JPH0673468B2 - レバウデイオサイドａの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、キク科に属するステビアレバウディアナ・ベ
ルトニーの葉や茎に含まれる優れた甘味成分であるレバ
ウディオサイドＡを極めて高い転換率でステビオサイド
より作る酵素的な製造方法に関するものである。

更に詳しくは、ステビオサイドとβ−1,3−グルコシル
糖化合物を含む水溶液に、微生物が生産するβ−1,3−
グルコシル糖化合物を糖の供与体としてステビオサイド
に糖を移転させる活性を有する酵素を作用させ、レバウ
ディオサイドＡに転換反応させるのに際し、該水溶液中
に有機溶媒及び／又は、エキソタイプのβ−1,3−グル
カナーゼを共存もしくは別途作用させ転移反応をさせる
ことを特徴とした高転換率のレバウディオサイドＡ製造
法に関する。

（従来技術） レバウディオサイドＡ（β−1,3−モノグルコシルステ
ビオサイド）はステビア葉や茎に２〜６％程度含まれ、
主成分であるステビオサイド（６〜12％）に次いで含量
が高い。これまでステビア甘味料としては、この両者の
混合物として使用されているが、ステビオサイドは苦味
を有し後味が残るのに対し、レバウディオサイドＡは苦
味のないまろやかな甘味を有し、蔗糖に対比した甘味倍
率も高いものである。これまでのステビア甘味料の呈味
質の改善法としては天然糖類、アミノ酸を添加する方法
等が多く試みられてきたが、最近ステビオサイドに糖を
付加させ、カロリーを上げることなく苦味を解消した新
規なステビア甘味料が開発されている。（特開昭54−50
70号公報） しかしながら、ステビオサイドに比べ甘味倍率が低下す
るという欠点を有していた。このことによりレバウディ
オサイドＡが単独あるいは高含有量のステビア甘味料の
開発が熱望されている。従来、レバウディオサイドＡを
得る方法としては、ステビア乾燥葉から抽出、精製して
得られたステビオサイドとレバウディオサイドＡの混合
状態からステビオサイドを晶析除去後、再結晶をくり返
す方法で行われているが、収率が悪いため、レバウディ
オサイドＡを抽出時に高含有にする必要がある。

そこで本発明者らは、ステビア葉抽出液中に最も多く存
在するステビオサイドに発酵法又は酵素法によりグルコ
ースを付加しステビオサイドをレバウディオサイドＡに
変換させることを目的とした発明を既に完成し、特開昭
58−149697号公報として出願済である。その先願発明
は、ステビオサイドとβ−1,3−グルコシル糖化合物例
えばカードラン、パキマン、ラミナリン糖のβ−1,3−
結合を有する糖化合物を含有する水溶液に、これらβ−
1,3−グルコシル化合物からグルコースをステビオサイ
ドのアグリコンであるステビオールの水酸基に結合した
β−Ｄ−グルコースのＣ_３位に転移しうる活性すなわち
β−1,3−グルコシル転移活性を有する微生物の培養
液、菌体または菌体処理物を反応させてレバウディオサ
イドＡを生成させることを目的とするものである。

しかしながら、この先願発明の方法では、レバウディオ
サイドＡを含む２種以上のβ−1,3−グルコシルステビ
オサイドを生成するが、レバウディオサイドＡへのモル
変換率は20％以下であり満足できるものではなかった。
そこで本発明者らは更にステビオサイドを著しい選択性
を以てレバウディオサイドＡに高変換する能力を有する
微生物を検索すべく、広い自然土壌界から多くの微生物
を分離し、その中から、ストレプトミセス属に属し、強
いβ−1,3−ズルコシルトランスフェラーゼ活性を有し
ている微生物を見出すとともに、該微生物により高モル
変換率でステビオサイドをレバウディオサイドＡのみに
変換する能力を見出し、特開昭59−17996号として出願
している。

しかしながら、β−1,3−グルコシル糖転移酵素による
ステビオサイドよりレバウディオサイドＡの転換率は反
応条件をコントロールしても50〜60％が限界であった。

（問題点を解決する為の手段） そこで本発明者らは、ステビオサイドに糖を転移させ、
レバウディオサイドＡに転換させるβ−1,3−グルコシ
ル転移活性を有する酵素による副反応生成物の生成を抑
制し、極めて高転換率でレバウディオサイドＡを生成さ
せる方法について鋭意研究し、本発明を完成させるに至
った。

即ち、本発明は、β−1,3−グルコシル糖化合物とステ
ビオサイドとを含有する水溶液に微生物の生産するβ−
1,3−グルコシル転移活性を有する酵素を作用させて、
ステビオサイドをレバウディオサイドＡに転換反応させ
るのに際し、該水溶液中に有機溶媒及び／又はエキソタ
イプのβ−1,3−グルカナーゼを共存もしくは別途作用
させて転移反応をさせることを特徴とするレバウディオ
サイドＡの製造法を提供するものである。

（構成） 本発明に用いるステビア甘味成分を含有した水溶液は、
高度に精製又は粗精製されたステビア甘味料製品の水溶
液い限ることなく、ステビア葉からの抽出中の溶液、抽
出後の溶液であってもいずれのものでもよい。

本発明に用いるβ−1,3−グルエコシル転移酵素は、β
−1,3−グリコシル糖化合物を糖供与体としてステビオ
サイドに糖を転移させ、レバウディオサイドＡに転換さ
せる能力を有している酵素であれば、微生物、動物、植
物を問わずいずれの起源のものからであってもよい。

本発明では特にストレプトマイセス（Streptomyces）に
属する微生物が生産する酵素が好ましい。その中でも特
に好ましい微生物としてストレプトマイセス・エスピー
（Streptomyces.sp）DIC−108が挙げられる。

又、本発明は、該β−1,3−グルコシル転移活性を有す
る酵素をβ−1,3−グルコシル糖化合物とステビオサイ
ドとを含有する水溶液に作用させる際に、有機溶剤を共
存させるか、エキソタイプのβ−1,3−グルカナーゼを
共存させて移転反応させるか、有機溶媒とエキソタイプ
のβ−1,3−グルカナーゼとを共存させるか、別々に両
方を使用するものであるが、有機溶媒と該グルカナーゼ
を併用するのがより好ましい。このエキソタイプのβ−
1,3−グルカナーゼは、β−1,3−グリコシル糖化合物を
分解し、グルコースを生成製物として生成し、かつβ−
1,3−グルコシル糖転移活性を有する酵素によるステビ
オサイドのレバウディオサイドＡへの転換率を高める作
用を有していればいずれの起源のものであっても良い。
好ましくは、ストレプトマイセス属に属する微生物に起
源するものである。特に好ましい微生物としては、スト
レプトマイセス・エスピー（Streptomyces.sp）DIC−10
8が挙げられるが、これに限定されるものではない。

尚、ストレプトマイセス・エスピーDIC−108の菌学的性
質については、特開昭59−17996号公報に既に記載され
ているが、詳細には以下の様な性質を有するものであ
る。

〔ストレプトマイセス・sp.DIC−108の菌学的性質〕 （１） 形態的特徴 使用した培地（ISP培地を含む）上での栄養菌糸の生育
は優れており、デンプン無機塩、オートミール寒天、イ
ースト麦芽寒天培地上で豊富な気菌糸を形成する。

胞子形成気菌糸は直状又は直曲状である。胞子は楕円体
で大きさは、短径×長径0.7〜0.8μ×1.0〜1.2μであ
る。走査型電子顕微鏡による観察では胞子の表面構造は
イボ状（Warty）である。

（２） 各種培地における生育状態 １）シュクロース硝酸塩寒天培地（37℃） 薄茶色の基生菌糸状に灰色の気菌糸を形成し、溶解性色
素は認められない。

２）グルコース・アスパラギン寒天培地（37℃） 薄黄白色の生育で気菌糸の形成はみとめられない。また
溶解性色素は認められない。

３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP培地−No.
5 37℃） 薄黄色の生育で気菌糸の着生はみとめられない。又、溶
解生色素は認められない。

４）スターチ・無機塩寒天培地（ISP培地37℃） 無色の発育上に緑灰色の気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。

５）チロシン寒天培地（ISP培地−７、37℃） 薄茶色の発育上に培養７日目では気菌糸は着生せず、14
日目で色灰色の気菌糸を着生する。溶解性色素は認めら
れない。

６）栄養寒天培地（37℃） 緑灰黒色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生し、溶解性
色素は認められない。

７）イースト麦芽寒天培地（ISP培地−２、37℃） 薄茶色の生育上に薄緑灰色の気菌糸を着生する。水溶性
色素の生成は認められない。

８）オートミール寒天培地（ISP培地−３、37℃） 無色の生育上に緑茶灰色の気菌糸を着生し、水溶性色素
の生成は認められない。

（３）生理的性質 １）生育温度範囲 酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生育試験では、
30℃〜50℃で生育するが、至適温度は37℃〜45℃であ
る。

２）ゼラチンの液化：陰性 ３）脱脂乳の凝固及び 脱脂乳のペプトン化：陰性 ４）メラニン色素の生成（ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ISP培地６）：陰性 ５）デンプンの分解性：陽性（分解ゾーンに白いリング
を形成） ６）炭素源の利用性（プリドハム、ゴドリーブ寒天培地
−９、37℃） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ
−マンニトール、ガラクトースをよく利用して生育し、
シュクロース、ラフイノース、サリシンは利用しない。

７）細胞壁組成 ISPに記載されている糖組成TypeとしてはTypeIに属す
る。

尚、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
申請し、微工研菌寄第6593号として受託されている。

本発明による酵素生産の為の培養には、通常の固体培地
又は液体培地が使用され、液体培養の為の培地の炭素源
としては、β−1,3−グルコシル糖化合物であれば利用
できる。

例えば、カードラン、パキマン、ラミナリン、リケナ
ン、酵母細胞壁又はその部分加水分解物、リュウコシ
ン、カロース、パラミロン等が挙げられ、又窒素源とし
ては硫安、塩安、リン安、硝酸ナトリウム、尿素、ペプ
トン、カゼイン等、有機窒素、無機窒素、いずれも利用
できる。

天然栄養源としては、例えば各種糖蜜、コーンステイー
プリカー、オートミール、味液、魚粉、肉エキス、酵
母、酵母エキス、ポテトエキス、麦芽エキス等があげら
れる。

無機物としては、例えばリン酸二カリウム、リン酸一ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、微量金属類などが挙げら
れる。その他、必要に応じてビタミン類等を添加するこ
ともできる。これらの使用濃度としては、0.1〜40重量
％が用いられる。また醗酵中の発泡を抑制するため、0.
0001〜1.0重量％の消泡剤を添加してもよい。消泡剤と
しては、シリコーン、大豆油など通常の消泡剤を用い
る。

培養方法は、振とう培養、通気培養などの好気的液体培
養が適しており、pH5.0〜8.0、培養温度20℃〜50℃で１
〜６日、望ましくはpH6.5〜7.5、35〜40℃で２日前後培
養する。

β−1,3−グルコシル転移活性を有する酵素及びエキソ
タイプのβ−1,3−グルカナーゼは、菌体外に生産する
酵素であるので、培養終了後、ロ過又は遠心分離して除
菌し、上清液を回収する。そして必要に応じて濃縮し、
硫安、硫酸ナトリウムによる塩析、又はアセトン、エタ
ノール、メタノール、イソプロパノールなどの有機溶剤
を加え、酵素を沈澱物として取得し、乾燥、保存する。

本発明で好ましく用いられる前記DIC−108株からのβ−
1,3−グルコシル転移活性を有する酵素（SGTaseと称
す）及び同じくエキソタイプのβ−1,3−グルカナーゼ
（β−1,3−グルカナーゼFi IIと称す）の性質を次に示
す。

SGTase （１）作用： β−1,3−グルコシル糖化合物、例えばカードラン、ラ
ミナリン、パキマン、酵母細胞壁及びその部分分解物に
作用してエンドタイプの加水分解作用を示す。Ｇ_５（ラ
ミナリペンタオース）を基質とした時の主分解生成物は
Ｇ_２とＧ_３である。（図−1,2参照）糖受容基質とし
て、ステビオール配糖体のステビオサイド、レバウディ
オサイドＣ、レバウディオサイドＡのいずれが存在して
も糖転移作用を示す。

（２）作用pH範囲及び最適作用pH: pH3〜９の範囲で作用し、最適作用pHは６付近にある。
（図−３参照） （３）作用温度範囲及び最適作用温度： 約20℃〜約70℃まで作用し、最適作用温度は約65℃であ
る。（図−４参照） （４）熱安定性： 0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）中、１時間の熱処理により
活性は、約50％低下した。

（５）精製方法 本酵素は培養ロ過液から硫安65％飽和で沈澱物として回
収後、DEAE−Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー
（0.01Mトリス−HClバッファ−、pH7.5）を行い、食塩
濃度0.2Mで溶出される画分を集める。そして脱塩後CM−
Sephadex C−25カラムクロマトグラフィー（0.01M酢酸
バッファー、pH6.0）を行って未吸着画分を集め、再度D
EAE−Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー（０〜
0.25Mのリニアグラディエント）により活性画分を集め
る。次いでＧ−100ゲルロ過クロマトグラフィーによ
り、ほぼ均一な酵素タンパク質を得る。

（６）分子量： セファデックスＧ−100ゲルクロマトグラフィーによる
分子量は約27,000と推定された。

β−1,3−グルカナーゼFi II （１）作用： β−1,3−グルコシル糖化合物、例えばカードラン、ラ
ミナリン、パキマン、酵母細胞壁及びその部分加水分解
物に作用してエキソ型の加水分解作用を示すが、糖転移
作用は持たない。Ｇ_５を基質としたときの主分解生成物
はグルコースとＧ_３である。（図−５参照） （２）作用pH範囲及び最適作用pH: pH3〜９まで作用し、最適作用pHは６である。（図−６
参照） （３）作用温度範囲及び最適作用温度： 約20℃〜約70℃まで作用し、最適作用温度は約60℃であ
る。（図−７参照） （４）熱安定性： 0.01M酢酸バッファー中では45℃、１時間の熱処理で完
全に失活するが、0.1Mリン酸バッファー中では60℃、１
時間の熱処理で約60％失活する。

（５）精製方法： 本酵素は培養ロ過液から硫安65％飽和で沈澱物として回
収後、DEAE−Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー
（0.01Mトリス−HClバッファー、pH7.5）を行い、塩化
ナトリウム濃度0.2Mで溶出される画分を集める。脱塩後
CM−Sephadx C−25カラムクロマトグラフィー（0.01M酢
酸バッファー、pH6.0）を行って塩化ナトリウム0.3M溶
液で溶出される画分を集め、次いでハイドロキシルアパ
タイトカラムクロマトグラフィーの0.2Mリン酸バッファ
ーで溶出される活性画分を集めることにより、ほぼ均一
なタンパク質を得ることができる。

（６）分子量： セファデックスＧ−100ゲルクロマトグラフィーによる
分子量は約44,000と推定された。

本発明で用いる有機溶剤としては、ステビオサイドのレ
バウディオサイドＡの転換率を高めるか、レバウディオ
サイドＡ以外のステビオサイド系甘味料化合物となるこ
とを阻害する働きを有するものであればいずれのもので
も良く、具体的にはアルコール類として例えばメタノー
ル、エタノール、プロピルアルコール、ブチルアルコー
ル等が挙げられる。ケトン類としては、例えばアセト
ン、アルキルメチルケトン、ジエチルケトン、ｎ−ブチ
ルエチルケトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。
酢酸エステル類としては、酢酸メチル、酢酸エチル、酢
酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸アミル等が挙げられる。
炭化水素類としては、例えばヘキサン等が挙げられる。
フタル酸エステル類としては例えばフタル酸ジメチル、
フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル等がある。グルコ
ール類としては、エチレングリコール、プロピレングリ
コール、チオグリコール等がある。その他ジメチルスル
ホゴキサイド（DMSO）及びジオキサン２−メルカプトエ
タノールといった溶剤が用いられる。これらから選ばれ
る１種以上の有機溶剤は、容積比でステビオサイドとβ
−1,3−グルコシル等化合物とを含有する水溶液に対
し、１〜50％（V/V）、好ましくは２〜30％で用いられ
る。

次にこれらの酵素を用いて高転換率でステビオサイドを
レバウディオサイドＡに転換する方法について説明す
る。

まず、β−1,3−グルコシル糖化合物として例えば0.1〜
30wt％のカードランあるいはこれを分解して得られたラ
ミナリペンタオースを含むラミナリオリゴ糖に対し、0.
1〜10wt％のステビオサイドを溶解させた液に、好まし
くは２〜30％（V/V）、より好ましくは５〜20％（V/V）
の例えばアルコール類もしくはケトン類等の有機溶媒、
例えば、アセトン、酢エチ、メチルエチルケトン、ヘキ
サン、DMSO、ジオキサン、チオグライコール、プロピレ
ングライコール、フタル酸メチル、メタノール、エタノ
ール等を添加し、β−1,3−グルコシル転移酵素（例え
ばSGTase）を作用させるか、更にエキソタイプのβ−1,
3−グルカナーゼと共に同時に作用させるか、又はβ−
1,3−グルコシル転移酵素による反応後、更にエキソタ
イプのβ−1,3−グルカナーゼを作用させる。この反応
により、ステビオサイドよりレバウディオサイドＡへの
転換率は70〜100％となり、ステビオサイドのレバウデ
ィオサイドＡへの反応収率は40％以上が得られる。

本発明の方法に用いるβ−1,3−グルコシル糖化合物と
しては、好ましく使用されるストレプトミセス・エスピ
ーDIC−108によってステビオサイドからレバウディオサ
イドＡを生成するものであればいずれでも良いが、例え
ば、パキマン、カードラン、ラミナリン、酵母細胞壁又
は酵母細胞壁の部分加水分解物、ここで言う酵母とは、
例えばサッカロマイセス属、キャンディダ属、ピヒア
属、シゾサッカロマイセス属、トルロプシス属、ハイセ
ヌラ属等を言うものであり、更にリュウコシン（珪藻類
の細胞壁）、カロース（高等植物ハセオラス細胞壁）、
パラミロン（単細胞藻類の細胞壁）、リケナン（コケの
抽出物）、イネ科植物の種子胚乳より得られる糖類（こ
こで言うイネ科植物とはイネ、オオムギ、コムギ等を指
称する）、などのβ−1,3−グルコシル糖化合物含有物
が挙げられる。それらのうち好適なものとしては、パキ
マン、カードランやラミナリンが挙げられ、これらは入
手し易い点からもより好ましい。尚、カードランとは、
β−1,3−グルコシド結合を主体とする水不溶性のβ−
グルカンであり、その懸濁液を加熱するとかたい弾力性
のある熱不可逆性のゲルをつくる多糖の総称である。こ
のものは現在のところ微生物によってつくられたものが
市販されている。（Agr.Biol.Chem.,29,757.'65又は発
酵と工業36,2.,'78参照）。

本発明で好ましく使用されるストレプトミセス・エスピ
ーDIC−108を培養した培養液及び菌体はバッチ式で反応
させてもよいし、公知の方法により菌体を固定化して連
続的に変換反応を行わせることもできる。

本発明の転移反応条件は、ステビオサイドとβ−1,3−
グルコシル糖化合物とを含有する水溶液に、ストレプト
ミセス・エスピーDIC−108の培養液、菌体、菌体処理
物、又はこれらより分離されたβ−1,3−グルコシル転
移活性を有する酵素を反応させればよい。反応に用いる
ステビオサイドは、精製ステビオサイドの場合、反応液
中のステビオサイドの濃度を約0.1〜約10重量％とし、
β−1,3−グルコシル糖化合物の濃度を約0.1〜約30重量
％とすればよい。これらの反応液のpHと温度はβ−1,3
−グルコシル転移活性を有する酵素が反応してレバウデ
ィオサイドＡを生成させうる条件であればよいが、通常
pH3〜10好ましくはpH5〜８、温度20〜70℃好ましくは30
〜50℃が適当である。このようにしてレバウディオサイ
ドＡを生成せしめた反応溶液は、そのままでも甘味料と
して使用できる。また必要に応じて、酵素あるいは菌体
を加熱失活させた後、スチレンとジビニルベンゼンの重
合吸着樹脂例えばダイヤイオンHP−20（商品名、三菱化
成社製）、アンバーライトXAD−２（商品名、オルガノ
社製）糖、又はイオン交換樹脂（例えばＨ型強酸性イオ
ン交換樹脂およびOH型弱塩基性イオン交換樹脂）を用い
て脱塩し、これを濃縮してシラップ状の甘味料とする
か、又は乾燥、粉末化して粉末状の甘味料とすることも
できる。

更に脱塩した反応溶液を精製してレバウディオサイドＡ
を分離採取して甘味料とすることもできる。この際、濃
縮、乾燥、粉末化は公知の方法、例えば減圧濃縮、膜濃
縮、真空乾燥、噴霧乾燥等の各種方法が自由に用いられ
る。このようにして得られたレバウディオサイドＡの甘
味度は、甘味度の測定条件によっても異なるが一般に
は、反応に用いたステビオサイドの固型物重量に見合う
甘味度に比べおよそ1.3倍強い。またその甘味の質は、
苦味や渋味等の嫌味がなく、まろやかな甘味であって砂
糖に似ており、残味の切れもよい。

このレバウディオサイドＡは、苦味、嫌味、アク味等が
全くない無臭、白色の粉末で水に可溶であるためステビ
オシド及びグリチルリチンの共存比率、又液体、粉末状
の条件下で任意に共存させることができる。また、レバ
ウディオサイドＡは、サッカリン及びその塩類、サイク
ラミン酸ナトリウム、ジヒドロカルコン、アスパラテー
ム等の周知の合成甘味物質と共用してその呈味特性を有
効利用することが可能であり、これらの合成甘味物質の
１種又は２種以上に本化合物を添加使用すれば、合成甘
味物質特有の苦味、嫌味等の不快味を改良することが可
能となる。

また、レバウディオサイドＡを賦形剤、希釈剤、吸着剤
的に使用されている砂糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、水
飴、デキストリン、デンプン等の周知の糖類甘味に添加
使用することにより、甘味が増強され、従来の使用量よ
りも、大幅にその使用量を削減することが可能となる。
更に本化合物をソルビット、マルチトール、マンニトー
ル、キシリトール等の砂糖よりも甘味度が低い低カロリ
ー甘味物質に添加使用すれば甘味物質の長所を損なうこ
となく甘味を増強することが出来、良質の低カロリー甘
味料が得られる。

レバウディオサイドＡはこの様に一般食品及びダイエッ
ト食品、医薬、医薬部外品、煙草、飼料等の甘味源とし
て使用できることはいうまでもない。

例えば、しょう油、粉末しゅう油、みそ、粉末みそ、も
ろみ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末
すし酢、中華の素、天つゆ、めんつゆ、ソース、ケチャ
ップ、焼肉のタレ、カレールー、シチューの素、スープ
の素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テー
ブルシラップ等の各種の調味料、せんべい、あられ、お
こし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊かん、
水羊かん、ゼリー、カステラ、飴等の各種和菓子、パ
ン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリ
ン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリ
ーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレ
ート、チューインガム、キャラメル、キャンデー等の各
種洋菓子、アイスクリーム、シャーベット、アイスキャ
ンデー等の氷菓、果実のシロップ漬、水飴等のシロップ
類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツ
ペースト等のペースト類、ジャム、マーマレード、シロ
ップ漬、糖菓などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、
千枚漬、らっきょう漬等の漬物類、ハム、ソーセージ等
の畜肉製品類、食肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、
チクワ、天ぷら等の魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、さき
するめ、ふぐのみりん干等の各種珍味類、のり、山菜、
するめ、小魚、貝等で製造されるつくだ煮類、煮豆、ポ
テトサラダ、コンブ巻等のそう菜食品、魚肉、畜肉、果
実、野菜のビン詰、缶詰類、合成酒、果実酒、洋酒等の
酒類、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲
料、乳酸菌飲料等の清涼飲料水、プリンミックス、ホッ
トケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席
しるこ等即席飲食品等の各種飲食物、嗜好物の甘味付に
使用できる。その他、医薬品及び医薬部外品としては練
歯みがき、口紅、リップクリーム、内服薬、トローチ、
肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香錠、うがい薬等への
甘味剤として使用することも自由に行いうる。

（効果） 本発明によれば、従来の方法に比べて高変換率でステビ
オサイドをレバウディオサイドＡに変換できるので生産
性が高く、工業的に優れた方法である。

以下に、本発明の方法およびそれによって得られる甘味
料について実施例により具体的に説明するが、以下の％
は重量基準とする。

実施例１〜３ （１）SGTase及びβ−1,3−グルカナーゼFi IIの調製 ストレプトミセス・sp.DIC−108（微工研菌寄第6593
号）を酵母エキス0.2w/v％、ポリペプトン0.2w/v％MgSO
_４・7H_２0 0.1w/v％、Ｋ_２HPO_４0.2w/v％からなる倍地3
5に植菌し、同時に別殺菌したカードラン350gを加え
て70Jarにて35℃で40時間通気撹拌培養した。得られ
た培養液23を遠心分離してその上清液を硫安0.65飽和
で塩析し、SGTaseとβ−1,3−グルカナーゼFi IIを含有
する粗酵素標品（Ｉ）を得た。（Ｉ）よりSGTaseとβ−
1,3−グルカナーゼFi IIを分離、精製するには、（Ｉ）
を0.01M Tris−HClバッファー（pH7.5）にて溶解し、同
バッファーにて透析し脱塩後、同バッファーで平衡化し
たDEAE−セファデックスＡ−25（330ml Vol）カラムに
吸着させ、0.2M NaCl溶液で溶出される画分470mlを得
る。次いで0.01M酢酸バッファーで透析後、CM−セファ
デックスＣ−25（250ml vol）によるカラムクロマトグ
ラフィーを行うと、未吸着区分にSGTaseが、そして0.3M
NaCl溶液溶出区分にβ−1,3−グルカナーゼFi IIが得
られる。SGTaseの画分800mlを、さらに透析脱塩後、再
びDEAE−セファデックスＡ−25（100ml vol）に吸着さ
せ、０〜0.25Mの食塩にて直線濃度勾配法にて溶出を行
い、SGTase画分100ml（prot.44mg）を得た。このときの
活性は約5,800Uであった。これをさらに濃縮後Ｇ−100
ゲルロ過クロマトグラフィー（φ45×1800mm）により精
製することにより単一酵素を得ることができるが、本発
明においてはゼルロ過以前の精製酵素で充分行いうる。
またβ−1,3−グルカナーゼFi II画分170ml（prot.50.2
mg）をさらにハイドロキシルアパタイトカラムクロマト
グラフィー（vol.200ml）を行い、0.18Mのリン酸バッフ
ァーで溶出することにより、電気泳動的に単一な酵素を
得ることができるが、本発明においては、ハイドロキシ
ルアパタイトカラムクロマト以前の精製酵素において充
分行いうる。なおこの時のβ−1,3−グルカナーゼFi II
の活性は約6,000Uであった。

ここで言うSGTaseの酵素活性１単位とは、pH7.0、0.1M
のリン酸バッファー中で0.5％のステビオサイドと２％
のカードランを作用させ、それに適量の酵素を加えて水
で5.0mlとし、45℃で反応させる。この条件で１時間に
１μＭのレバウディオサイドＡを生成させる酵素量を言
う。

またβ−1,3−グルカナーゼFi IIの酵素活性１単位と
は、0.01Mのリン酸バッファー（pH6.0）にラミナリペン
タオース１％を懸濁させ、それに適量の酵素を加えて水
で5.0mlとし45℃で反応させる。この条件で１時間に1mg
のグルコースに相当する還元力を生成する酵素量を言
う。

（２）転換反応（レバウディオサイドＡの選択的生成反
応） ステビオサイド（純度98％）10g、ラミナリペンタオー
ス（純度95％）40g、先に調製したSGTase20単位、及び
β−1,3−グルカナーゼFi II 1,000単位を0.01Mリン酸
バッファー（pH6.0）１に溶解し、同時に酢酸エチル1
00mlを添加し、40℃で16時間反応させた。その後、90℃
で10分間加熱し、酵素を失活させた。この溶液を合成吸
着樹脂ダイヤイオンHP−20にS.V.＝２で通し、ステビオ
サイド類を吸着させた後、95％エタノールで脱着した。
脱着液のエタノールを減圧留去した後、強酸性イオン交
換樹脂であるアンバーライト−IR−120B（Ｈ型、商品
名、ロームアンドハース社製品）、弱塩基性イオン交換
樹脂であるアンバーライト−IRA−93（OH型、商品名、
ロームアンドハース社製品）にS.V.＝２で通して脱塩し
た。ついでこれを70℃以下で減圧濃縮し、真空乾燥して
粉末のレバウディオサイドＡ（BebAと略記する）6.70g
及びステビオサイド（Stvと略記する）を3.10g得た。

比較例１ 実施例１のβ−1,3−グルカナーゼFi II及び酢酸エチル
をそれぞれ除いて反応させた以外は全く同様の操作を行
ったところ、得られたStvとRebAは表−１のようであっ
た。

実施例４ 実施例１及び実施例３で用いた酢酸エチルの代わりにア
セトン15％（V/V）を用いた以外は実施例１及び３と全
く同様の操作を行った。その結果、SGTaseとアセトン併
用でRebA3.8g、Stv5.1gであり,SGTase、Fi IIとアセト
ン併用でRebA6.4g及びStv3.2gが得られた。転換率は各
々78％、94％、反応収率は各々38％、64％であった。

実施例５ 実施例１及び同３の酢酸エチルの代わりにメチルエチル
ケトン10％（V/V）を用いた以外は実施例１及び同３と
全く同様の操作を行った。その結果、SGTaseとメチルエ
チルケトン併用でRebA3.8g、Stv5.0gであり、SGTase、F
i IIとメチルエチルケトン併用でRebA6.0g及びStv3.8g
が得られた。転換率は各々76％、96％、反応収率は、各
々38％、60％であった。

実施例６ 実施例１及び同３の酢酸エチルの代わりにエタノールを
用いた以外は実施例１及び同３と全く同様の操作を行っ
た。その結果、SGTaseとエタノール併用でRebA3.6g、St
v5.0gであり、SGTase、Fi IIとエタノール併用でRebA6.
0g、Stv4.3gが得られた。転換率は各々72％、95％で、
反応収率は各々36％、60％であった。

実施例７ 実施例１のステビオサイドの代わりにステビア甘味料
（Stv58％、RebA14％、RebC10％）10gを用いた以外は実
施例１と全く同様の操作を行ったところ、Stv22％、Reb
A56％、RebC2％のステビア甘味料が得られた。

【図面の簡単な説明】

図−１はラミナリペンタオースの高速液体クロマトグラ
フィー（HLC）のチャートを示し、図−２は、SGTase反
応後のラミナリペンタオースのHLCチャートを示す。図
−３はSGTaseの作用pHと活性との関係を示すグラフであ
り、図−４はSGTaseの作用温度と活性との関係を示すグ
ラフである。図−５は、β−1,3−グルカナーゼFi II反
応後のラミナリペンタオースのHLCチャートを示す。図
−６はβ−1,3−グルカナーゼFi IIの作用pHと活性との
関係を示すグラフであり、図−７は、β−1,3−グルカ
ナーゼFi IIの作用温度と活性との関係を示すグラフで
ある。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】β−1,3−グルコシル糖化合物とステビオ
   サイドとを含有する水溶液に微生物の生産するβ−1,3
   −グルコシル転移活性を有する酵素を作用させてステビ
   オサイドをレバウディオサイドＡに転換反応させるのに
   際し、該水溶液中に有機溶媒及び／又はエキソタイプの
   β−1,3−グルカナーゼを共存もしくは別途作用させて
   転移反応をさせることを特徴とするレバウディオサイド
   Ａの製造法。
2. 【請求項２】反応液中に存在させる有機溶媒が、アセト
   ン、酢酸エチル、メチルエチルケトン、ヘキサン、ジメ
   チルスルホオキサイド（DMSO）、ジオキサン、チオグラ
   イコール、プロピレングライコール、フタル酸メチル、
   メタノール、エタノールから選ばれる１種以上であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のレバウディ
   オサイドＡの製造法。