JPS62178521A

JPS62178521A - ヘモグロビン含有リポソ−ム

Info

Publication number: JPS62178521A
Application number: JP61016858A
Authority: JP
Inventors: Ichihiko Suzuki; 鈴木　一比好; Yuji Miyauchi; 宮内　雄二
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1986-01-30
Filing date: 1986-01-30
Publication date: 1987-08-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１０発明の背景［技術分野］本発明は改良されたヘモグロビン含有リポソームに関す
る。さらに詳しくは本発明は、リポソーム膜壁にビタミ
ンＥを、ヘモグロビン水溶液にビタミンＣを含有する安
定化されたヘモグロビン含有リポソームに関する。

本発明のリポソームは酵素運搬能が高く、酸化に対して
安定な人工赤血球として利用される。

［先行技術および問題点］ヘモグロビンを含有するリポソームとして従来いわゆる
１ＩＩＩ法により製造されたものがミラー（ＨｉｌｌＯ
ｒ）らにより報告されている（米国特許第４．１３３，
８７４号）。この方法によればヘモグロビン含有リポソ
ームは、リポソーム形成脂質をクロ口ホルム等の適当な
有機溶媒に溶解し、得られた溶液から溶媒を留去して脂
質のＦｌｌ膜をつくり、この薄膜に溶血ヘモグロビン水
溶液を加え、激しく撹拌して多重層リポソームを形成し
、次にこれを超音波処理することによって得られる。こ
の方法によれば、ヘモグロビンが酸素に触れる時間が少
ないのでヘモグロビンの変性が比較的少ない利点がある
。しかしながら保存中にリポソーム中のヘモグロビンの
ヘム鉄が徐々に酸化されてメトヘモグロビンに変質して
酸素の運搬ｉ能を失うおそれがある。血球内においては
ヘモグロビンはメト型に酸化されても酸素の作用により
もとへ還元される機構をそなえているが、溶血して血球
外へとり出されるとこのような機構がないため、一旦メ
ト型に変質すると酸素運搬能を失ってしまう。

さらに、ヘモグロビンは分子１６８，０００の高分子化
合物であり、その水溶液は粘度が低分子量物質の水溶液
と比較すると高く、また高分子量物質の低濃度水溶液と
比較しても高い。ところが従来の方法ではこのような高
分子ｍ１高濃度の水溶液を含有するリポソームを調製す
ることはできず、ヘモグロビン濃度がせいぜい１５％程
度のリポソームしか（ｑられない。天然赤血球中のヘモ
グロビン濃度が３５％前後であることを考慮すると上記
濃度では効率が悪く人工赤血球としては実用に耐えない
。

■０発明の目的本発明はヘモグロビンの酸化を防止したヘモグロビン含
有リポソームを提供することを目的とする。

さらに本発明はリポソーム中に取り込まれたヘモグロビ
ン水溶液におけるヘモグロビン濃度が３０〜６０％（Ｗ
／Ｗ　）であるヘモグロビン含有リポソームを提供する
ことを目的とする。

■０発明の詳細な説明本発明は、脂質からなる膜を有するリポソームにヘモグ
ロビン水溶液を取り込んでなるヘモグロビン含有リポソ
ームにおいて、前記膜がビタミンＥを含有し、または、
さらに、前記ヘモグロビン水溶液がビタミンＣを含有す
ることを特徴とするヘモグロビン含有リポソームからな
る。リポソームは主として脂質よりなる膜を有する閉鎖
小胞と定義される。

本発明におけるリポソーム膜形成脂質には特に制限はな
く、リポソームを形成するものであれば天然または合成
の脂質が使用可能である。特にリン脂質が好適に使用さ
れ、その例として、レシチン、ホスファチジルエタノー
ルアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロ
ール、スフィンゴミエリン、カルシオリビンおよびこれ
らを常法に従って水素添加したものがあげられ、これら
を組合せて用いることもできる。リポソーム膜にはその
酸化を防止するためビタミンＥが添加される。ビタミン
Ｅすなわちトコフェロールには、α、β、γ、δの４個
の異性体が存在するが、本発明においてはいずれの異性
体も使用することができる。ビタミンＥの添加ｍはリポ
ソーム膜の総脂質に対して０．５〜４．５モル％、好ま
しくは１．０〜２．０モル％である。リポソーム膜の構
成成分として所望によりステロール電荷付与物質を添加
して膜構造の強化や崩壊時間の調節を図ることができる
。

リポソーム内に取り込まれるヘモグロビンは赤血球を常
法に従って溶血し分画分子量５万の膜を使用した限外濾
過により３０％（ｗ／ｗ）以上に濃縮したものが使用さ
れる。ヘモグロビンは水溶液の形態で取り込まれ、その
濃度は３０〜６０％（ｗ／ｗ）である。ヘモグロビン水
溶液に含有されるビタミンＣすなわちアスコルビン酸は
、遊離の酸または塩の形態、好ましくはリチ「クム、カ
リウム、ナトリウム等のアルカリ金属の塩の形態で添加
され、添加ｍは仕込ヘモグロビンに対しておよそ２〜１
０倍モルである。リポソームの直径はおよそ０．１〜１
．０μｍが適当である。

本発明のヘモグロビン含有リポソームはリポソーム膜形
成脂質およびビタミンＥ並びに所望により膜強化物質や
崩壊円面物質をクロロホルム、エタノール等の適当な有
機溶媒に溶解し、得られた溶液から溶媒を留去し、残留
物に３０％（ｗ／ｗ）　８度以上のヘモグロビン生理食
塩水溶液にビタミンＣを添加した溶液を加え、振どうま
たは超音波処理により均一な懸濁液とし、この原料溶液
を高圧吐出処理し、次いでビタミンＣを添加した生理食
塩水で遠心洗浄することによって得られる。

上記方法において、上記原料溶液を得るまでの工程は、
いわゆるＭ脱法として知られるリポソームの製造方法で
あり、常法に従って実施される。

原料溶液を高圧吐出処理する工程は、高圧吐出型乳化機
、好ましくはフレンチプレスを用いて原料溶液を１００
〜２０００、好ましくは５００〜１７０ＯＮｆＦ／１２
の圧で細隙から数回吐出させることによって実施される
。圧力が高いほどリポソームの粒径は小さくなる。

かくして得られる液はヘモグロビン含有リポソーム、余
剰ヘモグロビンおよび余剰脂質の混合液であり、これに
ビタミンＣを添加した生理食塩水を加えて数倍に希釈し
、超遠心処理し、最上層の余剰ヘモグロビンをデカンテ
ーションで除く。沈殿物にビタミンＣ添加生理食塩水を
加えて再懸濁し、再び超遠心処理する。この操作を余剰
へモグロビンが検出されなくなるまでくり返して行う。

本発明のへＤグロビン含有リポソームは従来公知のもの
と同様にして人工赤血球として使用される。すなわち、
本発明のリポソームを生理食塩水または代用血漿中に分
散させて人工血液として使用する。また、本発明のリポ
ソームを凍結乾燥して保存し、使用時に生理食塩水また
は代用血漿中に分散させることができる。

次に実施例および試験例を示して本発明をさらに具体的
に説明する。

実　　施　　例、血・ｔ　ζ　ヘモ　ロビンの　１抗凝固剤入りの採血バッグを用いて牛の静脈より１５０
０−の全面を採取する。全血を３０００ｒｐｍ　、　２
０ｍ１ｎ遠心処理を行ない、上層の血漿、血小板、白血
球を取り除き、生理食塩水を用いて赤血球沈殿層を再懸
濁させ、再度、３０００ｒｐｍ　、　２０ｉ＋ｉｎ遠心
処理を行なう。以下、同様の操作を行ない、血漿、血小
板、白血球を取り除いた洗浄赤血球４００ａｉ！を得る
。次に洗浄赤血球の容量に対して２倍容量８００　ｄの
蒸留水を添加して赤血球を溶血させる。

次にＩＮ　　ＨＣＪ溶液ｒ　ｐＨ５，８５ｋｍ　ｍｌ　
シタｌａ、１７０００ｒｐｍ、　３０ａ＋ｉｎ遠心処理
を行なう。上澄をポアサイズ０，２２μのメンブランフ
ィルタ−で濾過して赤血球膜を除去したヘモグロビン９
９０ｃｃを得る。

ヘモグロビン濃度は６．３％であった。このヘモグロビ
ン溶液を分画分子量５万の膜を使用して限外が過により
ヘモグロビン濃度３０％まで濃縮して、３０％濃度の赤
血球膜除去ヘモグロビン１８０ｍを得る。

リボンーム七Ｊ　　の精製ホスファデジルコリン７．３７６９、コレステＤ　
−／ｌｚ　３．７１２！９、ステアリンＦＭ　Ｏ，３９
０ｇ、ビタミンＥ　Ｏ，３１７９をクロロホルムに溶解
する。該脂質溶液をナスフラスコに入れ、エバポレーシ
ョンを行ないクロロホルムを除去し、ナスフラスコの底
に脂質膜を形成させる。

ビタミンＣを０．６５８９添加したヘモグロビン濃度３
０％の赤血球膜除去ヘモグロビン１８０ｄを該脂質膜に
添加して振どうまたは、超音波により均一な懸濁液とす
る。この原料溶液をフレンチプレスを用いて１７００ｋ
ｇ／α２の圧力で２回処理する。

ヘモ　ロビ１ハ１−　のフレンチプレス処理後の液とビタミンＣを添加した生理
食塩水（ビタミンｃｍ度は３．６６１Ｎ９７ｒｄ＞で５
倍に希釈した侵、５００００ｒｐｍ、　３０ｍ１ｎ　テ
超遠心を行ない上層の余剰ヘモグロビンおよび余剰脂質
を取り除く。該ビタミンＣ添加生理食塩水でヘモグロビ
ン含有リポソームの沈殿を懸濁させ、再度５００００ｒ
ｐｍ、　３０ｍ１ｎで超遠心を行なう。以下同様の操作
を行なってヘモグロビン含有リポソームのみを回収する
。最終的に生理食塩水に再懸濁して人工赤血球として用
いる。粒径は１５０ｎａ　（米国コールタ−社ｃｏｕｎ
ｔｅｒ　＠Ｎａｎｏ−３ｉＺｅｒ　”にも測定）であっ
た。

の両方を含有する本発明リポソームと、ビタミンＣのみ
を含有する対照リポソームとビタミンＣおよびビタミン
Ｅの両方を含有しない対照リポソームとをそれぞれ４℃
で１〜４週間保存したときのリポソーム中のメト型ヘモ
グロビンの濃度（％）は表１のとおりであった。表中、
本発明リポソーム１は、上記実施例で得られたビタミン
ＣおよびビタミンＥを含有するリポソーム、対照リポソ
ーム１はビタミンＣおよびＥの両方を含有しないリポソ
ーム、本発明リポソーム２はビタミンＥを膜壁中に含有
するリポソーム、対照リポソーム２はビタミンＣをヘモ
グロビン溶液中に含有するリポソームをそれぞれ意味す
る。尚対照リポソームにおけるビタミンＣまたはＥの含
有量は、実施例におけるそれらと同一である。メト型ヘ
モグロビン濃度はＣＯオキシメーター（Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔａｔｉｏｎｃａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を用いて
測定した。

−１メト型ヘモ　ロビン　　　％表１から、ビタミンＣおよびＥを含有しない対照リポソ
ーム１中のヘモグロビンは作製後１週間で半分以上がメ
ト型ヘモグロビンに酸化されるのに対して本発明リポソ
ーム１および対照リポソーム２中のヘモグロビンは４週
間後でも殆んど酸化されないことが明らかである。尚、
本発明リポソーム１と対照リポソーム２とのメト化率は
４週間後では差異はないが３週間後においては本発明リ
ポソームの方が安定性に優れているといえる。

本発明リポソームおよび各対照リポソームを作製した直
後におけるヘモグロビンの吸収スペクトルを図に示す。

いずれの試料においても５４０および５７８層にヘモグ
ロビンの特異吸収を示すがビタミンＣおよびＥの両方を
含有しない対照リポソーム１においては６３０順にメト
ヘモグロビンの吸収を示し、リポソームの作製直後にお
いても一部メト化が起こっている。

■０発明の具体的作用効果本発明のヘモグロビン含有リポソームは、ヘモグロビン
が酸化から保護されているので優れた酸素運搬能を有す
る。ヘモグロビン含有リポソームは一般にそれの製造過
程において、あるいは製品の保存中に酸素と接触してメ
ト型ヘモグロビンに酸化され、酸素運搬能が低減乃至喪
失するが、本発明のリポソームにおいてはヘモグロビン
水溶液中にビタミンＣが存在するのでヘモグロビンの酸
化が防止されている。さらに本発明のリポソームにおい
てはリポソームの膜壁にビタミンＥが存在するので膜の
酸化が防止されている。ヘモグロビンの酸化と膜の酸化
は相互に作用し合い、一方の酸化は他方の酸化を促進す
るが、本発明のリボソ゛−ムにおいては両方の酸化が防
止されているので効果的である。

さらに本発明のリポソームは、３０％（ｗ／ｗ）以上と
いう赤血球に匹敵する高いヘモグロビン濃度を有するの
で酸素運搬能が高く、人工赤血球として優れた性質を有
している。

【図面の簡単な説明】

図は作製直後の本発明リポソームおよび対照リポソーム
中のヘモグロビンの吸収スペクトルを表わすグラフであ
る。図において曲線（１）は本発明リポソーム１の、（
２）は対照リポソーム１の、（３）は本発明リポソーム
２の、（４）は対照リポソーム（２）のヘモグロビンの
吸収スペクトルをそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）脂質からなる膜を有するリポソーム内にヘモグロ
ビン水溶液を取り込んでなるヘモグロビン含有リポソー
ムにおいて、前記膜がビタミンＥを含有することを特徴
とするヘモグロビン含有リポソーム。
（２）脂質からなる膜を有するリポソーム内にヘモグロ
ビン水溶液を取り込んでなるヘモグロビン含有リポソー
ムにおいて、前記膜がビタミンＥを含有し、前記ヘモグ
ロビン水溶液がビタミンＣを含有することを特徴とする
ヘモグロビン含有リポソーム。
（３）ヘモグロビン濃度が３０〜６０％（ｗ／ｗ）であ
る特許請求の範囲第２項記載のヘモグロビン含有リポソ
ーム。
（４）ビタミンＥの含有量が総脂質に対して０．５〜４
．５モル％であり、ビタミンＣの含有量がヘモグロビン
に対して２〜１０倍モルである特許請求の範囲第２項ま
たは第３項に記載のヘモグロビン含有リポソーム。