JPS6219085A

JPS6219085A - ラツト肝ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酵素遺伝子とその酵母内発現を目的とした発現用プラスミドｐＡＲＦ１、およびｐＡＲＦ１を用いて形質転換し、ラツト肝ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酵素を発現している酵母菌株

Info

Publication number: JPS6219085A
Application number: JP14665385A
Authority: JP
Inventors: Hiroko Murakami; 裕子村上; Yoshiyasu Yabusaki; 藪崎　義康; Hideo Okawa; 秀郎大川
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-07-05
Filing date: 1985-07-05
Publication date: 1987-01-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ラット肝ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０
還元酵素遺伝子を組み込んだ組換えプラスにドおよびラ
ット肝Ｎ　Ａ　Ｉ）　）’ローチトクロムＰ−４５０還
元酵素を生産する酵母菌株並びにこれらの製造方法に關
する。

ラット肝ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元＃素（
以下Ｆｐｔと略称する）は、肝ミクロソーム電子伝達系
の主要ｉｌＩ１１３ｇで、フラビンアデニンモノヌクレ
オチドとフラビンモノヌクレオチドとを補酵素として分
子内に含有する膜酵］ひとつであるチトクロムＩ）−４
５０に伝達する。

チトクロムｐ−４５０は、これによってのみ、その基質
に対して酸化活性を示すことができる。

本発明者らは、既に、ラット肝チトクロムｐ−４５０Ｍ
Ｃ（Ｐ−４５０ＭＣ）ヲ単離シ、酵母内で発現させるこ
とに成功した（特願昭５９−１７５１６９）。

酵母内で発現したＰ−４５０ＭＣは、酵母ミツ０ソーム
画分に存在し、酵母のＦｐｔと相互作用して酸化活性を
示し、この酵母ミクロソーム画分、Ｐ−４５０ＭＣを生
産する酵母菌体等を各種化合物の酸化反応に利用するこ
とができる。

また、このラット肝チトクロムＰ−４５０ＭＣを含む酵
母ミクロソームに、精製したラット肝Ｆｐｔを添加する
とチトクロムＰ−４５０ＭＣ依存性の酸化活性が著しく
上昇し、ラット肝ＦｐｔをチトクロムＰ−４５０ＭＣと
ともに酵母内で発現させることによりチトクロムＰ−４
５０ＭＣ依存性の酸化活性を妬めることができる。

そこで、本発明者らは、ラット肝Ｆｐｔをコを示し工業
的に有用なパイオリ１クターとして利用できる。また、
酵母の生−したＦｐｔを精製し、Ｉ）−４６０と共に固
定化して酸化プロセス等に利用することもできる。

本発明のプラスミドは、ラット肝Ｆｐｔをコードするｃ
ＤＮＡを含むプラスミドからラット肝Ｆ　ｐ　ｔをコー
ドする領埴を切り出しこれをアルコール脱水素酵素■（
以下Ａ　Ｉ）　ｌ（と略称する）プロモーターを保持す
る発現ベクターへ組み込むことにより構築することがで
きる。さらに、このプラスミドをｍｓへ導入することに
よりラット肝Ｆｐｔを生産する形°ｉ転換−母を製造す
る仁とができる。

次に、実施例により本発明をより詳細に説明する。

１）トリプシンで再構成膜より可溶化したラット肝Ｆｐ
ｔのアミノ酸配列の決定ｉ＃１１シたＦｐｔ（１キ）（ラット肝からＴａｎｉｇ
ｕｃｈｉらの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ　、　５１ＳＯ、８４１（１９７９）に記Ｍ）
により精製した）を１％コール酸、２０％グリセロール
、０．１　ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍ　Ｍ　
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，７）（１ｙｄ）に懸濁し
、Ｆｐｔの６００倍のモル数に相当するシミリストイル
ホスファチジルコリンを溶解させた。混液を透析液Ａ（
０，１ｍＭＥＴ）ＴＡ　、０．１ｍＭジチオスＬ／イト
ール、１０ｍＭリン酸カリウム緩挑′液、ｐＨ７，１）
に対して２日間透析して再構成膜をつくった。

１０５．０００　Ｘｌ　１時間の超遠心分前により再構
成膜を回収し、透析液Ａに懸濁して、トリプシン１００
Ｊ＃（１ｓｆ／ｓｇ、２ｍＭＩＩ　Ｃｔ　）　　を加え
、０℃、１晩攪拌しながら可溶化した。再び、１０５．
０００　ｘｆ／、１時間の超遠心分離することにより、
再構成膜より可溶化したＦｐｔ断片（Ｆｐｔ−Ｌ）を含
む上したのち凍結乾漏し、約１７′１７ｍｏｌをアプラ
イド−バイオシステム社４７ｏＡ型ペプチドシーケシ号
・−にかけ、自動ヱドマン分解：′ｔ７ｊつだ、各サイ
クルで得られたＰＴ）（−アミノ酸を高速液体クロマト
グラフィーを用いて次に示す条件で分析・同定した。条
件■：カラム；　４１３ｏｎｄａｐａｋ　Ｃ＋ａ　（４
Ｘ２５０ｗｍ）、溶媒；ＣＨａＣＮ　：　　１０　ｍＭ
酢ｄナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）＝４２　：５８、
流４　；　０．８　ａＪ／ｆＩ）ｉｎ検出；２６９ｎｍ
、条件■：カラム；２０ｒｂａ）＜ＣＮ　（４，６Ｘ　
２５０１１１１１　、溶媒；１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝１液（ｐＨ６，８）、アセトニトリル−メタノール（
４：１）の１２−１６％不連続グラディエンド、流速；
　１．０　姑軸ｉｎ、検出；２６９ｎｍ２）合成りＮＡプローブの調製Ｆｐｔ−Ｔ、のアミノ酸配列より推定したオＣ／ｒＴＴ
Ｃ／ＴＴＣ８′１６本の混合ＤＮＡ）をアブライトノク
イオシステムス社８８０Ａ型ＤＮＡ合或機を用いて合成
した。取得したオリゴヌクレオチド（１７ｍａｒ）をア
ンモちア水中、５０℃で４時間インキュベートする仁と
により保護基を脱離した。高速液体クロマトグラフ　、
（−＃Ｂｏｎｄａｐａｌｃ　Ｃｔｓ　、　０．１　Ｍ　
トリエチルアミン−酢酸緩衝液（ｐＨ７，０）ニアセト
ニトリル＝９５：５〜６０：４０）でオリゴヌクレオチ
ド画分を分取し、凍結乾燥したのち、８０％酢酸を加え
、室隠で２０分間放置し、トリチル基を脱離した。再び
高速液体クロマトグラフィーかけオリゴヌクレオチドの
画分を分取した。取得したオリゴヌクレオチド約１００
　ｐｍｏｌを１００　ｎｃｉ（７）　Ｃｒ　−８２Ｐ〕
ＡＴＰ（〜５８００　Ｃｉ／ｍｏｌ、〜２Ｑ　ｐｒｎｏ
ｌ）、１５゜単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含
た。

８）　　Ｆ　ｐ　ｔ　　ｍＲＮＡの部分精製ＳＤ系鳩性
ラット（４週令、１００−１２０　ｆｌ　）にフェノバ
ルビタールを８０ｑ／Ｋｐの割合で、腹腔内に投与ｊハ
投与１４−１５時間後に、ラットを層殺し、肝を摘出し
ｔこ。肝を細切したのち、１０＠容の２５ｍＭ）リス−
塩酸（ｐＨ７，５）、　２５　ｍＭ　ＮａＣ１，ａｍＭ
　ＭｇＣｒ２゜０．２Ｍショ糖、５％トリトンＸ−１０
０，１噌／　ｍｌヘパリンナトリウムを加えて、ホモジ
ナイズ１７．２７．０００　×Ｉで１０分間遠心して得
られる上清に２０％の２　Ｍ　ＭｙＣｔｘを含む上記緩
衝液を等臓添加して、ポリソームを沈殿させた。ポリソ
ームは、２６．４００　Ｘ　ＩＩ、１０分間の遠心分離
により回収し、６０Ａ２６０／−になるように、５　ｍ
　Ｍ　ＭｙＣｔｘ　１コ懸濁した。ポリソームの収１よ
、ｆ肝あたり、約１５ＯＡ２６０であった。２０−のポ
１】ソ゛−ム懸濁液に、等鰍の抽出緩衝液（０，２Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５，０）、１％５ＤＳ）を加え、２
倍希釈した抽出緩衝液で飽和しｔコツエノール４０−を
加えて振とうした。

２−８分間放置したのち、４０−のクロロホルムを加え
て、さらに振とりしｔこ。１５．０００×ｆ、１分間の
遠心分離により水層と有機層を分離し、水層にクロロホ
ルム８０−を加えて再び抽出した。中間層がなくなるま
で、クロロホルムによる抽出を繰り返し、最終的ｌζ得
られる水層に２倍容の冷エタノ−ＪしをｔＩｎえ、−２
０℃で１夜放置し、ＲＮＡを沈殿させた。

回収したＲＮＡは、８Ｍ酢酸ナトＩ】ラム（ｐＨ１６，
０）で２回洗浄したのち、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７，Ｑ）に溶解し、再びエタノール沈殿を施した。沈
殿したＲＮＡを回収し、７５％エタノールで洗浄したの
ち、真空乾燥させて、−８０℃で保存したつポリソーム
からのＲＮＡの抽出率は、８８〜８７％であった。

つぎに、得られたＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラムに通し、ポリ（〜を有するｍＲＮＡを分画した。Ｒ
ＮＡを少量の滅菌水に溶解し、平衡化緩衝液〔０，５Ｍ
　ＮａＣ１，１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＴＴ７．５　）
　、　１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ　１で、１０〜
１５Ａ２６０／−になるように希釈した。６５℃５分間
の熱処理を施したのち、あらかじめ平衡化緩衝液で平衡
化したオリゴ（ｄｔ）セルロースカラムにかけ、平衡化
緩衝液で十分洗浄した。滅菌水で溶出される画分を集め
、終濃度２％の酢酸カリウム水溶液、２倍容の冷エタノ
ールを添加し、ＲＮＡを沈殿させた。回収【ノたＲＮＡ
は、７５％エタノールで洗浄したのち、滅菌水に溶解し
た。

つぎに、得られたｍＲＮＡを１０−８０％ショ糖密度勾
配遠心分離によりサイズ分画した。

１０−８０％のショ糖直線密度勾配をもつ、０、１　Ｍ
　ＮａＣ１、０，５％Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　ｔ　ｍＭ　ＥＴ
）’ＦＡ。

１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐｔ（７，５）ニ、６５℃５分
間熱処理したＲＮＡ、２．４Ａ２６０を重層し、ＴＶ８
６５型パーティカルローター　（ＤｕＰｏｎｔ　５ｏｒ
ｖａｔｌ）で、２６５．０００Ｘｆ１時間遠心した。遠
心後、０．８−ずつの両分に分画し、それぞれの両分か
ら、ｍＲＮＡをエタノール沈殿により回収した。

各両分のｍＲＮＡを２．２　Ｍホルムアルデヒドを含む
変性アガロースゲル寵気泳動にかけた後、ニトロセルロ
ースフィルターにブロッティングし、合成り　Ｎ　Ａプ
ローブを用いてノザンーハイブリダイゼーシ日ンによる
分析を行った。その結果２２Ｓの両分にバンドが検出で
きたので、この−分を用いてＣＩ’）　Ｎ　Ａ合成を行
った。

４）ＣＩ）ＮＡクローニングＣＤＮＡクローニングは、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法
により行った。まず−８′−オリゴ（ｄｔ’）付加ｐｓ
Ｖ７１８６　　由来プラスミドプライスマー（ファルマ
シアＰ　−Ｌバイオケミカルズ社より購入）約１．８μ
ｆと、あらかじめ熱処理（６５℃、５分間）を施したｍ
ＲＮＡ約２ａｆを５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ　Ｈ８，８
）８ｍＭＭｇＣｚ２　、８０ｍＭ　ＫＣｔ、　０．８　
ｍＭＤＴＴ　、　２　ｍ　ＭｄＮＴＰａ中で、５．５１
１位の逆転写酵素を添加して、４５℃で２０分間インキ
ュベートした。

・フ・純ノール−クロロホルム処理したのち、エタノー
ル沈殿により、ＤＮＡを回収した。ついで、このＤＮＡ
に、ターミナルトランスフェラーゼによるｄＣ付加を施
し、約１０のｄＣ付加を確認した。反応生成物は、エタ
ノール沈殿により回収したのち、Ｈｉｎｄｍで消化した
。

こうして得られたＤＮＡ０．０２１）ｍＯ６と８′−オ
リゴ（ｄＧ）付加ｐｓＶ１９Ｂ２由来ｐ（ｉｎｄｕｘリ
ンカ−（ファルマシアＰｌ−Ｌバイオケミカルズ社より
購入）　０．０４　ｐｍｏｚを、１０ｂＬ（ＤｌｏｍＭ
）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０
．１ＭＮａＣ６中で、６５℃２分間、ついで４２℃８０
分子ｆｔｌインキ、ベートしたのち、０℃に冷却した。

これに、２０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、４ｍＭ
ＭＩＣ１ｇ　、　１０　ｍＭ　（ＮＨ４）＄１８０４　
、ｏ、１ＭＫ、ｃｚＯ，１ｍＭβ−ＮＡＤ　、　５０　
ｔｔ　Ｉ　／ｍ＃ＢｓＡ　。

１０単位１’３ＮＡリガーゼを加え、全容を１００μｔ
とした。１２℃で１夜インキユベートしたのち、４０μ
Ｍ　ｄＮＴＰｓ　、　０．１５τ■β−ＮＡＤ　。

２単位ＤＮＡリガーゼ、５単位ＤＮＡポリメラーゼＩ、
１．２５単位リボヌクレアーゼＨをそれぞれ添加し、全
容を１０４μｔとし、１２℃１時間、さらに、２５℃１
時間インキキベ。

−トした。このＤＮＡ溶液を用いて、大−菌ＤＨ１株を
形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを選択した。

５）　　Ｆ　ｐ　ｔ　　＄ｒ）ＮＡ　りｏ　−ン（Ｄ？
Ｉｊ抜得られたアンビレリン耐性のコロニーから、Ｆ　
ｐ　ｔ　ｃＩ）ＮＡ　を含むクローンを選抜するために
、合成プローブを用いたコロニーへイブリダイゼーショ
ンを行った。

プラスミドを持つ大腸菌をプレートにまきコロニーを形
成させた後、ニトロセルロースフィルターにレプリカし
た。フィルター上のコロニーをフィルターごと０．２　
Ｍ　ＮａＯＨに浸し溶菌させ、Ｄ　Ｎ　Ａをフィルター
に結合させた。フィルターを０゜５　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−
ＨＣＬ、　（ｐＨ８，０）に浸して中和した後、８０℃
の貞空オーブン中で２時間乾燥し、ＤＮＡをフィルター
に固定させた。４ｘＳＳＣ（ｔａｍＭクエン酸ナトリウ
Ａ　−１５０ｍＭ　　ＮａＣｚ　）、　１０Ｘ　Ｄｅｎ
ｈａｒｃｌｔ　（０，０２％フィコール、ｏ、ｏｇ％Ｂ
ＳＡ％０．０２％ポリビニルピロリドン）。

１００ｍｇ／ｄサーモン精巣ＤＮＡの混液とフィルター
をプラスチックバ・ソゲにつめ、６０Ｌ、８時間インキ
ュベートした。上記の混液に合成りＮＡプローブを添加
し、再びフィルターとともにプラスチックバッグにつめ
て４０℃で１晩インキユベートした。フィルターを取り
出し、４０℃に保温しなから４×ＳＳＣで４回洗浄した
後オートラジオグラムイ撮り、ポジティブなレグナルを
与えるコロニーを単離した。４つのポジティプロ口ニー
がか得られ、そのうちの１つをｐＲＦｌと命名した。

を作成＄１・°　プラスミドｐＲＦｌを大腸菌より単離し、種々
の制限酵素で切断し、フラグメントを０．８病ア／＞”
ロースゲル電気泳動で分析して、制限酵素地図を作成し
た。図８にｐＲＦｌ　ｃＤＮＡインサート（長さ２．６
　ｋｂ）の制限酵素地図を示す。

７）ｐＲＦｌ　ｃＤＮＡインサートの塩基配列の決定ダ
イデオキレ（Ｄｉｄｅｏｘｙ）法を用いて、ｐＲＦｌｃ
ＤＮＡ　インサートの全塩基配列を決定した。

プラスミドＤＮＡを制限酵素で切断し、Ｍ１８フγ−ジ
ｍｐ８およびｍｐ９にクローニングしたのち、１本鎖Ｄ
ＮＡを単離し、Ｍ１８シークエンスキット〔宝酒造Ｃ株
）〕を用いて行っな。第４図にｐＲｆ’ｌ　ｃＤＮＡイ
ンサートの全塩基配列を示す。また、塩基配列より推定
されるＦｐｔのアミノ酸配列をあわせて示す。

ラット肝Ｆｐｔのアミノ基末端のアミノ酸はアセチル化
されていることが知られており（Ｂｌａｃｋ　＆　Ｃｏ
ｏｎ　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、　、２５７５９２
９（１９８２）アミノ基末端のアミノ酸配列は明らかに
されていないが、図４に水工−もた開始コドンＡ　’１
’　ＧからＦｐｔが読まれる□ 、とすると、ラット肝Ｆｐｔは６７８アミノ酸゛残基か
らなる分子量７６．９００の蛋白質であると推定される
。図４中で下線を施したアミノ酸配列は、トリプシンで
再構成膜より可溶化したＦｐｔ標品について決定したア
ミノ酸配列を示し、塩基配列から読み取ったアミノ酸配
列に一致した。またアミノ基末端付近のアミノ酸配列は
既に報告されているウサギ肝Ｆｐｔのアミノ酸配列と高
いホモロジーを示す。

これらのことから、ｐＲＦ　１　ｃＤＮＡ　　インサー
トはＦｐｔの全コーディング領域を含む完全長ＣＤＮＡ
であることが判明した。

う・ソト肝Ｆｐｔの全コーディング領域を持つ組換え体
プラスミドｐＲＦ１かも、Ｆｐｔ遺伝子部分約２．８　
ｋ　ｂを単離し、ＡＤＨプロモーターを保持する発現ベ
クターｐＡＡＨ５□　　　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｆｙ　１０１　、　ｐａｒｔ　Ｃｐ１９
２−２０１．　、Ａｍｍｅｒｅｒらの方法により製造す
ることができる。）に組み込み、酵母自発現用プラスミ
ド構築の第１段階として、Ｆｐｔ遺伝子の先頭と後尾に
制限酵素部位且１ｎｄｉｕ　　を持つ組換え体プラスミ
ド１）ＲＦＣＣ５を構築した。第１図にその概要を示す
。

ステップ１：組換え体プラスミドｐＲＦ”Ｒ１１１の構
築（ａ　）１　＃　ｆ（りｐＲＦ１プラスｔＦＤＮＡＩｃ
２５−Ｌ　−１−−ｔ　）　１７）制限酵素ＰｖｕＩＩ
と口ｉｎｄ　ｍを加え、２５０＃ｔの制限酵素反応液Ｍ
〔１０ｍＭ）リス−塩酸、（ｐｌｌ　７．５　）、１０
ｍＭ八（ｇｃｔｚ、１ｍＭジチオスレイトール、５０　
ｍ　Ｍ　ＮａＣｚ）中で８７℃、１時間反応させた。反
応液を０．５Ａｆ／−の臭化エチジウム（アルドリッチ
社）を含む０．７％の低融点ア健ロースゲル（ベセスダ
ーリサーチ社）に供し、７０Ｖで１２０分間電気泳動後
、紫外線ランプＦでｌ）　Ｎ　Ａ断片ｌ（約ｌ、Ｑｋｂ
）に相当するゲル部分を切り出し、エッペンドルフ管に
とり、６５℃で５分間加熱した。融解したゲルにＴＥ緩
衝液〔１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）、１ｍＭ　
　ＥＤ’ｌ’Ａｌで飽和した７　ｘ　／　−ＪＬＴを等
量加えてフェノール抽出を行った。

１２．００Ｏｒｐｍで５分間遠心し、上層を分取した後
、２倍容の冷エタノールを加えて、＝８０℃に１５分間
放置することにより１３　Ｎ　Ａをエタノール沈殿した
。その後、１２．００Ｏｒｐｍ　　で１０分間遠心し、
約０．２ｓｆのＤＮＡ断片１を回収し、ｌＯμＬの蒸留
水にＳ濁した。

（ｂ）つぎに、調製した０、２μｆのＤＮＡ断片１　ニ
５　ユニー　／　）　（Ｄ制限＃素Ｒｓａｘ（ＮＥＢ社
）を加え、２０μｔの制限酵素反応液Ｍ中で８７℃、１
時間反応させた後、前述のように０．７％低ｉ点アガロ
ースゲル璽気泳動に共し、Ｉ’）ＮＡ断片１’（７００
ｂｌ））に相当するゲル部分を切り出し、同様にエタノ
ール沈殿して０．１５　ａ　ｆのＤＮＡ断片１′を回収
し、１０μｔｏ＞蒸留水に懸濁した。

（Ｃ）つぎに、調製した０、１５μｆのＩ）ＮＡ断片１
’ニ１　ａ　＆（７）Ｈｉｎｄｍ　　’Ｊ　ンカ−（宝
ａ造社）と８ユニツトのＴ４ＤＮＡ　　リガーゼを加え
、２０ａＬのＴ４　　リガーゼ反応液〔６６ｍＭ）リス
−塩酸、（ｐＨ７，５）、６６　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｒ２．
１０ｍＭ　ＤＴＴ、　　１ｍＭ　ＡＴＰ　〕中で１６℃
、２００時間反応せた。反応後１、５　Ｍ　ＮａＣ１を
１ａＬと５　Ｑ　：Ｌ　二・ｙトの制限酵素Ｈｉｎｄｍ
　（宝酒造社）を加え、８７℃で８時間反応させた後、
６５℃で５分間インキュベートして酵素を失活させた。

（ｄ）１＃ｆのｐＢＲ８２２に８ユニツトの制限酵素則
罰ｄｍを加え、２０μｔの制限酵素反応液Ｍ中で８７℃
、１時間反応させたのち、フェノール抽出、エタノール
沈殿を行い、ＤＮＡを回収し２０μｔの蒸留水に懸濁し
た。懸濁液に１９９ｍＭトリス−塩酸（Ｉ）Ｈ８，０）
２６μｔと大腸菌のアルカリ性フォスフマターゼ０．５
ユニットを加え、６０℃で１時間反応させた。反応後、
フェノール：クロロホルム−１：１の混液で８回抽出し
、１２．００Ｏｒｐｍ、、　　５分間遠心して上層を分
取し、エタノール沈殿により１）　Ｎ　Ａを回収し、２
０μｔの蒸留水に懸濁した。

（ｅ）　　（ｃ）および（ｄ）で得たＤＮＡ断片各々５
μＬずつを混合し、８ユニツトのＴａＤＮＡ　リガーゼ
を加えて２０１ｔのＴ４用いて大腸菌ＤＨ１株を形質転
換した。大腸菌の培養にはＬ培地（１１当り１０９ポリ
ペプトン、６ｆイーストエキストラクト、５ｆ　　Ｎａ
Ｃｚ　、　　１１グア１ｚ　：ｆｆ　−スヲ含ム）ヲ用
い、　プレート培地には、１４９の寒天を加えた。以後
も同様である。

目的とするＨｉｎｄｍ　　リンカ−のついたＤＮＡ断片
１′をクローニングするため、１００μｇ／−のアンピ
シリン（シグマ社）を含ｔｒ　Ｌプレートに形質転換体
を広げ、コロニーを単離した。つぎに、Ｂｉ　ｒｎｂｏ
　ｉｍ　　らの方法（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅａ
、　７　、　ｐ１５１Ｂ　−１５２１１１）に従ってコ
ロニーよりプラスミドＬ）ＮＡを単離し、０．１　／４
１のプラスミドＤＮＡに対して５ユニツトの制限Ｉ＃＃
素川１用ｄｕｌを加えて、制限酵素反応液へ４中で８７
℃、１時間反応させた後、０．８％アガロースゲル電気
泳動で分析し、Ｉｌｉｎｄｍ・・で切り出せるＤＮＡ断
片１′を組み込んだ組換え体プラスミドを選択した。得
られたクロニヅトの制限−素ル１ｍＨｆ　　（宝酒造社
）を加え、制限Ｗ＃素反応液Ｈ（１０ｍＭ）リス−塩酸
、（ｐＨ７，５）、１０　ｍ　Ｍ　ＭｐＣｚｇ１ｍＭジ
チオスレイトール、１００ｍＭＮａＣｚ）中で８７℃、
１時間反応させた後、０．８％アガロースゲル電気泳動
で分析し、ＦｐｔＯＮ末がｐＢＲ８２２のシ叫ＨＩ切断
部位に近い方向につながっているプラスミドを選択し、
その中のひとつをｐＲＦＲｌ　１１と（ｌａ）ＳＪｌｆ
ＩのｐｋＦ１プラスｉドＤＮＡに２６ユニリトの制＠ｌ
＃素Ｐｖｕｌｌを加え、２６０μｔの制限ａ＃素反応ｅ
Ｍ中で８７℃、１時間反応させた。反応液を０．８％低
融点アガロースゲル電気泳動で分画し、目的の１）ＮＡ
断片２（約１．８ｋｋｌを紡速の方法に倣い、応させた
。反応後１．５　Ｍ　ＮａＣｚ　ヲ１　ｉｍ　Ｌと６０
　：ｘ、　ニー７　）の制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌｌを加え
、８７Ｃで８時間反応させた後、６６℃で６分間インキ
ュベートした。

（ｃ）　　（ｂ）とステップ１（ｄ）で得た１）　Ｎ　
Ａ断片各６μｔずつを混合し、８ユニｑ　トノＴ４１）
ＮＡ　Ｑ　カーゼを加エテ、２０ｓＬのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ反応液中で１５Ｃ，４時間反応させた。反応後ステ
ップ１（ｅ）と同様に、反応液で大腸菌ＤＨＩ株を形質
転換し、コロニーを単離した。得られたコロニーよりプ
ラスミドＤＮＡを単離し、０．１μｇのプラスミドＤＮ
Ａに対し５ユニ９トの制限酵素Ｈｉｎｄｕｌあるいは制
限酵素Ｎｅｏ　ＩとＢａｍＨＩをそれぞれ５ユニツトず
つ添加してＤＮＡを切断し、アガロースゲル電気泳動で
分析してＨｉｎｄ　ｍで切り出され、（Ｆｐｔの）Ｃ末
がＴ）ＢＲ８２２（７）　ＥｃｏＲＩ部位に近くなるよ
うにＤＮＡ断片２が挿入されているクローンを選んでｐ
ＲＦＰ２　　とした。

ステップ８　組換え体プラスミドｐＲＦＣ２の構築（ａ）ｌｎｆのｐＲＦＲｌ　１１　ＤＮＡニ２０　ユニ
。

トの制限酵素ＮｃｏＩと２０ユニツトの制限酵素と１を
加え、１００μｔの制限酵素反応液Ｈ中で８７Ｃ１時間
反応させた後、０．８％低融点アガロースゲル電気泳動
に供し、長い方の１）　Ｎ　Ａ断片をゲルより切り出１
ノ、フェノール抽出を行い、エタノール沈殿によりＤＮ
Ａ断片を回収し、２０ｔｔｌの蒸留水に懸濁した。

（ｂ）１ｂｆｌのｐＲＦＰ２ＤＮＡにライて（ａ）と同
様の操作を行い、０．８％低融点アガロースゲル１１Ｅ
ｇＫ泳動で短い方のＤＮＡ断方を抽出、回収して２０μ
ｔの蒸留水に懸濁した。

（ｃ）　（ａ）および（ｂ）Ｍ調製したＤＮＡ溶液２０
μｔずつを混合し、８ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを
加え、５　Ｑ　ａ　ＬノＴ４ＤＮＡリガーゼ反応液中で
１６℃、２００時間反応せた。得られた反応液を用いて
、大腸菌ＤＨ１株を形質転換し、出現したコロニーより
プラスミドＤＮＡを調製した。

得られた０、１μｆのプラスミドＤＮＡに対して、５ユ
ニツトの制限酵素用−ｉｎｄｍを加え、２０ＡＬの制限
酵素反応液Ｍ中で８７℃、１時間反応させ、０．８％ア
ガロースゲル電気泳励で分析した。目的とする構造を保
持するプラスミドを趨択し、ｐＲＦｃ２とした。

ステ・ノブ４　組換え体プラスミドｐＲＦＣ５の構築（ａ）１＃ＮのｐＲＦＣ２ＤＮＡに対して２０ユニリド
の制ｗｉｒ＃えル辺Ｉを加え、１００μｔの制限酵素反
応液Ｈ中で８７℃１時間反応させたのち、フェノール、
クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によりＤＮＡ
を回収し、２０＃ｔの蒸留水に懸濁した。こ（７）　Ｄ
　Ｎ　Ａ　Ｉｎ　ｌ＆に０．５ユニツトのアルカリ性フ
ォスファターゼを加え、０．１Ｍ）リス−塩酸（ｐＨｇ
、０）中で６０℃、１時間反応させた。反応後フェノー
ル：クロロホルム；１：ｌによる抽出を８回行い、エタ
ノール沈殿後、ＤＮＡを回収し、２０μｔの蒸留水に懸
濁した。

（ｂ）１＃＃のｐＲＦＩＤＮＡに２０ユニ・リドの部分
を切り出し、ＤＮＡを回収し２０μｔの蒸留水に懸濁し
た。

（ｃ）　　（ａ）および（ｂ）で調製しりＤＮＡ溶液２
０μｔを混合し、８ユニ９トの１４１）ＮＡ　　リガー
ゼを加え、５０＃ｔのＴａＤＮＡリガーゼ反応故中で１
５℃、８時間反応させた。反応後、反応混液で大腸菌Ｄ
Ｈ１株を形質転換した。

（ｄ）得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製し
、０．ｌμｌのプラスミドＤＮＡに対して５ユニツトの
制限酵素５ｃａＩおよび５ユニリドの制限酵素Ｓ−ａ　
ｃ　Ｉを加え、制限酵素反応液ＩＩ中で８７℃、１時間
反応した（１”）！；０．８％のアガロースゲル電気泳
動で分析した。分析したプラス【ドのうち目的の構造を
保持するプラスミドを選択し、ｐＲＦＣＣ５とした。

２）発境用プラスミドｐＡＲＦｌ　　の構築ｌで構築し
たｐＲＦＣＣ５プラスミドＤＮＡかう、ラット肝Ｆｐｔ
遺伝子部分を取り出し、ＡＤＨプロモーターを保持する
酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄ−ａｔｉｏｎより入手、
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

方法を詳しく述べる。

（ａ　）１　ａ　ＩＩ　（７）ｐＲＦｃｃ５ＤＮＡｊｃ
　２０　：Ｌニーｑ　トの制＠酵素−Ｕ尤ｎｄｕ＋を加
え、１００　ａ　Ａ（７）制限酵素反応液Ｍ中で８７℃
、１時間反応させた後、０．８％低融点アガロースゲル
電気泳動に供し、［５２Ｃ泳動後、２．８ｋｂのＤＮＡ
断片をゲルより切り出し、ＤＮＡを回収し、２゜μｌの
蒸留水に懸濁した。

（ｂ）１μｌの酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏ
ｎ　　より入手した）に、２０ユニツトの制限酵ＸＨｉ
ｎｄｕ＋　　を加え、１００ｎＡの制限酵素反応液Ｍ中
で８７℃、１時間反応させ、ＤＮＡを回収後、２０＃Ｌ
の蒸留水に懸濁した。

このＤＮＡ溶液に０．５ユニツトのアルカリ性フォスフ
ァター虻を加え、２５ａＬの０、１　Ｍ　トリス−塩酸
・（りＨ８，０）中で６０℃、１時間反応させた。反応
後フェノール、クロロホルム混液による抽出を８回行い
、エタノール沈殿後、ＤＮＡを回収し、２０＃ｔの蒸留
水に懸濁した。

（Ｃ）　（ａ）および（ｂ）で調製したＤＮＡ溶液２０
μｔを混合し、８ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え
、Ｔ４ＤＮＡ４ＤＮＡリガーゼで１６℃、４時間反応さ
せた。反応後、反応液で大腸菌ＤＨＩ株を形質転換し、
得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製した。０
．１ａｌのプラスミドＤＮＡに対して５ユニツトの制限
酵素ＮｃｏＩと６ユニツトの制限酵素旦靭声■　を加え
、制限酵素反応液Ｈ中で８７℃、１時間反応させた後、
０．８％アガロースゲル電気泳動で分析した。目的とす
る構造を保持するプラスミドを選択しｐＡＲＦｌ　　と
した。ｐＡＲＦ　１はｐＡＡＨ５のＡＤＨプロモーター
とＡ　ｌ）　Ｈタミネーターの間に、ラリト肝Ｆｐｔと
遺伝子がＡＤＨプロモーターと順方向に接続している。

Ｐ−４５０還元酵素の発現を行った。以下にその方法を
述べる。

ステップ１　酵母形質転換体の単離ＹＰＤ培地（１％酵母エキストラクト、２％がリペプト
ン、２％グルコース）６−にす分）により集菌した。得
られた菌体を０．２ＭＬｉＣｚで洗浄したのち、得られ
たペレットにＩ　Ｍ　ＬｉＣＬ　２０μｔとｐＡＲＦｌ
　プラスミドＤＮＡ１μｇ（１０μｔ）、さらに７０％
ポリエチレングリコール４０００　８０ｓＬ加えよく懸
濁し、８０℃、１時間インキュベートした。その後混液
に滅菌水１４０μｔを加え、１００μｔずつＳＤプレー
ト（０，６７％酵母窒素源、２％グルコース、２％寒天
、２４−”（ｐＡＲＦｌ）株を得た。

ステップ２　酵母全蛋白質の調製ス、２４ａｆｉ／−ヒスチジン）中で培養した。

１対数増殖期にある酵母培養液０．９−に２Ｍ１ＮａＯ
Ｈ，９％２−メルカプトエタノールを０、１−加え、水
中で１０分間インキュベートした後、８０％’Ｉ”　Ｃ
Ａを０．２−加えて焚に氷中、１０分間放置した。１２
．００Ｏｒｐｍ、　２分間の遠心分離により沈殿を集め
、氷冷したア七トンで洗浄した後、乾燥させた。

ステリプ８　発現蛋白の回定ステップ２で調製した酵母ＡＨ２２（ｐＡＲＦｌ　）株
の全蛋白質に、１００℃で５分間沸湯させたサンプル緩
衝液〔４％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１６Ｍ）リス
−塩酸（ｐ　）Ｉ　６．８　）、０．８８Ｍ２−メルカ
プトエタノール、２０％グリセロール、０．０１％ブロ
ムフェノールブルー〕５０μｔを８口え、１００℃でイ
ンキュベートしながら溶解させた。溶液を７．５％Ｓ　
Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミドゲルに供し、−６８５）に
従って′心気泳動を行った。泳゛動後、アクリルアミド
ゲルとニトロセルロース１）・　１７４　ＪＬｔター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈ
ｎｉｉｌ１社）を１重・ねブロッティング用緩衝液〔２
５ｍＭ）リス−塩酸（１）８８．８）、１９２ｍＭグリ
シン、２０％メタノール）中で、８０Ｖの電圧を約１０
時間かけ、蛋白質をニトロセルロースフィルターへ移行
させた。泳動後、ニトロセルロースフィルターをブロッ
キング溶液〔８％ゼラチン、５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ
Ｈ７，５）２０６　ｍＭ　ＮａＣｔ、　０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２Ｇ　）　ニ浸し、８０分間攪拌した。つぎに、
２０ａｆｉ／−の抗ｐｐｔ　　工ｇＧを含む緩衝液〔１
％ゼラチン、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、２
００ｍＭＮａＣｚ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０　）に
浸し、さらに２時間攪拌した。続いてニトロセルロース
膜を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液ｒ
５０ｍＭ）リス−塩酸（ＰＨ７，５）、２６　Ｑ　ｍＭ
　ＮａＣｚ）　Ｆ　８０分ずつ、４回洗浄し、再度ブロ
ッキング溶液に浸した。ブロッキング溶液を除き、２０
＋ＪノＩ−ＰｒｏｔｅｉｎＡ溶Ｐ＆（２μＣｉ）に１時
間浸したのち、０．０５％ｃＤ　Ｔｗｅｅｎ　２０を含
むＴＢＳ溶液で８０分ずつ４回洗浄し、最後にＴＢＳ溶
液で洗浄した。

、株では精製Ｆｐｔ標品と同じ位置に発現したｉＦｐ虹
と考えられるバンドが確認できた。それに対しＡＨ２２
（ｐＡＡＨ５）　　株の全蛋白質を泳動した場合にはＦ
ｐｔの位置にバンドが認められず、Ａ）１２２（Ｉ）Ａ
ＲＦＩ）株で検出されたＦｐｔのバンドはｐＡＲＦｌに
より発現したと考えられる。Ｆｐｔｉ製標品全標品にと
り発現緻を算出すると酵母細胞あたり約ｌＸｌ０”分子
のラット肝ＮＡＤＰｆ（−チトクロムＰ−４ｆｉＯ還元
酵素蛋白が産生されていた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｆｐｔのコーディング領域を含むプラスミド
１）ＲＦＣＣ５の構築の概要を示す図である。第２図は、Ｆｐｔの酵母自発現用プラスミドｐＡＲＦ１
の構築の概要を示す図である。第８図は、プラスミドｐＲＦ１のＣＤＮＡインサート部
分の制ｆｆｌ＃素地図を示す。図中、太線は、Ｆｐｔの
コーディング領域を示す。第４図（そのｌ〜その５）は、プラスミドｐＲＦ１のｃ
ＤＮＡインサートの全塩基配列を示す。手続補正書（自発）昭和【／年ｐ月ノ牛口特許庁長官　　黒　１）明　雄　殿１、事件の表示昭和６０年　特許側　第１４６６５３号２、発明の名称ラット肝ＮＡＤＰ）Ｉ−チトクロムＰ−４５０ｉＷ元酵
素遺伝子とその酵母内発現を目的とした発現用プラスミ
ドｐＡＲＦ１、およびｐＡＲＦｌを用いて形質転換し、
ラット肝ＮＡＤＰ）ｆ−チトクロムＰ−４５０還元酵素
を発現している酵母菌株３、補正をする者事件との関係　　特許出願人郵便番号１００４、補正の対象明細書の発明の詳細な説明の欄５、補正の内容（１）　明細書第５頁第１３行目に「プロモーターを保持する発現ベクター」とあるを［プ
ロモーター　（酵母ＡＤＨ遺伝子プロモーターは、Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔ
ｉｏｎの米国特許出願箱２９９７３３に含まれており、
米国において、工業的、商業目的で使用する場合は、権
利者からの権利許諾を必要とする。）を保持する発現ベ
クター」と訂正する。（２）　同第４頁第１行目〜２行目に「特願昭５９−１
７５１５９Ｊとあるを［特開昭６ｌ−５６０７２Ｊと訂
正する。（３）同第１８頁第１１行目〜１５行目にｒＡＤＨプロ
モーターを保持する発現ベクターｐ　ＡＡＨ５（ト噌ｅ
ｔ、ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１０１．ｐａｒ
ｔＣＰ１９２−２０１．、Ａｍ１ｅｒｅｒらの方法によ
り製造することができる。）に組み込み、」とあるを［
酵母ＡＤＨ遺伝子のプロモーターおよび同ターミネータ
−を保持する酵母発現ベクター１）ＡＡＨ５（Ｗａｓ旧
ｎｇｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ
から入手可能、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　１０１．　ｐａｒｔ　ＣＰ１９２−２０１゜Ａｍ
ｍｅｒｅｒらの方法により製造できる。）に組み込み、
」と訂正する。（４）　同第２９頁第６行目〜９行目にｒ　ｐ　Ａ　Ａ
　Ｈ５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎより入手、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１　　ｐａｒｔ　ＣＰ１９
２−２０１、Ａｍｍｅｒｅｒらの方法により製造するこ
とができる。、）」とあるをｒｐＡＡＨ５Ｊと訂正する
。（５）　同第３０頁第１行〜３行にｒ　ｐ　Ａ　Ａ　Ｈ５（ｋｌａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎより入手した）に
」とあるをｒｐＡＡＨ５にＪと訂正する。以上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ラット肝ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元
酵素遺伝子の全コーディング領域を保持するプラスミド
。
（２）第３図の構造を有する特許請求の範囲第１項記載
のプラスミドｐＲＦ１。
（３）ラット肝ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元
酵素遺伝子を酵母内で発現させる発現用プラスミド。
（４）ラット肝ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元
酵素遺伝子をアルコール脱水素酵素Ｉプロモーターを保
持する発現ベクターｐＡＡＨ５へ組み込むことにより構
築した特許請求の範第３項記載の発現用プラスミド。
（５）第２図記載の構造を有する特許請求の範囲第３項
記載の酵母発現用プラスミドｐＡＲＦ１。
（６）ラット肝ＮＡＯＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元
酵素遺伝子を保有しラット肝ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ
−４５０還元酵素を生産する酵母。
（７）サッカロミセス属に属する特許請求の範囲第６項
記載の酵母。
（８）サッカロミセス・セレビセＡＨ２２（ｐＡＥＦ１
）株である特許請求の範囲第６項記載の酵母。
（９）ラット肝ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元
酵素遺伝子をプラスミドｐＲＦ１から単離し、これをア
ルコール脱水素酵素Ｉプロモーターを保持する発現ベク
ターｐＡＡＨ５へ組み込むことを特徴とする酵母発現用
プラスミドｐＡＲＦ１の構築方法。
（１０）酵母発現用プラスミドｐＡＲＦ１を用い酵母を
形質転換することを特徴とするラット肝ＮＡＤＰＨ−チ
トクロムＰ−４５０還元酵素を生産する酵母の製造方法
。