JPS62146599A - レバウデイオサイドａの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、キク科に属するステビアレバウディアナ・ベ
ルトニーの葉や茎に含まれる潰れた甘味成分であるレバ
ウｒイオサイドＡ仝憔めて高い転換率でステビオサイド
より作る酵素的な製造方法に関するものである。

更に詳しくは、ステビオサイドとβ−１，３−グルコシ
ル糖化合物を含む水溶液に、微生物が生産するβ−１，
３−グルコフル樵化合物金糖の供与体としてステビオサ
イドに糖を転移笛せる活性ｋｍする酵素全作用させ、レ
バウディオサイドＡＫ転侯反応させるのに際し、該水溶
液中にＭ磯溶媒及び／又は、エキソタイプのβ−１，３
−グルカナーゼを共存もしくは別途作用させ転移反応全
きせることを特徴とした筒転換率のレバウｆイオサイド
Ａの製造法に関す、る。

（従来技術） レバウディオサイドＡ（β−１，３−モノグルコシルス
テビオザサイド）はステビア葉や４シに２〜６チ程度含
まれ、主成分であるステビオサイド（６〜１２％）に次
いで含量が高い。これまでステビア甘味料としては、こ
の両者の混合物として使用感れているが、ステビオサイ
ドは苦味を有し後味が残るのに対し、レバウディオサイ
ドＡは苦味のない１ろやかな甘味を有し、蔗楯に対比し
た甘味倍率も高いものである。これまでのステビア甘味
料の呈味質の改善法としては天然糖類、アミノ酸を添加
する方法等が多く試みられてきたが、最近ステビオサイ
ドに糖を付加させ、カロリーを上げることなく苦味を解
消した新規なステビア甘味料が開発されている。（特開
昭５４−５０７０号公報）しかしながら、ステビオサイ
ドに比べ甘味倍率が低下するという欠点を有していた。

このことによシレバウディオサイドＡが単独を）るいは
腐金有量のステビア甘味料の開発が熱望芒れている。従
来、レバウディオサイドＡを得る方法としては、２テピ
ア幹探粂から抽出、精製して得られたステビオサイドと
レバウディオサイドＡの混合状態からステビオサイドを
晶析除去後、再結晶をくυ返す方法で行われているが、
収率が悪いため、レバウディオサイドＡを抽出時に高含
有にする８普がある。

そこで本発明者らは、ステビア葉抽出液中に最も多く存
在するステビオサイドに発酵法又は酵素法によりグルコ
ースを付加しステビオサイドをレバウディオサイドＡに
変換させることを目的とした発明を既に完成し、％圀昭
５８−１４９６９７号公報として出願済である。その先
Ｍ発明は、ステビオサイドとβ−１，３−グルコシル糖
化合物例えばカードラン、パキマン、ラミナリン等のβ
−１，３−結合を有する糖化合物を含有する水溶液に、
これらβ−１，３−グルコシル化合物からグルコースを
ステビオサイドのアグリコンであるステビオールの水酸
基に結合したρ−Ｄ−グルコースのＣ３位に転移しうる
活性すなわちβ−１，３−グルコシル転移活性を有する
微生物の培養液、菌体または菌体処理物を反応させてレ
バウディオサイドＡを生成させることを目的とするもの
である。

しかしながら、この先願発明の方法では、レバウディオ
サイドＡを含む２種以上のβ−１，３−グルコシルステ
ビオサイドを生成するが、レバウディオサイドＡへのモ
ル変換率は２０％以下であシ満足できるものでになかっ
た。そこで本発明者らは更にステビオサイド金者しい選
択性を以てレバウディオサイドＡに高変換する能カ全有
す°る微生物を枚葉すべく、広く自然土壌界から多くの
微生物全停離し、その中から、ストレプトミセス属に禍
し、強いβ−１，３−グルコジルトランスフェラーゼ活
性を有している微生物を見出すとともに、該微生物によ
り高上層変換率でステビオサイドをレバウディオサイド
Ａのみに変換する能力全見出し、特開昭５９−１７９９
６号として出願している。

しかしながら、β−１，３−グルコシル糖転移酵素によ
るステビオサイドよりレバウディオサイドＡの転換率は
反応条件全コントロールしても５０〜６０％が限界であ
った。

（問題点を解決する為の手段） そこで本発明者らは、ステビオサイドに楯全転移させ、
レバウディオサイドＡに転換さ″せるβ−１・３−グル
コシル転移活性を有する酵素による副反応生成物の生成
を抑制し、極めて高転換率でレバウディオサイドＡを生
成させる方法について７槻意研究し、本発明を完成させ
るに至った。

即ち、本発明は、β−１，３−グルコシル糖化合物とス
テビオサイドとを含有する水溶液に微生物の生産するβ
−１，３−グルコシル転移活性を有する酵素を作用させ
て、ステビオサイドをレバウディオサイドＡに転換反応
させるのに際し、該水溶液中に有機溶媒及び／又はエキ
ソタイプのβ−１，３−グルカナーゼを共存もしくは別
途作用させて転移反応をさプることを特徴とするし・ぐ
ウディオサイドＡの製造法を提供するものである。

（構　成） 本発明に用いるステビア甘味成分を含有した水溶液は、
高度に精製又は粗精製されたステビア甘味料製品の水溶
液に限ることなく、ステビア葉からの抽出中の溶液、抽
出後の溶液であってもいずれのものでもよい。

本発明に用いるβ−１，３−グルコシル転移酵素は、β
−１，３−グリコジル糖化合物を糖供与体としてステビ
オサイドに糖と転移させ、レバウディオサイドＡ　ＭＣ
転換させる能力？有している酵素であれば、微生物、動
物、植物を問わずいずれの起源のものからであってもよ
い。

本発明では特にストレプトマイセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｅｅｓ＋　）に属する微生物が生
産する酵素が好ましい。その中でも特に好ましい微生物
としてストレプトマイセス゛エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｅｅｓ−５ｐ）ＤＩＣ−１０８が挙げられる。

又、本発明は、該β−１，３−グルコシル転移活性を有
する酵素をβ−１，３−グルコシル糖化合物とステビオ
サイドと全官有する水溶液に作用させる際に、有機溶剤
を共存させるか、エキソタイプのβ−１，３−グルカナ
ーゼ金共存させて転移反応↓ が、有機温媒と該グルカナーゼを併用するがよシ好〜ま
しい。このエキソタイプのβ−１，３−グルカナーゼｕ
、β−１，３−グリコジル糖化合物を分解し、グルコー
スを主生成物として生成し、かつβ−１，３−グルコシ
ル糖転移活性を有する酵素によるステビオサイドのレバ
ウディオサイドＡへの転換率金高める作用金有していれ
ばいずれの起源のものであっても良い。好ましくは、ス
トレプトマイセス属に属する微生物に起源するものでち
る。特に好ましい微生物としては、ストレプトマイセス
・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、ｓｐ）　ＤＩ
Ｃ−１０８が挙げられるが、これに限定されるものでは
ない。

尚、ストレプトマイセス・エスピーＤＩＣ−１０８の菌
学的性質については、特開昭５９−１７９９６号公報に
既に記載されているが、詳細には以下の様な性質金有す
るものである。

〔ストレプトマイセス・ｓｐ、ＤＩＣ−１０８の菌学的
性質〕（１）形態的特徴 使用した培地（ＩＳＰ培地を含む）上での栄養菌糸の生
育は優れており、デンでン無機塩、オートミール寒天、
イースト麦芽寒天培地上で豊富な気菌糸を形成する。

胞子形成気菌糸は重求戊七厘状又は直曲状である。胞子
は楕円体で大きさは、短径×長径０．７〜０．８μＸ　
１．０〜１．２μである。走丘型電子顕微鏡による観察
では胞子の表面構造はイボ状（Ｗａｒｔｙ）である。

（２）各種培地における生育状態 １）シュクロース硝酸塩寒天培地（３７℃）薄茶色の基
生菌糸状に灰色の気菌糸を形成し、溶解性色素は認めら
れない。

２）グルコース・アスパラギン寒天培地（３７℃）薄黄
白色の生育で気菌糸の形成はみとめられない。また溶解
性色素は認められない。

３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地−
７１ａ５３７℃） 薄黄色の生育で気菌糸の着生はみとめられない。

又、溶解性色素は認められない。

４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ培地３７℃）無
色の発育上に繰入色の気菌先金着生し、溶解性色素は認
められない。

５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地−７，３７℃）薄茶
色の発育上に培養７日目では気菌糸は着生せず、１４４
日目白灰色の気菌糸を着生する。溶解性色素は認められ
ない。

６）栄養寒天培地（３７℃） 繰入黒色の発育上に薄縁灰色の気菌糸を着生し１、溶解
性色素は認められない。

７）イースト麦芽寒天培地（ＩＳＰ培地−２，３７℃）
薄茶色の生育上に薄縁灰色の気菌糸を着生する・水溶性
色素の生成は認められない。

８）　オートミール球入培地（ＩＳＰ培地−３，３７℃
）無色の生育上に緑茶灰色の気菌糸を着生し、水溶性色
素の生成は認められない。

（３）生理的性質 １）生育温度範囲 酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生育試験では、
３０℃〜５０℃で生育するが、至適温度は３７℃〜４５
℃である。

２）ゼラチンの液化二陰性 ３）脱脂乳の凝固及び 脱脂乳のペプトン化：陰性 ４）メラニン色素の生成（ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ＩＳＰ培地６）：陰性 ５）デンプンの分解性：陽性（分解ゾーンに白いリング
を形成） ６）炭素源の利用性（ｆ　ＩＪドハム、ゴドリープ寒天
培地−９，３７℃） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ
−マンニトール、ガラクトースをよく利用して生育し、
シュクロース、２フイノース、サリシンは利用しない。

７）細胞壁組成 ＩＳＰに記載されている糖組成ＴｙｐｅとしてはＴｙｐ
ｅＩに属する。

尚、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
申請し、微工研菌寄第６５９３号として受託されている
。

本発明による酵素生産の為の培養には、通常の固体培地
又は液体培地が使用され、液体培養の為の培地の炭素源
としては、β−１，３−グルコシル糖化合物であれは利
用できる。

例えば、カードラン、・クキマ／、ラミナリン、リケナ
ン、酵母細胞壁又はその部分加水分解物、リュウコシン
、カロース、パラミロン等が挙げられ、又窒素源として
は硫安、塩安、リン安、硝酸ナトリウム、尿素、ベプト
′ン、カゼイン等、有機窒素、無磯窒素、いずれも利用
できる。

天然栄養源としては、例えば＠種楯（、コーンステイー
プリカー、オートミール、味液、魚粉、肉エキス、酵母
、酵母エキス、７１！テトエキス、麦芽エキス等があげ
られる。

無機物としては、例えばリン酸二カリウム、リン酸−ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、微量金属類などが挙げら
れる。その他、必要に応じてビタミン類等を添加するこ
ともできる。これらの使用濃度としては、０．１〜４０
重量係が用いられる。

また醗酵中の発泡を抑制する友め、０．０００１〜１．
０重量％の消泡剤を添加してもよい。消泡剤としては、
シリコーン、大豆油など通常の消泡剤を用いる。

培養方法は、損とり培養、通気培養などの好気的液体培
養が適しており、ｐ）ｉ５．ｏ〜８，０．培養温度２０
℃〜５０℃で１〜６日、望ましくはｐ）１６．５〜７，
５．３５〜４０℃で２日前後培養する。

β−１，３−グルコシル転移活性を有する酵素及びエキ
ソタイプのβ−１，３−グルヵナーゼハ、菌体外に生産
する酵素であるので、培養終了後、口過又は遠心分離し
て除菌し、上溝液を回収する。

そして必要に応じて濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムによ
る塩析、又はアセトン、エタノール、メタノール、イソ
グロパノールなどの有機溶剤を加え、酵素を沈澱物とし
て取得し、乾燥、保存する。

本発明で好ましく用いられる前記ＤＩＣ−１０８株から
のβ−１，３−グルコシル転移活性を有する酵素（ＳＧ
Ｔａｓｅと称す）及び同じくエキソタイプのβ−１，３
−グルカナーゼ（β−１，３−グルカナーゼＦｉｆｆと
称す）の性質を次に示す。

５ＧＴａｓの （１）作用二 β−１，３−グルコシル糖化合物、例えばカードシン、
ラミナリン、パキマン、酵母細胞壁及びその部分分解物
に作用してエンドタイプの加水分解作用を示す。Ｇ５（
ラミナリペンタオース）を基質とした時の主分解生成物
はＧ２と０３である。（図−１，２参照）糖受容基質と
して、ステビオール配糖体のステビオサイド、レバウデ
ィオサイドｃルバウディオサイドＡのいずれが存在して
も糖転移作用を示す。

（２）作用−範囲及び最適作用ｐＨ二 ｐＨ３〜９の範囲で作用し、最適作用−は６付近にある
。（図−３参照） （３）　　作用温度範囲及び最適作用温度：約り０℃〜
約７０℃まで作用し、最適作用温度は約６５℃である。

（図−４参照） （４）熱安定性。

０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ−１６，０）中、１時間の
熱処理によシ活性は、約５０％低下した。

（５）精製方法 本酵素は培養口過液から硫安６５％飽和で沈澱物として
回収後、ＤＥＡＥ　−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ　−２５カ
ラムクロマトグラフイー（０，ＯＩ　Ｍトリス−ＨＣｔ
バッファー、ｐＨ７，５）を行い、食塩凝度０．２Ｍで
溶出される画分を集める。そして脱塩後ＣＭ−８ｆ１ｐ
ｈａｄｅｘ　Ｃ−２５カラムクロマトグラフイー（０，
０１Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ６，０）を行って未吸着画
分子集め、再度ＤＥＡＥ　−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ　−
２５カラムクロマトグラフイー（０〜０．２５Ｍのリニ
アグラディエンド）により活性画分を集める。次いでＧ
−１００ｒルロ過クロマトグラフイーによシ、はぼ均一
な酵素タンパク質を得る。

（６）分子量： セファデノクスＧ−１００グルクロマトグラフイーによ
る分子量は約２７，０００と推定された。

β−１，３−グルカナーゼＦｉｎ （１）　　作用： β−１，３−グルコシル糖化合物、例えばカードラン、
ラミナリン、・クキマン、酵母細胞壁及びその部分加水
分解物に作用してエキソ型の加水分解作用を示すが、漁
転移作用は持たない。Ｇ５を基質とじたときの生分解生
成゛；刀はグルコースとＧ、である。

（図−５参照） （２）作用μｍ範囲及び最適作用Ｆ１１（：ｐＨ３〜９
まで作用し、最適作用−は６でおる。

（図−６参照） （３）　　作用温度範囲及び最適作用温度：約り０℃〜
約７０℃まで作用し、最適作用温度は約６０℃である。

（図−７参照〕 （４）熱安定性二 ０．０１Ｍ酢酸バッファー中では４５℃、１時間の熱処
理で完全に失活するが、Ｏ，１Ｍ！Ｊン敢バッファー中
では６０℃、１時間の熱処理で約６０％失活する。

（５）精製方法： 本酵素は培養口過液から硫安６５％飽和で沈澱物として
回収後、ＤＥＡＥ　−５ｅｐｈａｄｓｘ　Ａ　−２５カ
ラムクロマトグラフイー（０，０１Ｍトリス−ＨＣＺバ
ッファー、ｐＨ７，５）ｅ行い、塩化ナトリウム濃度０
．２Ｍで溶出さｎる画分全集める。脱塩後ＣＭ−８ｅｐ
ｈａｄｘ　Ｃ−２５カラムクロマトグラフイー（０，０
１Ｍ酢酸バッファー、ｐ）１６．０）を行って塩化ナト
リウム０．３Ｍ溶液で溶出される両分を集め、次いでハ
イトロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィーの０
．２Ｍリン酸バッファーで溶出される活性画分を集める
ことにより、はぼ均一なタン・々り質を得ることができ
る。

（６）分子ｆオニ セファデックスＧ−１００ｒルクロマトグラフイーによ
る分子量は約４４．０００と推定された。

本発明で用いる有機溶剤としては、ステビオサイドのｌ
／パウディオサイドＡの転換率を高めるか、レバウディ
オサイドＡ以外のステビオサイド系甘味料化合物となる
ことを懇書する働きを有するものであればいずれのもの
でも良く１．具体的にはアルコール類として例えばメタ
ノール、エタノール、ゾロ♂ルアルコール、ブチルアル
コール等が挙ケられる。ケトン類としては、例えばアセ
トン、アルキルメチルケトン、ジエチルケトン、ｎ−ブ
チルエチルケトン、メチルエチルケトン等が挙げられる
。酢酸エステル類としては、酢酸メチル、酢酸エチル、
酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸アミル等が挙げられる
。炭化水素類としては、例えばヘキサン等が挙げられる
。フタル酸エステル類としては例えばフタル酸ジメチル
、７タル酸ソエチル、フタル酸ジグチル等がある。グリ
コール類としてハ、エチレングリコール、フロピレンゲ
リコール、チオグリコール等がある。その他ジメチルス
ルホオキサイド（ＤＭＳＯ）及びジオキサン２−メルカ
グトエタノールといった溶剤が用いられる。これらから
選ばれる１種以上の有機溶剤は、容積比でステビオサイ
ドとβ−１，３−グルコシル糖化合物とを含有する水溶
液に対し、１〜５０％（Ｖ／Ｖ　）、好ましくは２〜３
０％で用いられる。

次にこれらの酵素を用いて高転換率でステビオサイドを
レバウディオサイドＡに転換する方法について説明する
。

まず、β−１，３−グルコシル糖化合物として例えばＯ
，１〜３０ｗｔ％のカードランあるいはこれを分解して
得られたラミナリペンタオースを含ｔｒラミナリオリゴ
糖に対し、０．１〜１０ｗｔ％のステビオサイド全溶解
させた液に、好ましくは２〜３０％　（Ｖ／Ｖ　）、よ
シ好ましくは５〜２０％（Ｖ／Ｖ　）の例えばアルコー
ル類もしくはケトン類等の有機溶媒、例えば、アセトン
、酢エチ、メチルエチルケトン、ヘキサン、ｌ）ＭＳｏ
　１ジオキサン、チオグライコール、プロピレングライ
コール、フタル酸メチル、メタノール、エタノール等金
添加し、β−１，３−グルコシル転移酵素（例えｔｄ　
５ＧＴａａ＠）　’ｆｒ、作用させるか、更にエキソタ
イプのβ−１，３−グルカナーゼと共に同時に作用させ
るか、又はβ−１，３−グルコシル転移酵素による反応
後、更にエキソタイプのβ−１，３−グルカナーゼを作
用させる。

この反応により、ステビオサイドよシレパウディオサイ
ドＡへの転換率は７０〜１００％となシ、ステビオサイ
ドのレバウディオサイドＡへの反応収率は４０％以上が
得られる。

本発明の方法に用いるβ−１，３−グルコシル糖化合物
としては、好ましく使用されるストレプトミセス・エス
ピーＤＩＣ−１０８によってステビオサイドからレバウ
ディオサイドＡを生成するものであればいずれでも良い
が、例えば、パキマン、カードラン、ラミナリン、酵母
細胞壁又は酵母細胞壁の部分加水分解物、ここで言う酵
母とは、例えばサツカロマイセス属、キャンディダ属、
ビヒア属、シゾサッ力ロマイセス属、トルロゾシス属、
ハイセヌラ属等を言うものであシ、更にリーラコシン（
珪藻類の細胞壁）、カロース（高等植物）・セオラス細
胞壁）、パラミロン（単細胞間の細胞壁）、リケナン（
コケの抽出物）、イネ科植物の種子胚乳よｐ得られる糖
類（ここで言うイネ科植物とはイネ、オオムギ、コムギ
等を相称する）、などのβ−１，３−グルコシル糖化合
物含有物が挙げられる。それらのうち好適なものとして
は、２母キマン、カードランやラミナリンが挙げられ、
これらは入手し易い点からもよシ好ましい。尚、カード
ランとは、β−１，３−グルコシド結合全主体とする水
不溶性のβ−グルカンでちゃ、その懸濁液を加熱すると
かたい弾力性のある熱不可逆性のグル全つくる多糖の総
称でおる。このものは現在のところ微生物によってつく
られたものが市販されている。（Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈ＠ｍ、　、　２９　、７５７．’６５又は発酵と工業
３６，２．’７８参照）。

本発明で好ましく使用されるストレプトミセス・エスピ
ーＤＩＣ−１０８を培養した培養液及び菌体はバッチ式
で反応させてもよいし、公知の方法によシ菌体を固定化
して連続的に変換反応を行わせることもできる。

本発明の転移反応条件は、ステビオサイド１とβ−１，
３−グルコシル糖化合物とを含有する水溶液に、ストレ
プトミセス・エスピーＤＩＣ−１０ｓの培誉液、菌体、
菌体処理物、又はこれらより分離されたβ−１，３−グ
ルコシル転移活性を有する酵素を反応させればよい。反
応に用いるステビオサイドは、Ｍ　Ｈステビオサイドの
場合、反応液中のステビオサイドの濃度全豹０．１〜約
１０重量％とし、β−１，３−グルコシル糖化合物の濃
度を約０．１〜約３０重ｔ％とすればよい。これらの反
応液のＰＩ（と温度はβ−１，３−グルコシル転移活性
を有する酵素が反応してレバウディオサイドＡｋ生成さ
せうる条件であればよいが、通常ｐＨ３〜１０好ましく
はＰＨ５〜８、温度２０〜７０℃好なしくけ３０〜５０
℃が適当である。このよりにしてレパウテ′イオサイ＋
ｙ　Ａ　Ｘ、ｃ生成せしめた反応溶液は、そのままでも
甘味料として使用できる。また必要に応じて、ａ４素あ
るいは菌体全加熱失活させた後、スチレンとノビニルベ
ンゼンの重合吸着樹脂例えばダイヤイオンＨＩ’−２０
（商品名、三菱化成社製）、アンバーライ）　ＸＡＤ　
−２（間品名、オルガノ社！［り等、又はイオン交換樹
脂（例えばＨ型強酸性イオン交換樹脂およびＯＨ型弱塩
基性イオン交換樹脂）金用いて脱塩し、こｆｌｔｄ縮し
てシラツブ状の甘味料とするか、又は乾燥、粉末化して
粉末状の甘味料とすることもできる。

更に脱塩した反応溶液をキ１イ製してレバウディオサイ
ドＡを分離採取して甘味料とすることもできる。この際
、濃縮、乾燥、粉末化は公知の方法、例えば減圧濃縮、
膜濃縮、真空乾燥、Ｉ！Ａ初乾燥等の各種方法が自由に
用いられる。このようにして得られたレバウディオサイ
ドＡの甘味度は、甘味度の測定条件によっても異なるが
一般には、反応に用いたステビオサイドの固型物点量に
見合う甘味度に比べおよそ１．３倍強い。またその甘味
の質は、苦味や渋味等の４４に味がなく、まろやかな甘
味であって砂糖に似ておシ、残味の切れもよい。

このレバウディオサイド人は、苦味、嫌味、アク味等が
全くない無臭、白色の粉末で水に可溶であるためステビ
オシト及びグリチルリチンの共存比率、又液体、粉末状
の条件下で任意に共存させることができる。また、レバ
ウディオサイドＡは、サッカリン及びその塩類、サイク
ラミン酸ナトリウム、ジヒドロカルコ／、アスパラテー
ム等の周知の合成甘味物質と共用してその呈味特性を有
効利用することが可能で１）、これらの合成甘味物質の
１種又は２種以上に本化合物を添加使用すれば、合成甘
味物質特有の苦味、嫌味等の不快味を改良することが可
能となる。

また、レバウディオサイドＡを賦形剤、希釈剤、吸着剤
的に使用されている砂糖、米糖、ブドウ糖、乳糖、本論
、デキストリン、デンプン等の周知の糖類甘味に添加使
用することによシ、甘味が増強され、従来の使用量よυ
も、大幅にその使用ｉｋ削減することが可能となる。更
に本化合物をソルビット、マルチトール、マンニトール
、キシリトール等の砂糖よりも甘味度が低い低カロリー
甘味物質に添加使用すれば甘味物質の長所を損なうこと
なく甘味全増強することが出来、良質の低カロリー甘味
料が得られる。

レバウディオサイド八はこの様に一般食品及びダイエツ
ト食品、医薬、医薬部外品、煙草、飼料等の甘味源とし
て使用できることはいうまでもない。

例えは、しより油、粉末しょう油、みそ、粉末みそ、も
ろみ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末
すし酢、中華の素、天つゆ、めんっゆ、ソース、ケチャ
ツプ、焼肉のタレ、カレールー、シチューの素、スープ
の素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テー
ブルシラツブ等の各種の調味料、せんべい、あらｎｌお
こし、絣類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊かん、
本革かん、ゼリー、カステラ、飴等の各種和菓子、ノ９
ン、ビスケット、クラッカー、クツキー、パイ、プリン
、パタークリーム、カスタードクリーム、ンユークリー
ム、ワクフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレー
ト、チューインガム、キャラメル、キャンデー等の各種
洋菓子、アイスクリーム、シャーベット、アイスキャン
デー等の氷菓、果実のシロップ漬、水蜜等のシロップ類
、フラワーペースト、ビーナツツペースト、フラーペー
スト等の被−スト物、ジャム、マーマレード、シロップ
漬、糖菓などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、千枚
漬、らっきょう漬等の漬物ＩＬ・・ム、ソーセージ等の
畜肉製品類、食肉・・ム、魚肉ソーセージ、カマゴコ、
チクワ、天ぷら等の魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、さき
するめ、ふぐのみりん干等の各種珍味類、のり、山菜、
するめ、小魚、貝等で製造されるつくだ魚類、煮豆、ポ
テトサラダ、コンブ巻等のそう菜食品、魚肉、畜肉、果
実、野菜のピン詰、缶詰類、合成酒、果実酒、洋酒等の
酒類、コーヒー、ココア、シーース、炭酸飲料、乳酸飲
料、乳酸菌飲料等の清涼飲料水、プリンミックス、ホッ
トケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席
しるこ等即席飲食品等の各種飲食物、嗜好物のせ味付に
使用できる。その他、医薬品及び医薬部外品としては線
画みがき、口紅、リップクリーム、内服薬、トローチ、
肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香錠、うがい薬等への
甘味剤として使用することも自由に行いうる。

（効　果） 本発明によれば、従来の方法に比べて高変換率でステビ
オサイドをレバウディオサイドＡに変換できるので生産
性が高く、工業的に優れた方法でちる。

以下に、本発明の方法およびそれによって得られる甘味
料について実施例により具体的に説明するが、以下のチ
は重量基準とする。

実施例１〜３ （１）　　５ＧＴａｓ＠及びβ−１，３−グルカナーゼ
Ｆｉｎの調製 ストレプトミセス・ｓｐ、ＤＩｃ　−１０８（微工研菌
寄扁６５９３号）を酵母エキス０．２　ｖｒ／ｖ％、ポ
リペブト　ン　０．　２　　ｗ／ｖ　　％　ＭｇＳＯ４
・　７　　Ｈ２Ｏ０，ｌ　　ｗ／ｖ　　％、Ｋ２ＨＰＯ
４Ｑ、　２　ｗ／ｖ％からなる培地３５４に植菌し、同
時に別殺菌したカードラン３５０．９’ｚ加えて７０　
ｔ　Ｊａｒにて３５℃で４０時間通気攪拌培養した。得
らｔた培養液２３ｔを遠心分離してその上清液を硫安０
．６５飽和で塩析し、５ＧＴａｉｅとβ−１，３−グル
カナーゼＦｉｌｌ金含Ｍする粗酵素標品（Ｉ）’に得た
。（Ｉ）よＦ）　ＳＧＴａｍｅとβ−１，３−グルカナ
ーゼＦｌｌｌｉ分離、精製するには、（Ｉ）　ｋ　０．
　ＯＩ　Ｍ　Ｔｒｉ　ｓ　−ＨＣｔバッファー（ＰＨ７
，５）にて溶解し、同バッファーにて透析し脱塩後、同
バッファーで平衝化したＤＥＡｇ−セファデックスＡ−
２５（３３０ｒｎｌＶｏｔ）＊ラムに吸着させ、０．２
　Ｍ　ＮａＣｔ浴液で溶出される両分４７０ｄ′！！−
得る。次いで０．ＯＩＭ酢酸／？ソファ−で透析後、Ｃ
Ｍ−セファデックスＣ−２５（２５０ｍｖｏｔ）による
カラムクロマトグラフィーを行うと、未吸着区分に５Ｇ
Ｔａａｅが、そして０．３　Ｍ　ＮａＣ１溶ｇ、連出区
分にβ−１，３−グルカナーゼＦｌ［が得られる。

５ＧＴａａｓの画分８００ｄｋ、さらに透析脱塩後、再
びＤｇＡＥ−セファデックスＡ　−２５（１００ｍ１ｖ
ｏｔ）に吸着させ、０〜０．２５Ｍの食塩にて直線濃度
勾配法にて溶出を行い、５ＧＴａａｅ画分１００　ｔｒ
Ｌｉ３　（ｐｒｏｔ。

４４Ｌｎり）を得た。このときの活性は約５．８００　
Ｕでおった。これ？さらに濃扁後Ｇ−１００ダルロ過ク
ロマトグラフィー（φ４５　Ｘ　ｌ　８００　ｒａｍ　
）にょｐ精製することにより単−酵素全得ることができ
るが、本発明においてはダル口過以前の精製酵素で充分
性いうる。またβ−１，３−グルカナーゼＦｉｌ１画分
１７０　ｍｌ　（ｐｒｏｔ、５０．２％ｌ　）　ｋさら
にハイトロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィー
（ＶＯ６゜２００ｒ！Ｌｔ）を行い、Ｏ，１８Ｍ　ノ’
）　ン酸ハｙ　７７−で溶出することにより、電気泳動
的に単一な酵素を得ることができるが、本発明において
は、ハイドロキンルアノゼタイト力ラムクロマト以前の
精製酵素において充分性いうる。なおこの時のβ−Ｉ、
３−グルカナーゼＦｉｌｌの活性は約６，０００　Ｕで
あった。

ここで言う５ＧＴａｓｅの酵素活性１単位とは、μｉ７
．０．０、ＩＭのリン酸バッファー中で０．５％のステ
ビオサイドと２％のカードラン全作用させ、それに適量
の酵素を加えて水で５．　ＯＩｒＬｌとし、４５℃で反
応させる。この条件で１時間に１虜のレバウディオサイ
ドＡを生成させる酵素量を言う。

またβ−１，３−グルカナーゼＦｉｌｌの酵素活性１単
位とは、０．０１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ６，０）
にラミナリインタオース１％を懸濁させ、それに適量の
酵素全顎えて水で５．０ゴとし４５℃で反応させる。こ
の条件で１時間に１〜のグルコースに相当する還元力を
生成する酵素量を百５゜（２）転換反応（レバウディオ
サイドＡの選択的生成反応） ステビオサイド（純度９８％）１０ｇ、ラミナリペンタ
オース（純度９５％）４０ｇ、先に調製した５ＧＴａｓ
ｅ　２０単位、及びβ−１，３−グルカナーゼＦｉｌｌ
、０００単位を０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６，
０）ｌｊＫ溶解し、同時に酢［ニーＦ−ルｌＯＯゴを添
加し、４０℃で１６時間反応させた。その後、９０℃で
１０分間加熱し、＃素全失活させた。

この溶液全合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０にＳ、
Ｖ、＝２で通し、ステビオサイド類を吸治させた後、９
５チエタノールで脱着した。脱着液のエタノールを減圧
留去した後、強酸性イオン交換樹脂であるアンバーライ
ト−ＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ型、商品名、ロームアントノ１
−ス社製品）、弱塩基性イオン交換樹脂でおるアンバー
ライ）　−ＩＲＡ　−９３（ＯＨ型、商品名、ロームア
ンドハース社製品）にｓ、ｖ、　＝２で通して脱塩した
。ついでとれき７０℃以下で減圧繰鞘ル、４（生乾燥し
て粉末のジウディオサイドＡ　（ＢｅｂＡと略記する）
６．７０．！Ｉ＋及びステビオサイド（Ｓｔｖと略記す
る）全３．ｌｏ、！ｉ＋得た。

比較例１ 実施例１のβ−１，３−グルカナーゼＦｉｌ及び酢酸エ
チルをそれぞれ除いて反応させた以外は全く同様の操作
を行ったところ、得られたＳｔｖとＲｅｂＡは表−１の
ようであった。

表−１ 実施例４ 実施例１及び実施例３で用いた酢酸エチルの代わりにア
セトン１５％（Ｖ／Ｖ）　ｋ用いた以外は実施例１及び
３と全く同様の操作を行った。その結果、５ＧＴａｓｅ
とアセトン併用でＲｅｂＡ　３．８９　、Ｓｔｙ　５．
１　、ｊｉ’であシ、５ＧＴａａｅ、　Ｆｉ　ＩＩとア
セトン併用でＲｅｂＡ６．４．！Ｆ及びＳｔｖ　３．２
９が得られた。転換率は各々７８チ、９４％、反応収率
は各々３８％、６４％であった。

実施例５ 実施例１及び同３の酢酸エチルの代わりにメチルエチル
ケトン１０％（Ｖ、’Ｖ）’を用いた以外は実施例１及
び同３と全く同様の操作を行った。その結果、５ＧＴａ
ｓｅとメチルエチルケトン併用でＲ・ｂＡ３．８ｇ、Ｓ
ｔｖ　５．　Ｏｇであり　、　５ＧＴａａａ、Ｆｉｌｌ
とメチルエチルケトン併用でＲｅｂＡ　６．　Ｏ、ｉｉ
ｌ及びＳｔｖ　３．８　ｇが得られた。転換率は各々７
６％、９６％１反応収゛率は、各々３８％、６０チであ
った。

実施例６ 実施例１及び同３の酢酸エチルの代わυにエタノールを
用いた以外は実施例１及び同３と全く同様の操作を行っ
た。その結果、ＳＧＴａｇｅとエタノール併用でＲ＠ｂ
Ａ　３．６　ｇ、Ｓｔｖ　５．　Ｏｊ！であり、５ＧＴ
ａｓｅ　。

Ｆｌｎとエタノール併用でＲｅｂＡ　６．０９．　Ｓｔ
ｙ　４．３　ｇが得られた。転換率は各々７２％、９５
％で、反応収率は各々３６％、６０％であった。

実施例７ 実施例１のステビオサイドの代わりにステビア甘味料（
Ｓｔｖ　５８％、ＲｅｂＡ　ｌ　４％、ＲｅｂＣＩ　０
％）ｌＯｙを用いた以外は実施例１と全く同様の操作を
行ったところ、Ｓｔｖ　２２　％、ＲｅｂＡ　５６％、
ＲｅｂＣ２優のステビア甘味料が得ら九た。

【図面の簡単な説明】

図−１はラミナリペンタオースの高速漬液体クロマトグ
ラフィー（ＨＬＣ）のチャートを示し、図−２は、５Ｇ
Ｔａ　ｓ　ｅ反応後のラミナリペンタオースのＨＬＣチ
ャートを示す。図−３は５ＧＴａｓｅの作用−と活性と
の関係を示すグラフであり、図−４は５ＧＴａｓｓの作
用温度と活性との関係を示すグラフである。 図−５は、β−１，３−グルカナーゼＦｉ［反応後のラ
ミナリベンタオースのＨＬＣチャートを示す。図−６は
β−１，３−グルカナーゼＦ１０の作用−と活性との関
係を示すグラフであシ、図−７は、β−１，３−グルカ
ナーゼＦｉｌｌの作用温度と活性との関係を示すグラフ
である。 代理人　弁理士　高　橋　勝　利 ｒｔｒ１乙６ 、ｔ、４．’ｌｌ？ ξ 霞−２ ｐＨ ロー３ １度（’ｃ） 図−十 ｒｔ、３．ｏｌ ｔｖ ローＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、β−１，３−グルコシル糖化合物とステビオサイド
   とを含有する水溶液に微生物の生産するβ−１，３−グ
   ルコシル転移活性を有する酵素を作用させてステビオサ
   イドをレバウディオサイドＡに転換反応させるのに際し
   、該水浴液中に有機溶媒及び／又はエキソタイプのβ−
   １，３−グルカナーゼを共存もしくは別途作用させて転
   移反応をさせることを特徴とするレバウディオサイドＡ
   の製造法。 ２、反応液中に存在させる有機溶媒が、アセトン、酢酸
   エチル、メチルエチルケトン、ヘキサン、ジメチルスル
   ホオキサイド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、チオグライコ
   ール、プロピレングライコール、フタル酸メチル、メタ
   ノール、エタノールから選ばれる１種以上であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載のレバウディオサ
   イドＡの製造法。