JPS6217188B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は特に血清のような生物学的液体とは限
らない液体中に抗原または抗体の存在を定めるた
めのその液体の分析に関するものである。本明細
書においては、記号Ag、AbおよびAb：Agはそ
れぞれ抗原（このことばには付着体（haptene）
および抗体または同様な結合たん白質によつて結
合されうる他の物質を含む）、抗体（同様な結合
たん白質を含む）および抗体：抗原複合体を意味
するものとして使われる。 Agは適当なAbと反応してAb：Agを作るもの
でありそして大抵の免疫分析法がこの反応を利用
していることはよく知られている。さらにまたポ
リスチレン（一般的にラテツクスと呼ぶ）のよう
な微粒子物質をAbまたはAgでコーチングし、次
いでコーチングされた粒子を試験する試料溶液に
さらし、そしてこの粒子が凝着（aggultinate）
したかそしてどの程度に凝着したかを調べること
も知られている。この凝着は２つまたはそれ以上
のコーチングされたラテツクス粒子と反応して凝
着を起すことのできるAbまたはAgが試料中に存
在することを示すものである。 コーチングされた粒子の凝着を観測する技術は
多くの点において満足できるものであるのに、小
さいAgすなわちその分子量が約4000よりも少な
いAgの分析には問題がある。そのようなAgは使
用する微粒子物質に対し非常に小さく、そのため
に識別できるような凝着がしばしば起らないかま
たはある程度まで起らない。したがつてこの技術
は小さいAgの分析用には全面的の信頼は置けな
い。 本発明者らは今回液体中のAbおよびAgを分析
（その存在の検出および所望によりその量の測定
も共に行なう）する改良された技術を開発した。
それは特に小さいAg（またはAb）の分析に有用
であるがもつと大きいAg（またはAb）の分析に
使うこともできる。 本発明の１つの実態は次のような分析法の提供
である。 (a)(i) 分析すべき特定の抗原または抗体成分を含
む液体試料、 (ii) 実質的に均一な粒子寸法をもつ第１のラテ
ツクスにより担持された第１の試薬、および (iii) 前記第１ラテツクスと異なる実質的に均一
な粒子寸法をもつ第２のラテツクスにより担
持された第２の試薬〔ただしここで前記第１
試薬は前記第２試薬と結合して前記第１およ
び第２ラテツクスを凝着させることができ、
そして少なくとも第１試薬は前記特定成分と
結合して前記第１および第２ラテツクスの凝
着を阻害することもできるものとする〕の混
合物を形成し、 (b) この混合物をインキユベートして前記第１試
薬を競合的に前記特定成分および前記第２試薬
と結合させ、そして (c) 前記第１および第２ラテツクスの凝着または
不凝着の程度を、混合物中の凝着していないラ
テツクスの光学的技術による選択的計数により
測定し、それにより試料中に存在する前記特定
成分を定量する ことから成る、液体中の特定の抗原または抗体成
分を定量する方法。 本発明の方法に従つて、２種の異なるラテツク
ス試薬を同時に使うが、この点が１種のラテツク
ス試薬しか使わない先行技術と異なるところであ
る。これら２種の試薬はいつしよに混合されたと
きに凝着するが混合前には凝着しないものであ
る。例えば一方のラテツクス試薬はAgまたはAg
−配合物で、他方AgまたはAg−配合物と結合す
るAbであることができる。この２種の試薬を混
合するとAbはAg（またはAg−配合物）と結合し
て粒子の凝着を起させる。しかしながら微粒子試
薬の少なくとも１つは、それが液体中の被験特殊
AbまたはAgと結合するように選ばれる。ラテツ
クス試薬が遊離のAbまたはAgと結合することは
ラテツクス試薬の結合位置をふさぐのでそれは他
のラテツクス試薬と結合しそして凝着することは
もはやできない。混合物中の凝着の程度はこうし
て液体中の特殊な被験AgまたはAbの量に依存す
る量だけ減少する（それは特殊なAgまたはAbが
存在しない場合に液体中に起る量以上である）。
この現象を観察することによつて特殊なAbまた
はAgの存在を確認することができ、そして凝着
または不凝着の程度を測定することによつて特殊
なAbまたはAgの量を定量することができる。こ
れは通常最も便宜的には、既知濃度のAgまたは
Abを使つて得られた結果から標準曲線を作り、
そして次に被験試料中のあらかじめ未知のAbま
たはAgの量を定量するようにこの曲線を使うこ
とによつて行なわれる。 本発明の信ずるところでは、本発明の方法は、
どのようなAgにも使われそしてAgでコーチング
されたラテツクス試薬によつて特異性が導入され
るからラテツクス試薬上には特異なAbを必要と
しない。すなわち例えば、１つのラテツクス試薬
上のAbコーチングが非特異性でそのためにそれ
は３つの異なるAgと反応することができ、そし
てこれらのAgの中のただ１つだけ（すなわち
Ag′）を液体試料から分析することが所望される
とすると、その場合にはAbをコーチングした試
薬と共にAg′をコーチングしたラテツクス試薬を
使うことによつてAg′の分析を行なうことができ
る。この手法は試料中のAbの検出および測定に
も同じようにして使うことができる。 本発明の方法に使われるラテツクス試薬は顕微
鏡的あるいは超顕微鏡的サイズのものである。す
なわちそれは一般に15ミクロンよりも小さく最も
普通には数ミクロンまたはサブミクロン（５〜
100ｍμ程度）のサイズである。このようなサイ
ズのラテツクス粒子は市販されている。ラテツク
スのような顕微鏡的微粒物質にAbまたはAgを結
合することは知られている。これは通常粒子上に
反応性のコーチングを与えそして粒子上のAbま
たはAgを化学的に結合するかあるいは吸着する
ことによつて行なわれる。ある情況の場合には
AbまたはAgを直接に粒子（その間に介在するコ
ーチングをもたない）に結合することも可能であ
る。ラテツクス試薬を作る方法は本発明の目的で
なないしそして業界でよく知られているから、そ
れについてはこれ以上記載することはしない。 本発明の目的のためにラテツクスのような微粒
子物質に結合することができるAgおよびAbの中
には例えば次のような物がある。Abとしては免
疫グロブリンＧ（IgG）（これは人間、家兎、山
羊および羊の血清からのものである）ならびにそ
れらのＦ（ab）′_２断片、家兎IgM、Agとしては
人間のIgM、人間の胎盤ラクトーゲン、人間のα
―胎児たん白質（α―fetoprotein）、人間のラク
トフエリン（Lactoferrin）、人間の血清、（アル
ブミン）、人間のトランスフエリン
（Transferrin）、人間のＣ−反応性たん白質およ
び人間のIgGのFc断片、牛のIgGおよび血清アル
ブミン、馬のフエリチン（ferritin）、鉄たん白
質）、人間、マウス、ラツトおよびモルモツトの
IgG′および精製された人間のIgGの１、２、３お
よび４亜綱。また人間の血清のアルブミン、IgG
およびトランスフエリン、牛のアルブミンおよび
フイブリノーゲンおよび馬のフエリチンのチロキ
シン配合物を結合させることもできた。また人間
および牛のアルブミンおよび牛のIgGのジゴキシ
ン（Digoxin）配合物も結合させた。その表面に
反応性カルボキシル基をもつているポリスチレン
ラテツクス粒子にチロキシンは直接に結合するこ
とができる。 各ラテツクス試薬の粒子サイズは実質的に一様
であることおよび以下にもつと詳しく記載するよ
うに第１のラテツクス試薬の粒子サイズは第２の
ラテツクス試薬のそれとは異なる（少なくとも後
者の２倍が好ましい）ものであることが好まし
い。 特殊なAgまたはAbの存在を検出する方法を実
施するのには、凝着の阻害が起つたかどうかを確
証することだけが必要である。被験試料中にAg
またはAbが比較的大量にあるときには、混合物
は顕微鏡のスライドに広げられているので、顕微
鏡を通しての観察で肉眼で凝着の阻害を検出する
ことができる。１つの特に好ましい試験は牛乳中
のプロゲステロンの存在を検出するためのもので
ある。そこでは牛乳と、プロゲステロンまたはプ
ロゲステロン配合物から成る顕微鏡的もしくは超
顕微鏡的ラテツクス試薬とそしてプロゲステロン
およびプロゲステロン配合物の両方と結合する
Abから成る顕微鏡的もしくは超顕微鏡的ラテツ
クス試薬との混合物が作られる。肉眼で混合物を
調べると通常凝着阻害がわかるものである。もち
ろん凝着阻害の有無を確証する試験において定量
分析に関係して後述する方法の１つを使うことも
できる。 本発明による定量分析では、ラテツクス試薬の
凝着または不凝着の程度を測ることが必要であ
る。これは種々の方法で行なうことができる。例
えば凝着した粒子を凝着しない粒子から分別し、
それから後者の数を測定することができる。その
分別は例えばろ過、遠心分離またはカラムクロマ
トグラフイによつて行なうことができる。次に不
凝着粒子の数を測定するのであるが、それには例
えば計数によるかあるいはラテツクス試薬上の確
認ラベル（例えば放射性原子）を使うことによつ
て測ることができる。 しかしながら一般にこれは避けることが好まし
い。それは時間がかかりそして誤差が生じ易いか
らである。その代りに凝着、不凝着の程度を算定
するために反応混合物を測ることが好ましい。こ
れはそれ自体は当業界で知られている選択的計数
技術を使うことによつて便利に行なうことができ
る。この方法では例えば与えられたサイズ範囲の
粒子（この範囲外のサイズの粒子は無視される）
の数を算定することができる。 これは行なう１つの既知装置はテクニコン自動
計数器（Technicon Autocouuter）である。その
基本型においては、この装置は希釈された試料が
光束に直角にポンプで送られるフローセル
（Flowcell）を光が通過するような光学系から成
るものである。光学系の他の端は光電池がある。
そしてフローセルのすぐ後には中心に黒点をもつ
たレンズがある。この黒点はフローセルを直接に
通つた光線が光電池に到達するのを防ぐためのも
のである。粒子が光束の中にあるときは、入射光
の１部は黒点を迂回するように散乱されて光電池
に到達する。これが電子の衝撃（インパルス）を
示し、このインパルスを集計することによつて試
料中の粒子の計数が行なわれる。 選択的計数技術を使う場合には、２つのラテツ
クス試薬は計数器で識別できるように異なるサイ
ズのものであると非常に好都合である。ミクロン
またはサブミクロンのサイズの粒子を使つてこの
ような目的には、２倍のサイズの差があれば通常
満足である。選択計数を使う本発明方法の操作を
単に例によつて説明すると次の通りである。被験
Agを含む試料にサイズがそれぞれ１ミクロンと
0.1ミクロンの第１と第２のラテツクス試薬を加
える。ここで加える第１の試薬の量はわかつてお
り、そして試料中のすべてのAgと結合するのに
要する量の過剰を加える。第１の試薬の１部は
Agと結合し、そしてそれによつて第２の試薬の
粒子と結合することは阻害される。しかしAgと
結合しなかつた第１の試薬粒子は第２のラテツク
ス試薬と結合して凝着する。このとき混合物は(i)
試料からのAgに結合した第１試薬の粒子（不凝
着）、(ii)過剰の第２試薬の粒子（不凝着）および
(iii)凝着した粒子を含んでいる。不凝着の第１およ
び第２の試薬粒子の間にはサイズの差があるの
で、凝着しない第１試薬の粒子の数(i)を計数する
ことができる。そしてその算定（と標準結果と）
から試料中のAgの量を計算することができる。 この（または同様な）方法で処理することは非
常に好ましい。 本発明の方法は小さいAgとAbを分析するのに
特に好都合である。これに関連してステロイドと
医薬の分析は最も重要なものに入る。 本発明がさらに充分に理解されるように説明す
るために次の実施例を示す。 例 １ この実施例はジゴキシン（digoxine）の分析を
説明する例である。 (a) Abでコーチングされたラテツクスの製法 ラテツクス粒子（ダウケミカル社製品、直径
0.09μのポリスチレンで10重量％懸濁液として
入手したもの）をうすいグリシンで緩衝された
食塩水（dGBS−20mMグリシン、34mM
NaCl、PH９）〔これはStastnyおよびHorejsi、
Clin.Chim.Acta６、782（1961）の方法によつ
て作られる羊の抗ジゴキシン血清のリバノール
可溶画分0.2mg/mlを含む〕中に20倍に希釈さ
れ、そして室温で30分間インキユベートされ
た。次に１mldGBS当り牛の血清アルブミン
（bSA）10mgの1/10容量を加えた（ラテツクス
が完全にたん白質でコーチングされたことを確
かめるため）。そして30分間インキユベートし
た後にコーチングされたラテツクスを２回遠心
分離して洗いdGBS中に再び懸濁された。最後
にコーチングされたラテツクスは１ml中１mgの
bSAを含むGBS（0.1Mグリシン、0.17M
NaCl、PH９）中に0.5％懸濁液として再び懸濁
された。 (b) Agでコーチングされたラテツクスの製法 ラテツクスを直径1.1μのものを使い、イン
キユベーシヨンをAg−配合物濃度を４μｇ/ml
にして行なつた以外は(a)におけると同じ方法を
行ない、そして次に10mg/mlのトランスフエリ
ンの1/10容量を加えた。 Ag−配合物はジゴキシンとエチレングリコ
ールとを酸化結合させることによつて作られ、
次にこの複合体を還元結合することによつてた
ん白質とされた。無水アルコール２ml中に溶か
したジゴキシン50mgを0.1M NaClO₄2mlと共に
25分間インキユベートし、次でエチレングリコ
ール60μを加えさらに５分間インキユベート
した。この反応混合物を次に水２ml中の人間の
トランスフエリン60mgの溶液に加え５％
Na₂CO₃を加えてPHを9.5とし、そして45分間イ
ンキユベートした。新しくNaBH₄30mgを水２
mlに溶かした溶液を加える時間インキユベーシ
ヨンを続けた。この時期の最後には反応混合物
のPHは未反応のNaBH₄を分解するように1M
HCOOHの添加によつて6.5に下げられた。そ
してさらに１時間インキユベートした後1M
NH₄OHを加えてPHを8.5に上げ、そして製品を
４℃で２日間透析した。（その他のすべての操
作は室温で行なつた。） (c) 分析 ジゴキシンの分析に使う血清は血清妨害を減
らすように先ず酸と共に加熱された。血清25μ
を0.1N HCl25μと共に10分間56℃に加熱
し、次に2M Na₂CO₃10μを添加してアルカ
リ性とした。この加熱された血清に、Ab−ラ
テツクス（１mgbSA／mlを含むGBSで１：10に
希釈されたもの）25μおよび配合ラテツクス
（人間のトランスフエリン１mg/mlを含むGBSで
１：４に希釈されたもの）25μを加えた。そ
れらを振とう式インキユベーター上で水平にか
きまぜられる垂直に配置された管の中で室温で
15分間インキユベートした。この時期の最後
に、管の内容物をGBS5mlで希釈し、そして
0.01％トウイーン20（Tween20）を含むGBSで
さらに20倍に希釈した後テクニコン自動カウン
ターのフロウセルを２ml／分の速度で通した。
各試料中の凝着しない（モノマー）ラテツクス
粒子の相対的な数が選択的光学計数によつて決
定された（凝着した粒子の相対的な数も同様で
ある）。第１表に得られた数値を示す。

【表】 この方法は付着体のAg−配合物をbSAとい
つしよに使つてジニトロフエノール（DNP）
の定量にも見事に適用された。 粒子の選択的光学計数において、１つの粒子
で散乱される光の量は粒子のサイズに依存す
る。すなわち、光電池内に発生する電子衝撃
（インパルス）は粒子のサイズに比例する。そ
して異なるサイズの粒子は別々に計数すること
ができる。第２表はすべての粒子を計数するの
とは反対に凝着しない粒子（モノマー）だけを
計数することによつて得られる定量（標準曲線
に対してもつと拡張された範囲を提供すること
によつて）の精確度における改良を説明するも
のである。この表はまた凝着しない粒子と凝着
した粒子との比率（モノマー／ポリマー比）を
計算することによつて実現できる感度の大きな
増加を説明している。粒子を全部計数すること
によつて感度および精確度の増進が、終点決定
の他の方法と比較によつて実感することができ
る。第３表は粒子は計数することによつて得ら
れる結果の比較を示す。

【表】

【表】 各数値はhPLが存在しない場合に得られる値
の％として表わされている。 ジゴキシンに対する標準曲線を表わす１組の
試料に対する（モノマーのみ）および濁度分析
（400nmにおける光学密度）。

【表】 各数値はジゴキシンが５nｇ/ml存在する場
合（最高阻止）に見出される数値の％として表
わされている。 例 ２ この例はチロキシンの分析を説明する。 (a) チロキシと結合したラテツクスの製法 ラテツクス粒子（ダウケミカル社製品、直径
0.857μのカルボキシル化変性ポリスチレン）
を10重量％懸濁液として入手し、それをりん酸
塩緩衝食塩水（PBS：りん酸ナトリウム
50mM、食塩0.17M、PH６）中に20倍に希釈
し、遠心分離（４℃、12000回転で10分間）し
そして新鮮なPBS中に再懸濁し最終的には２重
量％の懸濁液とした。PBS1ml中のチロキシン
25μｇと１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩50μｇの
溶液を０℃で作り、そして洗浄したラテツクス
懸濁液250μを加えた。これを０℃で１時間
インキユベートした後PBS中の25％エタノール
アミン250μを加えてさらに30分間インキユ
ベートした。次いでこのラテツクスを２回遠心
分離しそして新しいPBS（毎回１ml）中に再懸
濁し、それから４℃でPBS1に対して16時間
透析を行なつた。それを最終的に遠心分離しそ
してグリシンで緩衝された牛のアルブミン
（bSA）１％を含む食塩水中に再懸濁した。 (b) 混合凝着によるチロキシンの分析 (i) Abでコーチングされたラテツクスの製法 このラテツクスの製法は例１におけるジゴ
キシンの分析用のものと全く同じであるが、
この場合のAbは家兎抗チロキシン（T₄）血清
からの物である。 (ii) Agでコーチングされたラテツクスの製法 上記(a)の場合と同じである。 (iii) 分析 T₄を分析すべき血清は、ナトリウムジエ
チルバルビツレート75mM（PH9.2）中の１
−アニリノ−ナフタレン−８−スルホン酸
1mMの等容量と先ず混合する。この希釈さ
れた血清50μをbSA1％を含むGBS中のAb
−ラテツクスの0.01％懸濁液25μおよび例
１のジゴキシンの分析用と同じ方法の同じ懸
濁液中のAg−ラテツクスの0.1％懸濁液25μ
といつしよにインキユベートした。第４表
はこの系を使つた得られた代表的な結果を説
明する。 第 ４ 表 ngT₄血清 粒子濃度（最高％） ０ 48 10 51.5 50 59.5 100 89 この場合の最高値はAg−ラテツクスのみ
に対するものであつたが、上のすべての数値
はAg−ラテツクスの存在する場合にも同様
に見られる。 例 ３ 異なる粒子寸法を採用した場合と対比して同じ
粒子寸法のラテツクス粒子を採用した場合を示
す。手順は例１と同じである。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a)(i) 分析すべき特定の抗原または抗体成分
   を含む液体試料、 (ii) 実質的に均一な粒子寸法をもつ第１のラテ
   ツクスにより担持された第１の試薬、および (iii) 前記第１ラテツクスと異なる実質的に均一
   な粒子寸法をもつ第２のラテツクスにより担
   持された第２の試薬〔ただしここで前記第１
   試薬は前記第２試薬と結合して前記第１およ
   び第２ラテツクスを凝着させることができ、
   そして少なくとも第１試薬は前記特定成分と
   結合して前記第１および第２ラテツクスの凝
   着を阻害することもできるものとする〕の混
   合物を形成し、 (b) この混合物をインキユベートして前記第１試
   薬を競合的に前記特定成分および前記第２試薬
   と結合させ、そして (c) 前記第１および第２ラテツクスの凝着または
   不凝着の程度を、混合物中の凝着していないラ
   テツクスの光学的技術による選択的計数により
   測定し、それにより試料中に存在する前記特定
   成分を定量する ことから成る、液体中の特定の抗原または抗体成
   分を定量する方法。 ２ 特定成分として抗原型物質を、第１試薬とし
   て分析すべき抗原型物質と結合できる抗体を、そ
   して第２試薬として前記抗体と実質的に同じ物質
   を使う、前項１に記載の方法。 ３ 特定成分として抗体を、第１試薬として前記
   抗体と結合できる抗原型物質を、そして第２試薬
   として前記抗原型物質と結合できる抗体を使う、
   前項１に記載の方法。 ４ 分析すべき特定成分として分子量が約4000よ
   りも小さいものを使う、前項１に記載の方法。 ５ 第１ラテツクスとして第２ラテツクスの少な
   くとも２倍の粒子寸法をもつものを使う、前項１
   に記載の方法。 ６ 第１ラテツクスとしてその既知量を混合工程
   (a)において使い、混合物中の凝着していない第１
   ラテツクスを選択的に計数する、前項５に記載の
   方法。