JPS6337638B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、キク科に属するステビア レバウデ
イアナ ベルトニー（Stevia rebaudiana
BERTONI）の葉や茎に含まれる甘味成分であ
るレバウデイオサイドＡ（RebaudiosdeA）の発
酵法による製造方法に関するものである。更に詳
しくは、ステビオサイドとβ―１，３グルコシル
糖化合物とを含有する水溶液又は水懸濁液に、ス
トレプトマイセス属に属し、ステビオサイドとβ
―１，３グルコシル糖化合物との間におけるβ―
１，３グルコシル転移活性を有する酵素を産生
し、ステビオサイドをレバウデイオサイドＡに転
換し得る能力を有する微生物の培養液、菌体、そ
れらの菌体処理物またはその微生物から分離され
た前記β―１，３グルコシル転移活性を有する酵
素を作用させることを特徴としたレバウデイオサ
イドＡの製造方法に関する。 レバウデイオサイドＡ（β―１，３―モノグル
コシルステビオサイド）はステビア葉や茎に２〜
６％程度含まれ、主成分であるステビオサイド
（６〜12％）に次いで含量が高い。これまでステ
ビア甘味料としてはこの両者の混合物として使用
されているが、ステビオサイドは苦味を有し後味
が残るのに対し、レバウデイオサイドＡは苦味の
ないまろやかな甘味を有し、蔗糖に対比した甘味
倍率も高い。これまでのステビア甘味料の呈味質
の改善法としては天然糖類、アミノ酸を添加する
方法等が多く試みられてきたが、最近ステビオサ
イドに糖を付加させ、カロリーを上げることなく
苦味を解消した新規なステビア甘味料が開発され
ている。（特開昭54−5070号公報） しかしながら、ステビオサイドに比べ甘味倍率
が低下するという欠点を有していた。このことよ
りレバウデイオサイドＡが単独あるいは高含有量
のステビア甘味料の開発が熱望されている。従
来、レバウデイオサイドＡを得る方法としては、
ステビア乾燥葉から抽出、精製して得られたステ
ビオサイドとレバウデイオサイドＡの混合状態か
らステビオサイドを晶析除去後、再結晶をくり返
す方法で行われているが、収率が悪いため、レバ
ウデイオサイドＡを抽出時に高含有にする必要が
ある。ステビアの育種によりレバウデイオサイド
Ａの含有量を高めたステビア葉の品種改良も試み
られているが、遺伝による形質維持の不安定から
現状としては実用性に乏しい。 そこで本発明者らは、ステビア葉抽出液中に最
も多く存在するステビオサイドに発酵法又は酵素
法によりグルコースを付加しステビオサイドをレ
バウデイオサイドＡに変換させることを目的とし
た発明を既に完成し、特願昭57−31479号として
出願済である。その先願発明は、ステビオサイド
とβ―１，３グルコシル糖化合物例えばカードラ
ン、パキマン、ラミナリン等のβ―１，３結合を
有する糖化合物を含有する水溶液に、これらβ―
１，３グルコシル化合物からグルコースをステビ
オサイドのアグリコンであるステビオールの水酸
基に結合したβ―Ｄ―グリコースのC₃位に転移
しうる活性すなわちβ―１，３グルコシル転移活
性を有する微生物の培養液、菌体または菌体処理
物を反応させてレバウデイオサイドＡを生成させ
ることを目的とするものである。 しかしながら、この先願発明の方法では、レバ
ウデイオサイドＡを含む２種以上のβ―１，３グ
ルコシルステビオサイドを生成するが、レバウデ
イオサイドＡへのモル変換率は20％以下であり満
足できるものではなかつた。そこで本発明者らは
更にステビオサイドを著しい選択性を以てレバウ
デイオサイドＡに高変換する能力を有する微生物
を検索すべく、広く自然土壌界から多くの微生物
を分離し、その中から、ストレプトミセス属に属
し、強いβ―１，３グルコシルトランスフエラー
ゼ活性を有している微生物を見出すとともに、該
微生物により高モル変換率でステビアサイドをレ
バウデイオサイドＡのみに変換する能力を見出
し、本発明を完成させるに至つた。 即ち、本発明はステビオサイドとβ―１，３グ
ルコシル糖化合物とを含有する水溶液または水懸
濁液に、ストレプトマイセス属に属し、ステビオ
サイドとβ―１，３グルコシル糖化合物との間に
おけるβ―１，３グルコシル転移活性を有する酵
素を産生し、ステビオサイドをレバウデイオサイ
ドＡに転換し得る能力を有する微生物の培養液、
菌体、菌体処理物またはその微生物から分離され
た前記β―１，３グルコシル転移活性を有する酵
素を作用させることを特徴とするレバウデイオサ
イドＡの製造方法を提供するものである。 本発明で使用されるストレプトミセス属の菌
は、β―１，３―トランスフエラーゼを含有し、
ステビオサイドとβ―１，３グルコシル糖化合物
とによりレバウデイオサイドＡを生産する菌であ
ればいずれでも良いが、好ましくは、以下に詳細
に説明するストレプトミセス エスピー DIC―
108、ストレプトミセス エスピー DIC―146で
ある。また他の好ましいものとしてこれらの菌株
を人工的に変異処理即ち化学的、物理的手段によ
る変異誘発処理を行うことにより得られる人為的
突然変異株、あるいは自然変異株も全て含まれ
る。 本発明で好ましく使用される前述の２株の菌学
的性質は次のとおりである。 〔ストレプトミセス・エスピー DIC―108の
菌学的性質〕 (1) 形態的特徴 使用した培地（ISP培地を含む）上での栄養
菌糸の生育は優れており、デンプン無機塩、オ
ートミール寒天、イースト麦芽寒天培地上で豊
富な気菌糸を形成する。胞子形成気菌糸は直状
又は直曲状である。胞子は橢円体で大きさは、
短径×長径0.7〜0.8μ×1.0〜1.2μである。走査
型電子顕微鏡による観察では胞子の表面構造は
イボ状（Warty）である。 (2) 各種培地における生育状態 １ シユクロース硝酸塩寒天培地（37℃） 薄茶色の基生菌糸状に灰色の気菌糸を形成
し、溶解性色素はみとめられない。 ２ グルコース・アスパラギン寒天培地（37
℃） 薄黄白色の生育で気菌糸の形成はみとめら
れない。また溶解性色素はみとめられない。 ３ グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP
培地−No.５ 37℃） 薄黄色の生育で気菌糸の着生はみとめられ
ない。又、溶解性色素はみとめられない。 ４ スターチ・無機塩寒天培地（ISP培地 37
℃） 無色の発育上に緑灰色の気菌糸を着生し、
溶解性色素はみとめられない。 ５ チロシン寒天培地（ISP培地―７、37℃） 薄茶色の発育上に培養７日目では気菌糸は
着生せず、14日目で白灰色の気菌糸を着生す
る。溶解性色素はみとめられない。 ６ 栄養寒天培地（37℃） 緑灰黒色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着
生し、溶解性色素はみとめられない。 ７ イースト麦芽寒天培地（ISP培地―２、37
℃） 薄茶色の生育上に薄緑灰色の気菌糸を着生
する。水溶性色素の生成はみとめられない。 ８ オートミール寒天培地（ISP培地―３、37
℃） 無色の生育上に緑茶灰色の気菌糸を着生
し、水溶性色素の生成はみとめられない。 (3) 生理的性質 １ 生育温度範囲 酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生
育試験では、30℃〜50℃で生育するが、至適
温度は37℃〜45℃である。 ２ ゼラチンの液化：陰性 ３ 脱脂乳の凝固及び 脱脂乳のペプトン化：陰性 ４ メラニン色素の生成（ペプトン・イース
ト・鉄寒天培地、ISP培地６）：陰性 ５ デンプンの分解性：陽性（分解ゾーンに白
いリングを形成） ６ 炭素源の利用性（プリドハム、ゴドリーブ
寒天培地―９、37℃） Ｄ―グルコース、Ｌ―アラビノース、Ｄ―
キシロース、Ｄ―フルクトース、イノシトー
ル、Ｌ―ラムノース、Ｄ―マンニトール、ガ
ラクトースをよく利用して生育し、シユクロ
ース、ラフイノース、サリシンは利用しな
い。 ７ 細胞壁組成 ISPに記載されている糖組成Typeとして
はTypeIに属する。 以上の性状から、本菌株はストレプトミセス
（Streptomyces）属に属し、また気菌糸の色調か
ら灰色系（Gray Series）に含まれ、メラニン様
色素を生成しないノン・クロモジエニツク・タイ
プの菌種に属している。 これらの性状から本菌株の分類上の位置につい
て既知菌種を検索すると、ストレプトミセス・ア
ラビカス（Streptomyces aravicus）〔Int.J.of
Sys.Bacteriology（インターナシヨナル・ジヤー
ナル・オブ・システマチツク・バクテリオロジー
の略称）vol.18No.２ p.294′68〕、ストレプトミセ
ス・グリセオフラバス（Streptomyces
griseoflavus）〔Int.J.of Sys.Bacteriology
vol.19 No.4p.433'69〕、ストレプトミセス・マク
ロスポレウス（Streeptomyces macrosporeus）
〔Int.J.of Sys.Bacteriology vol.18 No.２
p.142'68〕、ストレプトミセス・マテンシス
（Streptomyces matensis）〔Int.J.of Sys.
Bacterio logy vol.18 No.２ p.344'68〕、がDIC
―108に近縁の菌種としてあげられる。そこで発
酵研究所の保存株であるストレプトミセス・アラ
ビカスIFO―14035、ストレプトミセス・グリセ
オフラバスIFO―12372、ストレプトミセス・マ
クロスポレウスIFO―12794そしてストレプトミ
セス・マテンシスIFO―12889を同一条件下で培
養して比較すると、ストレプトミセス・アラビカ
ス及びストレプトミセス・グリセオフラバスはデ
ンプンの分解性がないことで明らかに本菌と異な
る。ストレプトミセス・マクロスポレウスとスト
レプトミセス・マテンシスはデンプンの分解性は
どちらもみられるが本菌特有の分解ゾーン中に白
いリングを形成するのはストレプトミセス・マテ
ンシスによつてみられた。ストレプトミセス・マ
テンシスIFO―12889と本菌を比較すると表―１
のように各培地における気菌糸の色調に若干の違
いがみとめられるものの、その他の菌学的性状は
非常によく一致している。 従つて本菌株はストレプトミセス・マテンシス
に極めて近縁の種と考えられる。しかしながら、
β―１，３―グルコシルトランスフエラーゼ活性
の有無の点で大きく異なつており、即ち本菌株は
β―１，３糖化合物からグルコースをステビオサ
イドに転移させる活性を有するが、ストレプトミ
セス・マテンシスは該活性を有せず、又生育至適
温度が低いなど差があることなどから、本菌をス
トレプトミセス・マテンシスに近縁の新種とし
て、ストレプトミセス・エスピー DIC―108と
同定した。 なお本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託申請し、微工研菌寄第6593号として受託
されている。

【表】 〔ストレプトミセス・エスピー DIC―146の
菌学的性質〕 (1) 形態的特微 使用した培地（ISP培地を含む）上での栄養
菌糸の生育は優れており、グルコース・アスパ
ラギン寒天培地以外いずれの培地上においても
よく気菌糸を形成する。胞子形成気菌糸はらせ
ん状（Spiral）である。胞子と橢円体で大きさ
は短径×長径0.7〜0.8μ×1.2〜1.4μである。走
査型電子顕微鏡による観察では、胞子の表面構
造は平滑（Smooth）である。 (2) 各種培地における生育状態 １ シユクロース硝酸塩寒天培地（37℃） 無色の生育上に灰褐色の気菌糸を形成し、
溶解性色素はみとめられない。 ２ グルコース・アスパラギン寒天培地（37
℃） 薄黄色の生育で気菌糸の形成はみとめられ
ない。また溶解性色素はみとめられない。 ３ グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP
培地―No.５ 37℃） 薄灰褐色の生育で紫白灰色の気菌糸を形成
する。溶解性色素はみとめられない。 ４ スターチ・無機塩寒天培地（ISP培地37
℃） 薄茶色の生育上に赤灰色の気菌糸を着生
し、培養14日目ごろにコロニーの裏面に赤色
の色素を生成する。 ５ チロシン寒天培地（ISP培地―７、37℃） 灰黒色の発育上に茶白灰〜黒灰色の気菌糸
を着生し、拡散性色素はみとめられない。 ６ 栄養寒天培地（37℃） 灰褐色の発育上に白灰色の気菌糸を形成
し、培養14日目にコロニー裏面に赤〜朱色の
色素を生成する。 ７ イースト・麦芽寒天培地（ISP培地―２、
37℃） 茶色の生育上に薄茶灰色の気菌糸を着生す
る。水溶性色素の生成はみとめられない。 ８ オートミール寒天培地（ISP培地―３、37
℃） 灰褐色の生育上に赤灰色の気菌糸を着生
し、培養14日目ごろにコロニーの裏面に赤色
の色素を生成する。 (3) 生理的性質 １ 生育温度範囲 酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生
育試験では、30℃〜50℃で生育するが、至適
温度は37℃〜45℃である。 ２ ゼラチンの液化：陽性 ３ 脱脂乳の凝固及び 脱脂乳のペプトン化：陽性 ４ メラニン色素の生成（ペプトン・イース
ト・鉄寒天培地、ISP培地６）：陰性 ５ デンプンの分解性：陰性 ６ 炭素源の利用性（プリドハム、ゴドリーブ
寒天培地、ISP培地―９、37℃） Ｄ―グルコース、Ｌ―アラビノース、Ｄ―
キシロース、Ｄ―フラクトース、イノシトー
ル、Ｌ―ラムノース、ラフイノース、Ｄ―マ
ンニトール、ガラクトースをよく利用して生
育し、シユクロースとサリシンは利用できな
いか、または疑わしい。 ７ 細胞壁組成 ISPに記載されている糖組成Typeとして
はTypeIに属する。 以上の性状から、本菌株はストレプトミセス
（Streptomyces）属に属し、また気菌糸の色調か
ら、灰色系（Grayseries）に含まれ、メラニン様
色素を生成しないノン・クロモジエニツク・タイ
プの菌種に属している。これらの性状から本菌株
の分類上の位置について既知菌種を検索すると、
ストレプトミセス・オリバセウス
（Streptomyces olivaceus）〔Int.J.of Sys.
Bacteriology vol.18 No.２ p.154'68〕が最も近
縁の種としてあげられる。そこで発酵研究所の保
存株であるストレプトミセス・オリバセウスIFO
―3409と同一条件下で比較すると、表―２のよう
に、オートミール寒天培地、及びスターチ無機塩
寒天培地上での気菌糸の色において違いがみられ
るが、その他の菌学的性状は非常によく一致して
いる。 従つて本菌株はストレプトミセス・オリバセウ
スに極めて近縁の種と考えられる。しかしなが
ら、β―１，３―グルコシルトランスフエラーゼ
活性の有無の点で大きく異なつており、即ち本菌
株はβ―１，３糖化合物からグリコースをステビ
オサイドに転移させる活性を有するが、ストレプ
トミセス・オリバセウスは該活性を有せず、又生
育至適温度が低いなど差があることなどから、本
菌をストレプトミセス・オリバセウスに近縁の新
種としてストレプトミセス・エスピーDIC―146
と同定した。 なお本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託申請し、微工研菌寄第6594号として受託
されている。

【表】

【表】 本発明で使用されるβ―１，３トランスフエラ
ーゼは、これら好ましい微生物を、通常の微生物
が利用し得る炭素源、窒素源、無機成分など公知
の栄養源を含有する液体培地で好気的条件で常法
により培養して得られる。 炭素源としては、例えばスターチ、アミロー
ス、カードラン、パキマン、ラミナリン、アミロ
ペクチンなどの多糖類、メタノール、グリセリ
ン、高級アルコール等のアルコール類、コハク
酸、酢酸、高級脂肪酸等の有機酸類およびその塩
類、澱粉、麦芽糖、ブドウ糖、ラムノース等の糖
類があげられ、好ましくはパキマン、カードラ
ン、ラミナリンである。窒素源としては、例えば
硫安、塩安、リン安、硝酸ナトリウム、尿素、ペ
プトン、カゼイン等有機無機いずれでも使用でき
る。 炭素源、窒素源およびその他の栄養物質を含む
天然栄養源としては、例えば各種糖密、コーンス
テイープリーカー、オートミール、味液、魚粉、
肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキス、麦
芽エキスなどがあげられる。無機物としては、例
えばリン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、硫
酸マグネシウム、微量金属類などが挙げられる。
その他、必要に応じてビタミン類等を添加するこ
ともできる。使用濃度としては、0.1〜40重量％
が用いられる。また醗酵中の発泡を抑制するため
1.0重量％以下の消泡剤を添加してもよい。消泡
剤としては、シリコーン、大豆油など通常の消泡
剤を用いる。 培養方法は、振盪培養、通気培養などの好気的
液体培養が適しており、PH5.0〜8.0、20℃〜50℃
で１〜６日、望ましくはPH6.5〜7.5、35℃〜40℃
で２日前後培養する。 この様に本発明で好適に使用されるストレプト
マイセス・エスピーDIC―108同146の各菌は通常
のストレプトマイセス属微生物より生育至適温度
が高いので高温で培養でき工業的に有用な菌種で
ある。 又、本発明で使用される菌株のモル変換率は、 生成したレバウデイオサイドＡ／減少したステビオサ
イド×1.2×100 で計算され、 （ただし、1.2 ＝レバウデイオサイドＡの分子量／ステビオサイド
の分子量） その、モル変換率は、従来の値である20％より
明らかに大きく、50〜99％程度の数値を示す。更
に、本発明の菌株は、ステビオサイドの減少率も
従来と同程度であり、減少したステビオサイドが
高変換率でレバウデイオサイドＡに変換するもの
である。 本発明に用いるステビオサイドとは、高度に精
製されたステビオサイドに限られることなく、ス
テビオサイドとレバウデイオサイドＡの混合物で
あつても良く、さらに他の夾雑物を含有している
粗製品であつても、同様に本発明を実施すること
ができる。 本発明の方法に用いるβ―１，３グルコシル糖
化合物としては、好ましく使用されるストレプト
ミセス・エスピーDIC―108もしくはストレプト
ミセス・エスピーDIC―146等によつてステビオ
サイドからレバウデイオサイドＡを生成するもの
であればいずれでも良いが、例えば、パキマン、
カードラン、ラミナリン、酵母細胞壁又は酵母細
胞壁の部分分解物、ここで言う酵母とは、例えば
サツカロマイセス属、キヤンデイダ属、ピヒア
属、シゾサツカロマイセス属、トルロプシス属、
ハイセヌラ属等を言うものであり、更にリユウコ
シン（珪藻類の細胞壁）、カロース（高等植物ハ
セオラス細胞壁）、パラミロン（単細胞藻類の細
胞壁）、リケナン（コケの抽出物）、イネ科植物の
種子胚乳より得られる糖類（ここで言うイネ科植
物とはイネ、オオムギ、コムギ等を指称する）、
などのβ―１，３グルコシル糖化合物含有物が挙
げられる。それらのうち好適なものとしては、パ
キマン、カードランやラミナリンが挙げられ、こ
れらは入手し易い点からもより好ましい。尚、カ
ードランとは、β―１，３グルコシド結合を主体
とする水不溶性のβ―グルカンであり、その懸濁
液を加熱するとかたい弾力性のある熱不可逆性の
ゲルをつくる多糖の総称である。このものは現在
のところ微生物によつてつくられたものが市販さ
れている。（Agr.Biol.Chem.，29，757，’65又
は発酵と工業36，２，’78参照）。 本発明で好ましく使用されるストレプトミセ
ス・エスピーDIC―108あるいはストレプトミセ
ス・エスピーDIC―146を培養した培養液及び菌
体はバツチ式で反応させてもよいし、公知の方法
により菌体を固定化して連続的に変換反応を行わ
せることもできる。 本発明の転移反応条件は、ステビオサイドとβ
―１，３グルコシル糖化合物とを含有する水溶液
に、ストレプトミセス・エスピーDIC―108又は
ストレプトミセス・エスピーDIC―146の培養液、
菌体、菌体処理物、又はこれらより分離されたβ
―１，３グルコシル転移活性を有する酵素を反応
させればよい。反応に用いるステビオサイドは、
精製ステビオサイドの場合、反応液中のステビオ
サイドの濃度を約0.1〜約10重量％とし、β―１，
３グルコシル糖化合物の濃度を約0.1〜約30％重
量％とすればよい。これらの反応液のPHと温度は
β―１，３グルコシルトランスフエラーゼが反応
してレバウデイオサイドＡを生成させうる条件で
あればよいが、通常PH３〜10好ましくはPH５〜
８、温度20〜70℃好ましくは30〜50℃が適当であ
る。このようにしてレバウデイオサイドＡを生成
せしめた反応溶液は、そのままでも甘味料として
使用できる。また必要に応じて、酵素あるいは菌
体を加熱失活させた後、スチレンとジビニルベン
ゼンの重合吸着樹脂例えばダイヤイオンHP―20
（商品名、三菱化成社製）、アンバーライトXAD
―２（商品名、オルガノ社製）等、又はイオン交
換樹脂（例えばＨ型強酸性イオン交換樹脂および
OH型弱塩基性イオン交換樹脂）を用いて脱塩
し、これを濃縮してシラツプ状の甘味料とする
か、又は乾燥、粉末化して粉末状の甘味料とする
こともできる。 更に脱塩した反応溶液を精製してレバウデイオ
サイドＡを分離採取して甘味料とすることもでき
る。この際、濃縮、乾燥、粉末化は公知の方法、
例えば減圧濃縮、膜濃縮、真空乾燥、噴霧乾燥等
の各種方法が自由に用いられる。このようにして
得られたレバウデイオサイドＡの甘味度は、甘味
度の測定条件によつても異なるが一般には、反応
に用いたステビオサイドの固型物重量に見合う甘
味度に比べおよそ1.3倍強い。またその甘味の質
は、苦味や渋味等の嫌味がなく、まろやかな甘味
であつて砂糖に似ており、残味の切れもよい。 このレバウデイオサイドＡは、苦味、嫌味、ア
ク味等が全くない無臭、白色の粉末で水に可溶で
あるためステビオシド及びグリチルリチンの共存
比率、又液体、粉末状の条件下で任意に共存させ
ることができる。また、レバウデイオサイドＡ
は、サツカリン及びその塩類、サイクラミン酸ナ
トリウム、ジヒドロカルコン、アスパラテーム等
の周知の合成甘味物質と共用してその呈味特性を
有効利用することが可能であり、これらの合成甘
味物質の１種又は２種以上に本化合物を添加使用
すれば、合成甘味物質特有の苦味、嫌味等の不快
味を改良することが可能となる。 また、レバウデイオサイドＡを賦形剤、希釈
剤、吸着剤的に使用されている砂糖、果糖、ブド
ウ糖、乳糖、水飴、デキストリン、デンプン等の
周知の糖類甘味に添加使用することにより、甘味
が増強され、従来の使用量よりも、大幅にその使
用量を削減することが可能となる。更に本化合物
をソルビツト、マルテトール、マンニトール、キ
シリトール等の砂糖よりも甘味度が低い低カロリ
ー甘味物質に添加使用すれば甘味物質の長所を損
なうことなく甘味を増強することが出来、良質の
低カロリー甘味料が得られる。 レバウデイオサイドＡはこの様に一般食品及び
ダイエツト食品、医薬、医薬部外品、煙草、飼料
等の甘味源として使用できることはいうまでもな
い。 例えば、しよう油、粉末しよう油、みそ、粉末
みそ、もろみ、マヨネーズ、ドレツシング、食
酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、め
んつゆ、ソース、ケチヤツプ、焼肉のタレ、カレ
ールー、シチユーの素、スープの素、ダシの素、
複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシラツ
プ等の各種の調味料、せんべい、あられ、おこ
し、餅類、まんじゆう、ういろう、あん類、羊か
ん、水羊かん、ゼリー、カステラ、飴等の各種和
菓子、パン、ビスケツト、クラツカー、クツキ
ー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタード
クリーム、シユークリーム、ワツフル、スポンジ
ケーキ、ドーナツ、チヨコレート、チユーインガ
ム、キヤラメル、キヤンデー等の各種洋菓子、ア
イスクリーム、シヤーベツト、アイスキヤンデー
等の氷菓、果実のシロツプ漬、水密等のシロツプ
類、フラワーペースト、ピーナツツペースト、フ
ルーツペースト等のペースト類、ジヤム、マーマ
レード、シロツプ漬、糖菓などの果実、野菜の加
工食品類、福神漬、千枚漬、らつきよう漬等の漬
物類、ハム、ソーセージ等の畜肉製品類、食肉ハ
ム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷら
等の魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、さきするめ、
ふぐのみりん干等の各種珍味類、のり、山菜、す
るめ、小魚、貝等で製造されるつくだ煮類、煮
豆、ポテトサラダ、コンブ巻等のそう菜食品、魚
肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、合成
酒、果実酒、洋酒等の酒類、コーヒー、ココア、
ジユース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料等の
清涼飲料水、プリンミツクス、ホツトケーキミツ
クス、即席ジユース、即席コーヒー、即席しるこ
等即席飲食品等の各種飲食物、嗜好物の甘味付に
使用できる。その他、医薬品及び医薬部外品とし
ては練歯みがき、口紅、リツプクリーム、内服
薬、トローチ、肝油ドロツプ、口中清涼剤、口中
香錠、うがい薬等への甘味剤として使用すること
も自由に行いうる。 以下に、本発明の方法およびそれによつて得ら
れる甘味料について実施例により具体的に説明す
るが、以下の％は重量基準とする。 実施例 １ (1) β―１，３グルコシルトランスフエラーゼの
調製 ストレプトミセス・エスピーDIC―108（微工研
菌寄第6593号）を酵母エキス0.2W／Ｖ％、ポリ
ペプトン0.2W／Ｖ％、グルコース0.5％Ｗ／Ｖ
％、MgSO₄・7H₂O0.1W／Ｖ％、K₂HPO₄0.2％
Ｗ／Ｖ％からなる培地５に植菌し、同時に別殺
菌したカードラン100ｇを加えて37℃で40時間通
気撹拌培養した。得られた培養液を遠心分離し
て、その上清を硫安0.8飽和で塩析し、β―１，
３グルコシルトランスフエラーゼ活性を有する粗
酵素標品〔〕を得た。 このときの酵素活性は約1000単位であつた。な
お、ここでいう酵素活性１単位とは、PH7.0、
0.1Mのリン酸緩衝液中で0.5％のステビオサイド
基質濃度、50℃、30分間反応させたとき、１マイ
クロモルのレバウデイオサイドＡを生成させるに
必要な酵素（蛋白）量である。 (2) 転移反応（レバウデイオサイドＡの製造） ステビア甘味料（商品名、ステビア―DIC、大
日本インキ化学社製）10ｇ、カードラン（和光純
薬工業社製）20ｇ、先に調製した粗酵素標品
〔〕の10単位を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）１
に懸濁させ、50℃で30分間撹拌し、反応させ
た。反応液を濾過した後90℃で10分間加熱し、酵
素を失活させた。この溶液を合成吸着樹脂ダイヤ
イオンHP―20（商品名、三菱化成社製）にS.V.
＝２で通し、ステビオサイド類を吸着させた後、
95％エタノールで脱着した。脱着液のエタノール
を減圧留去した後、強酸性イオン交換樹脂である
アンバーライトIR―120B（Ｈ型、商品名、ローム
アンドハース社製品）、弱塩基性イオン交換樹脂
であるアンバーライトIRA―93（OH型、商品名、
ロームアンドハース社製品）にS.V.＝２で通して
脱塩した。ついでこれを70℃以下で減圧濃縮し、
真空乾燥して粉末のレバウデイオサイドＡを2.7
ｇ、ステビオサイドを3.3ｇ含んだ試料No.２（改良
甘味料と称す）を得た。一方、対照品（試料No.
１）として、あらかじめ加熱失活させた粗酵素標
品を用いて同様に反応させ、吸着樹脂、イオン交
換樹脂で精製したものではレバウデイオサイドＡ
は1.4ｇ、ステビオサイドは5.2ｇであつた。これ
と試料No.２とを比較すると、β―１，３グルコシ
ルトランスフエラーゼの粗酵素標品〔〕を作用
させることにより、ステビオサイドが約36％減少
し、レバウデイオサイドＡが約93％増大している
ことが確認された。この反応のモル変換率は57％
であつた。 なお、モル変換率は 生成したレバウデイオサイドＡ／1.2×減少したステ
ビオサイド×100 で計算される。 （ただし、1.2 ＝レバウデイオサイドＡの分子量／ステビオサイド
の分子量） 比較例 １ 実施例１の粗酵素標品〔〕に代えてドリセラ
ーゼ（協和醗酵社製）を0.1％濃度、50℃、３時
間反応させた以外は全く同様の操作を行つたとこ
ろ、ステビオサイド3.6ｇとレバウデイオサイド
A1.6ｇを含んだ混合物が得られ、実施例１の反
応を行わなかつた試料１と比較してステビアサイ
ドが1.6ｇ（31％）減少し、レバウデイオサイド
Ａが0.2ｇ（14％増加）生成していることが確認
された。 この反応のモル変換率は10％であつた。 (3) 改良甘味料の甘味度試験 試料No.１、No.２の0.02％及び0.05％水溶液を調
整し、砂糖の１〜７％の水溶液を0.5％濃度段階
で13種の標準溶液を作製し、これらについて甘味
度試験を行つた。試験は試料溶液と標準溶液との
２点比較法で、20名のパネル員により、室温20℃
で行い、その結果を表―３に示す。

【表】 表―３の(a)及び(b)の結果から、試料No.１の甘味
度は0.02％水溶液で砂糖濃度３％（甘味度150倍）
に相当し、0.05％水溶液で砂糖濃度６％（甘味度
120倍）に相当する。同様に試料No.２の甘味度は
砂糖濃度の各々3.5％および6.5％に相当するので
改良甘味料の甘味度は、用いたステビオサイドに
見合う甘味度のおよそ1.1〜1.2倍の甘味度と判断
される。 (4) 改良甘味料の味質試験 試料No.１の対照品と試料No.２の改良甘味料とを
用いて甘味の質の違いの比較を行つた。前記甘味
度試験で求めた甘味度から算出して、各試料を３
％、６％、10％の砂糖水溶液に相当する甘味度の
水溶液に調整した。そして各甘味度で試料No.１、
試料No.２の試料溶液につきその味質の良否を対比
した。 試験は、20名のパネル員により20℃の室温で行
つた。その結果を表―４に示す。

【表】 表―４の結果から、試料No.２の改良甘味料の甘
味質は、いずれの甘味度の場合も試料No.１の対照
品よりすぐれていることが明らかである。 実施例２ （レバウデイオサイドＡの分離、確
認） (1) ステビオサイドからの合成 純粋ステビオサイド10ｇ、カードラン20ｇ、実
施例１(1)で得られたβ―１，３グリコシルトラン
スフエラーゼ粗酵素標品〔〕10単位を0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）１に懸濁させ、50℃で１
時間撹拌し反応させた。反応液を濾過した後、90
℃で10分間加熱し酵素を失活させた。そして、ス
テビオサイドが4.8ｇ減少していることを確認し
た。この溶液を合成吸着樹脂ダイヤイオンHP―
20 200mlに通し、ステビオサイド類を吸着させた
のち、80％エタノールで脱着し、溶媒を留去し減
圧乾燥させた。 これをクロロホルム：メタノール：水＝30：
25：４の溶媒に溶解し600mlのシリカゲルカラム
（Wakogel Ｃ―300、商品名、和光純薬社製）に
吸着後、上記溶媒で展開し、レバウデイオサイド
Ａに相当するフラクシヨンを分取し、減圧濃縮乾
固後、レバウデイオサイドＡ相当の白色粉末3.5
ｇを得た。（試料No.３と称する） この反応のモル変換率は60％であつた。 (2) 天然レバウデイオサイドＡの抽出 一方、乾燥ステビア葉150ｇを３の温水（50
℃）にて３時間、２回抽出し、３まで濃縮し
た。抽出液よりタンパク類を除去後、合成吸着樹
脂ダイヤイオンHP―21を400mlカラムに充填しS.
V.＝2.0でカラムを通してステビオサイド類を吸
着させた。その後95％エタノール750mlをS.V.＝
2.0で通して脱着した。脱着液のエタノールを減
圧留去した後、乾固品を600mlの水に溶解した。
溶解液を、強酸性イオン交換樹脂IR―120B（Ｈ
型）130ml充填カラム中にS.V.＝2.0で流し、次い
で弱塩基性イオン交換樹脂であるIRA―93（OH
型）に900mlをS.V.＝2.0で通して脱塩した。つい
でこれを70℃以下で減圧濃縮、真空乾燥して粉末
の精製ステビア（商品名、ステビア―DIC）およ
そ20ｇを得た。この精製ステビアを５倍量（Ｗ／
Ｗ）の熱メタノール（60℃）に溶解し、次いで冷
却後沈殿を濾過した。濾過液を減圧乾固し、その
10ｇをワコーゲルＣ―300のカラムクロマトグラ
フイーに供した。 クロロホルム：メタノール：水＝6.5：３：１
（Ｖ／Ｖ／Ｖ）の溶媒組成で溶出し、ステビオサ
イド1.16ｇとレバウデイオサイドA0.7ｇを単離し
た。 試料No.３は、高速液体クロマトグラフイーによ
る分析ではこのレバウデイオサイドＡと同じ保持
時間をもち、またシリカゲル60Fプレート（メル
ク社製）にスポツトしてクロロホルム：メタノー
ル：水＝30：20：４の溶媒組成で展開すると、ス
テビオサイドのRf値を１としたとき、0.84のRf
値を示すレバウデイオサイドＡと一致した。また
¹³C―NMRによる構造確認において、田中ら
（Tetrahedr on Letters，No.13，1005'76）によ
り記載されたレバウデイオサイドＡのデータと合
致したNMRスペクトルを示した。（表―５、第
２図および第３図参照） 以上の結果、ステビオサイドとカードランを基
質とし、β―１，３グルコシルトランスフエラー
ゼ粗酵素標品を作用させて得られた試料No.３は、
レバウデイオサイドＡであることが確認された。
この試料No.３の融点を測定したところ237〜239℃
であつた。

【表】

【表】

【表】 比較例 ２ 実施例２の粗酵素標品〔〕に代えて、ドリセ
ラーゼ（協和醗酵社製品）0.1％濃度で、50℃、
２時間半反応させた以外は全く同様の操作を行つ
たところ、ステビオサイドが５ｇ（50％）減少
し、レバウデイオサイドA0.39ｇ（3.9％増加）生
成していることが確認された。 この反応のモル変換率は6.5％であつた。 実施例 ３ 実施例１(1)と同様の培地組成からなる培地５
にストレプトミセス・エスピーDIC―146（微工研
菌寄第6594号）を植菌し、実施例１と同様の方法
で、37℃、40時間通気撹拌培養を行つた。得られ
た培養液を遠心分離してその上清を硫安0.8飽和
で塩析し、β―１，３グリコシルトランスフエラ
ーゼ活性を有する粗酵素標品〔〕を得た。この
ときの酵素活性は約910単位であつた。 ステビア―DIC（ステビオサイド51％、レバウ
デイオサイドA14.5％含有）10ｇ、カードラン10
ｇ、前記調製酵素〔〕9.1単位を0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）１に懸濁させ、50℃で２時間反
応させた。実施例１(1)と同様に吸着樹脂で精製し
た後乾固し、高速液体クロマトグラフイーによる
分析の結果、ステビオサイド32％、レバウデイオ
サイドA26％を含んだ白色の固体11.5ｇを得た。 このときのステビオサイドからレバウデイオサ
イドＡへのモル変換率は約94％であつた。 実施例 ４ ステビア―DICに代えてステビア葉の水抽出液
（ステビオサイド類が約74％、レバウデイオサイ
ドA14.5％含有したもの）500mlとカードラン100
ｇを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に加えて総容量
を5.0にした。それに実施例１―(1)で調製した
粗酵素標品50単位を加えて、40℃で４時間撹拌
し、反応させた。反応液を濾過した後、90℃で10
分間熱処理を行つて酵素を失活させた。この溶液
をイオン交換樹脂アイバーライトIR―120B及び
IRA―93を通してステビア葉抽出物中の夾雑物を
除いて得られたステビオサイド類の中のレバウデ
イオサイドＡ含量は25％であり、もとのステビア
葉抽出液中のレバウデイオサイドＡに比べておよ
そ1.7倍増大していた。

【図面の簡単な説明】

図面において、第１図はレバウデイオサイドＡ
と試料３の薄層クロマトグラムを、そして第２
図、第３図はレバウデイオサイドＡと試料３の
¹³C―NMRチヤートを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ステビオサイドとβ―１，３グルコシル糖化
   合物とを含有する水溶液または水懸濁液に、スト
   レプトマイセス属に属し、ステビオサイドとβ―
   １，３グルコシル糖化合物との間におけるβ―
   １，３グルコシル転移活性を有する酵素を産生
   し、ステビオサイドをレバウデイオサイドＡに転
   換し得る能力を有する微生物の培養液、菌体、菌
   体処理物またはその微生物から分離された前記β
   ―１，３グルコシル転移活性を有する酵素を作用
   させることを特徴とするレバウデイオサイドＡの
   製造方法。