JPS62163694A - 宿生バチルス属微生物の異種構造形質転換方法 - Google Patents
宿生バチルス属微生物の異種構造形質転換方法Info
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- JPS62163694A JPS62163694A JP61308944A JP30894486A JPS62163694A JP S62163694 A JPS62163694 A JP S62163694A JP 61308944 A JP61308944 A JP 61308944A JP 30894486 A JP30894486 A JP 30894486A JP S62163694 A JPS62163694 A JP S62163694A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
すべての細胞の遺伝情報は、有機体の染色体中のデオキ
シリボ核酸（ＤＮＡ）中に貯蔵されていることはよく知
られている。遺伝機能の単位、すなわち、特定の遺伝形
質（ｂｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｔｒａｉｔ）に関連する
染色体上の座は遺伝子と呼ばれる。
シリボ核酸（ＤＮＡ）中に貯蔵されていることはよく知
られている。遺伝機能の単位、すなわち、特定の遺伝形
質（ｂｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｔｒａｉｔ）に関連する
染色体上の座は遺伝子と呼ばれる。
組換えＤＮＡ技術は、遺伝物質（遺伝子、またはＤＮＡ
断片）を１つの有様体から第２の有機体へ、「ベクター
（υｇｃｔｏデ）」と表示される成分によって移送し、
遺伝ｖＡ質の組み合わせを生成することを含む。第２肩
伎体（移送された遺伝物質を含１′する）は、組換え成
分と表示される。次いで、組換え成分は、バクテリアお
よび動物訓胞にそう人され、°組換え成分中に含有され
る組み合わされた遺伝子を伝える。組換え成分を挿入す
る細胞は宿主と表示される。
断片）を１つの有様体から第２の有機体へ、「ベクター
（υｇｃｔｏデ）」と表示される成分によって移送し、
遺伝ｖＡ質の組み合わせを生成することを含む。第２肩
伎体（移送された遺伝物質を含１′する）は、組換え成
分と表示される。次いで、組換え成分は、バクテリアお
よび動物訓胞にそう人され、°組換え成分中に含有され
る組み合わされた遺伝子を伝える。組換え成分を挿入す
る細胞は宿主と表示される。
ベクターの１の型は１バクテリアを感染するビールスで
るるバクテリオファージからなる。典型的なバクテリオ
ファージは、タンパク質被膜中に囲まれた核酸から成る
。
るるバクテリオファージからなる。典型的なバクテリオ
ファージは、タンパク質被膜中に囲まれた核酸から成る
。
組換えＤＮＡ技術を絹いると１遺伝改質（ｇｓｎｇ−１
ｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｌを、次のようにして
達成できる。バクテリオファージからの特定のＤＮＡお
よびバクテリアからの特定の、ＤＮＡは、たとえば、適
当な制限酵素で処理することによシ、めるいは他のよく
知られた技術によシ、「単離」される。
ｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｌを、次のようにして
達成できる。バクテリオファージからの特定のＤＮＡお
よびバクテリアからの特定の、ＤＮＡは、たとえば、適
当な制限酵素で処理することによシ、めるいは他のよく
知られた技術によシ、「単離」される。
この制限−ＲＺは、「化学的メス」として作用してＤＮ
Ａ分子を、各々が１〜１０よシ小の遺伝子を通常含有す
る特定の断片に分割する。次いで、所望の遺伝特性のた
めのＤＮＡ断片げｒαｇｔｎｇｎｔ）、すなわち、バク
テリア源からの「異種げＯｒｇｉｇｎ）ＤＮＡＪｆＤＮ
Ａバクテリオファージベクターへそう入する。ＤＮＡＩ
）ガーゼで処理することにより、ＤＮＡＶｆｒ片はバク
テリア１−７７−ジｆ）ＨＡ中にそう人され、そして組
換えバクテリオファージＤＮＡ分子は形成される。組換
えバクテリオファージは、バクテリオファージの遺伝子
プラスそう入された断片からの膚しい遺伝子（異種ＤＮ
Ａ）を含有する。この咀換えバクテリオファージを宿主
バクテリアへ導入し、これによって異種ＤＮＡを宿主に
クローン（ｄａｙ）することができる。新らしい遺伝子
は遺伝され、そしてバクテリア宿主の爪伝俵摘の一部分
となる。こうしてバクテリア債主は、新らしい遺伝子に
寄与された遺伝形質１ｇｇ訓ｔｉｃ ｔｒａｉｔ）を
獲得し、そしてこれらの形質「衣わす（ｅｘｐｒｌｌｓ
ｓ）Ｊことができる。
Ａ分子を、各々が１〜１０よシ小の遺伝子を通常含有す
る特定の断片に分割する。次いで、所望の遺伝特性のた
めのＤＮＡ断片げｒαｇｔｎｇｎｔ）、すなわち、バク
テリア源からの「異種げＯｒｇｉｇｎ）ＤＮＡＪｆＤＮ
Ａバクテリオファージベクターへそう入する。ＤＮＡＩ
）ガーゼで処理することにより、ＤＮＡＶｆｒ片はバク
テリア１−７７−ジｆ）ＨＡ中にそう人され、そして組
換えバクテリオファージＤＮＡ分子は形成される。組換
えバクテリオファージは、バクテリオファージの遺伝子
プラスそう入された断片からの膚しい遺伝子（異種ＤＮ
Ａ）を含有する。この咀換えバクテリオファージを宿主
バクテリアへ導入し、これによって異種ＤＮＡを宿主に
クローン（ｄａｙ）することができる。新らしい遺伝子
は遺伝され、そしてバクテリア宿主の爪伝俵摘の一部分
となる。こうしてバクテリア債主は、新らしい遺伝子に
寄与された遺伝形質１ｇｇ訓ｔｉｃ ｔｒａｉｔ）を
獲得し、そしてこれらの形質「衣わす（ｅｘｐｒｌｌｓ
ｓ）Ｊことができる。
組換え技術の研究において、形質転換した＊ｉｌｌ胞を
「スクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ月し、そして所
望の送伝素質を獲得した、すなわち、生活力のある形質
転換物質（宿主）を送択することができるようにすると
き１手におえない仕事に直面した。
「スクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ月し、そして所
望の送伝素質を獲得した、すなわち、生活力のある形質
転換物質（宿主）を送択することができるようにすると
き１手におえない仕事に直面した。
めるバクテリアの株において−「−次の」退択手取が・
σ在し・たとえば・形質転化したバクテリアがある抗生
物質ＶＣ対して抵抗性でおる場合、バクテリアをこのよ
うな抗生物質の存在で培！１！きすることができ−そし
て生存する細胞を生活力のめる形質転換物質として退択
できる。この方法は、バクテリアの生存に対してきわめ
てＸ要な遺伝子を含み、−次垣択と衣示さｎる。これと
対照的に、バクテリアの生存、たとえば、＋；４１１
ｔｋｌ外−系、たとえば、α−アミラーゼ、プロテアー
ゼ類、セルラーゼ駅およびセミセルラーゼｙＡの生産に
対して重要ではない遺伝形質は、−次込択を基準にして
辿ぶことはできない。こうして、−次逮択が存在しない
：、巨伝転子クローニング（ｃ ｌ ｏｎ ｉｎｇ ）
Ａらびに一次遠択が存在する遺伝子のクローニングの両
方に適用できる、組換え技術の方法が要求されている。
σ在し・たとえば・形質転化したバクテリアがある抗生
物質ＶＣ対して抵抗性でおる場合、バクテリアをこのよ
うな抗生物質の存在で培！１！きすることができ−そし
て生存する細胞を生活力のめる形質転換物質として退択
できる。この方法は、バクテリアの生存に対してきわめ
てＸ要な遺伝子を含み、−次垣択と衣示さｎる。これと
対照的に、バクテリアの生存、たとえば、＋；４１１
ｔｋｌ外−系、たとえば、α−アミラーゼ、プロテアー
ゼ類、セルラーゼ駅およびセミセルラーゼｙＡの生産に
対して重要ではない遺伝形質は、−次込択を基準にして
辿ぶことはできない。こうして、−次逮択が存在しない
：、巨伝転子クローニング（ｃ ｌ ｏｎ ｉｎｇ ）
Ａらびに一次遠択が存在する遺伝子のクローニングの両
方に適用できる、組換え技術の方法が要求されている。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ （バチルス）祠はほば４８の橿を含
有する。冥際上これらの糧のすべては、親の生賀地のも
とで、種々の内浴性Ｊｌ施外ｒ４系を分泌する。
有する。冥際上これらの糧のすべては、親の生賀地のも
とで、種々の内浴性Ｊｌ施外ｒ４系を分泌する。
ざらに、後述するように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ微生物も細
胞（ハ）の酵承および抗生物質を合成する。Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ微生物の利用は、医栗および一造のような徨々の
分野において工菓的Ｍ要・注會有するようになった。
胞（ハ）の酵承および抗生物質を合成する。Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ微生物の利用は、医栗および一造のような徨々の
分野において工菓的Ｍ要・注會有するようになった。
Ｂαｃｉｌ１％８のほかの工業的利用は、組換え技術を
ｆ四相して、ｈ「望の遺伝形質を符号化（ｇｚｚｃｏｄ
Ｉｇｌするいろいろなりαｃｉｌｌｕｓ遺伝子を異なる
Ｂαｃｉｌｉｕｍ微生′吻、たとえば、Ｅ、５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ中にそう人できるようにすることによって、提供
できる。
ｆ四相して、ｈ「望の遺伝形質を符号化（ｇｚｚｃｏｄ
Ｉｇｌするいろいろなりαｃｉｌｌｕｓ遺伝子を異なる
Ｂαｃｉｌｉｕｍ微生′吻、たとえば、Ｅ、５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ中にそう人できるようにすることによって、提供
できる。
Ｂａａｓ ｌ １１Ｌｓ 株においてα−アミラーゼを
符号化“よたは調光する遺伝子の、Ｂ、 ｓｗｂｔｉ
ｌｉｓ中への尋人は、これらの株が十分に密接な１３・
ｄ係をもつとき、すなわち、２つの株の闇に広範な遺伝
の相同が存在するとき、ＩＪ］ｌ’１Ｍであることは知
られている。
符号化“よたは調光する遺伝子の、Ｂ、 ｓｗｂｔｉ
ｌｉｓ中への尋人は、これらの株が十分に密接な１３・
ｄ係をもつとき、すなわち、２つの株の闇に広範な遺伝
の相同が存在するとき、ＩＪ］ｌ’１Ｍであることは知
られている。
これは相同クローニング（ｈｏｍｏｌｏｇｏｖ、ｓ ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）と呼ばれる。たとえば、Ｊ、Ｂａｃｔｇ
ｒｉｏｌ １２０ ：１１２２−１１５０（１９７４）
は、きわめて高いα−アミラーゼ活性を臂するＢ、
ｓｗｂｔｉｌｉｓｖａｒ ａｍｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉ
ｔｕｓからのＤ ＮＡ ’ｆ比較的低いα−アミラーゼ
活性を、ｒＪする遺伝的にＤｉｌ似する（相同）イ奴住
′吻１ｊ、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｖｆａｒｂｕｒｇ 中
に４・、（入することをム己？、祝している。この）多
質１；云換された微生物は、獲得した高いα−アミラー
ゼ活性を生成港友。
ｌｏｎｉｎｇ）と呼ばれる。たとえば、Ｊ、Ｂａｃｔｇ
ｒｉｏｌ １２０ ：１１２２−１１５０（１９７４）
は、きわめて高いα−アミラーゼ活性を臂するＢ、
ｓｗｂｔｉｌｉｓｖａｒ ａｍｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉ
ｔｕｓからのＤ ＮＡ ’ｆ比較的低いα−アミラーゼ
活性を、ｒＪする遺伝的にＤｉｌ似する（相同）イ奴住
′吻１ｊ、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｖｆａｒｂｕｒｇ 中
に４・、（入することをム己？、祝している。この）多
質１；云換された微生物は、獲得した高いα−アミラー
ゼ活性を生成港友。
しかしながら、＃１とんどのＢαｃｉｌ１１ＬｓはＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓに十分に関係づけられず、すなわち・
十分に相同でなく、１つのＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ株から得られたＤＮＡを異なるＢａｃｉｌｈｂ
ｓ中に十分に導入することができない。Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏ１１１１ニア０５−７１６（１９７２）。
十分に相同でなく、１つのＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ株から得られたＤＮＡを異なるＢａｃｉｌｈｂ
ｓ中に十分に導入することができない。Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏ１１１１ニア０５−７１６（１９７２）。
文献ＣＫａｗａｍｕｒａ、 ｇｔ ａｌ、 ： Ｇｇｎ
ｔｔ ５ ： ８７−９１ （１９７９）］は、ＤＮ／
ｌのバクテリオファージベクター中への２厚入を同、泳
に君゛む組、央えＤＮＡ技術を記框している。Ｋａｗａ
ｍｕｒａ ｇｔ ａｌ、は、染色体ＤＮ１１断片（ｉ−
６千形の（ｄｇｆｇｃｔ ｉｖｇ） Ｂ、 ５ｕｂｔ
ｉ−１ｉｓバクデリオフアージから導入し、そして単離
シｆＣＤ Ｊｖ’ Ａ ｆ 他のバクテリオファージへ
そう人して組換えバクテリオファージ’ｄ： ’Ｅ成す
ること（！−開示している。次いでｓ ＋Ｊ？Ａえバク
テリオファージをＢｓ ５ｕｂｔｉｔｉｓ微生物の形質
転換に使用し、そして形質転換′勿ケ４を普通の技術に
よシ選択した。
ｔｔ ５ ： ８７−９１ （１９７９）］は、ＤＮ／
ｌのバクテリオファージベクター中への２厚入を同、泳
に君゛む組、央えＤＮＡ技術を記框している。Ｋａｗａ
ｍｕｒａ ｇｔ ａｌ、は、染色体ＤＮ１１断片（ｉ−
６千形の（ｄｇｆｇｃｔ ｉｖｇ） Ｂ、 ５ｕｂｔ
ｉ−１ｉｓバクデリオフアージから導入し、そして単離
シｆＣＤ Ｊｖ’ Ａ ｆ 他のバクテリオファージへ
そう人して組換えバクテリオファージ’ｄ： ’Ｅ成す
ること（！−開示している。次いでｓ ＋Ｊ？Ａえバク
テリオファージをＢｓ ５ｕｂｔｉｔｉｓ微生物の形質
転換に使用し、そして形質転換′勿ケ４を普通の技術に
よシ選択した。
染色体ＤＮＡはＨｊｅノＨ，５ｕｂｔｉｌｉｓバクテリ
オ７７−ジから得ｆｃ （１） テ、ＤＮＡ ノＢ、５
ｕｂｔｉｌｉｓ微住物中へのそう人は相同形質転換を包
含した。
オ７７−ジから得ｆｃ （１） テ、ＤＮＡ ノＢ、５
ｕｂｔｉｌｉｓ微住物中へのそう人は相同形質転換を包
含した。
前避の先行技術の参考書はいずれも、異種ＤＮＡをＢ、
５ｉｃｂｔｉｌｉｓバクテリオフアージ甲に尋人し
て、遺・云子の異種構造のクローニングに使用できる凪
換えバクテリオファージを生成する方法を開示していな
い。
５ｉｃｂｔｉｌｉｓバクテリオフアージ甲に尋人し
て、遺・云子の異種構造のクローニングに使用できる凪
換えバクテリオファージを生成する方法を開示していな
い。
本９６すＪは１．医換えバクテリオファージ、それを生
成し、扇釈する方法、および遺伝的に異種’ｈ°４造（
ｈｅ ｔｇｒｏｌｏｇｏｗｓ）のＢαｃ ｉｌ １１Ｌ
ｓ宿主微生物において所望の遺伝形質を生合成するとき
有効な異種ＤＮＡ′ｔ−異種構造ク異種構造クロガング
関する。
成し、扇釈する方法、および遺伝的に異種’ｈ°４造（
ｈｅ ｔｇｒｏｌｏｇｏｗｓ）のＢαｃ ｉｌ １１Ｌ
ｓ宿主微生物において所望の遺伝形質を生合成するとき
有効な異種ＤＮＡ′ｔ−異種構造ク異種構造クロガング
関する。
組換えバクテリオファージを生成し、選択する方法は、
所望の遺伝形＊質を符号化する遺伝子断片を得、バクテ
リオファージからＤ ｊＶ’ Ａ ’ｆ（片を単印し、
遺伝子断片をＤＮＡ断片と連結して・ｍ換え分子を含有
する混合物を生成し、この混合物を、所望のうｈ公子断
片を含有しないあ２Ｂａｃｉｌｌｒｂｓ微生物からのＤ
ＮＡで培養し、Ｊｇ ２ Ｂａｃｉｌ １１ｂｓ微生物
は宿主Ｅａｃｉｌｌｕｓ微生物との実質的な遺伝子相同
を有し、そして生育必要物質について原始栄養性でるる
、そしてこの混合！：ｕを、バクテリオファージに対し
て石原性であシかつ生育必要物質について栄賽要素性で
ある宿主ＢαｃｉｌムＳ微生物で培養し−Ｃ１生゛ｎ必
要物質について原始栄、ｄｌ性であシ、所望の、■換え
バクテリオファージについて溶原住でめシ、かつバクテ
リオファージ内に該所望の遺伝形質を含有する、形質、
艇換宿主Ｂａｃｉｌｌｕｓを含有する混合・吻を生成す
ることからなる。形質伝漠した宿主Ｂαｃｉｌ’ｌｕ８
は１混合吻を、生育必要物質を含まない生育培地で、生
育させ、そして所望の遺伝形質の存在について決足する
ことによって、選択する。所望の遺伝形質を含有する組
換えバクテリオファージを、１Ｎ主Ｂａｃｉｌｌｕｓの
誘発（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）により回収する。Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ−１ｉｓ１月換えバクテリオファ
ージψ３Ｔ（ＡＴＣＣ３ｔｓｓｓ−Ｂｔ）は特許ｔｍＸ
されている。生成されたバクテリオファージは、宿主Ｂ
αｃｉｌｈｔｓをバクテリオファージで感染することに
より、異棟自°イ造の形質転換に２いて１更用できる。
所望の遺伝形＊質を符号化する遺伝子断片を得、バクテ
リオファージからＤ ｊＶ’ Ａ ’ｆ（片を単印し、
遺伝子断片をＤＮＡ断片と連結して・ｍ換え分子を含有
する混合物を生成し、この混合物を、所望のうｈ公子断
片を含有しないあ２Ｂａｃｉｌｌｒｂｓ微生物からのＤ
ＮＡで培養し、Ｊｇ ２ Ｂａｃｉｌ １１ｂｓ微生物
は宿主Ｅａｃｉｌｌｕｓ微生物との実質的な遺伝子相同
を有し、そして生育必要物質について原始栄養性でるる
、そしてこの混合！：ｕを、バクテリオファージに対し
て石原性であシかつ生育必要物質について栄賽要素性で
ある宿主ＢαｃｉｌムＳ微生物で培養し−Ｃ１生゛ｎ必
要物質について原始栄、ｄｌ性であシ、所望の、■換え
バクテリオファージについて溶原住でめシ、かつバクテ
リオファージ内に該所望の遺伝形質を含有する、形質、
艇換宿主Ｂａｃｉｌｌｕｓを含有する混合・吻を生成す
ることからなる。形質伝漠した宿主Ｂαｃｉｌ’ｌｕ８
は１混合吻を、生育必要物質を含まない生育培地で、生
育させ、そして所望の遺伝形質の存在について決足する
ことによって、選択する。所望の遺伝形質を含有する組
換えバクテリオファージを、１Ｎ主Ｂａｃｉｌｌｕｓの
誘発（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）により回収する。Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ−１ｉｓ１月換えバクテリオファ
ージψ３Ｔ（ＡＴＣＣ３ｔｓｓｓ−Ｂｔ）は特許ｔｍＸ
されている。生成されたバクテリオファージは、宿主Ｂ
αｃｉｌｈｔｓをバクテリオファージで感染することに
より、異棟自°イ造の形質転換に２いて１更用できる。
所望の、、、＋ａ胞外酵η・≦を符号化する染−、！！
、坏ＤＮＡは、まずＢαｃｉｌｔｉｕｓ微生物から得ら
れ、泗シ轟７＋：制限酵系、たとえば、Ｂｏｇｌｏｂｉ
ｇｉｉ（Ｂｇｌ ｌ １ ）から羊雁した酵素で消化
してＤＮＡを分裂し、そして酵素を不活性化する。ψ３
ＴバクテリオファージからのＤＮＡは、ｕ７１ｉ限酵素
でＩ？ｙＪ録に処理し、そして酵素を不活性化する。次
いで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ微生物知の技術によシ連結して
、組換え分子から成るＤＮＡの連結した混合物を生成す
る。組換え分子混合イ勿は、染色体ＤＮＡ断片・バクテ
リオファージ断片およびバクテリオファージ断片へ連斎
した染色体断片から成る不規則に連鎖した混合物を含有
する。〔プ照Ｊ、Ｂａｃｔｇｒｉｏｌ １２１ ：
３５４−３０２（１９７５）〕。
、坏ＤＮＡは、まずＢαｃｉｌｔｉｕｓ微生物から得ら
れ、泗シ轟７＋：制限酵系、たとえば、Ｂｏｇｌｏｂｉ
ｇｉｉ（Ｂｇｌ ｌ １ ）から羊雁した酵素で消化
してＤＮＡを分裂し、そして酵素を不活性化する。ψ３
ＴバクテリオファージからのＤＮＡは、ｕ７１ｉ限酵素
でＩ？ｙＪ録に処理し、そして酵素を不活性化する。次
いで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ微生物知の技術によシ連結して
、組換え分子から成るＤＮＡの連結した混合物を生成す
る。組換え分子混合イ勿は、染色体ＤＮＡ断片・バクテ
リオファージ断片およびバクテリオファージ断片へ連斎
した染色体断片から成る不規則に連鎖した混合物を含有
する。〔プ照Ｊ、Ｂａｃｔｇｒｉｏｌ １２１ ：
３５４−３０２（１９７５）〕。
組換えＬＡＭＡ分子の混合吻°ヲ、第２ Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ依生物から単一したＤ ｉＶ’ Ａで・そして宿王
Ｂαｃｉ−１ｈｔｓ微生物で培う、！した。冶：・ノの
ｌ１ｊｊ序（］−父えることかでさる。宿主Ｂα（ｉｌ
ｌｌｂＳは捉用するバクテリオファージに対して浴原′
：庄でのシ・セして゛また生育必要物質について栄養要
求：生でりる。；、＋４２Ｂａｃｉｔ１ｗｓ ％ｔ、ｊ
生物は組み込む＜ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｇ）べ＠遺伝子
断片を含有せず、宿主Ｂαｃｉｌｌｕｓと実質的に遺伝
ン１伯同でめシ、そして生胃必１９：吻負につ（ｈｇｔ
ｇｒｏｌｏｇｏｕｓｌの微生！＋勿のｘｌｔ念は、よく
知られておシ、そしてｊ、Ｂａｃｔｇｒｉｏｌ、 １１
１ ： ７０５−７１６（１９７２））に５いて考祭さ
れ−Ｃいる。
ｕｓ依生物から単一したＤ ｉＶ’ Ａで・そして宿王
Ｂαｃｉ−１ｈｔｓ微生物で培う、！した。冶：・ノの
ｌ１ｊｊ序（］−父えることかでさる。宿主Ｂα（ｉｌ
ｌｌｂＳは捉用するバクテリオファージに対して浴原′
：庄でのシ・セして゛また生育必要物質について栄養要
求：生でりる。；、＋４２Ｂａｃｉｔ１ｗｓ ％ｔ、ｊ
生物は組み込む＜ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｇ）べ＠遺伝子
断片を含有せず、宿主Ｂαｃｉｌｌｕｓと実質的に遺伝
ン１伯同でめシ、そして生胃必１９：吻負につ（ｈｇｔ
ｇｒｏｌｏｇｏｕｓｌの微生！＋勿のｘｌｔ念は、よく
知られておシ、そしてｊ、Ｂａｃｔｇｒｉｏｌ、 １１
１ ： ７０５−７１６（１９７２））に５いて考祭さ
れ−Ｃいる。
宿主Ｅａｃｉｌ ｈｂｓを生前必要物質について原始栄
棒性である相同Ｌ）ＮＡで培養する工程は、ＤＮＡと反
応することができるＢａｃｉｌｌｕｓ宿主を選択する技
術であシ、それゆえ形質弘湧した宿主微生物を一緒する
。
棒性である相同Ｌ）ＮＡで培養する工程は、ＤＮＡと反
応することができるＢａｃｉｌｌｕｓ宿主を選択する技
術であシ、それゆえ形質弘湧した宿主微生物を一緒する
。
宿主ＢａＣ１１ｈｔｓ中に組み込まれた。Ｓ［ｉ換えバ
クテリオファージのどれが所望の遺伝形質を含有するか
を決足するために、宿主ＢαｃｉｌｌｕｓをスクＩＪ−
ニングしなくてｈ７ｉ：らない。本シロ明の実施例にお
い−Ｃ１宿主ＢａＣ１１ｌｕｓをα−アミラーゼの生成
について、音道のでんぷん−ヨーメ（試験によシスクリ
ーニングする。次いで・組換えバクテリオファージは、
宿主Ｂａｃｉｌｌｕｓから誘発により’？：することが
できる。
クテリオファージのどれが所望の遺伝形質を含有するか
を決足するために、宿主ＢαｃｉｌｌｕｓをスクＩＪ−
ニングしなくてｈ７ｉ：らない。本シロ明の実施例にお
い−Ｃ１宿主ＢａＣ１１ｌｕｓをα−アミラーゼの生成
について、音道のでんぷん−ヨーメ（試験によシスクリ
ーニングする。次いで・組換えバクテリオファージは、
宿主Ｂａｃｉｌｌｕｓから誘発により’？：することが
できる。
実ｌ頓例に記・メする木元１力の蝮１示は・スレオニン
について原始栄養性（Ｔｈｒ＋ ）の相同ｆ） Ｎ’
Ａとスレオニンについて栄：＃女求件（Ｔｈｒ−）の宿
主Ｂａｃｉ−１１ｕｓ微生！１ｌＩＪに使用する。栄養
製水性の生貰必要吻ＪｊｊＬ（ｇｒｏｗｔｈ ｒｇｑｕ
ｉｒｇｍｇｎｔ）の−Ｊ定は１・１ｆ界的でない。他の
アミノｌ−１Ｉ２９Ａまたはプリン刺゛またをコニピラ
ミジン類についての生育必要１質を、適幽な微生物なら
びに抗生物質抵抗物質のような退択ｂ・ジ遺伝形質と一
緒に、、ｅ用できるでめろう。たとえば、過当なアミノ
ＭＤＲの［／ＩＪ Ｉｔｉ 、リシン、チロシン、アラ
ニン、ロイシンおよびセリンでのる。］火当なプリン；
７貞およびピリミジン類の９＋Ｊ ｒｗ二、アデニン、
チミン、クアニン、シトシンおよびチミンでめる。抗生
物質抵抗性の形質の例は、エリスロマイシン、スペクチ
ノマイシンおよびストレプトマイシンに抵抗性の′１勿
質である。
について原始栄養性（Ｔｈｒ＋ ）の相同ｆ） Ｎ’
Ａとスレオニンについて栄：＃女求件（Ｔｈｒ−）の宿
主Ｂａｃｉ−１１ｕｓ微生！１ｌＩＪに使用する。栄養
製水性の生貰必要吻ＪｊｊＬ（ｇｒｏｗｔｈ ｒｇｑｕ
ｉｒｇｍｇｎｔ）の−Ｊ定は１・１ｆ界的でない。他の
アミノｌ−１Ｉ２９Ａまたはプリン刺゛またをコニピラ
ミジン類についての生育必要１質を、適幽な微生物なら
びに抗生物質抵抗物質のような退択ｂ・ジ遺伝形質と一
緒に、、ｅ用できるでめろう。たとえば、過当なアミノ
ＭＤＲの［／ＩＪ Ｉｔｉ 、リシン、チロシン、アラ
ニン、ロイシンおよびセリンでのる。］火当なプリン；
７貞およびピリミジン類の９＋Ｊ ｒｗ二、アデニン、
チミン、クアニン、シトシンおよびチミンでめる。抗生
物質抵抗性の形質の例は、エリスロマイシン、スペクチ
ノマイシンおよびストレプトマイシンに抵抗性の′１勿
質である。
本弛明の方法は１細胞外ｌＪ１素〜則胞内酵素および抗
生物質のような塩体形質を符号化する遺伝子？クローン
するために適する。誦胞外酵素の例は、α−アミラーゼ
類、プロテアーゼ病、セルラーゼ−・ヘミセルラーゼ鎖
、ベニシリナーゼ類およびペクチナーゼ類でめる。訓ノ
厄円酵素の例は・浴ＪイＩＪＸ ｋ４ ％ グルコース
イソメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、？ｊ
ｔｊ限エンドヌクレアーゼおよびデキストラナーゼ類で
める。抗生物質の例は、ニブインＡ、およびす、 ％
バシトラシンＡ１グラミシジンＡ１チロシランおよびブ
チロシンＢでりる。
生物質のような塩体形質を符号化する遺伝子？クローン
するために適する。誦胞外酵素の例は、α−アミラーゼ
類、プロテアーゼ病、セルラーゼ−・ヘミセルラーゼ鎖
、ベニシリナーゼ類およびペクチナーゼ類でめる。訓ノ
厄円酵素の例は・浴ＪイＩＪＸ ｋ４ ％ グルコース
イソメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、？ｊ
ｔｊ限エンドヌクレアーゼおよびデキストラナーゼ類で
める。抗生物質の例は、ニブインＡ、およびす、 ％
バシトラシンＡ１グラミシジンＡ１チロシランおよびブ
チロシンＢでりる。
本シｂ′−Ａの′ツ￥廁′列は、ψ３Ｔバクチリオフア
ーゼの・：Ｚ川を１況１男する。他の適当沈バクテリオ
ファーゼノ例は、Ｓ ＰＯ２Ｃ”；ｉ８ＫＧｇｎｅ ７
： ５１−５８（１９７１））およびｌビｈｏｌｌ（
ｐ １ｌ）Ｃｔａ照Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ２０ ：
５０９−５１９ （１９？ ６ ） ）である。
ーゼの・：Ｚ川を１況１男する。他の適当沈バクテリオ
ファーゼノ例は、Ｓ ＰＯ２Ｃ”；ｉ８ＫＧｇｎｅ ７
： ５１−５８（１９７１））およびｌビｈｏｌｌ（
ｐ １ｌ）Ｃｔａ照Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ２０ ：
５０９−５１９ （１９？ ６ ） ）である。
さら釦、所望の形質を符号化する遺伝子を含有する組換
えバクテリオファージを、ＰＩ３望の形質についての遺
伝情報をすでに含有する宿主Ｂαｃｉｌｌｕｓに導入し
、こうしてその遺伝子の多数の遺伝子コピー、すなわち
、同じ形質についての多数の遺伝子を含有する宿主微生
・物を生成できる。たとえば、α−アミラーゼ遺伝転子
、 ａｍｙｌｏｌｉｑｗｅｆａｃｉｇｎｓＨを含有す
る。！１換えバクテリオファージψ３Ｔは、官能性Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓα−アミラーゼ這云子を含有するＢ、
５ｕｂｔｉｌｉｓに尋人して・一方がＢ・αｔｎｙｌｏ
ｔｉｑｕｇｆａｃｉｇｎｓ Ｂｙ伝転子よシ符号化され
、Ｗ方が、Ｈ０ｓｕｂｔｉｌｉｓ這伝子により符号化さ
れ友、２つのα−アミラーゼ全生成するＢ、５Ｂｂｔｉ
−１ｉｓを生成することができる。
えバクテリオファージを、ＰＩ３望の形質についての遺
伝情報をすでに含有する宿主Ｂαｃｉｌｌｕｓに導入し
、こうしてその遺伝子の多数の遺伝子コピー、すなわち
、同じ形質についての多数の遺伝子を含有する宿主微生
・物を生成できる。たとえば、α−アミラーゼ遺伝転子
、 ａｍｙｌｏｌｉｑｗｅｆａｃｉｇｎｓＨを含有す
る。！１換えバクテリオファージψ３Ｔは、官能性Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓα−アミラーゼ這云子を含有するＢ、
５ｕｂｔｉｌｉｓに尋人して・一方がＢ・αｔｎｙｌｏ
ｔｉｑｕｇｆａｃｉｇｎｓ Ｂｙ伝転子よシ符号化され
、Ｗ方が、Ｈ０ｓｕｂｔｉｌｉｓ這伝子により符号化さ
れ友、２つのα−アミラーゼ全生成するＢ、５Ｂｂｔｉ
−１ｉｓを生成することができる。
前述のように、−次２」択が存在しない遺伝子の組み込
みを含む組換えバクテリオファージの利用ＶＣ関する１
出換え技術り二、所望の徂１ＡえのスフＩＪ −ニンク
において主要な開議全提供する。
みを含む組換えバクテリオファージの利用ＶＣ関する１
出換え技術り二、所望の徂１ＡえのスフＩＪ −ニンク
において主要な開議全提供する。
たとえば、形質１ｉ云禎法が一次ぷ択技術が１字在しな
い遺伝子について試みられる場合、各、１側庖をスクリ
ーニングして起こシうる形質転換を検出しなくてはなら
ない。論理計算はむづかしい。クローニング実験におい
て、合計１０’−１０’の細胞を生育できる。はぼ１０
０の細ｊ逍は、単一のべ） ＩＪ皿上でスクリーニング
のために、培養し、生育できる。こうして、すべての司
１」°ヒな形’１ｍ ’ｋ 換について検査するために
は、１０，０００奴までのペトリ平板上の微生物の培養
およびスクリーニングが必要で必ろう。これと対１ｉｆ
ｔ的に、本発明の方法は、スクリーニングの仕事を看し
く減少するクローニング法を含む。前述の１０’の＋Ｉ
、１ｔｌ砲の代わりに、本発明の方法は、たとえば、１
０’−１０’ の程度の細胞に減少することができる。
い遺伝子について試みられる場合、各、１側庖をスクリ
ーニングして起こシうる形質転換を検出しなくてはなら
ない。論理計算はむづかしい。クローニング実験におい
て、合計１０’−１０’の細胞を生育できる。はぼ１０
０の細ｊ逍は、単一のべ） ＩＪ皿上でスクリーニング
のために、培養し、生育できる。こうして、すべての司
１」°ヒな形’１ｍ ’ｋ 換について検査するために
は、１０，０００奴までのペトリ平板上の微生物の培養
およびスクリーニングが必要で必ろう。これと対１ｉｆ
ｔ的に、本発明の方法は、スクリーニングの仕事を看し
く減少するクローニング法を含む。前述の１０’の＋Ｉ
、１ｔｌ砲の代わりに、本発明の方法は、たとえば、１
０’−１０’ の程度の細胞に減少することができる。
次いで、こｎらの細胞を１００〜２００枚のベトリ皿上
でスクリーニングの１こめ培養し・生育することができ
、これは廼とんど不可能・であったスクリーニングの仕
事を容易に処理できる仕事に！滅する。
でスクリーニングの１こめ培養し・生育することができ
、これは廼とんど不可能・であったスクリーニングの仕
事を容易に処理できる仕事に！滅する。
以下の実施例において、種々の？＆生物をＡｉ’ＣＣ番
号をもつものとして表示する。そのように表示した各微
生物はアメリカン・タイプ・カルチャー−：Ｉ ｖ ク
ショ７ （ｋｔｒｕｔｒｉｃａｎ Ｔ、ｙｐｅ Ｃｓｂ
ｌ−ｔｒｂｒｔｔＣｏｌｌｇｃｔｉｏｎ、ｔｌｏｃｋｖ
ｉｌｌｇ、Ｍａｒｙｌａ７Ｌｄ）に、保管ヲ此し、そし
て各培養＄ニジを一般の人々−二制限なしに入手するこ
とができる。
号をもつものとして表示する。そのように表示した各微
生物はアメリカン・タイプ・カルチャー−：Ｉ ｖ ク
ショ７ （ｋｔｒｕｔｒｉｃａｎ Ｔ、ｙｐｅ Ｃｓｂ
ｌ−ｔｒｂｒｔｔＣｏｌｌｇｃｔｉｏｎ、ｔｌｏｃｋｖ
ｉｌｌｇ、Ｍａｒｙｌａ７Ｌｄ）に、保管ヲ此し、そし
て各培養＄ニジを一般の人々−二制限なしに入手するこ
とができる。
実施例Ｉ
Ａ、α−アミラーゼ符号化遺伝子
α−アミラーゼ患伝情報を符号化する染色体ＤＮＡは−
ｉＭ述するようにＨ，ａｍｙｌ ｏｌ ｉｑｕｇ ｆａ
−ｃｉｇｎｓＨＲＵＢ５００ （ＡＴＣＣ３１５９２）
から侍た。〔参照Ｊ、ＶｉｒｏＬ、 １４：１０１３
−Ｂ 、 ’ ａＩｎＬｌｌＬ ｏ Ｌ ｉｑｓｇ ｆ
ａｃ １ｇｎ５ Ｅは、ディフコ−ラボラトリーズ（Ｄ
ｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｄｇｔｒｏｉ
ｔ。
ｉＭ述するようにＨ，ａｍｙｌ ｏｌ ｉｑｕｇ ｆａ
−ｃｉｇｎｓＨＲＵＢ５００ （ＡＴＣＣ３１５９２）
から侍た。〔参照Ｊ、ＶｉｒｏＬ、 １４：１０１３
−Ｂ 、 ’ ａＩｎＬｌｌＬ ｏ Ｌ ｉｑｓｇ ｆ
ａｃ １ｇｎ５ Ｅは、ディフコ−ラボラトリーズ（Ｄ
ｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｄｇｔｒｏｉ
ｔ。
Ａ４ｉｃｈｉｇａｎ）から商品名Ｄｉｆｃｏ Ｐｇｎａ
ｓｓａｙ Ｂｒｏｔｈで商業的に入手できるペプトン培
地の５０〜１００ｍｅ中で生育させ７’ｃａ ３７℃で
振とうしながら約１８時間培養した後、遠心分トルーＶ
Ｃより収穫し、２回洗い、１０ｍ１のチ慢衝液中に再；
諦濁した。このη゛浸億ｊ液は０．１５モルのトリス（
ｇドロキシメチル）アミノメタン塩鹸塩緩ｉｌ：ｊ剤、
シグマ、ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｇｍｉｃａｌ 、
ＳＬ、 Ｌｏｑｂｉｓ、 ｋｉｓｓｏｕｒｉ）から
商品名１’ｒｉｚｍａ Ｂａｓｔｉで入手できる、と０
，１モルのエチレンシアミンチトライＰＵ（ＥＤＴＡ）
からなり・ ｐｌｉｓ、ｏをン角゛した。この１１４１
１ 、！泡）諌１婦液を再び遠心分版し、そして結晶性
卵白リゾチーム（ｌｌｆｆｆ／ｙｄ）ｋさらに含有する
上の緩衝浴液の５ｄ中に３７′Ｇで３０分［田懸濁する
ことＶＣよって溶を加え、この培養液を５０τ；で１０
分間、次いで３７℃で５０分間培培養た。過当な醪簀は
カルビオケＡ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｍｎ、 ｌ：ｔａＪ
ｏｌｌａ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）からＦｒｏｎα８
ｅの部品名で入手できる。ｒｉＡ）泡質膜のタンパク質
錯体を、ＤＮＡから、ラウリル源赦ナトリウムと洗浄剤
、チバーガイギー・コーポレーション（Ｃｉｂａ−Ｇｅ
ｉｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ａｒｄｓｌｇｙ。
ｓｓａｙ Ｂｒｏｔｈで商業的に入手できるペプトン培
地の５０〜１００ｍｅ中で生育させ７’ｃａ ３７℃で
振とうしながら約１８時間培養した後、遠心分トルーＶ
Ｃより収穫し、２回洗い、１０ｍ１のチ慢衝液中に再；
諦濁した。このη゛浸億ｊ液は０．１５モルのトリス（
ｇドロキシメチル）アミノメタン塩鹸塩緩ｉｌ：ｊ剤、
シグマ、ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｇｍｉｃａｌ 、
ＳＬ、 Ｌｏｑｂｉｓ、 ｋｉｓｓｏｕｒｉ）から
商品名１’ｒｉｚｍａ Ｂａｓｔｉで入手できる、と０
，１モルのエチレンシアミンチトライＰＵ（ＥＤＴＡ）
からなり・ ｐｌｉｓ、ｏをン角゛した。この１１４１
１ 、！泡）諌１婦液を再び遠心分版し、そして結晶性
卵白リゾチーム（ｌｌｆｆｆ／ｙｄ）ｋさらに含有する
上の緩衝浴液の５ｄ中に３７′Ｇで３０分［田懸濁する
ことＶＣよって溶を加え、この培養液を５０τ；で１０
分間、次いで３７℃で５０分間培培養た。過当な醪簀は
カルビオケＡ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｍｎ、 ｌ：ｔａＪ
ｏｌｌａ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）からＦｒｏｎα８
ｅの部品名で入手できる。ｒｉＡ）泡質膜のタンパク質
錯体を、ＤＮＡから、ラウリル源赦ナトリウムと洗浄剤
、チバーガイギー・コーポレーション（Ｃｉｂａ−Ｇｅ
ｉｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ａｒｄｓｌｇｙ。
Ｎｇｗ Ｙｏｒｋ）から商品名５ａｒｋｏｓｙ Ｎ Ｚ
７−９７でｉＲ４業的に入手できる、との混合・、勿で
処理することによって、除去した。洗浄剤の最終１浪ノ
屁は、上の洗浄１−ｉｌＪの等郡を−ｎ４成し１約２″
ｌｆ頁／坏槓でのった。
７−９７でｉＲ４業的に入手できる、との混合・、勿で
処理することによって、除去した。洗浄剤の最終１浪ノ
屁は、上の洗浄１−ｉｌＪの等郡を−ｎ４成し１約２″
ｌｆ頁／坏槓でのった。
培％は５０℃において、細ｊ」己質ｊ拠の児全な酵しノ
１λが起こるまで、絖はンζ。次いで、ｌ） Ｎ’Ａ
＋’ｊ ０．１モルノＴｒｉｚｒｎｎ Ｂａ５ｅからな
る≦４ ｍｔ ＞１１で飽和したｐＺ１８．０の再蒸留
したフェノールを用いて、３回６山出した。ＤＮＡを０
．１モルのＮａＣ１および１０ス棒のまわ９に巻き・１
寸け、３回連続して７０πのエタノーノ哨谷）牧牛で洗
い、１ミリモルの１！： Ｄ １’ Ａを含有する１０
ミリモルのＴｒｉｚｔｎａ Ｂα８Ｒ中にｐＨ７，５１
１こおいて再俗解した。このＤＮＡは４°にでクロロホ
ルム上に貯蔵した。
１λが起こるまで、絖はンζ。次いで、ｌ） Ｎ’Ａ
＋’ｊ ０．１モルノＴｒｉｚｒｎｎ Ｂａ５ｅからな
る≦４ ｍｔ ＞１１で飽和したｐＺ１８．０の再蒸留
したフェノールを用いて、３回６山出した。ＤＮＡを０
．１モルのＮａＣ１および１０ス棒のまわ９に巻き・１
寸け、３回連続して７０πのエタノーノ哨谷）牧牛で洗
い、１ミリモルの１！： Ｄ １’ Ａを含有する１０
ミリモルのＴｒｉｚｔｎａ Ｂα８Ｒ中にｐＨ７，５１
１こおいて再俗解した。このＤＮＡは４°にでクロロホ
ルム上に貯蔵した。
次いで、単Ｆ、ニしたＤＮＡを制ｉ我酵累Ｂ、ｇｌｏ−
ｂｉｇｉｉ（Ｂｇｌ ｌ ｌ ）で消化してｌ） Ｎ
Ａ７ｆｃ）ＪＩ］水分解した。Ｅｏｇｔｏｂｉｇｉｉ
はマイシン・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド（
Ｍ’１ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓｓ。
ｂｉｇｉｉ（Ｂｇｌ ｌ ｌ ）で消化してｌ） Ｎ
Ａ７ｆｃ）ＪＩ］水分解した。Ｅｏｇｔｏｂｉｇｉｉ
はマイシン・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド（
Ｍ’１ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓｓ。
Ｉｎｃ、 、 Ｅｌｋｈａｒｔ、 Ｉｎｄｉａｎａ）か
ら開業的に入手できる。次いで・Ｂｇ１１１酵累は・
混合物を６８°にに１５分間力ロ熱することによって、
不活性化した。
ら開業的に入手できる。次いで・Ｂｇ１１１酵累は・
混合物を６８°にに１５分間力ロ熱することによって、
不活性化した。
Ｂ、ＪｊＴバクテリオファージの調製および単離１史用
したバクテリオファージはψ３Ｔであシ、まずＴｕｃｋ
ｔ、ｒ、 Ｊ、 Ｇｇｔｔ、 Ｖｉｒｏｌ、
４ ： ４８９−５０４ （１９６９）に記載されてい
るようにして単離した。便用したψ３Ｔは、後述するよ
うにバクテリア株ＲＵＢ８３０（ψ３Ｔ）を生育するこ
とによって侍た。ＲＵＢ８３０ψ３Ｔは以前に記載され
ており 〔Ｊ、ＶｉｒＯｌ、 ２１ ： ５２２−５
２９（１９７７）：）、そしてＷｉｌｓｏｆＬおよびＹ
ｏ ｕｎｇの個人のコレクションから入手できる。
したバクテリオファージはψ３Ｔであシ、まずＴｕｃｋ
ｔ、ｒ、 Ｊ、 Ｇｇｔｔ、 Ｖｉｒｏｌ、
４ ： ４８９−５０４ （１９６９）に記載されてい
るようにして単離した。便用したψ３Ｔは、後述するよ
うにバクテリア株ＲＵＢ８３０（ψ３Ｔ）を生育するこ
とによって侍た。ＲＵＢ８３０ψ３Ｔは以前に記載され
ており 〔Ｊ、ＶｉｒＯｌ、 ２１ ： ５２２−５
２９（１９７７）：）、そしてＷｉｌｓｏｆＬおよびＹ
ｏ ｕｎｇの個人のコレクションから入手できる。
高い力ｉ＋ｉｆｉの７ｊＵＢ８３０（ψ３Ｔｌｉ、ＲＵ
Ｂ８３０を生育培地（表示Ｍ）中で３２で；において５
０クレツト（Ｋｌｇｔｔ）単位（Ｋｌｇｔｔ−８ｗｍｍ
ｇｒｓｏｎＣｏｌｏｒｉｍｇｔｓｒ、 フィルターＪ
／ｉ ６６ ）の密度に生育し、ミドマイシンＣ（最終
像Ｊｉ０．５ ／’ Ｐ ／ ｍｅ ）で誘発すること
によってつ（；・た。Ｍ培地は、１０７のカゼインのパ
ンクレアチン消化’ｉ／ＩＪ 、ディフコ・ラボラトリ
ーズ（Ｄｉｆｃ、ｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓｓ、 Ｄ
ｇｔｒｏｉｔ。
Ｂ８３０を生育培地（表示Ｍ）中で３２で；において５
０クレツト（Ｋｌｇｔｔ）単位（Ｋｌｇｔｔ−８ｗｍｍ
ｇｒｓｏｎＣｏｌｏｒｉｍｇｔｓｒ、 フィルターＪ
／ｉ ６６ ）の密度に生育し、ミドマイシンＣ（最終
像Ｊｉ０．５ ／’ Ｐ ／ ｍｅ ）で誘発すること
によってつ（；・た。Ｍ培地は、１０７のカゼインのパ
ンクレアチン消化’ｉ／ＩＪ 、ディフコ・ラボラトリ
ーズ（Ｄｉｆｃ、ｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓｓ、 Ｄ
ｇｔｒｏｉｔ。
Ｍｉｃｈｉｇａｎ）からＥａｃｔｏ−’Ｉ’ｒｙｐｔ
ｉｎｎのｍ品名で商業的に入手できる；５ｙ−の酵母油
出物： ９．９ ＰのＮαＣｌ：および１．ＱＯＯｍｇ
の蒸留水を含有した。
ｉｎｎのｍ品名で商業的に入手できる；５ｙ−の酵母油
出物： ９．９ ＰのＮαＣｌ：および１．ＱＯＯｍｇ
の蒸留水を含有した。
この混合物をオートクレーブ処理し、５ゴの１モルのＭ
ＱＣＩ、および０．１モルのＭＭＣ〜の滅繭溶液を加え
次。
ＱＣＩ、および０．１モルのＭＭＣ〜の滅繭溶液を加え
次。
次いで、このＲＵＢ８３０（ψａ２’）バクテリオファ
ージをＢｇｔ ｌ ｌ制限酵素で消化してＤＮＡ’ｔ
７ＪＩ］水分解した。次いで、ＥにＩｔ １１酵素は混
合物を６０℃に１５分間〃０熱することによって不活性
化し゛た。
ージをＢｇｔ ｌ ｌ制限酵素で消化してＤＮＡ’ｔ
７ＪＩ］水分解した。次いで、ＥにＩｔ １１酵素は混
合物を６０℃に１５分間〃０熱することによって不活性
化し゛た。
ＨｏａｔｎｙｌｏｌｉｑｕｇｆａｃｉｇｎｓＨからのＤ
ＮＡとψ３Ｔを合わせ、後述するように連結した。〔さ
）ｌ＠、Ｊ、 ＢａｃｔｔｔｒｉｏＬ １２１：
３５４−３６２（１９７５））。
ＮＡとψ３Ｔを合わせ、後述するように連結した。〔さ
）ｌ＠、Ｊ、 ＢａｃｔｔｔｒｉｏＬ １２１：
３５４−３６２（１９７５））。
Ｃ０連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）法
リガーゼ反応は１００μＬの最終体積において笑Ｍｈし
た。Ｂ、 ａｍｙｔｏｌｉｑｗｇｆａｃｉｔ、ｎｓＥ
から単障したＤＮＡおよびψ３Ｔバクテリオファージｔ
−鴻に混合し、氷の上に１置き、そして次の成分を加え
た：５０５０ミリのＭｇＣ１（１０μＬ）：０．１モル
のジチオエリスリトール（１０ｐｔ）：Ｑ、５ミリモル
のアデノシントリホスフェート（１０μｔ）；水（２０
μｔ）；およびＤＮＡリガーゼ（ｘＵ／ａｙＤＮＡ）。
た。Ｂ、 ａｍｙｔｏｌｉｑｗｇｆａｃｉｔ、ｎｓＥ
から単障したＤＮＡおよびψ３Ｔバクテリオファージｔ
−鴻に混合し、氷の上に１置き、そして次の成分を加え
た：５０５０ミリのＭｇＣ１（１０μＬ）：０．１モル
のジチオエリスリトール（１０ｐｔ）：Ｑ、５ミリモル
のアデノシントリホスフェート（１０μｔ）；水（２０
μｔ）；およびＤＮＡリガーゼ（ｘＵ／ａｙＤＮＡ）。
この反応混合ｑ９１Ｊを氷上で１４℃において１２時間
培養した。
培養した。
通換え分子を含有するフ呈結した混合Ｃ吻を、Ｂ。
ｓｕｂ ｔｉ Ｌ ｉｓ微午吻からの染色体１）ＨＡで
培萎して、バクテリオファージベクターを生成した。こ
の微生吻は宿王νＣ対して相同であるが・宿王Ｂａｃｉ
ｌｌｒｔｓが栄養要求性である、ＬＥ青必要切質につい
て原始栄：４性でりる。
培萎して、バクテリオファージベクターを生成した。こ
の微生吻は宿王νＣ対して相同であるが・宿王Ｂａｃｉ
ｌｌｒｔｓが栄養要求性である、ＬＥ青必要切質につい
て原始栄：４性でりる。
上のＣからの４漠え分子を含；１ｆする混合物の１００
μｔを、Ｈ，５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＵ Ｅ ２００（Ａ
ＴＣＣ３１５９３）ＤＮＡの１００μｔ（１岬）で培−
Ｃした。１２Ｕ Ｂ ２００は、スレオニンについて原
始栄養性でめシ（ηｌは寺）、そしてα−アミラーゼ生
合成に欠ける（Ａｍｔｔ−）株である。
μｔを、Ｈ，５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＵ Ｅ ２００（Ａ
ＴＣＣ３１５９３）ＤＮＡの１００μｔ（１岬）で培−
Ｃした。１２Ｕ Ｂ ２００は、スレオニンについて原
始栄養性でめシ（ηｌは寺）、そしてα−アミラーゼ生
合成に欠ける（Ａｍｔｔ−）株である。
９１組換えバクテリオファージの形質転換およびノ’ａ
択 上からの全混合！ｉｌ （２００ｐ ｔ ） ｉ、Ｂ、
５ｕｂ−ｔｉｌｉｓｉ１！ＵＢ ２０１、（ＡＴＣＣ３
１５９４）の宿主株の１００μｔで肩癖した。宿主ＲＵ
Ｂ２ＣＨはスレオニンについて栄壌要求性（Ｔｈｒ−）
でめ９・そしてバクテリオファージψ３Ｔについて溶原
性である（後に説明する）。培養は通気しながら３７℃
において０．５時間実′１Ｊｉｓ した。
択 上からの全混合！ｉｌ （２００ｐ ｔ ） ｉ、Ｂ、
５ｕｂ−ｔｉｌｉｓｉ１！ＵＢ ２０１、（ＡＴＣＣ３
１５９４）の宿主株の１００μｔで肩癖した。宿主ＲＵ
Ｂ２ＣＨはスレオニンについて栄壌要求性（Ｔｈｒ−）
でめ９・そしてバクテリオファージψ３Ｔについて溶原
性である（後に説明する）。培養は通気しながら３７℃
において０．５時間実′１Ｊｉｓ した。
培養した宿主の試料（０，１ｙｔ ）をスビジゼン（Ｓ
ｐｉｚｉｚｇｎ）の最小前の球天の平板（２２ミリモル
のグルコース、２０μＰ ／ ｍｅの各芳香族アミ７Ｋ
、トリプトファン；フェニルアラニン；チロシンおよび
１％の司浴性でんぷんを補充したが、スレオニンを含有
しない）上に広げて、α−アミラーゼ生合成に形質転換
しくＡｙＬ１／” ）そしてスレオニン独立性（１’ｂ
ｒ”）である細胞について選択した。
ｐｉｚｉｚｇｎ）の最小前の球天の平板（２２ミリモル
のグルコース、２０μＰ ／ ｍｅの各芳香族アミ７Ｋ
、トリプトファン；フェニルアラニン；チロシンおよび
１％の司浴性でんぷんを補充したが、スレオニンを含有
しない）上に広げて、α−アミラーゼ生合成に形質転換
しくＡｙＬ１／” ）そしてスレオニン独立性（１’ｂ
ｒ”）である細胞について選択した。
ＴＩ＋ｒ−からＴｈｒ＋に形質転換した、すなわち、ス
レオニン独立性である細胞は、ＤＮＡを組み込むことに
よって形質転換された。これらの細胞のうちから、ある
数のものはａ−７ミラーゼ遺伝子を含む（Ａ＋ａｙ”
）Ｄ Ｎ Ａ断片をも取り上げているであろう。
レオニン独立性である細胞は、ＤＮＡを組み込むことに
よって形質転換された。これらの細胞のうちから、ある
数のものはａ−７ミラーゼ遺伝子を含む（Ａ＋ａｙ”
）Ｄ Ｎ Ａ断片をも取り上げているであろう。
スレオニンの不存在で生活力のあるほば１０’の細胞が
得られた。ｉ”ｌげ“へ形質転換されていない細胞はス
レオニンの不存在で生活力がなく、生存しなかった０次
いで、これらの形質転換物を、ベトリ皿にＩ２溶液をみ
なぎらせることを含む常用技術により、ａ−アミラーゼ
生産についてスクリーニングし、ａ−７ミラーゼー生産
微生物の存在は、このような細胞のまわりに鮮明なハロ
ーが現われることによって示された。 Ｂ、 ０ｕｌＪ
ＥｉｌｉｓＲＵ Ｂ ２０１はＢ、 ５ｕｂＬｉｌｉｓ
ＲＵＢ２０４ （ＡＴＣＣ３１５９４）に形質転換
された。後者はＡｍｙ ＶＣついての遺伝子情報を組み
込んで有する組換え・くクテリオファージψ３Ｔを含有
する。
得られた。ｉ”ｌげ“へ形質転換されていない細胞はス
レオニンの不存在で生活力がなく、生存しなかった０次
いで、これらの形質転換物を、ベトリ皿にＩ２溶液をみ
なぎらせることを含む常用技術により、ａ−アミラーゼ
生産についてスクリーニングし、ａ−７ミラーゼー生産
微生物の存在は、このような細胞のまわりに鮮明なハロ
ーが現われることによって示された。 Ｂ、 ０ｕｌＪ
ＥｉｌｉｓＲＵ Ｂ ２０１はＢ、 ５ｕｂＬｉｌｉｓ
ＲＵＢ２０４ （ＡＴＣＣ３１５９４）に形質転換
された。後者はＡｍｙ ＶＣついての遺伝子情報を組み
込んで有する組換え・くクテリオファージψ３Ｔを含有
する。
７“）ｒｒ＋に形質転換したほぼ１０’ の細ｊ泡のう
ちで、ｌＯより少ない細胞はα−アミラーゼ生産届ｕ）
成に形Ｊλ転換されたことが、決定された。説明した方
法は再現性がある。′ｒ？Ｉ？、明した実施例を反復し
、同１ｊ２な結果が−Ｉ呵られた。α−アミラーゼを生
合成できるは＃ご７つのＴｈｒ形質ζ云・負ミ１勿質が
イτすられた。
ちで、ｌＯより少ない細胞はα−アミラーゼ生産届ｕ）
成に形Ｊλ転換されたことが、決定された。説明した方
法は再現性がある。′ｒ？Ｉ？、明した実施例を反復し
、同１ｊ２な結果が−Ｉ呵られた。α−アミラーゼを生
合成できるは＃ご７つのＴｈｒ形質ζ云・負ミ１勿質が
イτすられた。
ψ３１’ ＆よ「マーカー（ｔＭｙ／ｃｓｒ）ｊ と
して・１吏用できるチミジレートシンセターゼを符号化
する遠転子（Ｔｈｙ Ｐ ３ ） ”ｘ有する。このマ
ーカーｆ ’２用して、クローンしたα−アミラーゼ退
伝転子ψ３Ｔｙマ伝子に［−合（ｌｉｎｋ） Ｊされる
こと、そしてこれらの２つが共形質１１１換されること
を証明できる。
して・１吏用できるチミジレートシンセターゼを符号化
する遠転子（Ｔｈｙ Ｐ ３ ） ”ｘ有する。このマ
ーカーｆ ’２用して、クローンしたα−アミラーゼ退
伝転子ψ３Ｔｙマ伝子に［−合（ｌｉｎｋ） Ｊされる
こと、そしてこれらの２つが共形質１１１換されること
を証明できる。
α−アミラーゼ符号化（ｈｎｙ力Ｂ、 ５ｕｂｔ ｉ
ｌ ｉｓ）＜ＵＢ２０４からのドナーＤＮＡ、バクテリ
オファージψ３Ｔおよび宿主バクテリアとしてＢ。
ｌ ｉｓ）＜ＵＢ２０４からのドナーＤＮＡ、バクテリ
オファージψ３Ｔおよび宿主バクテリアとしてＢ。
ｓｗｂｔｉｌｉｓ ＲＵＢ ２０５ ｔ−用いて、一連
の実験を行った。Ａｍｙ＋を含シ汀する形質壜換吻偵の
おのおのはＴｈ１１である、すなわち、チミジレートシ
ンセターゼを生成−ｔ−る、バクテリオファージψ３Ｔ
を含有することが決延された。これはＡｍｙ＋およびＴ
ｈｙ＋が「７−合」される、すなわち、同じα県断片上
に存在し・それゆえバクテリオファージψ３Ｔ断片の宿
主中へのそう人が所望のＡっｎｖ特注の宿主中への「運
ｊ慮（Ｃαｒｒｙｉｎｇ） Ｊの可能性を増加１−るで
おろうことを証明するので、慧味が必る。換１すると、
異軸ＤＮＡ、たとえば、Ａｍｙ“はψ３Ｔバクテリオフ
ァージ上へ「付加（ｔａｃｌｃ）Ｊされ、セしてψ３Ｔ
バクテリオファージばＡｆｒＬ１／＋を宿主バクテリア
中へ［引き（ｄｒａｙ）Ｊ込む。
の実験を行った。Ａｍｙ＋を含シ汀する形質壜換吻偵の
おのおのはＴｈ１１である、すなわち、チミジレートシ
ンセターゼを生成−ｔ−る、バクテリオファージψ３Ｔ
を含有することが決延された。これはＡｍｙ＋およびＴ
ｈｙ＋が「７−合」される、すなわち、同じα県断片上
に存在し・それゆえバクテリオファージψ３Ｔ断片の宿
主中へのそう人が所望のＡっｎｖ特注の宿主中への「運
ｊ慮（Ｃαｒｒｙｉｎｇ） Ｊの可能性を増加１−るで
おろうことを証明するので、慧味が必る。換１すると、
異軸ＤＮＡ、たとえば、Ａｍｙ“はψ３Ｔバクテリオフ
ァージ上へ「付加（ｔａｃｌｃ）Ｊされ、セしてψ３Ｔ
バクテリオファージばＡｆｒＬ１／＋を宿主バクテリア
中へ［引き（ｄｒａｙ）Ｊ込む。
宿主Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＵＢ ２０１す：ψ３Ｔ
バクテリオファージについて’ｆ４１ＪＫ性でめること
が、初期に示された。さらに・７旭換えノ；クテリオフ
ァージψ３Ｔ ＡＴＣＣ３１５９５−Ｂ１、すなわち
、形質転換された宿主、を含有する形質転換されん宿主
バクテリアは、組換えバクテリオファージψ３Ｔについ
て溶原化である。このことは、形質１：云化された宿主
が休止状態（しかしＡフルｙおよびψ３Ｔバクテリオフ
ァージＤＮＡを符号化する）の組換えバクテリオファー
ジψ３Ｔを含ンぼすることを意味する。普通の技術１：
Ｊ、ＶｉｒｏＬ 、 ２４ ：５２２−５２９ （１
９７７））を・ｉ妃用することにより、組換えバタテリ
オファージψ３Ｔｆ形質転換した宿主から誘発（侃ｒｈ
ｂｃｔｉｏｎ）により回収できる。形′Ｒ転換した宿主
は、休止状態の組換えバクテリオファージψ３Ｔｆ再生
産の植物サイクルに変える。それゆえ、徂僕えバクテリ
オファージを回収し、培養してそれ目体を復製できる。
バクテリオファージについて’ｆ４１ＪＫ性でめること
が、初期に示された。さらに・７旭換えノ；クテリオフ
ァージψ３Ｔ ＡＴＣＣ３１５９５−Ｂ１、すなわち
、形質転換された宿主、を含有する形質転換されん宿主
バクテリアは、組換えバクテリオファージψ３Ｔについ
て溶原化である。このことは、形質１：云化された宿主
が休止状態（しかしＡフルｙおよびψ３Ｔバクテリオフ
ァージＤＮＡを符号化する）の組換えバクテリオファー
ジψ３Ｔを含ンぼすることを意味する。普通の技術１：
Ｊ、ＶｉｒｏＬ 、 ２４ ：５２２−５２９ （１
９７７））を・ｉ妃用することにより、組換えバタテリ
オファージψ３Ｔｆ形質転換した宿主から誘発（侃ｒｈ
ｂｃｔｉｏｎ）により回収できる。形′Ｒ転換した宿主
は、休止状態の組換えバクテリオファージψ３Ｔｆ再生
産の植物サイクルに変える。それゆえ、徂僕えバクテリ
オファージを回収し、培養してそれ目体を復製できる。
さらにに１換えバクテリオファージを・便用して、後述
するように新らしい宿主Ｂａｃｉｌｌｕｓ’生物を感染
できる。
するように新らしい宿主Ｂａｃｉｌｌｕｓ’生物を感染
できる。
実施例２
実施例１に記載するようにして生成した、α−アミラー
ゼ符号化遺伝子を含有する５つのＢ、５ｕｂＬｉｌｉｓ
ＲＵＩ３２０４形質転換体を単離し、単離した形質
転換体にミドマイシンＣを添加し、これにより、上記Ｂ
、 ｓｕＭｉｌｉｓ形質転換体を誘発し、すなわち、溶
原化したバクテリアを刺激して感染７アーノを生成せし
め、そして生成する１３．５ｕｂＬｉｌｉｓ組換えバク
テリオファージφ３′ｒを単離した。
ゼ符号化遺伝子を含有する５つのＢ、５ｕｂＬｉｌｉｓ
ＲＵＩ３２０４形質転換体を単離し、単離した形質
転換体にミドマイシンＣを添加し、これにより、上記Ｂ
、 ｓｕＭｉｌｉｓ形質転換体を誘発し、すなわち、溶
原化したバクテリアを刺激して感染７アーノを生成せし
め、そして生成する１３．５ｕｂＬｉｌｉｓ組換えバク
テリオファージφ３′ｒを単離した。
これらの５つの組換えバクテリオファージの各々を使用
して、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ？ Ｕ １３２０
０の培養物を感染した。ＲＵＢ２００の感染は、ＲＵＢ
２００をＩ３． ！３ｕｂＬｉｌｉｓＪＩｌ換えバクテ
リオ７アージφ３Ｔで３７℃において３０分間通気しな
がら培養することによって、達成した。
して、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ？ Ｕ １３２０
０の培養物を感染した。ＲＵＢ２００の感染は、ＲＵＢ
２００をＩ３． ！３ｕｂＬｉｌｉｓＪＩｌ換えバクテ
リオ７アージφ３Ｔで３７℃において３０分間通気しな
がら培養することによって、達成した。
培養したＲＵＢ２００の試料を、トリプトース血液寒天
平板のペプトン培地に入れ、感染中心、すなわち、ブッ
クを普通の技術［０照Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ。
平板のペプトン培地に入れ、感染中心、すなわち、ブッ
クを普通の技術［０照Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ。
２１：５２２−５２９ （１９７７））により検査した
。
。
溶原函（バクテリア）、州胞はバクテリオファージを含
有する）を、プラク中心から得、でんぷんを含有する培
地で二次培養し、引き続いてα−アミラーゼの生産につ
いて１′ｉ−述のでんぷん−１２Ｆ＝１Ａで試験した。
有する）を、プラク中心から得、でんぷんを含有する培
地で二次培養し、引き続いてα−アミラーゼの生産につ
いて１′ｉ−述のでんぷん−１２Ｆ＝１Ａで試験した。
形成し友溶原−は明確なノ・ロー（ｈａｌｏ）を兆生し
、α−アミラーゼ生産ガ勿の存在を示し、このことによ
り徂崇えバクテリオファージはバクテリア宿主に有効に
そう人されｌζことが示された。
、α−アミラーゼ生産ガ勿の存在を示し、このことによ
り徂崇えバクテリオファージはバクテリア宿主に有効に
そう人されｌζことが示された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）所望の遺伝形質を符号化する遺伝子断片を得
、 （ｂ）バクテリオファージからＤＮＡ断片 を単離し、 （ｃ）工程（ａ）において得られた遺伝子断片を工程（
ｂ）において得られたＤＮＡと連結して、一連の組換え
分子を含有する混合物 を生成せしめ、 （ｄ）工程（ｃ）の混合物を、工程（ａ）において得ら
れた該遺伝子断片を含有しない第２ のバチルス属微生物から単離したＤＮＡと 共にインキュベートし、その際該第２のバ チルス属微生物は宿主バチルス属微生物と の実質的な遺伝子相同を有し、そして生育 必要物質について原始栄養性であり、 （ｅ）工程（ｄ）の混合物を、工程（ｂ）の該バクテリ
オファージに対して溶原性でありか つ該生育必要物質について栄養要求性であ る該宿主バチルス属微生物と共にインキュ ベートして、該生育必要物質について原始 栄養性であり、該所望の組換えバクテリオ ファージについて溶原性であり、かつ該バ クテリオファージ内に該所望の遺伝形質を 含有する、形質転換宿主バチルスを含有す る混合物を生成せしめ、 （ｆ）該混合物を、該生育必要物質を含ま ない生育培地で、生育させ、そして該所望 の遺伝形質の存在について決定することに よって、該形質転換した宿主バチルスを選 択し、そして （ｇ）それから該所望の遺伝特性物質を含 有する該組換えバクテリオファージを、該 原始栄養性の宿主バチルスの誘発により得 る、 工程からなる方法により生産されたバクテリオファージ
で、宿主バチルス属微生物を適当な条件下でインキュベ
ートして、該バクテリオファージを該宿主バチルス属微
生物に挿入して異種構造の形質転換を実施することを特
徴とする、所望の遺伝形質の生合成に欠ける宿主バチル
ス属微生物を、該遺伝形質を生合成できる微生物に異種
構造形質転換する方法。 ２、該宿主バチルスおよび第２のバチルス属微生物がＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓである特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ３、該遺伝子断片がＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉ
ｑｕｅ−ｆａｃｉｅｎｓ Ｈから得られる特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ４、該宿主バチルス属微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ ＲＵＢ２０１（ＡＴＣＣ３１５９４）で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、該生育必要物質がスレオニンである特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ６、該宿主バチルス属微生物からのα−アミラーゼを符
号化するＤＮＡを含有する組換えバクテリオファージφ
３Ｔを誘発し、そしてα−アミラーゼを生合成しない第
２の宿主バチルス属微生物に感染させる追加の工程を包
含する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、該第２の宿主バチルス属微生物が機能的α−アミラ
ーゼを符号化する遺伝子を含有する特許請求の範囲第６
項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11004280A | 1980-01-07 | 1980-01-07 | |
| US110042 | 1980-01-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62163694A true JPS62163694A (ja) | 1987-07-20 |
Family
ID=22330923
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20581A Granted JPS56113293A (en) | 1980-01-07 | 1981-01-06 | Recomoination bacteriophage for anisogenome structure cloning of batilus microorganism and production thereof |
| JP61308944A Pending JPS62163694A (ja) | 1980-01-07 | 1986-12-26 | 宿生バチルス属微生物の異種構造形質転換方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20581A Granted JPS56113293A (en) | 1980-01-07 | 1981-01-06 | Recomoination bacteriophage for anisogenome structure cloning of batilus microorganism and production thereof |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0032238B1 (ja) |
| JP (2) | JPS56113293A (ja) |
| AT (1) | ATE16943T1 (ja) |
| DE (1) | DE3071292D1 (ja) |
| DK (1) | DK3781A (ja) |
| ES (1) | ES8205264A1 (ja) |
| IL (1) | IL61837A (ja) |
| NO (1) | NO159863C (ja) |
| ZA (1) | ZA8142B (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO159863C (no) * | 1980-01-07 | 1989-02-15 | Univ Rochester | Fremgangsm te for fremstilling og seleksjon av en rant bakteriofag som inneholder et genetisk fragment og koder for alfa-amylase, egnet for bruk i heterolog transformering av en bacillus-verts-mikroorganisme. |
| EP0074553A3 (en) * | 1981-09-11 | 1985-01-09 | The University Of Rochester | Method of increasing the yield of a product by altering a microorganism |
| JPS60145685A (ja) | 1984-01-09 | 1985-08-01 | Nec Corp | 分布帰還型半導体レ−ザ |
| JPS592689A (ja) * | 1982-06-04 | 1984-01-09 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | 強力な遺伝子発現能を有する新規レプリコンの作成法 |
| FR2533583A1 (fr) * | 1982-09-24 | 1984-03-30 | Centre Nat Rech Scient | Nouvel adn recombinant utile dans la preparation d'a-amylase |
| FR2537602B2 (fr) * | 1982-09-24 | 1986-10-24 | Centre Nat Rech Scient | Nouvel adn recombinant perfectionne utile dans la preparation d'a-amylase par bacillus subtilis |
| DE3380878D1 (en) * | 1982-11-01 | 1989-12-28 | Miles Inc | Method of heterologous cloning of gene in bacillus microorganism |
| US5624829A (en) * | 1984-07-03 | 1997-04-29 | Gist-Brocades, B.V. | Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them |
| IE58014B1 (en) * | 1983-07-06 | 1993-06-16 | Gist Brocades Nv | Molecular cloning and expression in industrial microorganism species |
| US4801537A (en) * | 1984-06-08 | 1989-01-31 | Genex Corporation | Vector for expression of polypeptides in bacilli |
| EP0221923A4 (en) * | 1985-03-29 | 1990-03-22 | Bioteknika International | SECRETION VECTOR. |
| AU620326B2 (en) * | 1987-02-27 | 1992-02-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56113293A (en) * | 1980-01-07 | 1981-09-07 | Univ Rochester | Recomoination bacteriophage for anisogenome structure cloning of batilus microorganism and production thereof |
-
1980
- 1980-12-15 NO NO803779A patent/NO159863C/no unknown
- 1980-12-24 DE DE8080108211T patent/DE3071292D1/de not_active Expired
- 1980-12-24 EP EP80108211A patent/EP0032238B1/en not_active Expired
- 1980-12-24 AT AT80108211T patent/ATE16943T1/de not_active IP Right Cessation
-
1981
- 1981-01-01 IL IL61837A patent/IL61837A/xx unknown
- 1981-01-05 ES ES498333A patent/ES8205264A1/es not_active Expired
- 1981-01-05 ZA ZA00810042A patent/ZA8142B/xx unknown
- 1981-01-06 JP JP20581A patent/JPS56113293A/ja active Granted
- 1981-01-06 DK DK3781A patent/DK3781A/da not_active Application Discontinuation
-
1986
- 1986-12-26 JP JP61308944A patent/JPS62163694A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56113293A (en) * | 1980-01-07 | 1981-09-07 | Univ Rochester | Recomoination bacteriophage for anisogenome structure cloning of batilus microorganism and production thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE16943T1 (de) | 1985-12-15 |
| JPS6246153B2 (ja) | 1987-09-30 |
| JPS56113293A (en) | 1981-09-07 |
| ES498333A0 (es) | 1982-06-01 |
| IL61837A0 (en) | 1981-02-27 |
| DE3071292D1 (en) | 1986-01-23 |
| NO159863B (no) | 1988-11-07 |
| IL61837A (en) | 1984-08-31 |
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| DK3781A (da) | 1981-07-08 |
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| NO159863C (no) | 1989-02-15 |
| ZA8142B (en) | 1982-07-28 |
| EP0032238B1 (en) | 1985-12-11 |
| ES8205264A1 (es) | 1982-06-01 |
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