JPS59224563A - ヒト絨毛性ゴナドトロピンの酵素免疫測定用試薬組成物および測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下ＨＯＧと略
す）の酵素免疫測定法（以下Ｅ工Ａと略す）に関するも
のである。

ＨＣＧは胎盤の絨毛組織で産生、分泌される性腺刺激ホ
ルモンで、妊娠と同時にその産生量は増加し、分娩後急
激に減少するところから、妊娠診断の検査項目としてよ
く知られている。さらに近年・放射免疫測定法（以下Ｒ
ＩＡと略す）の開発によりＮ血清中の微量のＨＯＧの測
定が可能となり１妊娠とは無関係な種々の悪性腫瘍でＨ
ｃＧが分泌されているという報告が数多くなされ、他の
と共に注目されている検査項目である。

周知のように、ＨＯＧはα、βのサブユニットから構成
される糖蛋白ホルモンであり、α−サブユニットは、他
の下垂体性ホルモンである・黄体形成ホルモン、卵胞刺
激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン等のα４−サブユニッ
トとほとんど等しいアミノ酸配列を有し、β−サブユニ
ットは各ホルモンに特異的であるが、黄体形成ホルモン
（以下ＬＨと略す）とは蛋白質のカルボキシル基末端（
Ｃ末端）でＨＯＧの方が３０個長いペプチド鎖を有する
が、アミ７基末端（Ｎ末端）がら１１５個のアミノ酸配
列中２３個が異なるだけで、９２個は共通である。

このような理由から、ＨＣ（）の免疫測定ではＬＨとの
交叉反応が強く・前述の如く一腫瘍診断においてはＬＨ
との交叉反応の少ないＨＣＧの免疫測定が必要とされて
いる。そのためには、Ｅ工ＡによるＨＯＧの測定にも・
ＬＨとの交叉反応を少なくするために〜ＨＯＧに対して
特異的に結合する抗体よりもＨＣＧのβ−サブユニット
に対して特異的に結合する抗体を用いて免疫測定を行っ
た方が好ましい。

Ｈ（３Ｇの測定方法としては一上記の妊娠診断に用いら
れている赤血球凝集反応あるいは赤血球凝集阻止反応の
他、ラテックス凝集反応、Ｒ工Ａなどが知られているが
、これらの測定方法はたとえば赤血球凝集反応、ラテッ
クス凝集反相などでは定性的であり、感度が低く、血清
成分の干渉を受は易く、またＲ工Ａでは感度は高いが、
放射性物質を使用するため特殊な設備を必要とし、どこ
でも手帖に実施するわけにはいがないといった欠点を有
している。

近年・これらの測定方法の欠点を補うべく、酵素免疫測
定法（Ｅ工Ａ）が開発され、数多くのキットが市販され
るようになったが、測定感度の点ではＲ工Ａにいま少し
及ばないと言われている。

Ｅ工Ａの測定原理は大別すると競争的結合法とサンドイ
ンチ法とにわけられるが、血清中の干渉物質の影響を受
けにくいという点からはサンドインチ法が優れている。

さて−このサンドイツチ法でＨＯＧを測定する方法を簡
単に説明する。

まず・ＨＯＧに対して特異的に結合する抗体を結合させ
た固相に、ＨＯＧを含む被検液を反応させた後、反応液
を洗浄１除去する。次いで、Ｈ（ｊＧに対して特異的に
結合する抗体に酵素を結合させた複合体（以下単に複合
体と略す）を反応させると１同相表面上に抗体−ＨｏＧ
−複合体なるサンドインチ状結合物が生成する。次に余
剰の反応液を除去して、固相表面上に結合した複合体の
酵素活性を測定するか、もしくは洗浄液中の結合しなか
った複合体の酵素活性を測定することにより被検液中の
ＨＯＧの量を測定することができる。

ところが従来から行われている前記のサンドイツチ法で
は一固相に被検液中のＨＯＧの量とは無関係に１前記の
複合体が非特異的に結合し一測定のバックグランドを高
くするため、感度が低いという大きな欠点を有していた
。

そこで一本発明者らはＨＯＧのサンド・ｒフチ法におけ
る複合体の非特異的結合を低減せしめ１感度を高くする
ことを目的とし、鋭意研究した結果１本発明に到達した
のである。

すなわち、本発明は（１）　ＨＣａに対して特異的に結
合する抗体および／またはＨＣＧに対して特異的に結合
する抗体の７ラグメントを結合させた固相と、ＨＣＧに
対して特異的に結合する抗体の７ラグメントに酵素を結
合させた複合体−と、前記酵素の活性を測定する基質と
から収ることを特徴とするＨＯＧのλ酵素免疫測定用の
試薬組成物、（２）ＨＯＧに対して特異的に結合する抗
体および／またはＨＯＧに対して特異的に結合する抗体
の７ラグメントを固相に結合させ・前記固相にＨＯＧを
含む被検液を反応させた後、必要により前記同相を洗浄
し１前記固相に、ＨＣＧに対して特異的に結合する抗体
の７ラグメントに酵素を結合させた複合体を反応させ、
反応後過剰の前記複合体を洗浄で除き、前記同相に結合
した複合体の酵素活性を測定するか、または洗浄液中の
結合しなかった前記複合体の酵素活性を測定することを
特徴とするＨＯＧの酵素免疫測定方法〆である。

本発明による試薬組成物を用いてＨＯＧの酵素免疫測定
を行うと、測定のパックグランドが低いため感度が大幅
に向上し、Ｒ１八と同等かもしくはそれ以上の感度が得
られる； 一般にＨＯＧの妊娠女性を除く健康人における血清中の
濃度は、男女差あるいは女性でも月経周期により若干変
動するが、０．２〜１．５ｎ９／−であ’）ｓＨｃＧ（
１）β−サブユニットのそれは０．１〜１．０ｎ９／−
であるとされている。そこで、これらを測定するために
は、Ｅ工八においても、０．１〜１．５ｎり／−を測定
するに足りつる感度が必要である。

しかし・前述の如くＮ従来から行われているＥ工八のサ
ンドイツチ法では、このような測定感度を満たすという
ことは側底不可能であり１本発明による試薬組成物を用
いた時にそれが可能となるわけである。

Ｅ工八におけるこのような測定感度の向上は・健康人血
清中の濃度が比較的高い血清中蛋白質またとえば７エリ
チン（ｓ　ｏ　〜１ｏｏｎＧｌ／＋Ｒｔ）−工ｑＢ（１
００〜８００　ｎり／−）などでは、容易に達成されう
るかもしれないがｓ　ＨＯＧあるいはＨＯＧのβ−サブ
ユニットのように健康人血清中の濃度が１前述の如く、
極めて低い場合に１測定感度を向上せし得るということ
は％当該分゛野においＣは驚異的な知見である。

以下−さらに本発明の詳細な説明する。

抗体の７ラグメントとは、抗体である免疫グロブリンを
ペプシン１パパインなどの蛋白分解酵素で切断して得ら
れる免疫グロブリンの断片であり、具体的にはｙ（ａｂ
’）１　、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｏなどである。ここで
、これらの抗体の７ラグメントのうち−Ｆｃは本発明か
ら除外される。なぜなら−Ｐａフラグメントには抗原結
合部位がないためＨＯＧを測定することができないから
である。

さて、前記のサンドイツチ法でＨＯＧを測定する場合の
具体的方法を以下に述べる。

まず１前記の如く１ペプシン−パパインなどの蛋白分解
酵素でＨＣＧに対して特異的に結合する抗体（以下抗Ｈ
ＯＧ抗体と略す）を切断して得られた免疫グロブリンの
断片またとえばＦａｂを固。

相に結合させる。この時、固相に結合させるものはＦｌ
ｂ単独であっても抗ＨＯＧ抗体であっても、あるいは両
者を混合したものであっても良い。

ここで〜固相とは一般に水に不溶性の担体と言うが１特
に好ましいのは、ポリスチレンポール−ポリスチレンチ
ューブ−ガラスビーズ、シリコーン片などである。これ
らの固相に前記Ｆａｂ　　などを結合させるには、公知
の結合技術が用いられるがどのような方法であってもＴ
ａｂ　などの抗体を変性させずに行わなければならない
。たとえばＦａｂ　を溶解した緩衝液に前記のポリスチ
レンボール−ポリスチレンチューブ等を数時間浸漬し、
必要であれば洗浄して、適当な保護剤を含有する緩衝液
中に懸濁して調製すること゛ができる。

次に抗ＨＯＧ抗体の７ラグメント、たとえばＦＩＬｂ　
に酵素を結合させた複合体の調製方法を述べる。

ここで用いる酵素としては、酵素免疫測定でよく知られ
ているβ−ガラクトシダーゼ−アルカリフォスファター
ゼＮグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ等が挙
げられるが、これらに限定されるものではない。特に好
ましい酵素としては西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ
が１安価で入手が容易であること、比較的分子量が小さ
いことなどの点から優れている。

これらの酵素を前記のＦａｂ　　に結合させるのにも公
知の結合技術を用いることができる。たとえば、２官能
性試薬であるゲルタールアルデヒドを用いてＴａｂと酵
素とを架橋結合させても良いし、ペルオキシダーゼのよ
うに分子中に糖鎖ｔｔ持っている酵素ならば、その糖鎖
を過ヨウ素酸で酸化し、アルデヒド基を露出させ、Ｆ＆
ｂのアミノ基と結合させれば良い。

あるいは、マレイミド基とチオール基との特異的結合反
応を利用して、酵素とＦａｂとにそれぞれ、マレイミド
基、チオール基を導入して結合させることも可能である
。この場合、抗体の７ラグメントとしてＦａｂ　を用い
ると、それ自身チオール基を有しているため、そのまま
〜結合に用いることができて有利である。このようにし
て得られた複合体は一透析、ゲル濾過などの適当な精製
操作を施して１酵素活性・ＨＯＧ結合活性が共に高い区
分を使用すると有利であるのは言うまでもない。

次にＮ前記複合体の調製に用いた酵素の活性を測定する
基質について説明する。

基質としては酵素化学の分野で用いられるものならビど
のようなものでも良いが・測定感度の高い基質が好まし
いことは言うまでもない。そのような基質として、たと
えば酸素が西洋ワサビ由来酵素がβ−ガラクトシダーゼ
であるならば争−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシトー４−メチルウンベリフエリルーβ−Ｄ−ガラ
クトシド等を挙げることができる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例　Ｌ ａ、抗ＨｃＧ抗体のＦａｂ’フラグメントの調製家兎に
免疫して得られた抗ＨＯＧ血清から１硫安分画、ＤＥＡ
ＥセルロースクロマＦにより、Ｉｙａ　　画分を取得し
、２０１１９を０．１　Ｍ酢酸緩衝ｔ（ｐＨ４，５）に
溶解した。次にペプシン（ぺ一ファデツクスＧ−１１５
０にてゲル濾過を行い１Ｆ（ａｂ’）、両分１１．５”
Ｐを得た。これに０．１　Ｍメルカプトエチルアミンを
０．２４加え、３７℃で９０分間反応させた後、セファ
デックスＧ−２５にてゲル濾過を行い、Ｆ＆ｂ’画分８
．２〜を得、使用まで０．１Ｍ酢酸緩衝液（Ｉｉ（５，
０）に懸濁して保存した。

ｂ、　　Ｆａｂ’結合固相試薬の調製 ａで調製したＦａｂ’フラグメントを０．１ＭＮａＨＯ
Ｏ３溶液で５０μ９／−に希釈した。この溶液にポリス
チレン球（直径４−）を浸漬し、４時間放置した後、洗
浄し、牛血清アルブミンとアジ化ナトリウムを含む緩衝
液中に保存して〜Ｆａｂ’結合固相を調製した。

Ｑ、、　　Ｆ＆ｂ’と西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ
との複合体の調製 西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡製）６Ｗ９に
Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルホキシレー１２１１９を加え、
室温で１時間反応させた後・セファデックスＧ−２５に
てゲル濾過を行い一マレイミドペルオキシダーゼを得た
。これにａで得たＦａｂ’　７ラグメント３．０ηを混
合して、４℃で２４時間反応させた後、ウルトロゲルへ
〇Ａ４４（ＬＫＢ社製）にてゲルー過を行い複合体を得
た。

ｄ、ペルオキシダーゼの活性測定用基質の調製０−フェ
ニレンジアミンを０．０２％のＨ２Ｏ２ヲ含むクエン酸
−リン酸緩衝液に３■／−となるように溶解して基質溶
液とした。

ｅ、ＨＯＧの測定 ブラスチン′り製の試験管（１０鰭φＸ　７５１１＠　
）に、ＨＯＧを含む被検液または種々濃度のＨＣＧ標準
液５０μｌと０．０２Ｍリン酸緩衝液２００μｌとを添
加し、ｂで得たＦａｂ’結合ポリスチレン球を１個人れ
て３７℃ｎ１時間振とうした後、生理食塩水で３回洗浄
した。次いで０で得た複合体を牛血清アルブミンを含む
リン酸緩衝液で５００倍に希釈した液を２５０μ！添加
して％３７℃で１時間振とうし、生理食塩水で３回洗浄
した。次にポリスチレン球を別の試験管に移し、ｄで得
た基質溶液を０．５−加えて、暗所で１時間酵素反応さ
せた後、１規定の硫酸溶液を２　ｍｌ加えて反応を停め
、４９２　ｎｍの吸光度を測定した。

比較例 実施例１の０に記載した複合体の替りに、次のようにし
て調製した複合体を用いた。

家兎に免疫して得られた抗ＨＯＧ血清から精製した工９
Ｇ抗体５哩と西洋ワサビ由来のベルオキに シダーゼ（東洋紡製）５〜とをＰ、に、Ｎａ客ａｎｅら
の方法（Ｎａ１ａｎｅ　、　Ｐ、に、　ａｎｄ　Ｋａｗ
ａｏｉ　、　Ａ、、　Ｊ、Ｈ１ｓｔｏｃｈｅｍ＋Ｏｙｔ
ｏｏｈｅｍ、、２２．１０８４〜１０９１　（１９７４
）ｔ　Ｎａ１ａｎｅ。

Ｐ、に、　ｉ　ＭｅｔｈｌＬｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、
　３７，１３３〜１３６（１９７５））により結合させ
、セファデックスＧ−２００でゲル濾過を行い、高活性
画分を複合体として得た。・このようにして得た複合体
を牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液で５００倍に希
釈し、実施例１のｅに記載した複合体の替りに用いてＨ
ＯＧの測定を行った。

第１図に比較例と実施例１におけるＨＯＧの検量線を示
した。第１図から、本発明方法では測定のバンクグラン
ド値が低く、感度が著しく高くなっていることが明らか
である。

実施例　２ 実施例１の抗ＨＯＧ抗体の替りに抗ＨＯＧ−β−サブユ
ニット抗体を用い、被測定検体としてＨＣＧの替りに５
ＨＯＧのβ−サブユニットを用いた以外は実施例１と同
様にしてＨＣＧのβ−サブこの時の結果を第２図に示し
た。第２図からも、本発明方法では測定のバックグラン
ド値が低く〜比較例に比べて著しく高い感度を有してい
ることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法と比較例とにおけるＨＣＧの検量線
を示し一第２図は本発明方法によるＨｅＧのβ−サブユ
ニットの検量線と比較例とを示したグラフである。第１
，２図において、０−０は本発明方法を示し〜・−・は
比較例の方法を示す。 特許出願人　東洋紡績株式会社 亮１ａ 第２図 ｎｇ／ｍｆｆｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下ＨＯＧと・
   略す）に対して特異的に結合する抗体および／またはＨ
   ＣＧに対して特異的に結合する抗体の７ラグメントを結
   合させた同相と、ＨＯＧに対して特異的に結合する抗体
   の７ラグメントに酵素を結合させた複合体と・前記酵素
   の活性を測定する基質とからなることを特徴とするＨＣ
   Ｇの酵素免疫測定用試薬組成物二 （２）ＨＣＧがＨＣＧのβ−サブユニットである特許請
   求の範囲第１項記載の試薬組成物。 （８）酵素が西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼである
   特許請求の範囲第１項記載の試薬組成物。 （４）ＨＣ！Ｇに対して特異的に結合する抗体および／
   またはＨＣＧに対して特異的に結合する抗体のフラグメ
   ントを固相に結合させ、前記同相にＨＣＧを含む被検液
   を反応させた後、必要により前記同相を洗浄し、前記固
   相に、ＨｃＧに対して特休を洗浄で除き１前記固相に結
   合した複合体の酵素活性を測定するか−または洗浄液中
   の結合しなかった前記複合体の酵素活性を測定すること
   を特徴とするＨＯＧの酵素免疫測定方法。 （５）ＨＯＧがＨＣＧのβ−サブユニットである特許請
   求の範囲第４項記載の方法。 （６）＃素が西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼである
   特許請求の範囲第４項記載の方法。