固定化胞子を無菌的に培養を行なつ
た。その結果、粒子ゲル中で胞子は発芽、成育
し、培養時間の経過と共に菌糸が発達した。この
粒状固定化菌糸は、水酸化活性を示し、ステロイ
ドの11β−水酸化反応では、固定化しない菌糸と
同等の活性をもつていた。

Claims

【特許請求の範囲】１ (a) １分子中に少なくとも２個のエチレン性
不飽和結合を有する親水性光硬化性樹脂、 (b) 光重合開始剤、 (c) 少なくとも１種の多価金属イオンとの接触に
よりゲル化する能力のある水溶性高分子多糖
類、及び (d) 酵素、又は細菌類及び真菌類から選ばれる微
生物菌体を含んでなる液状組成物を、多価金属イオンを含
有する水性媒体中に滴下して該組成物が粒状にゲ
ル化させ、次いで得られる粒状ゲルに活性光線を
照射して該粒状ゲル中の光硬化性樹脂を硬化させ
ることを特徴とする酵素又は微生物菌体の粒状固
定化成形物の製造方法。