JPS62159046A - ホルモンのサブユニツトの測定方法 - Google Patents
ホルモンのサブユニツトの測定方法Info
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- JPS62159046A JPS62159046A JP60298547A JP29854785A JPS62159046A JP S62159046 A JPS62159046 A JP S62159046A JP 60298547 A JP60298547 A JP 60298547A JP 29854785 A JP29854785 A JP 29854785A JP S62159046 A JPS62159046 A JP S62159046A
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- Japan
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- subunit
- measured
- hormone
- measurement system
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はホルモン類、特に、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモ
ン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＬＨ（黄体形成ホ
ルモン）およびＨＣＧ（ｆｉ毛性腺刺激ホルモン）から
選ばれたホルモンのサブユニットの測定方法に関する。
ン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＬＨ（黄体形成ホ
ルモン）およびＨＣＧ（ｆｉ毛性腺刺激ホルモン）から
選ばれたホルモンのサブユニットの測定方法に関する。
一般に、これらホルモンはαおよびβの各＋ ７” −
Ｌ ニットから構成されており、αサブユニットの抗原
性は４種のホルモンともそれぞれ極めて類似していると
いわれている。そして、その血中または体液中の濃度の
測定は原発性甲状腺機能低下症、バセドゥ病、フレチン
症等の診断に広く利用されている。しかしながら、血中
または体液中には、通常、αおよびβの各サブユニット
で構成されるホルモン自体のほかにそれぞれのホルモン
において遊離の形のαサブユニットとβサブユニットも
存在すると云われており、正常人または上記の各症状を
有する患者におけるそれら各サブユニット成分の動態に
ついて種々の検討がなされているが、現在のところ、ま
だその十分な解明はなされていない。
Ｌ ニットから構成されており、αサブユニットの抗原
性は４種のホルモンともそれぞれ極めて類似していると
いわれている。そして、その血中または体液中の濃度の
測定は原発性甲状腺機能低下症、バセドゥ病、フレチン
症等の診断に広く利用されている。しかしながら、血中
または体液中には、通常、αおよびβの各サブユニット
で構成されるホルモン自体のほかにそれぞれのホルモン
において遊離の形のαサブユニットとβサブユニットも
存在すると云われており、正常人または上記の各症状を
有する患者におけるそれら各サブユニット成分の動態に
ついて種々の検討がなされているが、現在のところ、ま
だその十分な解明はなされていない。
従来、これら遊離の形のサブユニット濃度は、それぞれ
のホルモンについて大量の血清からゲ）Ｖ：Ｆ５過等の
煩雑な操作によυ各すブユニットを分離したのち測定し
ていたが、鰐部等は、９日本内分泌学会雑誌、ｖｏ１．
５５＋１３８４〜１３９４．（１９７９）“において、
Ｒ工人法を用い血清サンプルより直接血中ＴＳＨサブユ
ニット値を測定できるとしている。また、コリデｙ、（
Ｋｏｕｒｉｄｅｓ）等も同様なＲ工人法により甲状腺疾
患患者の血清から直接ＴＳＨサブユニットを測定できる
と報告している（ ＥｎｄＯＯｒｉ、ｎｏｌＯｇｙ９４
： １４１１−１４２１（１９７４）“および“Ｊ、Ｃ
１１ｎ、 Ｅｎｄ。
のホルモンについて大量の血清からゲ）Ｖ：Ｆ５過等の
煩雑な操作によυ各すブユニットを分離したのち測定し
ていたが、鰐部等は、９日本内分泌学会雑誌、ｖｏ１．
５５＋１３８４〜１３９４．（１９７９）“において、
Ｒ工人法を用い血清サンプルより直接血中ＴＳＨサブユ
ニット値を測定できるとしている。また、コリデｙ、（
Ｋｏｕｒｉｄｅｓ）等も同様なＲ工人法により甲状腺疾
患患者の血清から直接ＴＳＨサブユニットを測定できる
と報告している（ ＥｎｄＯＯｒｉ、ｎｏｌＯｇｙ９４
： １４１１−１４２１（１９７４）“および“Ｊ、Ｃ
１１ｎ、 Ｅｎｄ。
ｃｒｉ−ｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、、８７２−８８５．（１
９７５）″参照〕。しかしながら、これらのＲＴＡ法は
いずれも競合２抗体法であるために高純度のＴＳＨ−α
またはβサブユニットおよび高特異性の抗ＴＳＨ−αま
たはβサブユニット抗体を必要とする。これらのαまた
はβサプユニッ）は、少量しか存在しないヒトの下垂体
より抽出精製したＴＳＨから得るものであり極めて高価
で貴重である。また、抗−ＴＳ’Ｈ−αまたはβサブユ
ニット抗体は動物免疫血清、即ち、ポリクローナル抗体
を用いるため、特異性を向上させるための精製が極めて
難かしく、従って、その免疫および精製にあたっても貴
重なＴＳＨ−αまたはβサブユニットの大量の使用を余
議なくされる。これらのこトハ、池のホルモンのサブユ
ニットを測定する場合も同様である。
９７５）″参照〕。しかしながら、これらのＲＴＡ法は
いずれも競合２抗体法であるために高純度のＴＳＨ−α
またはβサブユニットおよび高特異性の抗ＴＳＨ−αま
たはβサブユニット抗体を必要とする。これらのαまた
はβサプユニッ）は、少量しか存在しないヒトの下垂体
より抽出精製したＴＳＨから得るものであり極めて高価
で貴重である。また、抗−ＴＳ’Ｈ−αまたはβサブユ
ニット抗体は動物免疫血清、即ち、ポリクローナル抗体
を用いるため、特異性を向上させるための精製が極めて
難かしく、従って、その免疫および精製にあたっても貴
重なＴＳＨ−αまたはβサブユニットの大量の使用を余
議なくされる。これらのこトハ、池のホルモンのサブユ
ニットを測定する場合も同様である。
本発明者等は、血中ホルモン成分の動態解析に有効な手
段となるべき各ホルモンのサブユニットの測定方法につ
いて研究を進めていくうちに、各ホルモンに対する特異
性モノクローナル抗体を用いて極めて有効な測定方法を
見い出した。
段となるべき各ホルモンのサブユニットの測定方法につ
いて研究を進めていくうちに、各ホルモンに対する特異
性モノクローナル抗体を用いて極めて有効な測定方法を
見い出した。
各ホルモンに対する特異性モノクローナル抗体は公知で
るり、例えば、”ＣＬ工Ｎ工ＣＡＬＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
、Ｖｏｌ、２８．／Ｆｌｌ１９．ＰＰ、１８６２−１８
６６．１９８２“には、Ｈ，Ｇａｒｒｅｔｔ、 Ｗａｄ
ａ。
るり、例えば、”ＣＬ工Ｎ工ＣＡＬＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
、Ｖｏｌ、２８．／Ｆｌｌ１９．ＰＰ、１８６２−１８
６６．１９８２“には、Ｈ，Ｇａｒｒｅｔｔ、 Ｗａｄ
ａ。
等によりこれらホルモンのαサブユニット特異性モノク
ローナル抗体およびβサブユニット特異性モノクローナ
ル抗体およびこれを用いたサンドイッチＥＩＡ法による
各ホルモンの測定が報告されている。この報告によれば
、固相としてαサブユニット特異性モノクローナル抗体
を使用し、標識抗体としてβサブユニット特異性モノク
ローナル抗体を用い、上記各ホルモンのαサグユニット
の構造的、免疫化学的性質の類似性のために、固相αサ
ブユニットモノクローナル抗体は、いスレ力１つのホル
モンのαサブユニットモノクローナル抗体でよいとして
いる。
ローナル抗体およびβサブユニット特異性モノクローナ
ル抗体およびこれを用いたサンドイッチＥＩＡ法による
各ホルモンの測定が報告されている。この報告によれば
、固相としてαサブユニット特異性モノクローナル抗体
を使用し、標識抗体としてβサブユニット特異性モノク
ローナル抗体を用い、上記各ホルモンのαサグユニット
の構造的、免疫化学的性質の類似性のために、固相αサ
ブユニットモノクローナル抗体は、いスレ力１つのホル
モンのαサブユニットモノクローナル抗体でよいとして
いる。
さらに、本発明者等は、このようなホルモンのαサブユ
ニット特異性モノクローナル抗体またはβサブユニット
特異性モノクローナルにおいても同じαサブユニット特
異性（あるいはβサブユニ、７ ）特異性）モノクロー
ナル抗体でも認識エピトープの異なる即ち反応性ノ異な
る種々のモノクローナル抗体が存在することを見い出し
ている（例えば、特願昭６０−１７７８１３号参照のこ
と）。
ニット特異性モノクローナル抗体またはβサブユニット
特異性モノクローナルにおいても同じαサブユニット特
異性（あるいはβサブユニ、７ ）特異性）モノクロー
ナル抗体でも認識エピトープの異なる即ち反応性ノ異な
る種々のモノクローナル抗体が存在することを見い出し
ている（例えば、特願昭６０−１７７８１３号参照のこ
と）。
本発明は、これら種々の反応性を有するαまたはβサブ
ユニットモノクローナル抗体の組合せにより達成したも
のであり、次の事実に基づく。
ユニットモノクローナル抗体の組合せにより達成したも
のであり、次の事実に基づく。
先ず、ＥＩＡまたはＥＩＡ法のような測定すべきホルモ
ンを含む試料、固定化抗体および標識抗体とを反応させ
ることからなるホルモンの測定方法において、固定化抗
体として測定すべきホルモンのαサブユニット特異性モ
ノクローナル抗体を用い、標識抗体として測定スべきホ
ルモンのβサブユニット特異性モノクローナル抗体を用
いた測定系（あるいは逆の固定化抗体としてβサブユニ
ット特異性モノクローナル抗体および標識体としてαサ
ブユニ、７１−モノクローナル抗体を用いた系、以下測
定系Ａという）では、測定すべき試料がホルモン自体以
外にそのαまたはβサブユニットヲ含んでいたとしても
ホルモン自体のみしか測定し得ない。というのは、例え
ば、固相にαサブユニット特異性モノクローナル抗体を
用い標識体にβサブユニット特異性モノクローナル抗体
を用いた場合、固相はホルモンとそのαサブユニットと
を結合するが、βサブユニットは結合しない。一方、標
識体はホルモンとβサブユニットヲ結合し得るが、αサ
ブユニットとは結合しないからである。
ンを含む試料、固定化抗体および標識抗体とを反応させ
ることからなるホルモンの測定方法において、固定化抗
体として測定すべきホルモンのαサブユニット特異性モ
ノクローナル抗体を用い、標識抗体として測定スべきホ
ルモンのβサブユニット特異性モノクローナル抗体を用
いた測定系（あるいは逆の固定化抗体としてβサブユニ
ット特異性モノクローナル抗体および標識体としてαサ
ブユニ、７１−モノクローナル抗体を用いた系、以下測
定系Ａという）では、測定すべき試料がホルモン自体以
外にそのαまたはβサブユニットヲ含んでいたとしても
ホルモン自体のみしか測定し得ない。というのは、例え
ば、固相にαサブユニット特異性モノクローナル抗体を
用い標識体にβサブユニット特異性モノクローナル抗体
を用いた場合、固相はホルモンとそのαサブユニットと
を結合するが、βサブユニットは結合しない。一方、標
識体はホルモンとβサブユニットヲ結合し得るが、αサ
ブユニットとは結合しないからである。
結果として、固相に結合した標識体の量は、遊離のαお
よびβサグユニットを含まないホルモン量に対応する。
よびβサグユニットを含まないホルモン量に対応する。
また、固定化抗体および標識体共に測定すべきサブユニ
ットに特異性を有するモノクローナル抗体（ただし、固
定化抗体および標識体に用いるモノクローナル抗体はそ
れぞれ認識するエピトープを異にするものを用いる必要
がある）を用いた測定系（以下、測定系Ｂという）では
、固相は上記と同じ理由でホルモンと測定すべきサブユ
ニットとを吸着し、その両方に標識体が結合するのでホ
ルモン＋測定すべきサブユニットの量を測定できること
になる。しかしながら、測定した吸光度は分子量の異な
る二種の物質に対する値である、 ため、実際には、
その吸光度値からは正確な合計量は求められない。
ットに特異性を有するモノクローナル抗体（ただし、固
定化抗体および標識体に用いるモノクローナル抗体はそ
れぞれ認識するエピトープを異にするものを用いる必要
がある）を用いた測定系（以下、測定系Ｂという）では
、固相は上記と同じ理由でホルモンと測定すべきサブユ
ニットとを吸着し、その両方に標識体が結合するのでホ
ルモン＋測定すべきサブユニットの量を測定できること
になる。しかしながら、測定した吸光度は分子量の異な
る二種の物質に対する値である、 ため、実際には、
その吸光度値からは正確な合計量は求められない。
本発明によれば、上記測定系ＡおよびＢを用い、各ホル
モンのサブユニットを次の如くして正確に求めることが
できる。
モンのサブユニットを次の如くして正確に求めることが
できる。
先ず、測定系ＡおよびＢそれぞれでのホルモン自体の標
準曲線および測定系Ｂでの測定すべきサブユニットの標
準曲線を作成する。
準曲線および測定系Ｂでの測定すべきサブユニットの標
準曲線を作成する。
次に、測定すべきサブユニットヲ含む検体中のホルモン
自体の量を測定系Ａで測定して検体の吸光度から標準曲
線より求め２おく。
自体の量を測定系Ａで測定して検体の吸光度から標準曲
線より求め２おく。
続いて、検体の吸光度ｂ１を測定系Ｂで測定し、測定系
Ａで求めたホルモン自体の量に対応した測定系Ｂの吸光
度善２を測定系Ｂで得たホルモン自体の標準曲線より求
める。
Ａで求めたホルモン自体の量に対応した測定系Ｂの吸光
度善２を測定系Ｂで得たホルモン自体の標準曲線より求
める。
その後、吸光度に１−吸光度４２＝吸光度喜３に相応す
る測定系Ｂでの測定すべきサブユニットの標準曲線の吸
光度よりサブユニットの量を求めることができる。
る測定系Ｂでの測定すべきサブユニットの標準曲線の吸
光度よりサブユニットの量を求めることができる。
本発明で用いる各種ホルモンのαまたはβサブユニット
特異性モノクローナル抗体は、通常の方法、例えば、ホ
ルモン自体または各ホルモンのαまたはβサブユニット
で免疫したマウスの牌臓細胞とマウスミエローマ細胞を
融合し、さらにクローニングして得られたモノクローナ
ル抗体産生性ハイプリドーマのなかからその特異性を調
べて所望のαまたはβサブユニ、７ ）特異性モノクロ
ーナル抗体産生ハイプリドーマを選択し、このハイプリ
ドーマを人工培地中あるいはマウス腹腔内で増殖させる
ことによって得られるαまたはβサブユニット特異性モ
ノクローナル抗体を調製することによって得ることがで
きる。さらに、この中から測定系Ｂで用いる認識エピト
ープの異なる２種のαまたはβサブユニット特異性モノ
クローナル抗体の組み合せを後述するようにして選定し
たものである。
特異性モノクローナル抗体は、通常の方法、例えば、ホ
ルモン自体または各ホルモンのαまたはβサブユニット
で免疫したマウスの牌臓細胞とマウスミエローマ細胞を
融合し、さらにクローニングして得られたモノクローナ
ル抗体産生性ハイプリドーマのなかからその特異性を調
べて所望のαまたはβサブユニ、７ ）特異性モノクロ
ーナル抗体産生ハイプリドーマを選択し、このハイプリ
ドーマを人工培地中あるいはマウス腹腔内で増殖させる
ことによって得られるαまたはβサブユニット特異性モ
ノクローナル抗体を調製することによって得ることがで
きる。さらに、この中から測定系Ｂで用いる認識エピト
ープの異なる２種のαまたはβサブユニット特異性モノ
クローナル抗体の組み合せを後述するようにして選定し
たものである。
本発明は、このようなモノクローナル抗体を用いること
によって通常の免疫学的測定法、例えば、ＥＩＡ法、Ｒ
工Ａ法、螢光抗体法その池の方法によって各種ホルモン
のαまたはβサブユニットの測定を容易にかつ効果的に
行うことができ、血中での各ホルモン成分の動態解析に
極めて有効な手段を提供し得るものである。
によって通常の免疫学的測定法、例えば、ＥＩＡ法、Ｒ
工Ａ法、螢光抗体法その池の方法によって各種ホルモン
のαまたはβサブユニットの測定を容易にかつ効果的に
行うことができ、血中での各ホルモン成分の動態解析に
極めて有効な手段を提供し得るものである。
これらモノクローナル抗体を固定化するのに使用する担
体としては、通常当該技術において任意の担体物質を使
用でき、例えば、シリコーン、ポリアクリルアミド、ポ
リスチレン、セファデックス等の合成高分子物質、アガ
ロース、寒天、でんぷん等の多糖質、蛋白質（ポリアミ
ノ酸）、ガラスが挙げられる。
体としては、通常当該技術において任意の担体物質を使
用でき、例えば、シリコーン、ポリアクリルアミド、ポ
リスチレン、セファデックス等の合成高分子物質、アガ
ロース、寒天、でんぷん等の多糖質、蛋白質（ポリアミ
ノ酸）、ガラスが挙げられる。
また、標識体を得るための標識物質としてハ、例えば、
ベルオキンダーゼ、グリコシターゼ、アルカリホスファ
ターゼ、ガラクトシダーゼ等の酵素類；１ 、■ 等
のラジオアイソトープ；Ｆ工ＴＣ（フルオレセインイン
チオシアネート）、ローダミンＢ等の螢光色素等を使用
できる。好ましいのは取扱い易さの点で酵素である。
ベルオキンダーゼ、グリコシターゼ、アルカリホスファ
ターゼ、ガラクトシダーゼ等の酵素類；１ 、■ 等
のラジオアイソトープ；Ｆ工ＴＣ（フルオレセインイン
チオシアネート）、ローダミンＢ等の螢光色素等を使用
できる。好ましいのは取扱い易さの点で酵素である。
以下、本発明を実施例等により具体的に説明する。
調製例
モノクローナル抗体の調製
先ず、ＴＳＨ，ＴＳＨ−αまたはβサブユニット（いず
れも、カルビオケミ標準品）の５０Ｍｇをｌ、 ３ ｍ
ｌの０，９％生理食塩水に溶解し、アジュバントとして
Ｄ工ＦＣ○社のＦ ＣＡ ｌ、 ３ｍｌを加えて油中水
滴型としたものを基礎免疫用抗原とした。また、ブース
ター用抗原としてＴＳＨまたはＴＳＨ−βサブユニット
の５０Ｍｇを１．３ ｍｌの０．９％生理食塩水に溶か
して調製したものを用いた。
れも、カルビオケミ標準品）の５０Ｍｇをｌ、 ３ ｍ
ｌの０，９％生理食塩水に溶解し、アジュバントとして
Ｄ工ＦＣ○社のＦ ＣＡ ｌ、 ３ｍｌを加えて油中水
滴型としたものを基礎免疫用抗原とした。また、ブース
ター用抗原としてＴＳＨまたはＴＳＨ−βサブユニット
の５０Ｍｇを１．３ ｍｌの０．９％生理食塩水に溶か
して調製したものを用いた。
ＢＡＬＢ／Ｃマウ７４〜５週令♀を用い、一般的な免疫
スケージュルで免疫して得たマウス牌臓細胞を、以下、
通常の方法、例えば“渡辺武監修「ハイグリドーマ法と
モノクローナル抗体Ｊ 、Ｐ、２０〜Ｐ、２９（株）Ｒ
＆Ｄプランニング社、１９８２“に記載の方法によりマ
ウスミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ ）
と融合させ、クローニングしてＴＳＨ−αまタハβサブ
ユニット特異性モノクローナル抗体を産生ずるハイグリ
ドーマ１１種を得た。
スケージュルで免疫して得たマウス牌臓細胞を、以下、
通常の方法、例えば“渡辺武監修「ハイグリドーマ法と
モノクローナル抗体Ｊ 、Ｐ、２０〜Ｐ、２９（株）Ｒ
＆Ｄプランニング社、１９８２“に記載の方法によりマ
ウスミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ ）
と融合させ、クローニングしてＴＳＨ−αまタハβサブ
ユニット特異性モノクローナル抗体を産生ずるハイグリ
ドーマ１１種を得た。
各々をマウヌ腹腔内で増殖させることによって各モノク
ローナル抗体を得た。
ローナル抗体を得た。
上記で得た１１種のハイプリドーマが産生ずるモノクロ
ーナル抗体の抗原特異性を次のようにして測定した。
ーナル抗体の抗原特異性を次のようにして測定した。
先ず、トレーサーとしての １標識ＴＳＥ（。
１２５１１ｔ１ｍ Ｔ Ｓ Ｈ−αサブユニットおよび
１２５工標識ＴＳＥＩ−βサブユニットをクロラミン−
Ｔ法により調製した。
１２５工標識ＴＳＥＩ−βサブユニットをクロラミン−
Ｔ法により調製した。
サンプルとしての各ハイプリドーマの培養上清の免疫グ
ロブリン量を２０Ｍｇ ／ ｍ Ｊに調整したもの１０
０μｍと各トレーサーを約２００００ｃｐｍ／ １００
μｍに調整したもの１００μｍとを試験管内で混合して
３７°Ｃで１時間インキュベートした。次に市販の抗マ
ウヌイムノグロプリンヤギ血清（カッペル社製）を２０
倍希釈したもの５０μｍを加え、さらに３７°Ｃで３０
分間インキニーベートした。続いて、市販の黄色ブドウ
球菌ＣｏｗａｎＩ株菌体であるアブソープＧ（化血研製
）２００μｍを加え３７°Ｃで３０分間インキュベート
した。その後、０．１５Ｍりん酸緩衝食塩液（ｐＨ７，
２）で洗浄したのち、沈査中のＣｐｍをガンマ−カウン
ターでカウントして各ハイプリドーマの抗原性を測定し
た。
ロブリン量を２０Ｍｇ ／ ｍ Ｊに調整したもの１０
０μｍと各トレーサーを約２００００ｃｐｍ／ １００
μｍに調整したもの１００μｍとを試験管内で混合して
３７°Ｃで１時間インキュベートした。次に市販の抗マ
ウヌイムノグロプリンヤギ血清（カッペル社製）を２０
倍希釈したもの５０μｍを加え、さらに３７°Ｃで３０
分間インキニーベートした。続いて、市販の黄色ブドウ
球菌ＣｏｗａｎＩ株菌体であるアブソープＧ（化血研製
）２００μｍを加え３７°Ｃで３０分間インキュベート
した。その後、０．１５Ｍりん酸緩衝食塩液（ｐＨ７，
２）で洗浄したのち、沈査中のＣｐｍをガンマ−カウン
ターでカウントして各ハイプリドーマの抗原性を測定し
た。
また、イムノグロブリン・サブクラスの同定をマウスの
α、γ１、ｒ２ａ１，２Ｊ！ｒ、 γ３、μ、に、λ鎖
に対する各抗血清を用いてオフタロニー法により各ハイ
プリドーマ培養上清について測定した。
α、γ１、ｒ２ａ１，２Ｊ！ｒ、 γ３、μ、に、λ鎖
に対する各抗血清を用いてオフタロニー法により各ハイ
プリドーマ培養上清について測定した。
結果は、第１表のとおりでありＴＳＨ−αまたはβサグ
ユニットいずれかに特異性のモノクローナル抗体が得ら
れていることが判る。
ユニットいずれかに特異性のモノクローナル抗体が得ら
れていることが判る。
次に、測定系Ｂにおいて使用するための認識エピトープ
の異なるα−α系またはβ−β系モノクローナル抗体の
組合せを探すため、次の認識エピトープ確認試験を行っ
た。
の異なるα−α系またはβ−β系モノクローナル抗体の
組合せを探すため、次の認識エピトープ確認試験を行っ
た。
認識エピトープ確認試験
上記で得た５種のＴＳＨ−αサブユニット特異性モノク
ローナル抗体および６種のＴＳＨ−βサブユニット特異
性モノクローナル抗体の認識するエピトープの違いを次
のようにして決定した。
ローナル抗体および６種のＴＳＨ−βサブユニット特異
性モノクローナル抗体の認識するエピトープの違いを次
のようにして決定した。
即ち、 工標識ＴＳＨ）レーサー（３２，０００（Ｊ
ｍ、２００μｍ）を用い、これに上記各モノクローナル
抗体を５０μｇ７−、ｄに濃度調製したもの２００μｊ
−を加えて３７°ｃ、２時間反応させ、さらに、常法に
よりポリスチレンビースニ固定した上記モノクローナル
抗体を加え３７°Ｃ１２時間反応させた。洗浄後、固相
のｃｐｍを測定し、その値の高いもの即ち反応阻害のな
いものを認識エピトープの異なる組合せとした。
ｍ、２００μｍ）を用い、これに上記各モノクローナル
抗体を５０μｇ７−、ｄに濃度調製したもの２００μｊ
−を加えて３７°ｃ、２時間反応させ、さらに、常法に
よりポリスチレンビースニ固定した上記モノクローナル
抗体を加え３７°Ｃ１２時間反応させた。洗浄後、固相
のｃｐｍを測定し、その値の高いもの即ち反応阻害のな
いものを認識エピトープの異なる組合せとした。
結果は第２表および第３表のとおりであり、異性モノク
ローナル抗体２００μｍと常法によ）Ａ１のＴＳＨ−α
サプユニツ） 特Ｊｌモノクローナル抗体を固定したポ
リスチレンピースと共に試験管に入れ３７°Ｃで２時間
反応させ、５％） ウ４− ：／ （Ｔｗｅｅｎ ）２
０−ＰＢＳでビーズを３回洗浄後、別の試験管に移し換
えた６ さらに、０．１ Ｍクエン酸と０．２Ｍリン酸ナトリウ
ムを含むｐＨ４，８の液２５ｍｆ、５％Ｈ２０２２５μ
！およびＯ−フェンレンジアミン ２塩酸塩１５ｍｇと
からなる液５００μｍを添加し、暗所で３７°Ｃ１１時
間反応させ、さらに６Ｎ。
ローナル抗体２００μｍと常法によ）Ａ１のＴＳＨ−α
サプユニツ） 特Ｊｌモノクローナル抗体を固定したポ
リスチレンピースと共に試験管に入れ３７°Ｃで２時間
反応させ、５％） ウ４− ：／ （Ｔｗｅｅｎ ）２
０−ＰＢＳでビーズを３回洗浄後、別の試験管に移し換
えた６ さらに、０．１ Ｍクエン酸と０．２Ｍリン酸ナトリウ
ムを含むｐＨ４，８の液２５ｍｆ、５％Ｈ２０２２５μ
！およびＯ−フェンレンジアミン ２塩酸塩１５ｍｇと
からなる液５００μｍを添加し、暗所で３７°Ｃ１１時
間反応させ、さらに６Ｎ。
Ｈ２ＳＯ４１２５μｍを加え反応を停止し、Ｏ，Ｄ。
４９２ ｎｍで測定した吸光度とＴＳＨの濃度との関係
をプロットして第１図で測定系Ａ（Ａ系と表示）として
示す標準曲線を得た。
をプロットして第１図で測定系Ａ（Ａ系と表示）として
示す標準曲線を得た。
次に、固定化抗体として上記轟１のＴＳＨ−αサブユニ
ットモノクローナル抗体の代すに五７のＴＳＨ−βサブ
ユニットモノクローナル抗体を用いた測定系Ｂにおいて
、上記と同様な操作によりもう１つのＴＳＨ標準曲線（
第１図にＢ系として示す）を得た。
ットモノクローナル抗体の代すに五７のＴＳＨ−βサブ
ユニットモノクローナル抗体を用いた測定系Ｂにおいて
、上記と同様な操作によりもう１つのＴＳＨ標準曲線（
第１図にＢ系として示す）を得た。
また、ヒ）ＴＳＨ−βサブユニット標準品（カルビオケ
ミ社製、１ｏｏｍｇ／バイアル凍結乾燥品）ｆｔ用いて
上記ＴＳＨ標準液と同様にして各ＴＳＨ−βＳグーニッ
ト標準液を調製し、測定系Ｂにおいて、上記と同様な操
作によｐＴｓＨ−βサブユニット標準曲線を得た（第２
図）。
ミ社製、１ｏｏｍｇ／バイアル凍結乾燥品）ｆｔ用いて
上記ＴＳＨ標準液と同様にして各ＴＳＨ−βＳグーニッ
ト標準液を調製し、測定系Ｂにおいて、上記と同様な操
作によｐＴｓＨ−βサブユニット標準曲線を得た（第２
図）。
続いて、上記ＴＳＨフリー血清を用いＴＳＨ５μＵ／ｍ
１および’Ｉ’ＳＨ−βす、・ユニットｌｎｇ／ｍ４
を含む検体液を調製し、測定系ＡでＯ，Ｄ、４９２ｎｍ
での吸光度を測定したところ０．４２であゃ、第１図の
標準曲線Ａでみたところ、そのＴＳＨ濃度は５μＵ／ｍ
Ｊ−であり、検体濃度と一致していた。次に、測定Ｂに
おいて検体の吸光度６１ｔｌ−測定したところＯ，Ｄ。
１および’Ｉ’ＳＨ−βす、・ユニットｌｎｇ／ｍ４
を含む検体液を調製し、測定系ＡでＯ，Ｄ、４９２ｎｍ
での吸光度を測定したところ０．４２であゃ、第１図の
標準曲線Ａでみたところ、そのＴＳＨ濃度は５μＵ／ｍ
Ｊ−であり、検体濃度と一致していた。次に、測定Ｂに
おいて検体の吸光度６１ｔｌ−測定したところＯ，Ｄ。
４９２ｎｍ＝１．２５であった。測定系Ｂテ（７）ＴＳ
Ｈ標準曲線でのＴＳＨ５μＵ ／ ｍ １に対応する吸
光度ｌ３−２は、第１図から明らかな如＜０．２５であ
シ、句＝”ｌ−４２＝１．２５−０．２５＝１．００と
なる。
Ｈ標準曲線でのＴＳＨ５μＵ ／ ｍ １に対応する吸
光度ｌ３−２は、第１図から明らかな如＜０．２５であ
シ、句＝”ｌ−４２＝１．２５−０．２５＝１．００と
なる。
この吸光度はＴＳＨ−βサブユニットに由来するもので
、この吸光度４３から第２図のＴＳＨ−βサブユニット
標準線よｆｉＴｓＨ−βサブユニット濃度を求めるとち
ょうど１．Ｏｎｇ／ｍ１であり、当初の検体濃度と正し
く一致した。
、この吸光度４３から第２図のＴＳＨ−βサブユニット
標準線よｆｉＴｓＨ−βサブユニット濃度を求めるとち
ょうど１．Ｏｎｇ／ｍ１であり、当初の検体濃度と正し
く一致した。
種々の濃度のＴＳＨ−αサブユニット標準ｉｔヒトＴＳ
Ｈ−αサブユニット標準品（カルビオケミ社製、ｔｏｏ
ｍｇ／＞＜イアル凍結乾燥品）および実施例１のＴＳＨ
フリー血清を用いて調製した。
Ｈ−αサブユニット標準品（カルビオケミ社製、ｔｏｏ
ｍｇ／＞＜イアル凍結乾燥品）および実施例１のＴＳＨ
フリー血清を用いて調製した。
測定系Ｂとして共にＴＳＨ−αサブユニット特異性モノ
クローナル抗体であるクローン＆５（標識体）およびク
ローン遥３（固定化抗体）を用いた以外は、実施例１と
同様にして測定系ＡおよびＢでのＴＳＥ（標準曲線（第
３図）および測定系ＢでのＴＳＥ（−αサブユニ、７）
標準曲線（第４図）を得た。
クローナル抗体であるクローン＆５（標識体）およびク
ローン遥３（固定化抗体）を用いた以外は、実施例１と
同様にして測定系ＡおよびＢでのＴＳＥ（標準曲線（第
３図）および測定系ＢでのＴＳＥ（−αサブユニ、７）
標準曲線（第４図）を得た。
検体としてＴ Ｓ Ｈ１０ｔｔＵ／ｍＪＬ オよびＴＳ
Ｈ−αサプユニツＩ−２ｎｇ／ｍＡを含む液をＴＳＥ（
−αサブユニ７＋−標準品および実施例１のＴＳＨフリ
ー血清を用いて調製した。
Ｈ−αサプユニツＩ−２ｎｇ／ｍＡを含む液をＴＳＥ（
−αサブユニ７＋−標準品および実施例１のＴＳＨフリ
ー血清を用いて調製した。
実施例１と同様にして測定系Ａでの検体の吸光度を測定
したところ○、Ｄ、 ４９２ｎｍ＝ ０．６であり、こ
の吸光度から第３図によｐＴｓＨ濃度を求めたところ１
０ＡＵ／ｍ１であシ実際の含有量と一致した。また、Ｔ
ＳＨ濃度１０μＵ／ｍＪ−に対応する測定系Ｂでの標準
曲線よりの吸光度善２は○、Ｄ、４９２ｎｍ＝０．２５
であった。
したところ○、Ｄ、 ４９２ｎｍ＝ ０．６であり、こ
の吸光度から第３図によｐＴｓＨ濃度を求めたところ１
０ＡＵ／ｍ１であシ実際の含有量と一致した。また、Ｔ
ＳＨ濃度１０μＵ／ｍＪ−に対応する測定系Ｂでの標準
曲線よりの吸光度善２は○、Ｄ、４９２ｎｍ＝０．２５
であった。
次に、同様にして測定した測定系Ｂでの検体の吸光度菩
１はＯ，Ｄ、 ４９２ｎｍ ＝ １．７であり、４３即
ち４ｌ−４２＝１．７−０．２５＝１．４５であった。
１はＯ，Ｄ、 ４９２ｎｍ ＝ １．７であり、４３即
ち４ｌ−４２＝１．７−０．２５＝１．４５であった。
第４図を用いて、この吸光度６３＝１．４５に相当する
ＴＳＨ−αサブユニット濃度を見ると、２ｎｇ／ｍｆと
なり、検体中の実際の濃度に一致した。
ＴＳＨ−αサブユニット濃度を見ると、２ｎｇ／ｍｆと
なり、検体中の実際の濃度に一致した。
なお、実際の検体よりＴＳＥＩ−αサブユニットを測定
する場合には、池のホルモンとの交差反応を避けるため
（前述の如く、各ホル七ンのαサブユニットの抗原性類
似のため）、前以ってτ−ＨＣＧ−βサブＣニート、ニ
ーＬＥ（−βサブユニットおよびπ−ＰＳＥ（−βサブ
ユニットを結合させたビーズ等で前処理を行ってＨＣＯ
，ＬＨおよびＦＳＨを除去しておくことが好ましい。ま
た、α−サブユニットの場合、１つのホルモンのαサブ
ユニットだけでなく、すべてのホルモンのα−サブユニ
ット量が測定される。
する場合には、池のホルモンとの交差反応を避けるため
（前述の如く、各ホル七ンのαサブユニットの抗原性類
似のため）、前以ってτ−ＨＣＧ−βサブＣニート、ニ
ーＬＥ（−βサブユニットおよびπ−ＰＳＥ（−βサブ
ユニットを結合させたビーズ等で前処理を行ってＨＣＯ
，ＬＨおよびＦＳＨを除去しておくことが好ましい。ま
た、α−サブユニットの場合、１つのホルモンのαサブ
ユニットだけでなく、すべてのホルモンのα−サブユニ
ット量が測定される。
第１図は、ＴＳＨ−βサブユニットを測定するための測
定系ＡおよびＢでのＴＳＨ標準曲線を示し、第２図は測
定系ＢでのＴＳＨ−βサブユニット標準曲線を示す。 第３図はＴＳＥ（−αサブユニットを測定するための測
定系ＡおよびＢでのＴＳＨ標準曲線を示し、第４図は測
定系ＢでのＴＳＨ−αサブユニット標準曲線を示す。 第１図 ＴＳＨミ駄（）ＩＵ／ｍｌ） 第２図 第３図
定系ＡおよびＢでのＴＳＨ標準曲線を示し、第２図は測
定系ＢでのＴＳＨ−βサブユニット標準曲線を示す。 第３図はＴＳＥ（−αサブユニットを測定するための測
定系ＡおよびＢでのＴＳＨ標準曲線を示し、第４図は測
定系ＢでのＴＳＨ−αサブユニット標準曲線を示す。 第１図 ＴＳＨミ駄（）ＩＵ／ｍｌ） 第２図 第３図
Claims (1)
- （１）ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＬＨおよびＨＣＧから選ばれた
ホルモンのαサブユニット特異性モノクローナル抗体と
βサブユニット特異性モノクローナルとを用いて、イ）
αサブユニット特異性モノクローナル抗体の固定化抗体
（または標識抗体）−βサブユニット特異性モノクロー
ナル抗体の標識抗体（または固定化抗体）からなる測定
系Ａおよびロ）測定すべきサブユニットと同じサブユニ
ット特異性モノクローナル抗体であるが、その認識する
エピトープを異にする２種のモノクローナルを用いた固
定化抗体−標識抗体の測定系Ｂとを確立すること、 測定系ＡおよびＢそれぞれでホルモン自体 の２つの標準曲線を作成すること、 測定系Ｂにおいて測定すべきサブユニット の標準曲線を作成すること、 測定すべきサブユニットを含む検体を測定 系Ａで測定して検体の吸光度によりホルモン自体の量を
求めること、 測定すべきサブユニットを含む検体を測定 系Ｂで測定して検体の吸光度ｂ＿１を得ること、測定系
Ａで測定したホルモン自体の量に対 応した測定系Ｂの吸光度ｂ＿２を測定系Ｂで得たホルモ
ン自体の標準曲線より求めること、 吸光度ｂ＿１より吸光度ｂ＿２を差し引いた吸光度ｂ＿
３と測定系Ｂでの測定すべきサブユニットの標準曲線の
相応する吸光度よりサブユニットの量を求めること、 の各段階よりなる上記ホルモンのサブユニットの測定方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60298547A JPS62159046A (ja) | 1985-12-31 | 1985-12-31 | ホルモンのサブユニツトの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60298547A JPS62159046A (ja) | 1985-12-31 | 1985-12-31 | ホルモンのサブユニツトの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62159046A true JPS62159046A (ja) | 1987-07-15 |
Family
ID=17861142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60298547A Pending JPS62159046A (ja) | 1985-12-31 | 1985-12-31 | ホルモンのサブユニツトの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62159046A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992006377A1 (en) * | 1990-10-04 | 1992-04-16 | Teijin Limited | Method and kit for immunoassay of propeptide of osteocalcin and proosteocalcin |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54126723A (en) * | 1978-03-23 | 1979-10-02 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | Preparation of specific hcg and specific anti-hcg-beta-subunit antibody |
| EP0109856A2 (en) * | 1982-11-22 | 1984-05-30 | Monoclonal Antibodies, Inc. | HCG sandwich-type immunoassay and reducing LH cross-reactivity in an immunological reaction for HCG with LH present |
| JPS59224563A (ja) * | 1983-06-03 | 1984-12-17 | Toyobo Co Ltd | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの酵素免疫測定用試薬組成物および測定方法 |
| JPS6089429A (ja) * | 1983-08-26 | 1985-05-20 | アンダ・ビヨロジカル | 抗ｈｃｇおよび抗ｌｈワクチンの製造方法 |
| JPS60120255A (ja) * | 1983-12-02 | 1985-06-27 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | 下垂体性又は絨毛性糖蛋白ホルモンの測定 |
-
1985
- 1985-12-31 JP JP60298547A patent/JPS62159046A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54126723A (en) * | 1978-03-23 | 1979-10-02 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | Preparation of specific hcg and specific anti-hcg-beta-subunit antibody |
| EP0109856A2 (en) * | 1982-11-22 | 1984-05-30 | Monoclonal Antibodies, Inc. | HCG sandwich-type immunoassay and reducing LH cross-reactivity in an immunological reaction for HCG with LH present |
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