JPS62181784A - 殺虫性蛋白遺伝子の大腸菌内発現による殺虫 - Google Patents
殺虫性蛋白遺伝子の大腸菌内発現による殺虫Info
- Publication number
- JPS62181784A JPS62181784A JP61024563A JP2456386A JPS62181784A JP S62181784 A JPS62181784 A JP S62181784A JP 61024563 A JP61024563 A JP 61024563A JP 2456386 A JP2456386 A JP 2456386A JP S62181784 A JPS62181784 A JP S62181784A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- insecticidal protein
- strain
- gene
- dna
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、鱗翅目昆虫であるコナガおよびハスモンヨト
ウに対し強い殺虫活性を示すバチラス・チュリンゲンシ
ス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白遺伝子を含みこれ
を大腸菌等の微生物菌体内で発現させる発現プラスミド
、該プラスミドを保持しバチラス・チュリンゲンシス・
アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白を生産する微生物およ
び該微生物を培養することを特徴とする殺虫性蛋白の製
造方法に関する。
ウに対し強い殺虫活性を示すバチラス・チュリンゲンシ
ス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白遺伝子を含みこれ
を大腸菌等の微生物菌体内で発現させる発現プラスミド
、該プラスミドを保持しバチラス・チュリンゲンシス・
アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白を生産する微生物およ
び該微生物を培養することを特徴とする殺虫性蛋白の製
造方法に関する。
従来技術
バチラス・チュリンゲンシスの各種菌株は、胞子形成期
に殺虫性蛋白からなる１〜２μｍにおよぶ結晶を形成し
、この結晶蛋白を摂取した昆虫は、摂食活動を停止し、
腸管破裂等ののち、死に至ることが知られている。 バ
チラス・チュリンゲンシス株は、鞭毛抗原やエステラー
ゼ活性などにより２９亜種に分類されており、各々の菌
株は特異的、かつそれぞれ、異なる殺虫活性をしめす。
に殺虫性蛋白からなる１〜２μｍにおよぶ結晶を形成し
、この結晶蛋白を摂取した昆虫は、摂食活動を停止し、
腸管破裂等ののち、死に至ることが知られている。 バ
チラス・チュリンゲンシス株は、鞭毛抗原やエステラー
ゼ活性などにより２９亜種に分類されており、各々の菌
株は特異的、かつそれぞれ、異なる殺虫活性をしめす。
本発明者らは、鱗翅目昆虫のなかでも野菜の害虫である
コナガおよびハスモンヨトウに対し強い殺虫活性を示す
公知の菌バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
Ｌ株の生産する殺虫性蛋白を殺虫剤として利用すること
を目的として、研究を行い本発明を完成した。
コナガおよびハスモンヨトウに対し強い殺虫活性を示す
公知の菌バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
Ｌ株の生産する殺虫性蛋白を殺虫剤として利用すること
を目的として、研究を行い本発明を完成した。
問題解決の手段
本発明者らは、コナガおよびハスモンヨトウに対し強い
殺虫活性を示すバチラス・チュリンゲンシス・アイザワ
イＩＰＬ株の生産する殺虫性蛋白の遺伝子をクローン化
した後、同遺伝子の構造遺伝子部分の３４６５塩基の全
配列を決定し、殺虫性蛋白の一次構造を解明した。 更
に、この殺虫性蛋白の遺伝子を各種の発現ベクターに接
続し、微生物へ導入することにより、殺虫性蛋白を生産
する微生物を製造し、この微生物を培養することにより
バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の殺
虫性蛋白を大量に生産する製造方法を完成した。
殺虫活性を示すバチラス・チュリンゲンシス・アイザワ
イＩＰＬ株の生産する殺虫性蛋白の遺伝子をクローン化
した後、同遺伝子の構造遺伝子部分の３４６５塩基の全
配列を決定し、殺虫性蛋白の一次構造を解明した。 更
に、この殺虫性蛋白の遺伝子を各種の発現ベクターに接
続し、微生物へ導入することにより、殺虫性蛋白を生産
する微生物を製造し、この微生物を培養することにより
バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の殺
虫性蛋白を大量に生産する製造方法を完成した。
本発明のバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイｒＰ
Ｌ株の殺虫性蛋白遺伝子は、図２に記載した塩基配列お
よびアミノ酸配列で特定される。
Ｌ株の殺虫性蛋白遺伝子は、図２に記載した塩基配列お
よびアミノ酸配列で特定される。
本発明の殺虫性蛋白遺伝子を含むプラスミドは、バチラ
ス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株のプラスミ
ドＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作製し、適当なプロ
ーブ、例えば、図２に示した本発明の殺虫性蛋白遺伝子
の塩基配列を基に作成した合成オリゴヌクレオチド或い
は本国の類縁株゛であるバチラス・チュリンゲンシス・
Ｉ（Ｄ−１グイベル株の殺虫性蛋白遺伝子の既知塩基配
列から作製した合成オリゴヌクレオチドをプローブとし
て用い、このライブラリーをスクリーニングし、本発明
の殺虫性蛋白遺伝子を含むプラスミドを単離することに
より得ることができる。 なお、この場合、本発明の遺
伝子を含む組換えプラスミドの作製は、バチラス・チュ
リンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株から高い殺虫活性を
示す株を選抜し用いることにより有利に行うことができ
る。
ス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株のプラスミ
ドＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作製し、適当なプロ
ーブ、例えば、図２に示した本発明の殺虫性蛋白遺伝子
の塩基配列を基に作成した合成オリゴヌクレオチド或い
は本国の類縁株゛であるバチラス・チュリンゲンシス・
Ｉ（Ｄ−１グイベル株の殺虫性蛋白遺伝子の既知塩基配
列から作製した合成オリゴヌクレオチドをプローブとし
て用い、このライブラリーをスクリーニングし、本発明
の殺虫性蛋白遺伝子を含むプラスミドを単離することに
より得ることができる。 なお、この場合、本発明の遺
伝子を含む組換えプラスミドの作製は、バチラス・チュ
リンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株から高い殺虫活性を
示す株を選抜し用いることにより有利に行うことができ
る。
よく知られているように多くのアミノ酸についてはそれ
をコードする遺伝子ＤＮＡ塩基配列は複数存在する。
その塩基配列は一義的には決まらず多数の可能性が在り
うる。 本発明者らにより明らかにされたバチラス・チ
ュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白のア
ミノ酸配列をコードする遺伝子の場合も、そのＤＮＡ塩
基配列は、天然の遺伝子のＤＮＡ塩基配列以外にも多数
の可能性があるが、本発明の遺伝子ＤＮＡは、天然のＤ
ＮＡ塩基配列のみに限定されるものではなく、本発明に
より明らかにされた殺虫性蛋白質のアミノ酸配列をコー
ドする他のＤＮＡ塩基配列も含むものである。
をコードする遺伝子ＤＮＡ塩基配列は複数存在する。
その塩基配列は一義的には決まらず多数の可能性が在り
うる。 本発明者らにより明らかにされたバチラス・チ
ュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白のア
ミノ酸配列をコードする遺伝子の場合も、そのＤＮＡ塩
基配列は、天然の遺伝子のＤＮＡ塩基配列以外にも多数
の可能性があるが、本発明の遺伝子ＤＮＡは、天然のＤ
ＮＡ塩基配列のみに限定されるものではなく、本発明に
より明らかにされた殺虫性蛋白質のアミノ酸配列をコー
ドする他のＤＮＡ塩基配列も含むものである。
また遺伝子組換°え技術によれば基本となるＤＮＡの特
定の部位に、該ＤＮＡがコードするものの岱本的な特性
を変化させることなく、あるいはその特性を改善するよ
うに、人為的に変異を起すことができる。本発明により
提供される、天然の塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡある
いは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子ＤＮ
Ａに関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う
ことにより天然の遺伝子と同等あるいは改善された特性
とすることが可能で・あり、本発明は、そのような変異
遺伝子をも含むものである。
定の部位に、該ＤＮＡがコードするものの岱本的な特性
を変化させることなく、あるいはその特性を改善するよ
うに、人為的に変異を起すことができる。本発明により
提供される、天然の塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡある
いは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子ＤＮ
Ａに関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う
ことにより天然の遺伝子と同等あるいは改善された特性
とすることが可能で・あり、本発明は、そのような変異
遺伝子をも含むものである。
本発明のバチラス・チュリンゲンシス・ア・イザワイＩ
ＰＬ株の殺虫性蛋白遺伝子を適当な発現ベクター、例え
ば、Ｌａｃプロモーターを保持する発現ベクターｐＵｃ
１８（ファルマシア社）、大腸菌の強力プロモーターで
あるＴａｃプロモーターとｒｒｂＢリポソームＲＮＡの
ターミネータ−を保持する発現ベクターｐＫＫ２２３−
４、’ｌ’ｒｐプロモーターを保持する発現ベクターｐ
ＤＲ７２０（ファルマシア社）、誘導可能な発現ベクタ
ーｐＰ Ｌ −Ｌａｍｂｄａ （ファルマシア社）等に
接続することにより大腸菌等の微生物菌体内でバチラス
・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白
を生産させる発現ベクターを構築することができる。
ＰＬ株の殺虫性蛋白遺伝子を適当な発現ベクター、例え
ば、Ｌａｃプロモーターを保持する発現ベクターｐＵｃ
１８（ファルマシア社）、大腸菌の強力プロモーターで
あるＴａｃプロモーターとｒｒｂＢリポソームＲＮＡの
ターミネータ−を保持する発現ベクターｐＫＫ２２３−
４、’ｌ’ｒｐプロモーターを保持する発現ベクターｐ
ＤＲ７２０（ファルマシア社）、誘導可能な発現ベクタ
ーｐＰ Ｌ −Ｌａｍｂｄａ （ファルマシア社）等に
接続することにより大腸菌等の微生物菌体内でバチラス
・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白
を生産させる発現ベクターを構築することができる。
本発明の殺虫性蛋白遺伝子を保持する発現ベクターを大
腸菌〔例えば、大腸菌ＪＭ１０３株（ファルマシア社）
等の宿主微生物へ導入するこにより菌体内で殺虫性蛋白
を生産する微生物を得ることができる。
腸菌〔例えば、大腸菌ＪＭ１０３株（ファルマシア社）
等の宿主微生物へ導入するこにより菌体内で殺虫性蛋白
を生産する微生物を得ることができる。
この様にして製造された形質転換微生物を適当な培地、
条件で培養することにより殺虫性蛋白を大量生産するこ
とが可能である。 この場合、培養初期に誘導剤イソプ
ロピルチオガラクトシド等を添加することにより殺虫性
蛋白の生産を有利に行うことができる。
条件で培養することにより殺虫性蛋白を大量生産するこ
とが可能である。 この場合、培養初期に誘導剤イソプ
ロピルチオガラクトシド等を添加することにより殺虫性
蛋白の生産を有利に行うことができる。
墳養後の殺虫性蛋白の単離は、例えば、菌体を超音波で
破砕し、遠心分離することにより殺虫性蛋白から成る′
ａ集体を容易に濃縮、回収することにより行うことがで
きる。
破砕し、遠心分離することにより殺虫性蛋白から成る′
ａ集体を容易に濃縮、回収することにより行うことがで
きる。
また、大腸菌の宿主−ベクター系のみならず、枯草菌、
酵母、シュウトモナス菌あるいは放線凹等の宿主−ベク
ター系も利用可能であり、それぞれの宿主−ベクター系
の特徴を生かした殺虫性蛋白の大量生産が行える。
酵母、シュウトモナス菌あるいは放線凹等の宿主−ベク
ター系も利用可能であり、それぞれの宿主−ベクター系
の特徴を生かした殺虫性蛋白の大量生産が行える。
以下に実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明する。 本
発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、
本発明の技術分野に於ける通常の変更をすることができ
る。
発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、
本発明の技術分野に於ける通常の変更をすることができ
る。
参考例 殺虫性蛋白遺伝子の単離
鱗翅目昆虫コナガおよびハスモンヨトウに対して高い殺
虫活性を示すバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬＮａＴ株の選抜 ステップ１ バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ菌株の純化 アイザワイＩＰＬ株〔ユ・ニス・デパートメント オブ
アグリカルチャー リサーチ サービス（Ｕ、Ｓ、Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ）保管〕をＰＹ平板培
地（トリプトン（シグマ社）１０ｇ、 ＮａＣ１（半
片化学）５ｇ、イーストエキストラクト（シグマ社）５
ｇ、および寒天（シグマ社）１２ｇを加えて１１とし、
作製した寒天培地）上で純化し、得られた純化菌株３２
個につき、プラスミド解析を行った。各々の菌株をｌ
ＱｍｌのＰＹ液体培地（ＰＹ平板培地より寒天を除いた
培地）で２４時間培養後、菌を遠心操作（２０，０００
ｘ ｇ、 ３０分間）により集菌し、Ｂｔｒｎｂｏｉ
ｍとＤｏｌｙ （Ｎｕｃｌ’ｅｔｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅｓ ・’Ｌ １５１３−１５２３、）らの方法に従い
、プラスミドＤＮＡを調製し、０．８％アガロースゲル
電気泳動によりプラスミド解析を行った。その結果、解
析した３２個の純化菌株は同一のプラスミドパターンを
示さず、少なくとも９つの異なるプラスミドパターンに
分 類でき、４．ＯＭｄ、 ４．８Ｍｄ、 ５．４Ｍ
ｄ、 ８．５Ｍｄ、 １２Ｍｄ、 １５Ｍｄ、 １７Ｍ
ｄ、 ２１Ｍｄ、３７Ｍｄ、 ４０Ｍｄ、 ５０Ｍｄ、
５２Ｍｄの１２本のプラスミドＤＮＡバンドが観察さ
れた菌株をアイザワイＩＰＬＮａＴ株と名付けた。
虫活性を示すバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬＮａＴ株の選抜 ステップ１ バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ菌株の純化 アイザワイＩＰＬ株〔ユ・ニス・デパートメント オブ
アグリカルチャー リサーチ サービス（Ｕ、Ｓ、Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ）保管〕をＰＹ平板培
地（トリプトン（シグマ社）１０ｇ、 ＮａＣ１（半
片化学）５ｇ、イーストエキストラクト（シグマ社）５
ｇ、および寒天（シグマ社）１２ｇを加えて１１とし、
作製した寒天培地）上で純化し、得られた純化菌株３２
個につき、プラスミド解析を行った。各々の菌株をｌ
ＱｍｌのＰＹ液体培地（ＰＹ平板培地より寒天を除いた
培地）で２４時間培養後、菌を遠心操作（２０，０００
ｘ ｇ、 ３０分間）により集菌し、Ｂｔｒｎｂｏｉ
ｍとＤｏｌｙ （Ｎｕｃｌ’ｅｔｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅｓ ・’Ｌ １５１３−１５２３、）らの方法に従い
、プラスミドＤＮＡを調製し、０．８％アガロースゲル
電気泳動によりプラスミド解析を行った。その結果、解
析した３２個の純化菌株は同一のプラスミドパターンを
示さず、少なくとも９つの異なるプラスミドパターンに
分 類でき、４．ＯＭｄ、 ４．８Ｍｄ、 ５．４Ｍ
ｄ、 ８．５Ｍｄ、 １２Ｍｄ、 １５Ｍｄ、 １７Ｍ
ｄ、 ２１Ｍｄ、３７Ｍｄ、 ４０Ｍｄ、 ５０Ｍｄ、
５２Ｍｄの１２本のプラスミドＤＮＡバンドが観察さ
れた菌株をアイザワイＩＰＬＮａＴ株と名付けた。
ステップ２ 殺虫試験によるバチラス・チュリンゲンシ
ス・アイザワイＩ Ｐ ＬＮ１７菌株の選抜分類した９
つの純化アイザワイＩＰＬ株をそれぞれ、２枚のＰＹ平
板培地（１５ｃ＋ａ直径）で３０℃７日間培養し、胞子
形成および結晶形成を位相差ｉ微鏡で確認した後、集菌
し、凍結−融解を３回繰り返した後、２ｍｌの蒸留水に
懸濁し、超音波破砕処理を行うことにより、結晶Ｑｉ液
を調製した。 得られた調製液の原液、１０倍希釈液、
１００倍希釈液をそれぞれ１ｍＪずつ、人工飼料に浸み
込ませた後、４令のハスモンヨトウ１０匹に摂食させ、
３日後の死出数を観察した。コナガについても３令の幼
虫を用い、同様の試験を行った。純化菌株アイザワイＩ
ＰＬＮ１７株の結晶懸濁液（１ｍｊ！当たり２．２ Ｘ
１０’胞子を含む）を１ｍｌコナガに与えたとき、ｌ
Ｏ匹中ｌθ匹が死亡し、また′、結晶懸濁液（１ｍ１当
たり２，６ Ｘ １０”胞子を含む）をハスモンヨトウ
に与えたとき、１０匹中１０匹が死亡した。
ス・アイザワイＩ Ｐ ＬＮ１７菌株の選抜分類した９
つの純化アイザワイＩＰＬ株をそれぞれ、２枚のＰＹ平
板培地（１５ｃ＋ａ直径）で３０℃７日間培養し、胞子
形成および結晶形成を位相差ｉ微鏡で確認した後、集菌
し、凍結−融解を３回繰り返した後、２ｍｌの蒸留水に
懸濁し、超音波破砕処理を行うことにより、結晶Ｑｉ液
を調製した。 得られた調製液の原液、１０倍希釈液、
１００倍希釈液をそれぞれ１ｍＪずつ、人工飼料に浸み
込ませた後、４令のハスモンヨトウ１０匹に摂食させ、
３日後の死出数を観察した。コナガについても３令の幼
虫を用い、同様の試験を行った。純化菌株アイザワイＩ
ＰＬＮ１７株の結晶懸濁液（１ｍｊ！当たり２．２ Ｘ
１０’胞子を含む）を１ｍｌコナガに与えたとき、ｌ
Ｏ匹中ｌθ匹が死亡し、また′、結晶懸濁液（１ｍ１当
たり２，６ Ｘ １０”胞子を含む）をハスモンヨトウ
に与えたとき、１０匹中１０匹が死亡した。
従って、アイザワイ ＩＰＬＮｌＴ株は、両害虫に対し
て高い殺虫活性を示すことが明らかとなった。
て高い殺虫活性を示すことが明らかとなった。
ステップ１ 合成りＮＡプローブの作製バチラス・チュ
リンゲンシス・クリスターキ・ＨＤ−ＩＤｉｐｅ１株の
殺虫性蛋白遺伝子の塩基配列（Ｗｈｉｔｅｌｅｙ ら、
Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２６０．６２６４−７２
（１９８５））を参考に合成り Ｎ Ａプローブ（５
′−ＣＡＣ八八へ人ＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＧ−３’ ）
をイ乍製した。アプライド・バイオシステム社のＤＮＡ
合成合成デモデル３８０ＡちいてＤＮＡオリゴマーを合
成した後、ＤＮＡ１７ｉ集バイアルに２７％水酸化アン
モニウムを１ｍｌ加え、５５℃で４時間加温し、濃縮器
にかけ乾固させた。乾固後、１００μｌの０．ＯＩＭ
トリエチルアミン−酢酸（ＴＥＡＡ） （ｐＨ７，２
）に溶解し、逆相ＨＰ Ｌ ＣカラムＣ１８にかけ、ア
セトニトリル−０，１ＭＴＥＡＡ （ｐＨ７，２）の溶
媒系で溶出を行った。２６０ ｎｏ＋の吸収ピーク画分
を分取し、乾固後１００μｌのアセトニトリルで調製し
た８０％酢酸を加え、１５分間放置した。１５分間経過
後、淡オレンジ色を呈したら、乾固し、０．０１Ｍ
ＴＥＡＡ （ｐ［Ｉ７．２ ） １００ ／ｊ ｌを
加え、さらに酢酸エチルを１００μｌ加え、混合した。
リンゲンシス・クリスターキ・ＨＤ−ＩＤｉｐｅ１株の
殺虫性蛋白遺伝子の塩基配列（Ｗｈｉｔｅｌｅｙ ら、
Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２６０．６２６４−７２
（１９８５））を参考に合成り Ｎ Ａプローブ（５
′−ＣＡＣ八八へ人ＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＧ−３’ ）
をイ乍製した。アプライド・バイオシステム社のＤＮＡ
合成合成デモデル３８０ＡちいてＤＮＡオリゴマーを合
成した後、ＤＮＡ１７ｉ集バイアルに２７％水酸化アン
モニウムを１ｍｌ加え、５５℃で４時間加温し、濃縮器
にかけ乾固させた。乾固後、１００μｌの０．ＯＩＭ
トリエチルアミン−酢酸（ＴＥＡＡ） （ｐＨ７，２
）に溶解し、逆相ＨＰ Ｌ ＣカラムＣ１８にかけ、ア
セトニトリル−０，１ＭＴＥＡＡ （ｐＨ７，２）の溶
媒系で溶出を行った。２６０ ｎｏ＋の吸収ピーク画分
を分取し、乾固後１００μｌのアセトニトリルで調製し
た８０％酢酸を加え、１５分間放置した。１５分間経過
後、淡オレンジ色を呈したら、乾固し、０．０１Ｍ
ＴＥＡＡ （ｐ［Ｉ７．２ ） １００ ／ｊ ｌを
加え、さらに酢酸エチルを１００μｌ加え、混合した。
酢酸エチル相をすて、ジエチルエーテル１００μｌを加
え、同様の操作を２回行い、乾固した。
え、同様の操作を２回行い、乾固した。
０、ＯＩＭ ＴＥＡＡ （ａｌｌ ７．２）で溶解し、
再びＨＰ ＬＣによる２６０ｒｖ吸収ピ一ク画分を分取
し、乾固後、１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５） ＋
１ ｍＭＥＤＴＡ （ＴＥ）溶液に溶解した。つぎに
、調製した合成りＮＡプローブのｓｔｐ標識化を行った
。
再びＨＰ ＬＣによる２６０ｒｖ吸収ピ一ク画分を分取
し、乾固後、１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５） ＋
１ ｍＭＥＤＴＡ （ＴＥ）溶液に溶解した。つぎに
、調製した合成りＮＡプローブのｓｔｐ標識化を行った
。
５μｌの合成りＮＡプローブ（約１００ｐｍ１００ｐに
大腸菌ポリヌクレオチドカイネース（宝酒造）を１５ユ
ニツト、１００μＣｉの〔γ−”Ｐ）ＡＴＰ（アマ−ジ
ャム・ジャパン）およびｌＯ倍濃度の反応混液（０，５
？Ｉ トリス−塩酸（ｐＨ７，６） 、０．１ ＭＭ
ｇ Ｃｌ ｇ ０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール
）を１０ｕ’ｌ加えたのち蒸留水を加えて、全容を１０
０μｌとし、３７℃１時間反応後、クロロホルム：フェ
ノール（１： １）を加え混合後、上澄を分取した。分
取した上澄を、ＴＥＩＩ街液（ｐＨ７，５）で平衡化し
たＤＥ−５２カラム（ワットマン社、０．５ｍｌ１のベ
ッドサイズ）にアプライし、３ｍｌのＴＥＩＩ街液（ｐ
Ｈ７，５）で洗浄後、０．７Ｍ Ｎ ａ Ｃ１−ＴＥ
緩街液（ｐＨ７，５）で溶出を行い、放射活性画分を分
取し、３ｔｐ標識合成りＮＡプローブを作製した。
大腸菌ポリヌクレオチドカイネース（宝酒造）を１５ユ
ニツト、１００μＣｉの〔γ−”Ｐ）ＡＴＰ（アマ−ジ
ャム・ジャパン）およびｌＯ倍濃度の反応混液（０，５
？Ｉ トリス−塩酸（ｐＨ７，６） 、０．１ ＭＭ
ｇ Ｃｌ ｇ ０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール
）を１０ｕ’ｌ加えたのち蒸留水を加えて、全容を１０
０μｌとし、３７℃１時間反応後、クロロホルム：フェ
ノール（１： １）を加え混合後、上澄を分取した。分
取した上澄を、ＴＥＩＩ街液（ｐＨ７，５）で平衡化し
たＤＥ−５２カラム（ワットマン社、０．５ｍｌ１のベ
ッドサイズ）にアプライし、３ｍｌのＴＥＩＩ街液（ｐ
Ｈ７，５）で洗浄後、０．７Ｍ Ｎ ａ Ｃ１−ＴＥ
緩街液（ｐＨ７，５）で溶出を行い、放射活性画分を分
取し、３ｔｐ標識合成りＮＡプローブを作製した。
ステップ２ アイザワイＩＰＬ隘７株のプラスミドＤＮ
Ａライブラリーの作製 ２００ ｍ ＩｔのＰＹ液体培地で培養したアイザワイ
［ＰＩｌｌＴ株の菌体を３０ｍｊ！のＧ緩衝液（１０％
グリセロール、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭ）リス−塩酸
（ａｌｌ ８．０） ）で洗浄し、３ｍｌのりゾチーム
（５■／ ｍ ｊ！ ）に懸濁し、３０℃で２時間反応
させた。つぎに、アルカリ溶液（０，２ＮＮ ａ ＯＨ
。
Ａライブラリーの作製 ２００ ｍ ＩｔのＰＹ液体培地で培養したアイザワイ
［ＰＩｌｌＴ株の菌体を３０ｍｊ！のＧ緩衝液（１０％
グリセロール、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭ）リス−塩酸
（ａｌｌ ８．０） ）で洗浄し、３ｍｌのりゾチーム
（５■／ ｍ ｊ！ ）に懸濁し、３０℃で２時間反応
させた。つぎに、アルカリ溶液（０，２ＮＮ ａ ＯＨ
。
１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を１６ｍ１加
え、混合し、室温に１０分間放置したのち、中和溶液（
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｔｌ ４．８） ）を１２ｍ１
加え、４℃に１．５時間放置した。遠心操作（１４，０
０Ｏｒｐｍ、 ２０分間）により上澄を分取し、冷エタ
ノールを７９ｍｊ７加え、−２０℃で１時間放置し、エ
タノール沈澱により、ＤＮＡを回収した。
え、混合し、室温に１０分間放置したのち、中和溶液（
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｔｌ ４．８） ）を１２ｍ１
加え、４℃に１．５時間放置した。遠心操作（１４，０
０Ｏｒｐｍ、 ２０分間）により上澄を分取し、冷エタ
ノールを７９ｍｊ７加え、−２０℃で１時間放置し、エ
タノール沈澱により、ＤＮＡを回収した。
乾固後、５ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウムに懸濁し、Ｔ
Ｅ緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したフェノールによる
処理を２回行ったのち、上澄を分取し、２容の冷エタノ
ールを加え、再度エタノール沈澱した。
Ｅ緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したフェノールによる
処理を２回行ったのち、上澄を分取し、２容の冷エタノ
ールを加え、再度エタノール沈澱した。
さらに、乾固後、６ｍｌのＴＥｉ街液（ｐＨ７，５）に
懸濁し、常法に従って塩化セシウム平衡密度勾配遠心に
より、プラスミドＤＮＡを精製した。
懸濁し、常法に従って塩化セシウム平衡密度勾配遠心に
より、プラスミドＤＮＡを精製した。
つぎに、５μｇのプラスミドＤＮＡを１０ユニツトの制
限酵素ＢａｍＨＩで切断し、等容のフェノール：クロロ
ホルム（１： １）を加え混合した後、上澄をとり、エ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収し、乾固後、２０μｌ
のＴＥ緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁ルた。また、２μｇ
のｐｕｃａベクタープラスミド（ファルマシア社）を５
ユニツトの制限酵素１３ ａ ｍ ＨＩで消化後、同様
の操作でＤＮＡを回収し、２０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ
７，５）に懸濁後、５μｌの大腸菌アルカリホスファタ
ーゼ（宝酒造、２．０ユニツト）、５０μｌの０．１Ｍ
１−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） 、１５μｌの蒸
留水を加えた後、６０℃で１時間インキュベートし、ア
ルカリフォスターゼ処理を行った。反応後、フェノール
−クロロホルム処理を２回行ったのち、上澄を分取し、
エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、２０μｌのＴＥ
緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁した。
限酵素ＢａｍＨＩで切断し、等容のフェノール：クロロ
ホルム（１： １）を加え混合した後、上澄をとり、エ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収し、乾固後、２０μｌ
のＴＥ緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁ルた。また、２μｇ
のｐｕｃａベクタープラスミド（ファルマシア社）を５
ユニツトの制限酵素１３ ａ ｍ ＨＩで消化後、同様
の操作でＤＮＡを回収し、２０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ
７，５）に懸濁後、５μｌの大腸菌アルカリホスファタ
ーゼ（宝酒造、２．０ユニツト）、５０μｌの０．１Ｍ
１−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） 、１５μｌの蒸
留水を加えた後、６０℃で１時間インキュベートし、ア
ルカリフォスターゼ処理を行った。反応後、フェノール
−クロロホルム処理を２回行ったのち、上澄を分取し、
エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、２０μｌのＴＥ
緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁した。
つぎに、１５μｌのＢａｍＨＩ切断プラスミドＤＮΔ溶
液とＬ５ｕｌのＩ３ａｍＨＩ３μｐＵＣ８ヘクターＤＮ
Ａ？容？夜をン昆合１麦、ｌ、ｔ＋ＡのＴ４ＤＮＡ’Ｊ
ガーゼ（宝酒造、０．１ユニツト） 、７．５μｌの０
．１Ｍジチオスレイトール（牛丼化学） 、７．５μｌ
の１０ｍＭアデノシン３リン酸（牛丼化学）、２５μｌ
の３倍濃度反応混液（２００ｍＭ トリス−塩Ｈ（ｐＨ
７，６） ２０ ｍＭＭ ｇ Ｃｊ！ ｚ ）および
５μβの蒸留水を加え、全容７５μｌとし、１４℃で６
時間インキュベートした。得られたりガーゼ反応液１０
μｌを、スコツトらの方法（細胞工学、主、６１６−６
２６．１９８３）で調製した１００μｌの大腸菌ＤＨＩ
株（ＡＴＣＣ３３８４９）のコンビ−テントセルに加え
、０℃で１５分間インキュベートし、４２℃で４０秒間
熱処理したのち、０．９ｍｌのしブロス液体培地（トリ
プトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣ１
５ｇ、グルコース（牛丼化学）Ｉｇを加え、蒸留水で全
容１１とする）を加え、３７℃で１時間インキュベート
し、最終濃度５０μｇ ／ ｍ ｌのアンピシリンを含
むＬプロス平板培地（Ｌプロス液体培地に１．２％とな
るよう寒天を加えたもの）にプレートした。
液とＬ５ｕｌのＩ３ａｍＨＩ３μｐＵＣ８ヘクターＤＮ
Ａ？容？夜をン昆合１麦、ｌ、ｔ＋ＡのＴ４ＤＮＡ’Ｊ
ガーゼ（宝酒造、０．１ユニツト） 、７．５μｌの０
．１Ｍジチオスレイトール（牛丼化学） 、７．５μｌ
の１０ｍＭアデノシン３リン酸（牛丼化学）、２５μｌ
の３倍濃度反応混液（２００ｍＭ トリス−塩Ｈ（ｐＨ
７，６） ２０ ｍＭＭ ｇ Ｃｊ！ ｚ ）および
５μβの蒸留水を加え、全容７５μｌとし、１４℃で６
時間インキュベートした。得られたりガーゼ反応液１０
μｌを、スコツトらの方法（細胞工学、主、６１６−６
２６．１９８３）で調製した１００μｌの大腸菌ＤＨＩ
株（ＡＴＣＣ３３８４９）のコンビ−テントセルに加え
、０℃で１５分間インキュベートし、４２℃で４０秒間
熱処理したのち、０．９ｍｌのしブロス液体培地（トリ
プトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣ１
５ｇ、グルコース（牛丼化学）Ｉｇを加え、蒸留水で全
容１１とする）を加え、３７℃で１時間インキュベート
し、最終濃度５０μｇ ／ ｍ ｌのアンピシリンを含
むＬプロス平板培地（Ｌプロス液体培地に１．２％とな
るよう寒天を加えたもの）にプレートした。
ステップ３ コロニーハイブリダイゼーションによる殺
虫性蛋白遺伝子クローンの単離 プレートに広げたコロニーを２枚のニトロセルロースフ
ィルターにレプリカし、さらにアンピシリン（５０Ｍｇ
／ｍ１）及びクロラムフェニコール（６００μｇ／ｍｌ
）を含む平板プレートに移し、−夜インキエベートした
。１枚のフィルター当り、２．５ｍｌの０．５Ｎ Ｎ
ａ ＯＨを加え、５分間処理し、風乾後、等容の１Ｍ
トリス−塩酸（ｐＨ１７，５）を加え、５分間放置した
。風乾後、さらに２．５ｍｌのＩＭ）リス−塩酸（ｐＨ
７，５）−１，５Ｍ Ｎ ａ Ｃ１２で５分間処理し、
風乾後、８０℃で３時間、真空下で処理した。フィルタ
ー４枚当り、１０ｍｊ＋の０．１％ ５ＤＳ−４ｘＳＳ
Ｃ（ＳＳＣは０．１５Ｍ Ｎａ Ｃｌ−０，０１５Ｍク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）を示す）を加え、６０
℃１５分処理後、フィルター上のコロニーをふきとり、
６ｍｌ１のプレハイブリ溶液（４ＸＳＳＣ，ｌＱｘデン
ハート、１１００ＩＩ／ ｍ ｌサーモンテスティス１
本＠’（ＤＮＡ（シグマ社）；但し、１０×デンハート
は、０．２％フィコール、０．２％、ポリビニルピロリ
ドン、０６２％ＢＳＡを含む溶液である）に浸し、６０
℃で３時間処理した。つぎに上記溶液に、ステップ１で
作製した３２Ｐ標識化合成りＮＡプローブを加えたハイ
ブリ溶液中にフィルターを入れ、５６℃−夜インキユベ
ートした。ハイブリダイゼーション後、５６℃の４ＸＳ
ＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液で１５分間４回洗浄し、フィ
ルターを乾燥させ、Ｘ線フィルムにはさみ、オートラジ
オグラフィを行った。ポジティブシグナルを与えるコロ
ニーをマスタープレートより拾い、再度、同様のコロニ
ーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローン
大腸菌ＤＨＩ／ｐＡＢ６を単離した。
虫性蛋白遺伝子クローンの単離 プレートに広げたコロニーを２枚のニトロセルロースフ
ィルターにレプリカし、さらにアンピシリン（５０Ｍｇ
／ｍ１）及びクロラムフェニコール（６００μｇ／ｍｌ
）を含む平板プレートに移し、−夜インキエベートした
。１枚のフィルター当り、２．５ｍｌの０．５Ｎ Ｎ
ａ ＯＨを加え、５分間処理し、風乾後、等容の１Ｍ
トリス−塩酸（ｐＨ１７，５）を加え、５分間放置した
。風乾後、さらに２．５ｍｌのＩＭ）リス−塩酸（ｐＨ
７，５）−１，５Ｍ Ｎ ａ Ｃ１２で５分間処理し、
風乾後、８０℃で３時間、真空下で処理した。フィルタ
ー４枚当り、１０ｍｊ＋の０．１％ ５ＤＳ−４ｘＳＳ
Ｃ（ＳＳＣは０．１５Ｍ Ｎａ Ｃｌ−０，０１５Ｍク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）を示す）を加え、６０
℃１５分処理後、フィルター上のコロニーをふきとり、
６ｍｌ１のプレハイブリ溶液（４ＸＳＳＣ，ｌＱｘデン
ハート、１１００ＩＩ／ ｍ ｌサーモンテスティス１
本＠’（ＤＮＡ（シグマ社）；但し、１０×デンハート
は、０．２％フィコール、０．２％、ポリビニルピロリ
ドン、０６２％ＢＳＡを含む溶液である）に浸し、６０
℃で３時間処理した。つぎに上記溶液に、ステップ１で
作製した３２Ｐ標識化合成りＮＡプローブを加えたハイ
ブリ溶液中にフィルターを入れ、５６℃−夜インキユベ
ートした。ハイブリダイゼーション後、５６℃の４ＸＳ
ＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液で１５分間４回洗浄し、フィ
ルターを乾燥させ、Ｘ線フィルムにはさみ、オートラジ
オグラフィを行った。ポジティブシグナルを与えるコロ
ニーをマスタープレートより拾い、再度、同様のコロニ
ーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローン
大腸菌ＤＨＩ／ｐＡＢ６を単離した。
単離したポジティブクローン大腸菌ＤＨＩ／ｐＡＢ６か
らＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙらの方法に従って、プラ
スミドｐＡＢ６を単離した。プラスミド ｐｓｔｌ、Ｂ
ｇｌＩＩ、ｐｖｕ ■、ＥｃｏＲＩ、 八ｈａｍ、Ｋ
ｐｎｌ、Ｃ１ａｌを用いて切断し、０゜７％アガロース
電気泳動で分析することにより、インサートＤ Ｎ Ａ
２２．４ｋｂの制限酵素地図を作製した（図３上部
）、 さらに、上述の合成りＮＡプローブを用いたサザ
ン・ハイブリダイゼーション法（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉ
ｏｌ、 ９８．５０３−５１７（１９７５） ）により
、インサートＤＮＡ中の殺虫性蛋白遺伝子領域を特定し
、その領域の詳細な制限酵素地図を作製したく図３下部
）、 続いて、各種制限酵素で切断したＤＮＡ断片をベ
クターｐＵＣ８にサブクローニングした後、旧ｒｎｂｏ
ｉｓ＋とＤｏｌｙらの方法によりＤＮＡ断片を含むプラ
スミドＤＮＡを調製した。
らＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙらの方法に従って、プラ
スミドｐＡＢ６を単離した。プラスミド ｐｓｔｌ、Ｂ
ｇｌＩＩ、ｐｖｕ ■、ＥｃｏＲＩ、 八ｈａｍ、Ｋ
ｐｎｌ、Ｃ１ａｌを用いて切断し、０゜７％アガロース
電気泳動で分析することにより、インサートＤ Ｎ Ａ
２２．４ｋｂの制限酵素地図を作製した（図３上部
）、 さらに、上述の合成りＮＡプローブを用いたサザ
ン・ハイブリダイゼーション法（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉ
ｏｌ、 ９８．５０３−５１７（１９７５） ）により
、インサートＤＮＡ中の殺虫性蛋白遺伝子領域を特定し
、その領域の詳細な制限酵素地図を作製したく図３下部
）、 続いて、各種制限酵素で切断したＤＮＡ断片をベ
クターｐＵＣ８にサブクローニングした後、旧ｒｎｂｏ
ｉｓ＋とＤｏｌｙらの方法によりＤＮＡ断片を含むプラ
スミドＤＮＡを調製した。
得られたＤＮＡを１８μｌのＴＥ （ｐｆ１７．５）に
懸濁後、２μｌの２ＮＮａＯＨを加え、室温で５分間放
置し、８μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムアを加え、１
００μｌの冷エタノールを加え、エタノール沈澱を行っ
た。
懸濁後、２μｌの２ＮＮａＯＨを加え、室温で５分間放
置し、８μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムアを加え、１
００μｌの冷エタノールを加え、エタノール沈澱を行っ
た。
１２．００Ｏｒｐｍで５分間遠心し、沈澱を回収後、乾
固し、０．５ ｐｎ＋ｏｌ／ ５ ｍ ｊ！となるよう
蒸留水に溶解させた。５μｌの二周製したプラスミドＤ
ＮＡ （５ｐｍｏ Ｉ ）に、１．５μβの１０倍容濃
度クレノー緩衝液（宝酒造）、１μｌのプライマーＤＮ
Ａ （ＰＬバイオケミカル社）、４．５μｌの蒸留水を
加え、全容を１２μｌとし、６０℃で１５分間加温後、
室温に２０分間放置した。この反応液に２μｌのＣ４−
”ｒ’） Ａ Ｔ Ｐ （４００Ｃｉ／ｖｗｏｌ、アマ
−ジャム・ジャパン）と１μｌのクレノー断片酵素（宝
酒造、２ユニツト）を加え、混合した。この混合液の３
．２μｌずつを４種類の２μｐのｄＮＴＰ＋ ｄｄＮ
ＴＰ混合液（宝酒造）に加え、４２℃で２０分間放置し
た。各々に１μｌのチェース溶液（宝酒造）を加え、さ
らに、４２℃で２０分間放置した。最後に、６μｌの９
５％ホルムアミド色素（０，１％ブロムフェノールブル
ーと０．１％のキシレンシアツールを含む）を加えた。
固し、０．５ ｐｎ＋ｏｌ／ ５ ｍ ｊ！となるよう
蒸留水に溶解させた。５μｌの二周製したプラスミドＤ
ＮＡ （５ｐｍｏ Ｉ ）に、１．５μβの１０倍容濃
度クレノー緩衝液（宝酒造）、１μｌのプライマーＤＮ
Ａ （ＰＬバイオケミカル社）、４．５μｌの蒸留水を
加え、全容を１２μｌとし、６０℃で１５分間加温後、
室温に２０分間放置した。この反応液に２μｌのＣ４−
”ｒ’） Ａ Ｔ Ｐ （４００Ｃｉ／ｖｗｏｌ、アマ
−ジャム・ジャパン）と１μｌのクレノー断片酵素（宝
酒造、２ユニツト）を加え、混合した。この混合液の３
．２μｌずつを４種類の２μｐのｄＮＴＰ＋ ｄｄＮ
ＴＰ混合液（宝酒造）に加え、４２℃で２０分間放置し
た。各々に１μｌのチェース溶液（宝酒造）を加え、さ
らに、４２℃で２０分間放置した。最後に、６μｌの９
５％ホルムアミド色素（０，１％ブロムフェノールブル
ーと０．１％のキシレンシアツールを含む）を加えた。
常法に従い、６％アクリルアミド・尿素ゲルを作製し、
上記反応液２μｌをアプライし、１７００Ｖで６時間、
電気泳動を行った。ゲルを乾燥後、Ｘ線フィルムにはさ
み、怒光後、塩基配列を読み取った。
上記反応液２μｌをアプライし、１７００Ｖで６時間、
電気泳動を行った。ゲルを乾燥後、Ｘ線フィルムにはさ
み、怒光後、塩基配列を読み取った。
解明した塩基配列を図２に示す、バチラス・チュリンゲ
ンシス・アイザワイＩＰＬＩｋＴ株の殺虫性蛋白遺伝子
は、開始コドンＡＴＧから始まり、ストップコドンＴＡ
Ａで終わる３４６５塩基のコーディング領域をもち、１
１５５のアミノ酸をコードしていた。
ンシス・アイザワイＩＰＬＩｋＴ株の殺虫性蛋白遺伝子
は、開始コドンＡＴＧから始まり、ストップコドンＴＡ
Ａで終わる３４６５塩基のコーディング領域をもち、１
１５５のアミノ酸をコードしていた。
実施例
盪呈
ステップｌ ： ＡｈａｍＤＮＡ断片の調製殺虫性蛋白
遺伝子を含む約１０μｇの組換え体プラスミドｐＡＢ６
に、約３０ユニツトの制限酵素Ａｈａｎ［を加え、３０
ｔｔｌのＡｈａｍ反応液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７，５）、６０ｍＭＮａＣ１，７ｍＭＭｇＣｌ１ｚ 、
１０ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイト−ル〕中で３
７℃１時間反応後、反応液を０．１μｇ ／ ｍ ｌの
臭化エチジウムを含む０．８％の低融点アガロースゲル
（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社製）に供し、ア
ガロース電気泳動を行った。泳動後、紫外線ランプ下で
、３．５Ｋｂの Ａｈａｌ［ｌＤＮＡ断片に相当するゲ
ル部分を切り出し、試験管にとり、６５℃で５分間加熱
した。融解したゲルに２倍量のＴＥ１１衝液（ｌｏｍＭ
）リス−塩酸（ｐＨ８゜０）、０．５ｍＭＥＤＴＡ
）を加え、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノールを加えて、
フェノール抽出を行った。 １０．０００ ｒｐ−で５
分間遠心し、上層を分取した後、１／４０！ｉｔの４Ｍ
ＮａＣｌおよび２倍量のエタノールを加えて、−８０℃
に１０分間放置することによりＤＮＡをエタノール沈澱
した後、１０゜００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、ＤＮＡ
を回収し、１０μｌの蒸留水に懸濁した。
遺伝子を含む約１０μｇの組換え体プラスミドｐＡＢ６
に、約３０ユニツトの制限酵素Ａｈａｎ［を加え、３０
ｔｔｌのＡｈａｍ反応液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７，５）、６０ｍＭＮａＣ１，７ｍＭＭｇＣｌ１ｚ 、
１０ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイト−ル〕中で３
７℃１時間反応後、反応液を０．１μｇ ／ ｍ ｌの
臭化エチジウムを含む０．８％の低融点アガロースゲル
（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社製）に供し、ア
ガロース電気泳動を行った。泳動後、紫外線ランプ下で
、３．５Ｋｂの Ａｈａｌ［ｌＤＮＡ断片に相当するゲ
ル部分を切り出し、試験管にとり、６５℃で５分間加熱
した。融解したゲルに２倍量のＴＥ１１衝液（ｌｏｍＭ
）リス−塩酸（ｐＨ８゜０）、０．５ｍＭＥＤＴＡ
）を加え、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノールを加えて、
フェノール抽出を行った。 １０．０００ ｒｐ−で５
分間遠心し、上層を分取した後、１／４０！ｉｔの４Ｍ
ＮａＣｌおよび２倍量のエタノールを加えて、−８０℃
に１０分間放置することによりＤＮＡをエタノール沈澱
した後、１０゜００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、ＤＮＡ
を回収し、１０μｌの蒸留水に懸濁した。
ステップ２：ベクターの調製
１μｇの発現ベクターｐＵｃ１８（ファルマシア社）に
、１ユニツトの制限酵素ＨｉｎｃＩＩ （宝酒造）を加
え、２０ｐｌのＩｆ ｉ ｎ ｃ ｆ１反応液（１０ｍ
Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ７，４）、１００ｍＭＮａ Ｃｊ
！、 ７ ｍＭＭｇ Ｃ１２、１０ｍＭジチオスレイ
トール〕中で３７℃１時間反応した。反応後、反応液に
等量のフェノール・クロロホルム（ｌ：１）混液を加え
、混合し、１０，０００ ｒｐｍで５分間遠心後、上澄
を分取した。つぎに、２倍量の冷エタノールを加えて、
−８０℃に１５分間放置した後、１０．０００ ｒｐｖ
ａで１０分間遠心し、ＤＮＡを回収し、１０μｌの蒸留
水に懸濁した。
、１ユニツトの制限酵素ＨｉｎｃＩＩ （宝酒造）を加
え、２０ｐｌのＩｆ ｉ ｎ ｃ ｆ１反応液（１０ｍ
Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ７，４）、１００ｍＭＮａ Ｃｊ
！、 ７ ｍＭＭｇ Ｃ１２、１０ｍＭジチオスレイ
トール〕中で３７℃１時間反応した。反応後、反応液に
等量のフェノール・クロロホルム（ｌ：１）混液を加え
、混合し、１０，０００ ｒｐｍで５分間遠心後、上澄
を分取した。つぎに、２倍量の冷エタノールを加えて、
−８０℃に１５分間放置した後、１０．０００ ｒｐｖ
ａで１０分間遠心し、ＤＮＡを回収し、１０μｌの蒸留
水に懸濁した。
ステップ１およびステップ２で調製したＡｈａｎｌＤＮ
Ａ断片および発現ベクターｐＵｃ１８をそれぞれ１μｇ
ずつ混合し、７．２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加え、４５μ！のりガーゼ反応液（６６ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７，６）。
Ａ断片および発現ベクターｐＵｃ１８をそれぞれ１μｇ
ずつ混合し、７．２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加え、４５μ！のりガーゼ反応液（６６ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７，６）。
６．６ｍＭ Ｍ ｇ Ｃｌ ｚ、 １０ｍＭジチオスレ
イトール、１゜０ｍＭＡＴＰ）中で１６℃、２時間反応
した。その後、 Ｃｏｈｅｎらの方法に従い、反応液を
大腸菌ＪＭ１０３（ファルマシア社）に形質転換した。
イトール、１゜０ｍＭＡＴＰ）中で１６℃、２時間反応
した。その後、 Ｃｏｈｅｎらの方法に従い、反応液を
大腸菌ＪＭ１０３（ファルマシア社）に形質転換した。
出現したアンピシリン耐性コロニーを培養し、Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍらの方法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。
ｂｏｉｍらの方法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。
約ｌμｇのプラスミドＤＮＡに、３ユニツトの制限酵素
Ｈｉ ｎ ｄ ｍを加え、Ｈｉ ｎ ｄ ［［反応液（
１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐｌ！ ７．５）、６０ ｍ
Ｍ Ｎ ａＣｌ −１０ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｌ ｚ
１ ｍ Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００μｇ７
ｍｌ牛血”清アルブミン）中で３７℃１時間反応し、ア
ガロース電気泳動で分析した。 アガロース電気泳動の
結果より、発現ベクターのＬａｃプロモーターと順方向
に殺虫性蛋白遺伝子が接続した発現プラスミドをｐ Ａ
Ｈ８とし、逆方向に接続した発現プラスミドをｐＡＨ
７とした（図１参照）− ステップ１：殺虫性蛋白遺伝子を含むＰｓ ｔ ｒ −
ＢａｍＨＩ断片の調製 殺虫性蛋白遺伝子を含む約５μｇの発現プラスミドｐＡ
Ｈ８に、約２０ユニツトの制限酵素上土工！および約２
０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩを加え、５０ｔｔｌｌ
のＰｓｔ１反応液（１０ｍＭトリス−塩酸（１）Ｈ７，
５）、５０ｍＭＮａＣｊ！、１０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ
ｌ ｔ 、１ ｍ Ｍ ２−メルカプトエタノール、１
００μｇ ／ ｍ １２牛血清アルブミン〕中で３７℃
１時間反応後、３０μｌのＴＥ緩街液で飽和したフェノ
ールを加えて、フェノール抽出を行った。 １０．００
０ ｒｐｔｓで５分間遠心し、上層を分取後、１／４０
量の４ｍＭ ＮａＣ１および２倍量のエタノールを加
えて、−８０℃に１０分間放置した。
Ｈｉ ｎ ｄ ｍを加え、Ｈｉ ｎ ｄ ［［反応液（
１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐｌ！ ７．５）、６０ ｍ
Ｍ Ｎ ａＣｌ −１０ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｌ ｚ
１ ｍ Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００μｇ７
ｍｌ牛血”清アルブミン）中で３７℃１時間反応し、ア
ガロース電気泳動で分析した。 アガロース電気泳動の
結果より、発現ベクターのＬａｃプロモーターと順方向
に殺虫性蛋白遺伝子が接続した発現プラスミドをｐ Ａ
Ｈ８とし、逆方向に接続した発現プラスミドをｐＡＨ
７とした（図１参照）− ステップ１：殺虫性蛋白遺伝子を含むＰｓ ｔ ｒ −
ＢａｍＨＩ断片の調製 殺虫性蛋白遺伝子を含む約５μｇの発現プラスミドｐＡ
Ｈ８に、約２０ユニツトの制限酵素上土工！および約２
０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩを加え、５０ｔｔｌｌ
のＰｓｔ１反応液（１０ｍＭトリス−塩酸（１）Ｈ７，
５）、５０ｍＭＮａＣｊ！、１０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ
ｌ ｔ 、１ ｍ Ｍ ２−メルカプトエタノール、１
００μｇ ／ ｍ １２牛血清アルブミン〕中で３７℃
１時間反応後、３０μｌのＴＥ緩街液で飽和したフェノ
ールを加えて、フェノール抽出を行った。 １０．００
０ ｒｐｔｓで５分間遠心し、上層を分取後、１／４０
量の４ｍＭ ＮａＣ１および２倍量のエタノールを加
えて、−８０℃に１０分間放置した。
１０．０００ ｒｐｍで１０分間遠心後、ＤＮＡを回収
し、乾固させたのち、２０μｌの蒸留水に懸濁した。
し、乾固させたのち、２０μｌの蒸留水に懸濁した。
ステップ２：ベクターの調製
約５μｇの発現ベクターｐＫＫ２２３−３ （ファルマ
シア社製）に、０．１ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩ
（宝酒造）を加え、ＢａｍＨＩ反応液（１０ｍＭｌ−
リス−塩酸（ｐ ）Ｉ８．Ｏ） 、？ ｍＭＭｇＣｌｚ
、１００ｍＭＮａｃｊ！、２ｍＭ２−／ルカプトエタノ
ール、 ｏ、ｏｉ％ウシ血清シルブミン〕中で、３７℃
１５分間反応した。反応液を０゜１μｇ ／ ｍ ｌの
臭化エチジウムを含む０．８％の低融点アガロースゲル
に供し、電気泳動を行った。
シア社製）に、０．１ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩ
（宝酒造）を加え、ＢａｍＨＩ反応液（１０ｍＭｌ−
リス−塩酸（ｐ ）Ｉ８．Ｏ） 、？ ｍＭＭｇＣｌｚ
、１００ｍＭＮａｃｊ！、２ｍＭ２−／ルカプトエタノ
ール、 ｏ、ｏｉ％ウシ血清シルブミン〕中で、３７℃
１５分間反応した。反応液を０゜１μｇ ／ ｍ ｌの
臭化エチジウムを含む０．８％の低融点アガロースゲル
に供し、電気泳動を行った。
泳動後、紫外線ランプ下で、ｐＫＫ２２３−３が保持す
る２個の３μｍＨＩ認識部位のうち、１つのみ切断され
たと推定さ２れるＤＮＡ分子（４，６Ｋｂ）を切り出し
、試験管にとり、６５℃で５分間加熱した。ゲルを融解
し、フェノール抽出後、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡ
を回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁した。−調製したＤ
ＮＡ溶液に、最終濃度３ｍＭの４種デオキシリボヌクレ
オチドおよび５ユニツトの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
ラージフラグメントを加え、６０μｌの）（ｉ ｎｄｌ
［［反応液〔１０ｍＭトリス−塩酸（ｐ Ｈ７，５）、
６０ｍＭＮａｃｌ、１０ｍＭＭｇＣｊ２ｚ 、１ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、１００μｇ ／ ｍ Ｉ
ｔ牛血清アルブミン〕中で、２５℃、２時間反応後、フ
ェノール抽出、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを回収し
、２０μｌの蒸留水に懸濁した。約ｌμｇの回収したＤ
ＮＡに、３ユニツトＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加
え、４５μｌのりガーゼ反応液（６６ｍＭトリス−塩酸
（ｐ Ｈ７，６）、 ６．６ ｍＭＭｇＣｆ！ｚ 、１
０ｍＭジチオスレイトール、ｌ。
る２個の３μｍＨＩ認識部位のうち、１つのみ切断され
たと推定さ２れるＤＮＡ分子（４，６Ｋｂ）を切り出し
、試験管にとり、６５℃で５分間加熱した。ゲルを融解
し、フェノール抽出後、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡ
を回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁した。−調製したＤ
ＮＡ溶液に、最終濃度３ｍＭの４種デオキシリボヌクレ
オチドおよび５ユニツトの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
ラージフラグメントを加え、６０μｌの）（ｉ ｎｄｌ
［［反応液〔１０ｍＭトリス−塩酸（ｐ Ｈ７，５）、
６０ｍＭＮａｃｌ、１０ｍＭＭｇＣｊ２ｚ 、１ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、１００μｇ ／ ｍ Ｉ
ｔ牛血清アルブミン〕中で、２５℃、２時間反応後、フ
ェノール抽出、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを回収し
、２０μｌの蒸留水に懸濁した。約ｌμｇの回収したＤ
ＮＡに、３ユニツトＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加
え、４５μｌのりガーゼ反応液（６６ｍＭトリス−塩酸
（ｐ Ｈ７，６）、 ６．６ ｍＭＭｇＣｆ！ｚ 、１
０ｍＭジチオスレイトール、ｌ。
ＯｍＭＡＴＰ）中で１６℃、２時間反応した。その後、
コーエンらの方法に従い、反応液を大腸苗ＪＭ１０３株
に形質転換した。出現したアンピシリン耐性コロニーを
培養し、Ｂｉｒｎｂｏｉｍらの方法に従い、プラスミド
ＤＮＡを調製した。約１μｇのプラスミドＤＮＡに、３
ユニツトの制限酵素旦土工ＨＩを加え、ｌ１ｍＨＩ反応
液中で３７℃、１時間反応し、アガロース電気泳動で分
析した。解析したプラスミドのうち、ｐＫＫ２２３−３
プラスミドのマルチ・クローニング部位のＢａｍＨＩ部
位が保存されており、他のＢａｍＨ１部位が消失してい
るプラスミドを選択し、ｐＫＫ２２３−４とした。つぎ
に、約５μｇのｐＫＫ２２３−４ＤＮＡに、１０ユニツ
トの制限酵素Ｐｓｔｌおよび１０ユニツトの制限酵素Ｂ
ａｍＨＩを加え、５０μｌのＰｓＬＴ反応液（１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐ Ｈ７，５）、 ５０ ｍＭＮ ａ
Ｃｌ、１０ｍＭＭｇＣ１ｚ＋ １ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、１００μｇ ／ ｍ １牛血清アルブミ
ン〕中で、３７℃、１時間反応後、フェノール抽出、エ
タノール沈澱を行った後、ＤＮＡを回収し、２０μｌの
１留水に懸濁した。
コーエンらの方法に従い、反応液を大腸苗ＪＭ１０３株
に形質転換した。出現したアンピシリン耐性コロニーを
培養し、Ｂｉｒｎｂｏｉｍらの方法に従い、プラスミド
ＤＮＡを調製した。約１μｇのプラスミドＤＮＡに、３
ユニツトの制限酵素旦土工ＨＩを加え、ｌ１ｍＨＩ反応
液中で３７℃、１時間反応し、アガロース電気泳動で分
析した。解析したプラスミドのうち、ｐＫＫ２２３−３
プラスミドのマルチ・クローニング部位のＢａｍＨＩ部
位が保存されており、他のＢａｍＨ１部位が消失してい
るプラスミドを選択し、ｐＫＫ２２３−４とした。つぎ
に、約５μｇのｐＫＫ２２３−４ＤＮＡに、１０ユニツ
トの制限酵素Ｐｓｔｌおよび１０ユニツトの制限酵素Ｂ
ａｍＨＩを加え、５０μｌのＰｓＬＴ反応液（１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐ Ｈ７，５）、 ５０ ｍＭＮ ａ
Ｃｌ、１０ｍＭＭｇＣ１ｚ＋ １ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、１００μｇ ／ ｍ １牛血清アルブミ
ン〕中で、３７℃、１時間反応後、フェノール抽出、エ
タノール沈澱を行った後、ＤＮＡを回収し、２０μｌの
１留水に懸濁した。
ステップ３：発現プラスミドｐＴＢ１の構築ステップｌ
およびステップ２で調製したＰｓｔｌ−ＢａｍＨＩ切断
ＤＮＡ断片およびベクターｐｋｋ２２３−４をそれぞれ
１ｇｇずつ混合し、７゜２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造）を加え、４５μｌのりガーゼ反応液（６６
ｍＭｌ−リス−塩酸（ｐＨ７，６）、 ６．６ｍＭＭ
ｇ（１！ｚ 、 １０ｍＭジチオスレイトール、１
ＯｍＭＡＴＰ）中で１６℃、２時間反応した。コーエン
らの方法に従い、反応液を大腸菌ＪＭ１０３株に形質転
換した。出現したアンピシリン耐性コロニーを培養し、
プラスミドＤＮＡを調製した。約１μｇのプラスミドＤ
ＮＡに、３ユニツトの制限酵素ＢａｍＨｒを加え、３０
ｔｔｌのＢａｍＨＩ反応液中で３７℃、１時間反応し、
アガロース電気泳動で分析した。アガロース電気泳動の
結果より、発現ベクターのＴａｃプロモーターの下流に
、殺虫性蛋白遺伝子が接続したプラスミドを選択し、こ
れを発現プラスミドｐＴＢ１とした（図１参照）。
およびステップ２で調製したＰｓｔｌ−ＢａｍＨＩ切断
ＤＮＡ断片およびベクターｐｋｋ２２３−４をそれぞれ
１ｇｇずつ混合し、７゜２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造）を加え、４５μｌのりガーゼ反応液（６６
ｍＭｌ−リス−塩酸（ｐＨ７，６）、 ６．６ｍＭＭ
ｇ（１！ｚ 、 １０ｍＭジチオスレイトール、１
ＯｍＭＡＴＰ）中で１６℃、２時間反応した。コーエン
らの方法に従い、反応液を大腸菌ＪＭ１０３株に形質転
換した。出現したアンピシリン耐性コロニーを培養し、
プラスミドＤＮＡを調製した。約１μｇのプラスミドＤ
ＮＡに、３ユニツトの制限酵素ＢａｍＨｒを加え、３０
ｔｔｌのＢａｍＨＩ反応液中で３７℃、１時間反応し、
アガロース電気泳動で分析した。アガロース電気泳動の
結果より、発現ベクターのＴａｃプロモーターの下流に
、殺虫性蛋白遺伝子が接続したプラスミドを選択し、こ
れを発現プラスミドｐＴＢ１とした（図１参照）。
３、− での′ １性 白゛ 云 の生構築した各発
現プラスミドｐＡＨ？、 ｐＡＨ８およびｐＴＢｌを
Ｃｏｈｅｎらの方法に従い、大腸菌ＪＭ１０３株へ導入
した。
現プラスミドｐＡＨ？、 ｐＡＨ８およびｐＴＢｌを
Ｃｏｈｅｎらの方法に従い、大腸菌ＪＭ１０３株へ導入
した。
得られた大腸菌組換え体ＪＭＩ ０３／ｐＡＨ７゜ＪＭ
Ｉ ０３／ｐＡＨ８およびＪＭ１０３／ｐＴＢ１が生産
するバチ与ス、チュリゲンシス、アイザワイＩＰＬ株の
殺虫性蛋白の同定・分析を以下の如く行った。
Ｉ ０３／ｐＡＨ８およびＪＭ１０３／ｐＴＢ１が生産
するバチ与ス、チュリゲンシス、アイザワイＩＰＬ株の
殺虫性蛋白の同定・分析を以下の如く行った。
各大腸菌をＬプロス液体培地（１０ｇのトリプトン（デ
ィフコ社）、５ｇのＮａＣ１’、５ｇのイーストエキス
トラクト（ディフコ社）を１１の蒸留水に溶解させた培
地〕中で一夜培養する。０゜１ｍｌの終夜培養液を、１
０ｍ１のしブロス液体培地に移し、３７℃で培養し、Ｏ
Ｄ６６０ｎｎ＋の値が０．１に達した時、最終濃度２ｍ
Ｍのイソプロピルチオガラクトシドを添加する。さらに
、３７℃で培養を継続し、２０時間後、培養液０．３ｍ
ｊ！を分取し、遠心操作（３，００Ｏｒｐｍ、 １５分
）により菌を集め、５０μｌのサンプル緩衝液（６２，
５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８，０）、２％（ｗ／ｗ）
ドデシル硫酸ナトリウム、５％（ｖ／ｖ） ２−
メルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール
、０．Ｏ１％ブロムフェノールブルー〕に懸濁後、１０
０℃で５分間熱処理し、Ｌａｅｍｎ＋ｌｉ らの方法（
Ｎａｔｕｒｅ ２２７．６８０−６８５）に従って、
５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけた。泳動後
、ゲルをクーマージ−ブリリアントブルーで染色し、脱
気、乾燥後、口紙に固定した。その結果、発現プラスミ
ドを含む大腸菌ＪＭ１０３株では、分子ｆｆ１１２５に
の殺虫性蛋白バンドが検出され、この蛋白バンドは抗殺
虫性蛋白抗体（ＩｇＧ）と特異的な交叉反応を示した。
ィフコ社）、５ｇのＮａＣ１’、５ｇのイーストエキス
トラクト（ディフコ社）を１１の蒸留水に溶解させた培
地〕中で一夜培養する。０゜１ｍｌの終夜培養液を、１
０ｍ１のしブロス液体培地に移し、３７℃で培養し、Ｏ
Ｄ６６０ｎｎ＋の値が０．１に達した時、最終濃度２ｍ
Ｍのイソプロピルチオガラクトシドを添加する。さらに
、３７℃で培養を継続し、２０時間後、培養液０．３ｍ
ｊ！を分取し、遠心操作（３，００Ｏｒｐｍ、 １５分
）により菌を集め、５０μｌのサンプル緩衝液（６２，
５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８，０）、２％（ｗ／ｗ）
ドデシル硫酸ナトリウム、５％（ｖ／ｖ） ２−
メルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール
、０．Ｏ１％ブロムフェノールブルー〕に懸濁後、１０
０℃で５分間熱処理し、Ｌａｅｍｎ＋ｌｉ らの方法（
Ｎａｔｕｒｅ ２２７．６８０−６８５）に従って、
５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけた。泳動後
、ゲルをクーマージ−ブリリアントブルーで染色し、脱
気、乾燥後、口紙に固定した。その結果、発現プラスミ
ドを含む大腸菌ＪＭ１０３株では、分子ｆｆ１１２５に
の殺虫性蛋白バンドが検出され、この蛋白バンドは抗殺
虫性蛋白抗体（ＩｇＧ）と特異的な交叉反応を示した。
ゲル上の各蛋白バンドをデンシトメーターで測定したと
ころ、大腸菌ＪＭ１０３／ｐＡＨ７，ＪＭ１０３／ｐＡ
Ｈ８およびＪＭＩ ０３／ｐＴＢ １は、それぞれ全菌
体蛋白あたり１％、８％、１４％の殺虫性蛋白を生産し
た（図４参照）。従って、これらの大腸菌組換え体は、
効率よくバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ・Ｉ
ＰＬ株の殺虫性蛋白を産生じていることが、確認された
。
ころ、大腸菌ＪＭ１０３／ｐＡＨ７，ＪＭ１０３／ｐＡ
Ｈ８およびＪＭＩ ０３／ｐＴＢ １は、それぞれ全菌
体蛋白あたり１％、８％、１４％の殺虫性蛋白を生産し
た（図４参照）。従って、これらの大腸菌組換え体は、
効率よくバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ・Ｉ
ＰＬ株の殺虫性蛋白を産生じていることが、確認された
。
４、 腸菌で生産された殺虫性蛋白の調１ｔａ大腸菌を
Ｌブロス液体培地中で一夜培養した００１ｍ１の終夜培
養液を、ｌ Ｑｍｊ！のＬプロス培地に移し、３７℃で
培養し、ＯＤ６６０ｎｍの値が０．１に達した時、最終
濃度２ｍＭのイソプロピルチオガラクトシドを添加した
。さらに、培養を続け、培養液５ ｍ ｌを分取し、３
．００Ｏｒｐｍ、 １５分間遠心し、菌を集め、−８
０℃で凍結させた。次に、室温で融解させ、この操作を
３回繰り返した後、２ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リ
ス−塩酸（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、
３０秒で３回の超音波処理を行った。次に、この粗抽出
液を、７ 、００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、沈澱を集
めた。この沈澱画分を、電気泳動用サンプル緩衝液に懸
濁し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、この沈澱画
分に含まれる蛋白の約８０％が殺虫性蛋白であった。従
って、上記調製法を用いることにより、容易に、効率よ
く殺虫性蛋白を調製することが出来ることが明らかとな
った。 なお、この調製法は、大量の培養液について有
効であることを確認している。
Ｌブロス液体培地中で一夜培養した００１ｍ１の終夜培
養液を、ｌ Ｑｍｊ！のＬプロス培地に移し、３７℃で
培養し、ＯＤ６６０ｎｍの値が０．１に達した時、最終
濃度２ｍＭのイソプロピルチオガラクトシドを添加した
。さらに、培養を続け、培養液５ ｍ ｌを分取し、３
．００Ｏｒｐｍ、 １５分間遠心し、菌を集め、−８
０℃で凍結させた。次に、室温で融解させ、この操作を
３回繰り返した後、２ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リ
ス−塩酸（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、
３０秒で３回の超音波処理を行った。次に、この粗抽出
液を、７ 、００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、沈澱を集
めた。この沈澱画分を、電気泳動用サンプル緩衝液に懸
濁し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、この沈澱画
分に含まれる蛋白の約８０％が殺虫性蛋白であった。従
って、上記調製法を用いることにより、容易に、効率よ
く殺虫性蛋白を調製することが出来ることが明らかとな
った。 なお、この調製法は、大量の培養液について有
効であることを確認している。
図１は、発現プラスミドｐＡＨ？、 ｐＡＩＩ８、お
よびｐＴＢｌの構築方法を示している。 黒色、縦線、
横線、白色およびドツトを含むそれぞれのボックスは、
殺虫性蛋白遺伝子、Ｌａｃプロモーター、リポソームＲ
ＮＡターミネータ−１Ｔａｃプロモーターおよび１ａｃ
Ｚ遺伝子を示している。 ＡＴＧおよびＴＡＡは殺虫性蛋白遺伝子のそれぞれ開始
コドン、終止コドンである。Ａｈ、Ｋｐ。 ｐｖ、Ｂｍ、Ｈｃ、Ｐｓは、制限酵素ＡｈａＩ［Ｉ、基
エユＩ 、 Ｐ ｖ ｕ ＩＦ、ＢａｍＨＩ、Ｈｉ ｎ
ｃ ■、およびＰｓｔｌを示す。 図２は、殺虫性蛋白遺伝子の構造遺伝子部分の３４６５
塩基からなる全塩基配列を示す。 上段は塩基配列を下
段はそれから推定されるアミノ酸配列を示す。 塩基配
列中、塩基番号１番目から３４６５番目までの領域が殺
虫性蛋白質遺伝子の構造遺伝子をコードする領域である
。 図３は、プラスミドｐＡＢ６のインサートＤＮＡ（２２
，４ｋｂ）の制限酵素地図を示す、 アイザワイＩＰＬ
株殺虫性蛋白遺伝子領域を大枠で示す、 図の下部は、
殺虫性蛋白遺伝子領域の詳細な制限酵素部位を示してい
る。 図４は、発現した殺虫性蛋白の定量を、デンシトメータ
ーで行った結果である。（１）、 （２）、 （３１は
各々、ＪＭ１０３／ｐＡＨ？、ＪＭ１０３／ｐＡＩ（８
およびＪＭＩ Ｏ３／ｐＴＢ １の菌体粗抽出液中の殺
虫性蛋白を測定したものである。矢印のピークが、殺虫
性蛋白バンドに相当する。 冗 ５、補正の対象 手続補正書（自発） 昭和６１年４月１５日
よびｐＴＢｌの構築方法を示している。 黒色、縦線、
横線、白色およびドツトを含むそれぞれのボックスは、
殺虫性蛋白遺伝子、Ｌａｃプロモーター、リポソームＲ
ＮＡターミネータ−１Ｔａｃプロモーターおよび１ａｃ
Ｚ遺伝子を示している。 ＡＴＧおよびＴＡＡは殺虫性蛋白遺伝子のそれぞれ開始
コドン、終止コドンである。Ａｈ、Ｋｐ。 ｐｖ、Ｂｍ、Ｈｃ、Ｐｓは、制限酵素ＡｈａＩ［Ｉ、基
エユＩ 、 Ｐ ｖ ｕ ＩＦ、ＢａｍＨＩ、Ｈｉ ｎ
ｃ ■、およびＰｓｔｌを示す。 図２は、殺虫性蛋白遺伝子の構造遺伝子部分の３４６５
塩基からなる全塩基配列を示す。 上段は塩基配列を下
段はそれから推定されるアミノ酸配列を示す。 塩基配
列中、塩基番号１番目から３４６５番目までの領域が殺
虫性蛋白質遺伝子の構造遺伝子をコードする領域である
。 図３は、プラスミドｐＡＢ６のインサートＤＮＡ（２２
，４ｋｂ）の制限酵素地図を示す、 アイザワイＩＰＬ
株殺虫性蛋白遺伝子領域を大枠で示す、 図の下部は、
殺虫性蛋白遺伝子領域の詳細な制限酵素部位を示してい
る。 図４は、発現した殺虫性蛋白の定量を、デンシトメータ
ーで行った結果である。（１）、 （２）、 （３１は
各々、ＪＭ１０３／ｐＡＨ？、ＪＭ１０３／ｐＡＩ（８
およびＪＭＩ Ｏ３／ｐＴＢ １の菌体粗抽出液中の殺
虫性蛋白を測定したものである。矢印のピークが、殺虫
性蛋白バンドに相当する。 冗 ５、補正の対象 手続補正書（自発） 昭和６１年４月１５日
Claims (12)
- （１）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
株の殺虫性蛋白遺伝子を含みこれを微生物菌体内で発現
させる発現プラスミド - （２）遺伝子が図２に記載のアミノ酸配列で特定される
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のプラスミ
ド - （３）遺伝子が図２に記載の塩基配列で特定されること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のプラスミド - （４）ｐＡＨ７、ｐＡＨ８若しくはｐＴＢ１と命名した
特許請求の範囲第１項記載の発現プラスミド - （５）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
株の殺虫性蛋白遺伝子を含みこれを微生物菌体内で発現
させる発現プラスミドにより形質転換され殺虫性蛋白を
生産する微生物 - （６）遺伝子が図２に記載のアミノ酸配列で特定される
ことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の微生物 - （７）遺伝子が図２に記載の塩基配列で特定されること
を特徴とする特許請求の範囲第５項記載の微生物 - （８）ｐＡＨ７、ｐＡＨ８若しくはｐＴＢ１と命名した
発現プラスミドを保持する特許請求の範囲第５項記載の
微生物 - （９）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
株の殺虫性蛋白遺伝子を含みこれを微生物菌体内で発現
させる発現プラスミドにより形質転換され殺虫性蛋白を
生産する微生物を培養することを特徴とする殺虫性蛋白
の製造方法 - （１０）遺伝子が図２に記載のアミノ酸配列で特定され
ることを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の製造方
法 - （１１）遺伝子が図２に記載の塩基配列で特定されるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の製造方法 - （１２）ｐＡＨ７、ｐＡＨ８若しくはｐＴＢ１と命名し
た発現プラスミドを保持する微生物を培養することを特
徴とする特許請求の範囲第９項記載の製造方法
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61024563A JPS62181784A (ja) | 1986-02-06 | 1986-02-06 | 殺虫性蛋白遺伝子の大腸菌内発現による殺虫 |
| KR1019860008775A KR870004140A (ko) | 1985-10-28 | 1986-10-20 | 살충성 단백질 유전자의 숙주 세포내 발현에 의한 바실러스 튜린지엔시스아이자와이 ipl 아종의 살충성 단백질 제조방법 |
| EP86308180A EP0224331B1 (en) | 1985-10-28 | 1986-10-21 | Production of insecticidal protein of bacillus thuringiensis subsp. aizawai ipl by the expression of insecticidal protein gene in host cells |
| DE8686308180T DE3682166D1 (de) | 1985-10-28 | 1986-10-21 | Herstellung von insektizidprotein von bacillus thuringiensis subsp. aizawai ipl durch die expression von insektizidprotein-gen in wirtszellen. |
| US07/715,741 US5231008A (en) | 1985-10-28 | 1991-06-18 | Production of insecticidal protein of bacillus thuringiensis subsp. aizawal IPL by the expression of insecticidal protein gene in host cells |
| US08/233,962 USRE35714E (en) | 1985-10-28 | 1994-04-28 | Production of insecticidal protein of Bacillus thuringiensis subsp. aizawai by the expression of insecticidal protein gene in host cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61024563A JPS62181784A (ja) | 1986-02-06 | 1986-02-06 | 殺虫性蛋白遺伝子の大腸菌内発現による殺虫 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62181784A true JPS62181784A (ja) | 1987-08-10 |
Family
ID=12141621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61024563A Pending JPS62181784A (ja) | 1985-10-28 | 1986-02-06 | 殺虫性蛋白遺伝子の大腸菌内発現による殺虫 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62181784A (ja) |
-
1986
- 1986-02-06 JP JP61024563A patent/JPS62181784A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Benson et al. | Intragenic regions required for LamB export. | |
| JP3122642B2 (ja) | 虫害抵抗性植物 | |
| Alley et al. | Genetic analysis of a temporally transcribed chemotaxis gene cluster in Caulobacter crescentus. | |
| EP0013828A1 (en) | Recombinant DNA, hosts transformed with it and processes for the preparation of polypeptides | |
| JPH04503151A (ja) | ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター | |
| JPH07170978A (ja) | レンニンの製造方法 | |
| US4801536A (en) | Method for producing heterologous proteins | |
| JPS62500700A (ja) | ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造 | |
| US4642333A (en) | Immunologically reactive non-glycosylated amino acid chains of glycoprotein B of herpes virus types 1 and 2 | |
| Rhode 3rd | Construction of a genetic switch for inducible trans-activation of gene expression in eucaryotic cells | |
| JPS58150517A (ja) | Ｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子およびヒト血清アルブミン様ポリペプチドの製造方法 | |
| US4634678A (en) | Plasmid cloning and expression vectors for use in microorganisms | |
| Click et al. | Translational control of exported proteins that results from OmpC porin overexpression | |
| US5312901A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| JP2504723B2 (ja) | 組換体ｄｎａとこれを含むプラスミドベクタ―とこのような組換体ｄｎａを保持する大腸菌 | |
| CA1338605C (en) | Gene encoding insecticidal protein and production of said protein using said gene | |
| Müller et al. | Cloning of mglB, the structural gene for the galactose-binding protein of Salmonella typhimurium and Escherichia coli | |
| JPS62181784A (ja) | 殺虫性蛋白遺伝子の大腸菌内発現による殺虫 | |
| EP0224331B1 (en) | Production of insecticidal protein of bacillus thuringiensis subsp. aizawai ipl by the expression of insecticidal protein gene in host cells | |
| JPH0771492B2 (ja) | グラム陽性細菌の熱誘導性遺伝子発現方法 | |
| JPS62215393A (ja) | バチルス中でのヒト血清アルブミンの製造 | |
| US5229492A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| JPS63501053A (ja) | 異種タンパク質の生産方法 | |
| JPS63137684A (ja) | バチラス・チユリンゲンシスのキメラ殺虫性蛋白 | |
| JPS62198392A (ja) | バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイｉｐｌ株の殺虫性蛋白遺伝子 |