JPS62201598A - マウス−ヒトキメラ抗体ｈ鎖、それをコ−ドするキメラｄｎａ配列、プラスミドおよび細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明はマウス−ヒトキメラ抗体Ｈ鎖及びそれをコード
するキメラＤＮＡ１．：関するものである。

更に詳しくはマウスの抗体Ｈ！ｌ！ＩＶ領域とヒト抗体
Ｈ鎖のＣ領域の連結されたマウス−ヒトキメラ抗体Ｈ鎖
及びそれをコードするキメラＤＮＡに関するものである
。

ｂ、従来技術 最近の遺伝子操作技術の急速な発展に伴い、免疫グロブ
リン遺伝子解明が進み数多くの報告がなされている。吐
乳動物、殊にヒトやマウスの抗体遺伝子におけるＨ＠の
解明もなされつつある。一般に１４鎖は抗原との結合部
位である■領域（可変領域）と補体との結合や特定の細
胞との相互作用などの生理活性を有しているＣ領域（定
常領域）より形成されていることがよく知られている［
二本庶佑、アニュアル　レビュー　オプ　イムノロジ−
１巻４９９ページ（１９８３）　（Ｔ、ト１ｏｎｊｏ。

Ａｎｎｕａｌ　　Ｒｅｖ、１ｍｕｎｏｌ、１　　４９９
（１９Ｂ３））参照］。

一方抗体遺伝子のＤＮＡ配列及びその機能の解明は、マ
ウスの遺伝子について可成り進められており、その可変
領域遺伝子には、■遺伝子断片。

Ｄ遺伝子断片及びＪ３Ｈ伝子断片がこの順序で並んで存
在し、さらに可変領域の上流（５′側末端）にプロモー
ター傭能を有するＤＮＡ配列が存在すること、またＪ遺
伝子断片と定常領域遺伝子との間に、転写効率を著しく
増大させるｉｉを有するＤＮＡ配列、つまりエンハンサ
−の存在が推測されている。

このエンハンサ−はＪｍ伝子断片の下流に存在し、末分
化型ではプロモーターが遠く離れているため転写効率を
上げられないが、Ｖ−、Ｊ遺伝子及びＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子
の組み換えを起した時に発現型となりＶ遺伝子断片の上
流のプロモーターからの転写効率を上げる機能を有して
いると言われている。

そしてマウスの］］鎖遺伝子におけるエンハンサ−に関
して、そのＤＮＡ配列は、最近シャフナ−（Ｗａｌｔｃ
ｒ　　５ｃｈａｆｆｎｅｒ）らが明らかにし発表してい
る（Ｃｅｌｌ、　Ｖｏｌ、３３　、　７２９−７４０Ｊ
ｕｌｙ１９８３参照）。

また利根用進氏らも同様にマウスの１１−１ｔＥ１伝子
のエンハンサ−の存在並びにそのＤＮＡ配列を明らかに
している（Ｃｅ１１．　　Ｖｏｌ、３３　、７１７−７
２８゜Ｊ　ｕｌｙ１９８３参照）。

さらにデビット・バルチモア（Ｑ　ａｖｉｄＢａｌｔｉ
ｍｏｒｌ）らは、マウスの抗体遺伝子のし鎖のエンハン
サ−の存在並びにそのＤＮＡ配列を報告している（Ｃｅ
１１．Ｖｏｌ、３３　、７４１−７４８．Ｊｕｌｙ１９
８３参照）。

このように、マウスのＨ鎖およびＬ鎖の遺伝子に関して
は、可変領域、定常領域の両領域に含まれる種々の遺伝
子単位をはじめ、プロモーター。

エンハンサ−などの種々の機能を有する単位の存在が明
らかにされ、また一部はそれらのＤＮＡ配　・列が決め
られている。

一方ヒト抗体遺伝子のＨ鎖については、その構成遺伝子
及びその機能が次第に明らかにされつつあったが、エン
ハンサ−の存在は推測されていたにすぎず、その前ＤＮ
Ａ配列及びその機能を発現させるＤＮＡ配列単位につい
ては未だ知られてはいなかった。

しかしながら、ごく最近になって、ラビットら（Ｔ、　
ＨｏＲａｂｂｉｔｔｓ　ｅｔ、　ａｌ、　）および利根
用進らはそれぞれ独立にヒト抗体遺伝子のＨ鎖中のエン
ハンサ−のＤＮＡ配列を報告している（Ｎａｔｕｒｅ、
　　ｖｏｌ、３０６　、８０６−８０９．２２／２ａ。

Ｄｅｃｌｍｂｕ　　１９８３　　ａｎｄ　Ｎａｔｕｒｅ
　ｖｏｌ、３０７．３３４−３４０゜２６　　Ｊ　ａｎ
ｕａｒｙ　　１９８４参照）。

最近になってモノクローナル抗体の技術が進歩し、病態
の診断、制御、予防等の免疫学的診断・治療への応用が
期待されている。かかるモノクローナル抗体の利用にお
いてはヒト抗体を用いるのが最適である。しかしヒトの
場合にはマウスのハイプリドーマ生産技術程モノクロー
ナル抗体製造技術は進んでおらず、各種の特異性をもっ
た抗体を得るには制限が多く、この免疫学的診断、治療
には多くの制約がある。この困難さを克服する一つの手
段としてヒト抗体に酷似していてヒト体内で異物として
認識される事の少い抗体を人為的に創製し、この抗体を
免疫学的診断、治療に利用する事が考えられる。このよ
うな抗体として最近マウスの成る種の抗体の■領域とヒ
ト抗体のＣ領域とからなるキメラ抗体が提案されている
（特開昭６０１５５１３２＠公報参照）。

Ｃ１本発明の目的 そこで本発明者らは上記のような観点からヒトの免疫学
的診断及び治療に応用可能な新規なキメラ抗体を創製す
る事を目的とし、マウス抗体ト１鎖Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子断
片、並びにヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域を含む遺伝子断片を得る
こと、及びこれらの遺伝子を導入したキメラ抗体発現型
プラスミドの′開発を目的として研究を進めた結果、今
回ヒト急性白血病リンパ腫共通抗原（以下ヒト’　ＣＡ
　Ｌ　Ｌ　”抗原ということがある）に特異的に反応す
るマウス−ヒトキメラ抗体Ｈ鎖を見い出すに至った。

かくして、本発明によれば （お　マウス抗体Ｈ鎖Ｖ領域アミノ酸配列と（ｂ＋　　
ヒト抗体ｔ−＋ｇｔｃ領域アミノ酸配列とから成りヒト
ＣＡＬＬ抗原に特異的に反応するマウスヒトキメラ抗体
Ｈ鎖が提供される。

ヒトＣＡＬＬ抗原は各種の白血病リンパ腫患者の血中に
みられる抗原であり、ヒトＣＡＬＬ抗原に特異的に反応
し、且つヒトに異物として認識されないモノクローナル
抗体が存在すればかかる白血病リンパ腫患者の免疫学的
診断及び治療に極めて大きく貢献するものと考えられる
。

本発明の抗体Ｈ鎖はこの要望に答えるべく開発され゛た
ものであって、上記の通り くω　マウス抗体ＨｍＶ領域アミノ酸配列と山）　ヒト
抗体Ｈ鎖Ｃ領域アミノ酸配列との組み合わせより成るキ
メラ構造をもつ点に特徴があり、免疫学的にはヒトＣＡ
ＬＬ抗原に特異的に反応することにより特徴づけられる
。

マウス抗体のＶ領域は大きく分けて■断片、Ｄ断片、Ｊ
断片の部分から構成される。抗原特異性の決定にもっと
も大きく関与するのはＶ断片である。例えばＪ断片には
Ｊａ　、Ｊ２　、Ｊａ、Ｊａの４種が知られている。

而して本発明に於けるマクスト１鎖■領域は最終的に抗
体として組み立てられた時にヒトＣＡＬＬ抗原に特異的
に反応する限りＤ及びＪ断片については特定のアミノ酸
配列に限定されるものではなく変化しても良い。しかし
ながら中でもヒトＣＡＬＬ抗原に対して特異的に反応す
るマウス抗体ト１鎖に由来するものが好適である。その
ようなＶ領域の具体例として該Ｖ領域のＶ断片 ＡＳＩ）　　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｔ　
　Ｑｌｕ　　５ｅｒＧｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　　Ｐｒ。

ＧＩＶ　　ＧＩＶ　　Ｓｅｒ　　Ａｒ（Ｉ　　Ｌｙｓ　
　ｌｅｕ　　５ｅｒＣｙｓ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　ＴｈｒＰｈｅ　　Ｓｅｒ
　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　ｃ、Ｉｙ　　Ｍｅｔ　　ｌ−
１ｉｓＴｒｐ　　Ｖａｌ　　Ａｒａ　　Ｇｌｎ　　Ａｌ
ａ　　Ｐｒｏ　　ＧｌｕＬｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　
　Ｇｌｕ　　Ｔｒｐ　　Ｖａｌ　　ＡｌａＴｙｒ　　Ｉ
ｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｔ
ｙｒＴｈｒ　　ｌｉｅ　　Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ　　Ａｌａ
　　Ａｓｐ　　ＴｈｒＶａｔ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　
Ａｒ（Ｉ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　　ｌ１ｅＳｅｒ　　Ａ
ｒｇ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ａ
ｓｎＴｈｒ　　１−ｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌ
ｎ　　Ｍｅｔ　　ＴｈｒＳｅｒ　　１−ｅｕ　　Ａｒｇ
　　３ｅｒ　　Ｇｌｕ　　ＡｓｐＴｈｒＡｌａ　　Ｍｅ
ｔ　　Ｔｙｒ　　”ｒｙｒ　　Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　５
ｅｒＳｅｒ　　Ｔｙｒ　　ＧＩＶ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｃ
　　Ｔｒｐ　　ＴｙｒＰｈｅ　　ＡＳＩＩ　　Ｖａｔ　
　Ｔｒｉ）　　Ｇｎｙ　　Ａｌａ　　ＧｌｙＴｈｒ　　
Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　
Ｓｅｒを有するものが含まれ、更に限定的にはＶ領域が
下記前アミノ酸配列 ＡＳＩ）　　Ｖａｔ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｔ　
　Ｇｌｕ　　３ｅｒＧｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　ＡｒｇＬｙｓ　　Ｌｅ
ｕ　　５ｅｒＣｙｓ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　
　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒｐｉｅ　　Ｓｅｒ　　３
ｃｒ　　ｐｈｅ　　Ｑｌｙ　　Ｍｅｔ　　ＨｉｓＴｒｐ
　　Ｖａｌ　　Ａｒ（］　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｐｒ
ｏ　　ＧｌｕＬＶＳ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｑｌｕ　
　Ｔｒｐ　　Ｖａｌ　　ＡｌａＴｙｒ　　Ｉｌｃ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　ＴｙｒＴｈｒ
　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ　　Ａｌａ　　ＡＳＯ
ＴｈｒＶａｌ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｏ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｔｈｒ　　）ｌｅＳｅｒ　　ＡｒｇＡｓｐ　　Ａ
ｓｎ　　Ｐｒｏ　　１−ｙｓ　　ＡｓｎＴｈｒ　　Ｌｅ
ｕ　　ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ｍｅｔ　　Ｔｈ
ｒＳｅｒ　　ＬＱＵ　　Ａｒｇ　　３ｅｒ　　Ｇｌｕ　
　Ａｓｐ　　ＴｈｒＡｌａ　　Ｍｅｔ　　Ｔｙｒ　　Ｔ
ｙｒ　　ＣＶｓ　　Ａｌａ　　５ｅｒＳｅｒ　　Ｔｙｒ
　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｔｒｐ　　Ｔｙｒ
Ｐｈｅ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌｙ　　
Ａｌａ　　ＧｌｙＴｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｖａｌ　　３ｅｒ　　３ｅｒＳｅｒ　　Ｔｙｒ　
　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｔｒｐ　　ＴｙｒＰ
ｈｅ　　Ａｓｐ　　Ｖａｔ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌｙ　　Ａ
ｌａ　　ＧｌｙＴｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ
　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒを有するものが挙げら
れる。

使方本発明のキメラ抗体１」鎖Ｃ領域を構成するポリペ
プチドとしてはヒト抗体（Ｉａ）として知られている１
ｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉ（ｌ　Ｇ。

１（ＩＭのいずれのＨ鎖に由来するものであっても良い
が、一般的にはＩ’ｇＧ由来のもの、中でも１１Ｊ　Ｇ
＋由来のものが好適である。より具体的には下記のアミ
ノ酸配列を有するものが挙げられる。

Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　ｃｙｓ　　Ｇｌｌ／　
　Ｐｒｏ　　５ｅｒＶａｔ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｌ
ｅｕ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　５ｅｒＳｅｒ　　Ｌｙｓ
　　５ｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｑｌｙ　　Ｇｌｙ
Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　
Ｇｙｓ　　１−ｅｕＶａｌ　　ｌｙｓ　　ＡＳｐＴｈｒ
　　Ｐｈｅ　　ｐｒｏ　　ＧｌｕＰｒｏ　　Ｖａｌ　　
Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｔｒｐ　　Ａｓｎ３ｅ
ｒ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅ
ｒ　　ＧｌｙＶａｌ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　
　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　ＶａｔＬｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　ＴｙｒＳｅｒ
　　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　　Ｖ
ａｌ　　　ＴｈｒＶａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅ
ｒ　　３ｅｒ　　１−ｅｕ　　ＧｌｙＴｈｒ　　Ｇｌｎ
　　Ｔｈｒ　　’ｌｒ　　　Ｉｌｅ　　Ｇｙｓ　　Ａｓ
ｎＶａｌ　　Ａｓｎ　　ｔ−１ｉｓ　　ｌｙｓ　　ｐｒ
ｏ　　Ｓｅｒ　　ＡｓｎＴｈｒ　　Ｌ’／Ｓ　　ｖａｌ
　　ＡＳＩ）　　ＬｙＳ　　Ｌｙｓ　　ＶａｌＧｌｕ　
　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ａｓｐ　
　ＬｙｓＴｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓ　　Ｐ
ｒｏ　　Ｐｒｏ’ＣｙｓＰｒｏ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　
　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　１．−ｅｕ　　ＧＩｙＧｌｙ　
　ｐｒｏ　　３ｅｒ　　Ｖａｌ　　　ｐｈｅ　　ｌｅｕ
　　Ｐｈｅｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　ｐｒｏ　　
Ｉ−ｙｓＡＳｐＴｈｒＬｅｕ　　Ｍｅｔ　　　ｌｌｅ　
　Ｓｅｒ　　Ａｒ（ｌ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　ｃｙｓ　　ｖａｔ　　
Ｖａｌ　　ＶａｔΔｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｓｑｒ　　Ｈｉ
ｓ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　　Ｖ’ａｌ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　ＡＳｎ　
　Ｔｒｐ　　Ｔｙｒ■ａＩ　　ＡＳＩ）　　（３１ｙ　
Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　　Ｈｉｓ△ｓｎ　　Ａ
ｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ａ
ｒｇＧｌｕ　　　Ｇｌｕ　　　Ｇｌｎ　　　Ｔｙｒ　　
　Ａｓｎ　　　Ｓｅｒ　　　ＴｈｒＴｙｒ　　Ａｒ！１
１　　Ｖａｔ　　Ｖａｌ　　Ｓａｒ　　Ｖａｌ　　　１
ｅｕＴｈｒ　　　　Ｖａｌ　　　　Ｌｃｕ　　　　Ｈｉ
ｓ　　　　Ｇｌｎ　　　　ＡＳｐ　　　Ｔｒｐｌｅｕ　
　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　
　ＬｙｓＣｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　３ｅｒ　　Ａ
ｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ
　　ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｇ１１）　　ＬｙｓＴｈｒ　
　Ｉｌｅ　　３ｅｒ　　ｃｙｓ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　
　ＧｎｙＧｌｎ　　Ｐｒｏ　　Ａｒａ　　Ｇｌｕ　　Ｐ
ｒｏ　　Ｇｌｎ　　ＶａｔＴｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌ（！
Ｕ　　ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ａｒ（］Ｇｌｕ
　　Ｇｌｕ　　Ｍｅｔ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ
　　ＧｌｎＶａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　
Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　ＶａｔＬｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　３ｅｒ　　ＡｓｐＨｅ　　
Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｔｒｌ）　　Ｇｌｕ　
　５ｅｒＡｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｐｒｏ　　Ｇ
ｌｕ　　Ａｓｎ　　ＡｓｎＴｙｒ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ
　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　ＶａｌＬｅｕ　　
ＡＳＤ　　Ｓｅｒ　　ＡＳｒｌ　　Ｇｒｙ　　Ｓｅｒ　
　ＰｈｅＰＭ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｌｅｕ　　ＴｈｒＶａｌ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　
　Ｓｅｒ　　Ａｒａ　　Ｔｒｐ　　ＧｌｎＧｌｎ　　Ｑ
ｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ｃ
ｙｓＳｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　　）−１ｉｓ　　Ｇ
ＩＵ　　Ａｌａ　　１ｅｕＩ−１ｉｓ　　Ａｓｎ　　Ｈ
ｉｓ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｎ　　ＬｙｓＳｅｒ
　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ
　　Ｇｌｙｙｓ 従って本発明により提供されるマウスーヒトキメラ抗体
Ｈ鎖の一つの典型的なものとしては添付図１に示す如き
アミノ酸配列を有するものである。

本発明の上記キメラ抗体Ｈ鎖は前記マウス抗体Ｖ領域を
コードするＤＮＡ配列と前記ヒト抗体Ｃ領域のアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列とが発現可能な状態で連結
されたキメラＤＮＡ配列をベクタープラスミドに組み込
み、その組換えベクタープラスミドを宿主動物細胞に導
入し、該宿主動物細胞中で上記キメラＤＮＡ配列を発現
させることにより調製する事ができる。

前記マウスの抗体■領域のアミノ酸配列をコードしたＤ
ＮＡ配列は例えばヒト急性白血病リンパ腫の膜断片で免
疫したマウスの肺臓細胞とマウスミエローマ細胞との細
胞結合によって得られるハイブリドーマの染色体ＤＮＡ
から常法［例えばＴ。

マニアチス他、［モレキュラークローニング」コールド
スプリングハーバ−ラボラトリ−（１９８２）（Ｔ、　
Ｍａｎｉａｔｉｓ　、　　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ”Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒ
ｂｏｒ　　Ｌ　ａｂ　（１９８２）　）参照］によりク
ローン化することによって得られる。

その具体的手法は後記実施例９−１１に詳細に説明され
ている。

一方ヒト抗体Ｃ領域のアミノ酸配列をコードした遺伝子
はヒト抗体産生細胞から常法によりクローン化すること
によって得られる。その具体的手法は後記実施例１−３
に詳細に説明されている。

上記２種のＤＮＡ配列は少なくともヒトエンハンサ−を
含むＤＮＡ配列（以下ヒトエンハンサ−断片と称する）
を介して結合させる事により前述のマウス−ヒトキメラ
抗体をコードしたキメラＤＮＡ配列とすることができる
。

このヒトエンハンサ−断片にはヒトエンハンサ−を含ん
でいることが必要であるけれども、それ以外にマウスエ
ンハンサ−やマウス由来のイントロンを含んでいても差
しつかえない。

上記キメラＤＮＡは適当なベクタープラスミド例えばＰ
ＳＶ２Ｑｐｔ　、ＰＳＶ２ｎｅｏ　、ＰＫＳＶ−１０等
に組み込む事により組み換えベクタープラスミドが調製
される。

このようにして調製される組み換え体ベクタープラスミ
ドはプロトプラスト法［免疫実験操作法Ｘ　Ｉ　４５３
３ページ、日本免疫学会編、　　（１９８４）参照］に
より宿主動物細胞、例えばマウスミエローマＪ５５８Ｌ
、もしくはＮ５−１中に導入する。かくして得られる形
質転換細胞を培養することにより培養物中に所期のマウ
ス−ヒトキメラ抗体１」鎖を蓄積させることができ、こ
の培養物から該キメラＨ鎖を回収することができる。

本発明により提供される上記キメラ抗体１」鎖は例えば
以上述べたと同様の手段によって作成されるマウスヒト
キメラ抗体Ｌｌｌと組み合わせ完全な形のマウスヒトキ
メラ抗体とすることによりそのままあるいは抗癌剤と結
合させてヒト急性白血病リンパ腫患者に投与することに
より急性白血病リンパ腫の免疫学的治療に使用すること
が期待される。

次に実施例により本発明のキメラ抗体１」鎖をコードす
るキメラ［）ＮＡ配列の作成及び発現方法について更に
具体的に説明する。

実施例１（ヒト染色体ＤＮＡの単離） ヒト培養細胞Ａ　ＲＨ７７株３　ｘ　１０８個をガラス
棒でつぶし、２％ＳＤＳ存在下、プロテアーゼＫ（シグ
マ社製）で処理した後、１０ｍＭ　　ＴｒｉｓＨ（ａ）
　（ｐＨ８，０）−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ水溶液で飽和し
たフェノールを加えた。延伸によ、り水相とフェノール
相を分離し、水相を２０ｍＭ　　ＴｒｉｓＨ１（ａ）　
　（１）Ｈ７，５＞　　　−１００ｍＭ　　　　　Ｎａ
　　Ｃｊ−５ｍＭ　　　　　ＥＤＴＡ水溶液に対して透
析した。リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）処理をし、
フェノール抽出を行なった後、１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
　　Ｈ（ａ）　（ｐＨ８，０）１　　ｍＭ　　ＥＤＴＡ
水溶液に対して透析し、ヒト染色体ＤＮＡ的１．２可を
取１９　した［Ｎ、ブライン。

Ｄ、Ｗ、スタフオード；ヌクレイツク・アシッド、　Ｉ
Ｊザーチ３巻２３０３ページ（１９７Ｇ）　　（Ｎ、　
Ｂ１１ｍ　。

Ｄ、　Ｗ、　５ｔａＨｏｒｄ　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　
Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　　３　２３０３　（１９
７６）　）参照］。

実施例２（ヒト遺伝子ライブラリーの作成）実施例１で
得られたヒト染色体ＤＮＡ１５０μ９を後述する実施例
４に示した方法に準じて制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩ（宝酒造￥ｌＪ）で部分消２化した後、蔗糖密度勾
配遠心［蔗糖１０〜４０％（ｗｔ／ｖｏｌ　）　、　２
８０００ｒ、Ｉ）、１１．　Ｘ１５時間、２０’Ｃ］を
行ない、１５Ｋ　ｂ〜２３Ｋ　ｂに相当するＤＮＡ断片
４．３μグを得た。次にこのＤＮＡ断片０．８μりとシ
ャロン４Ａ　（Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ＞ベクター［Ｆ、Ｒ
，ブラットナー、Ｂ、Ｇ、ウィリアムス、Ａ、Ｅ、ブレ
クル、に、Ｄ、　トンプソン、ト（、Ｅ、ファーバー。

Ｌ、Ａ、フールロング、Ｄ、Ｊ、グルンヮルド。

Ｄ、０．キーフル、Ｄ、Ｏ，ムーア、Ｊ、Ｗ、シュム、
Ｆ、Ｌ、ジェルトン、ｏ、スミシーズ：サイエンス１９
６巻１６１ページ（１９７７）　　（Ｆ、　Ｒ，Ｂｌａ
ｔｔｎｅｒ　、　Ｂ、　Ｇ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　、　
Ａ、　Ｅ。

Ｂ　　１ｅｃｈｌ　　　、　　　Ｋ、　　　Ｄ、　　　
Ｔｈ０ＩｌｌｌｌＳＯｎ　　　、　　　ト１．　　　Ｅ
　　、　　Ｆａｂｅｒ。

Ｌ、　Ａ、　Ｉ”ｕｒｌｏｎｃ＋、　Ｄ、　Ｊ　、　Ｇ
ｒｕｎｗａｒｄ　、　Ｄ、　Ｏ。

Ｋｉｅｆｒｒ　、　Ｄ、　Ｏ，Ｍｏｏｒｅ、　Ｊ、　Ｗ
、　Ｓｃｈｕｍｍ　。

Ｆ、　Ｌ、　５ｈｅｌｄｏｎ　　ａｎｄ　　Ｏ，Ｓｍ１
ｔｈｉｅｓ　。

Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、　　１９６．　１６１　（１９７７
）参照）］との連結を行い、シャロン４△ベクターのラ
イトアームとレフ１〜アームの間にヒト由来のＤＮＡが
挿入されたハイブリッドＤＮＡを得た。連結にはＴ４−
ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
）社製）を用い、連結反応は６６１＋１Ｍ　　Ｔ　ｒｉ
ｓ−トＩＣｆ　　　（ｐ）−１７，６）　　　−６，６
ｍＭ　　　　Ｍ（ｌ　　Ｃ１０−１０ｍＭジチオスレイ
トール−１ｍＭＡＴＰ水溶液中で、１１℃、１２時間行
った。得られたハイブリッドＤＮＡについて、ｉｎ　　
ＶｉｔｒＯパッケージング［Ａ、ベッカー１Ｍ、ゴール
ド；プロシーディング　オブナショナルアカデミー　オ
ブ　サイエンス　オブザ　ユナイテイツド　プラーク　
オブ　アメリカ７２巻５８１ページ（１９７５）　　（
Ａ、　Ｂｅｃｋｅｒ　、　Ｍ。

Ｇｏｌｄ　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　Ｓ
ｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ。

７２　５８１　（１９７５）を行ない、ヒト遺伝子ライ
ブラリー（１，８Ｘ１０ＧＰＦＵ／μび、ヒトＤＮＡの
９９％以上を含む）とした。

実施例３（ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子のスクリーニング）前記
実施例２で得られたヒト由来のＤＮＡを含むシャロン４
Ａフアージの集合（遺伝子ライブラリー）を大腸菌Ｌ　
Ｅ　　３９２（ＡＴＣＣ３３５７２）に感染させプラー
クを形成させた。ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子を含むクローンは
ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ　）とデービス（Ｄ　ａｖｉｓ
）のプラークハイブリダイゼーション法［Ｗ、Ｄ、ベン
トン、ｒ、Ｗ、デービス；サイエンス１９６巻１８０ペ
ージ（１９７７）　　（Ｗ、　Ｄ。

Ｂｅｎｔｏｎ　、　Ｒ，Ｗ、　０ａｖｉｓ、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　　１９６１８０　（１９７７）　）参照］を使
用して［３２Ｐ］標識したヒト抗体ト１鎖Ｊ遺伝子で選
択した。ヒト抗体１１ｍＷ仏子を含むシャロン４Ａフア
ージからのＤＮＡ調製はトーマス（Ｔｈｏｍａｓ　）と
デービス（Ｑ　ａｖｉｓ）の方法［Ｍ、トーマス、Ｒ，
Ｗ、デービス：ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイ
オロジー９１巻３１５ページ（１９７４）　　（Ｍ、　
Ｔｈｏｍａｓ　。

Ｒ，Ｗ、［）ａｖｉｓ；　ＪｏＭＯｌ、　　Ｂｉｏｌ、
、９１　巻　３１５ページ＜１９７４）参照］により行
なった。

実施例４（ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子の制限エンドスフレアー
ゼ切断点地図の作成） 実施例３で得られたヒト抗体遺伝子を含むシャロン４Ａ
　　ＤＮＡ１μ９を制限エンドヌクレアーゼ消化用バッ
ファ　　［Ｅ（ＯＲ１，ＥＣ０ＲＶ、Ｍｌｕｌ、５ｐｈ
Ｉ消化では５０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐＨ７
，４）　−１００１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１−１０ｍＭ　ＭＣ
＋　８０４水溶液を、ＡａｔＩＩ　、　ＡｖａＩ　、　
ＢａｍＨＩ　、　ＢｓｔＥ　ＩＩ　。

Ｈｉｎｃ　Ｉｌ、　Ｈｉｎｄ　ｍ、　ＰｓｔＩ、　Ｐｖ
ｕｌＩ消化では１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ａ）　（１
）８７．５）　−６０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１−７１１Ｍ　
　Ｍ！７　Ｃ１ｚ　　（１）Ｈ７，４）　−１０ｆｌｌ
Ｍ　　Ｍ（］８５０４１１ｍＭジチオスレイトール水溶
を、そしｒｔ−１ｐａＩ消化では１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−ＨＣ１（吐１８．０）　−２０ｍＭ　　Ｋ（ａ）
−７ｍＭ　　ＭＱ　Ｃ１２−７１１１Ｍ２−メルカプト
エタノ ールれ用いた。１２０μ文に溶解させ、制限エンドヌク
レアーゼ（ＡａｔＩＩは東洋紡製，Ａｖａ■はベゼンダ
・リサーチ・ラボラトリーズ社製，ＢｓｔＥＩ［。

ＳｐｈＩはニュー・イングランド・バイオラブズ社製，
それ以外は宝酒造製を用いた。）２ユニツトを添加して
、３７℃，１時間以上消化を行なった。

ＢＳｔＥＩＩを用いた切断は６０℃で１時間以上行った
。

なお、二種類の制限エンドヌクレアーゼによる消化を行
なう場合には、まず低塩濃度で作用する制限エンドヌク
レアーゼで処理し、次に所定濃度まで塩濃度を上げてか
ら、より高塩濃度で作用する制限エンドヌクレアーゼで
処理した。

制限エンドヌクレアーゼによる消化後、４μ文の０．２
５％ブロモフェノールブルー・５０％グリセロール水溶
液を加え、０．８％〜２．５％アガロースゲル電気泳動
を行なった。アガロースはシグマ社のタイプ■電気泳動
用を使用した。電気泳動バッファーとして、４０　ｍＭ
　　Ｔｒｔｓ−ＣＨ３ＣＯＯＨ（ｐｌ−ｌ　８．０）　
−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ水溶液を用いた。

厚さ２履の垂直ゲル、にて、６〜９■／ｃ！Ｒの電圧で
、１．５〜３時間電気泳動を行なった。この電気泳動の
際、ＤＮＡ断片の分子層マーカーとして、λファージの
ＤＮＡをｔ−１ｉｎｄＢｌで消化したもの（ベーリンガ
ー・マンハイム社製〉を用いた。電気泳動終了後、アガ
ロースゲル中のＤＮＡを２μｇ／ｒｎ！エチジウムブロ
マイド水溶液を染色し、このゲルに対して長波長紫外線
を照射して、消化パターンの観察を行なった。各種制限
エンドヌクレアーゼ単独による消化、及び二種の制限エ
ンドヌクレアーゼの組合けによる消化、これらの消化パ
ターンを解析することにより、後述するような各制限エ
ンドヌクレアーゼ切断点の相対位置関係を決定した。

実施例５［ヒト抗体Ｈ［！転子のリクローニング（ヒト
Ｃγｌ遺伝子を含む８，２Ｋ　ｂＨｉｎｄｎＩ断片と大
腸菌プラスミドｏＢＲ３２２どのハイブリッドＤＮＡ＞
１ ヒト抗体遺伝子を含むシャロン４Ａ　　ＤＮＡ３μ７を
実施例４の方法に準じて制限エンドヌクレアーゼト１ｉ
ｎｄＩ［Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃
度）を行った。Ｃγ１遺伝子を含む８．２ＫｂのＤＮＡ
部分に相当するバンドを切り出し、そのアガロース断片
を３倍量（ｖｏｌ　／Ｗｊ）の８Ｍ　　ＮａＣｆ０ａ水
溶液に溶解させた。チェノ（Ｃｈｅｎ）とトーマス（Ｔ
　ｈｏｍａｓ　）のグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ、チェ
ン、Ｃ，Ａ、トーマス；アナリティ力ルバイオケミスト
リ−１０１巻３９９ページ（１９８０）　　（Ｃ，Ｗ、
　Ｃｈｅｎ　、　Ｃ，Ａ、　Ｔｈｏｍａｓ　、　Ｊｒ、
、　Ａｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１０１　３９９
（１９８０）　）参照］により８．２Ｋ　ｂのＤＮＡ断
片をアガロースより回収した。

一方、大腸菌プラスミドＩ）ＢＲ３２２１μびを実施例
４に準じて制限エンドヌクレアーゼ）−１ｉｎｄ■で消
化したものに対して、アルカリ性ホスファターぜ（Ｅ、
ｃｏｌｉｃ７５）　　（宝酒造製）を０．５ユニット加
えて、４５℃で１時間反応させた。反応終了後、反応液
中のアルカリ性ホスファターゼを失活・除去するために
、フェノール抽出を３回繰返した。このようにして得ら
れた１）ＢＲ３２２のｌ−１ｉｎｄ■／アルカリ性ホス
フアターゼ処理液を、ゲルより回収した８、２Ｋ　ｂ　
ＩＩ　ｉｎｄ　ｍ断片水溶液と混ぜ、エタノール沈澱の
後、連結反応用バッファー（実施例２を参照）５０μ磨
に溶解させる。２ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加
え、１１℃、１２時間反応させて、ハイブリッドＤＮＡ
を得た。

大腸菌Ｃ６００株（ＡＴＣＣ３３５２５）の形質転換は
通常のＣａｆＪｚ法［Ｍ、Ｖ、ノーガード、Ｋ。

キーン、Ｊ、Ｊ、モナハム；ジーン３巻２９７ページ（
１９７８）　（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｏａｒｄ、　Ｋ、　
Ｋｅｅｎ　ａｎｄＪ、　Ｊ、　Ｍｏｎａｈａｍ、　Ｇｅ
ｎｅ　、　３．　２９７（１９７８）　］の改良法で行
なった。すなわち、５戒のＬ−ブロス（１％トリプトン
、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ　Ｃ１，ｐｉ−１
７，２＞に大腸菌Ｃ６００株の１８時間培養基を接種し
、ｅｏｏｎｍにおける光学密度０．３まで生育させる。

菌体を冷たいマグネシウム・バッファー［０，１Ｍ　　
Ｎａ（ａ）−５ｍＭ　　Ｍｇ（ａ）２５ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−Ｈ（ａ）　（ｐＩ−１７，６，０℃）］中で２回洗
い、２戒の冷したカルシウム・バッファー［１００ｍＭ
　　Ｃａ　ＣＬｚ　−２５０ｍＭ　　Ｋ（ａ）−５ｍＭ
ＭＣｌ　ＣＲ２−５１１１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ａ）　
（１）Ｈ７，６，０℃）コ中に再懸濁さけ、０℃で２５
時間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、ハイブリッドＤＮＡ水溶液と２　：　
１　（ｖｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物
を６０分間、０℃で保った侵、１ｄのＬＢＧ−ブロス（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＩＪ、
　　０．０８％グ、リコース、　　ｌ）Ｈ７，２）を添
加し、３７℃で１時間培養する。培養液を選択培地（ア
ンピシリン３０μｇ／Ｉｄ、を含むＬ−ブロス・プレー
ト）に１００μｐ／プレートで接種する。プレートを３
７℃で１番培養して、形質転換株を生育させる。得られ
たコロニーより、公知の方法を用いてＤＮＡを調整し、
アガロースゲル電気泳動により、目的のハイブリッドＤ
ＮＡを確認した。

かくして得られたサブクローンの制限エンドヌクレアー
ゼ切断点地図を添付図２及び図３に示した。図２はヒト
抗体遺伝子を含む染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼＥＣ０ＲＴで切断して得られる断片である。５′端の
位置をＥ　ｃｏＲＩ　−（１）。

３′端の位置をＥｃｏＲＩ−（２）として示している。

図２にはまた制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＸｈ
ｏＩ切断点も示されている。

このＤＮＡ断片を適当な制限エンドヌクレアーゼで切断
し、いくつかの小さな断片にわけた。図３に示すように
いくつかの断片は大腸菌用プラスミドＩ）ＢＲ３２２と
連結され四つのザブクローンが得られた。

サブクローンの制限エンドヌクレアーゼ切断点地乱 サブクローンｐＴＪ１Ｂ ＨｉｎｄＩ［［−（２１とＩ−１ｉｎｄ　ｍ　−（３）
で切断される小ＤＮＡ断片（約８．２）（ｂ）を１）Ｂ
Ｒ３２２のｌ−１ｉｎｄｎｌサイトに挿入することによ
り得られた。このサブクローンの制限エンドヌクレアー
ゼ切断点地図を図３１１−Ａに示した。図３Ｉ［−Ａの
ＰｓｔＩ−（３）とＨｉｎｄ　ｍ　−（３）の間に３な
いし４個のｐｓｔエサイトが認められた。

サブクローンｐＴＪＩＢＲ ＤＢＲ３２２にｐＴＪＩＢの場合と同様の方法で挿入す
ることによって得られたが、その挿入方向はｐＴＪｌＢ
とは逆である。このサブクローンの制限エンドヌクレア
ーゼ切断点地図を図３ｎ−Ｂに示した。

サブクローンｐＴＪ５ 前記Ｅ）ＴＪｌＢのＰＳｔＩ−（２）とＰｓｔＩ　−（
３］テ囲まれる小ＤＮＡ断片ｉ片を１）ＢＲ３２２のｐ
ｓｔエサイトに挿入する事により得られた。このサブク
ローンの制限エンドヌクレアーゼ切断点地図を図３ＩＩ
−Ａ　−（１１に示した。

サブクローンｐＴＪ４ 前記１）ＴＪＩＢよりＨｉｎｄ　ｍ−（３）とＰＳｔＩ
−（３１の間に存在するＰｓｔＩサイトの肉量もＨｉｎ
ｄｌ−（３）に近いナイトからＰｓｔＩ−（２）までの
領域を欠失させることにより得られた。このサブクロー
ンの制限エンドヌクレアーゼ切断点地図を図３ＩＩ−Ａ
−（２）に示した。

サブクローンｌ］ＴＪ３ ［ｃｏＲＩ−け）とトｌ　ｉｎｄ　ｍ−（ｌｌｌ四囲れ
る小ＤＮＡ断片（約３，４Ｋｂ　’）を１）ＢＲ３２２
のＥＯＯＲＩとＨｉｎｄＩ［ｌｌナイトに連結すること
により得られた。

このサブクローンの制限エンドヌクレアーゼ切断点地図
を図３−４に示した。

実施例６（ヒト抗体ト１鎖遺伝子エンハンサー領域のＤ
ＮＡ塩基配列決定） ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子のエンハンサ−領域並びにＶ−Ｄ領
域のＤＮＡ塩基配列決定はマキシム−ギルバート；メソ
ッド　イン　エンサイモロジー６５巻４９９ページ（１
９８０）　（Ａ、、　Ｍａｘａｍ、　Ｗ。

Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｘｙｍｏｌ
、　６５４９９（１９８０）　）参照］により行った。

実施例５に準じて調整したサブクローンｐＴＪ３約５０
μ３を実施例４に準じてＢＳｔＥＩで切断した。得られ
たＤＮＡ断片をアルカリ性ホスファターゼで脱ホスホリ
ル化し、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミ
カルズ社製）５ユニツトを用いて［γ−３２１）ＩＡＴ
Ｐで標識した。ポリヌクレオチドキナーゼ反応は５　ｍ
Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−１−Ｉ　Ｃ９（ｐＨ９，５）　−１
０ｍＭ　　ＭｇＣ第２−５１１１Ｍジチオスレイトール
水溶液中で行ない、［γ−３２１）　］　ＡＴＰはアマ
−ジャム社製を１００μＣ１分用いた。

３２ｐ標識ＤＮＡ断片をｌ−１ｐａＩで消化した後、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）により
目的のＤＮＡ断片を分離し、ゲルからの抽出を行なツタ
。得られた３２ｐ標識−Ｂ　ｓｔＥ　Ｉ　／　ｌ−１１
１ａＩ断片について、各塩基特異的な部分分解反応を行
ない、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動
くゲル濃度８％〜２３％）で分離した。２〜７日間、−
８０℃でオートラジオグラフィーを行なった後、分解パ
ターンの解析を行ない、エンハンサ−領域の塩基配列決
定のための資料とした。

かくしてこの発明のエンハンサ−ＤＮＡ塩基配列を含む
ＤＮＡ塩基配列が決定された。ＤＮＡ塩基配列は添付図
４に示されている。

実施例７（ヒト抗体ト１鎖遺伝子定常領域のＤＮＡ塩基
配列決定） ヒト抗体１」鎖遺転子定常領域のＤＮＡ塩基配列決定は
マキシム−ギルバート法（Ｍ　ａｘａｉ　−Ｑｉｌｂｅ
ｒｔ法）［Ａ、マキシム、Ｗ、ギルバート：メソッド　
イン　エンサイモロジー６５巻４９９ページ（１９８０
）　（Ａ、　Ｍａｘａｍ、　Ｗ、　Ｇ１１ｂｅｒｔ。

Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　　Ｅ　ｅｚｙａ＋ｏｌ　　６５　４
９９　（１９８０）　）参照］により行った。

ｐＴＪ５をｐｓＢで消化し、３′端標識キツト（アマ−
ジャム社製）によって［α−３２ｐ　］　ｄｄＡＴＰを
用いて標識した。３２ｐで標識したＤＮＡはＳｍａＩで
消化した後ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
５％）により目的のＤＮＡ断片を分離し、ゲルからの抽
出を行なった。得られた３２ｐ−標識ＰＳｔＩ／Ｓｍａ
Ｉｌ！７ｒ片について、各塩基特異的な部分分解反応を
行い、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度８％〜２３％）で分離した。２〜７日間−８
０℃でオートラジオグラフィーを行った後、分解パター
ンの解析を行い添付図５に示すような定常領域塩基配列
決定の資料とした。

実施例８（ヒト抗体遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られた２１Ｋ　ｂのヒト抗体Ｈ鎖遺伝子を
含むＥＣ０ＲＩ断片（ＨＩＧＩ）をＰ６バーグ（Ｐ、　
Ｂｅｒｃ＋　）によって開発されたｐＳ　Ｖ　２−０１
）ｔ　　［Ｒ，Ｃ，ムリガン、Ｐ、バーグ；プロシーデ
ィング　オブ　ナショナルアカデミ−オブサイエンス　
オブ　ザ　ユナイテイツド　ステーッ　オブ　アメリカ
７８巻２０７２ページ（１９８１）　　（Ｒ。

Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　、　Ｐ、　ＢｅｒＯ、ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｃｌ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　　咀２０７２　（
１９８１）　）　参照］のｌ：ｃｏＲＩサイトに挿入し
ｐｓＶ２−ＨＩＧＩを得た。このプラスミドの制限エン
ドヌクレアーゼ切断点地図を添付図６に示した。

実施例９（マウス染色体ＤＮＡの単離）マウスハイブリ
ドーマＮＬ−１２Ｘ１０’個を１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　（Ｓ　
ｏｄｉｕｍ　　Ｉａｕｒｙｌ　　５ｕｌｆａｔｅ　）存
在下プロテアーゼＫ（シグマ社製）で処理した後、水飽
和フェノールを加えＤＮＡを抽出した、延伸により水相
を分離し、　１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　　ｐｌ
−１７，４０，Ｉ　ｎ＋Ｍ　　Ｎａ　Ｃｊ、　　０．１
　ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）バッファーで透析した。

リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）処理し、再度フェノ
ール抽出を行なった後、ＴＮＥバッファーで透析しマウ
ス染色体ＤＮＡ３００ｕｇを得た。

実［１０（マウスＮＬ−１３ｆｌ伝子ライブラリーの作
成） 実施例９で得られたマウス染色体ＤＮＡ１５０μ９を実
施例４に示した方法に準じて制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩ（宝酒造製）で完全消化しアガロース電気泳動
を行ない、７に〜９Ｋｂに相当するＤＮＡ断片５μ９を
アガロースゲル中から電気的に抽出した。

次にこのＤＮＡ０．４μびとシャロン４ＡベクターＥＣ
０ＲＩａｒ１１　　（アマ−ジャム社製）との連結をＴ
４　　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）で行ない、アマー
ジャム社のキットを用いて、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏパッケ
ージングを行ない、マウスＮＬ−１ｍ転子ライブラリー
８ｘ１０ＧＰＦＵ／μ３を得た。

実施例１１（マウス抗体ト１鎖遺伝子のスクリーニング
） 前記実施例１０で１ｑられたマウスＮＬ−１由来のＤＮ
Ａを含むシャロン４Ａフアージを大腸菌ＬＥ３９２株に
感染させ、プラークを形成させた。マウス抗体Ｈ鎖遺伝
子を含むクローンはブラークハイブリダイゼーシ、ヨン
法［Ｗ、Ｄ、ベントン、ＲｌＷ、デービス；サイエンス
１９６巻１８０ページ＜１９７７）　　（Ｗ、　Ｄ、　
Ｂｅｎｔｏｎ　、　Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉｓ。

Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　　１９６　１８０　（１９７７）　
）参照］を使用して３２ｐ標識マウス抗体１−１鎖Ｊ遺
伝子で選別した。

この方法によって、７．９Ｋ　ｂのマウスＮＬ−１の前
Ｖ領域（５’　Ｎａｎｋｉｎｇ領域、ｖＤＪ及びエンハ
ンサ−領域）を含む遺伝子を単離した。

実施例１２（マウス抗体Ｈ鎖遺伝子の制限エンドヌクレ
アーゼ切断点地図の作成） 実施例１１のマウスＮＬ−ＩＨ鎖ＤＮＡＥＣ０ＲＩ断片
７，９Ｋ　ｂをベクターＰＢＲ３２２にリクローニング
し、大腸菌ＤＨ−１形質転換し、この大腸菌の大量培養
により約１１ｆｔｇのマウスＮＬ−１鎖ＤＮＡ　　７．
９ＫｂをＰＢＲ３２２のＥＣ０ＲＩサイトに挿入したプ
ラスミド（ＰＢＲＮＬ−１−Ｈ）を得た。このＰＢＲＮ
Ｌ−１−１−ｔを一１１限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
Ｉ、Ｂａ１Ｈ１，Ｈｉｎｄ　ｍ。

Ｅ　ｃｏＲＶ　、　Ｐ′ｖｕＩ［（イｆ　ｈモ宝酒造社
’ｌｆｆ１）ＳｐｈＩ（ベヒスダ・リナーチ・ラボラト
リ−）を用いて、切断し制限酵素切断点地図を作成した
。代表例として、ＥＣ０ＲＩ切断を例示すると、ＤＮＡ
１μび。

制限エンドヌクレアーゼ５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　ＨＣ
Ｃｏｌ−１７，４，１００ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，１０ｍ
Ｍ　　Ｍｇ８０４水溶液を用いＥ　ｃｏＲＩ　４ユニツ
トで３７℃２時間消化を行ない、ＤＮＡをエヂジウムブ
ロマイド水溶液２μｇ／戒で染色し、紫外線照射によっ
て消化パターンの解析を行ない添付図７に示す制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位を決定した。

実施例１３（マウス抗体ＨｉＶＤＪ領域のＤＮＡ塩基配
列決定） 前記ＰＢＲ−ＮＬ−１−Ｈを制限エンドヌクレアーゼ５
ｐｈＩ及びＰｖｕＩ［で切断し、挿入遺伝子の与える５
ｐｈＩ・ＰｖｕｌＩ切断部位ではさまれる２種類の断片
を得た。これらを５ｐｈＩ及びｌ−１ｉｎｄＩＩで切断
したＭ１３ファージベクターｍｐ１８及びｍｐ１９　（
ビーエルバイオケミカルス）にクローニングした。

シーケンシングはＭ１３シークエンスキット（宝酒造社
製）を用いて、ジデオキシチェーンターミネーション法
で行った。Ｓ　ＤｈＩ　／　ＰｖｕＩＩ　１ｇｉ片の５
′側断片については５ｐｈＩサイトから３′方向、ＰＶ
Ｕ［サイトから５′方向に、３′側隣接断片については
Ｐｖｕｌｌサイトから３′方向に塩基配列を決定した。

可変領域のＤＮＡ塩基配列を添付図８に示した。

実施例１４（キメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐＭ　ｌ
−１−１の作成） 抗ヒト急性白血病リンパ腫抗体Ｈ鎖遺伝子（７，９Ｋｂ
　）をベクターｐＢＲ３２２のＥＣＯＲ丁サイトに挿入
したプラスミドｐＢＲ−ＮＬ−１−Ｈの１」鎖■領域全
域を含むＥ　ｃｏＲＶ　−Ｂ　ａｍＨＩフラグメント（
約２．７．Ｋｂ）を制限酵素切断のあと、アガロース電
気泳動によって分離し、実施例５に準じて精製した。

一方ｎｆｆ記プラスミドベクター１１８　Ｖ　２−　ｇ
ｐｔをＢａ１ｌ−Ｉ工及びト１１１ａＩＦ切断し、ＥＣ
０（ｌｌｌｔ　Ｍ転子ヲ含む約５．３Ｋ　ｂの線状ベク
ター遺伝子を分離精製した（このベクター遺伝子を゛フ
ラグメントー１′′と略称する）。

先にＩたｐＢＲ−ＮＬ−１−ｔ−Ｉ　　ＥｃｏＲＶ−３
μｍＨＩのフラグメント（約２．７Ｋｂ　）と前記ｐＳ
　Ｖ　２１ｔ）ｔのＢ　ａｍＨＩ　−ＨＦ）ａＩのフラ
グメント−１（約５．３Ｋｂ　）とをＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼで連結し、次いでＢａ１ｌＨＩで切断し、ＮＬ−１
−日の■領域約２．７Ｋ　ｂを含む線状ベクター遺伝子
（約８，０）（ｂ　）を得、分離しＷｉ製したくこのベ
クター遺伝子を°“フラグメント−２″と略称する）。

また、ヒト抗体遺伝予約２１Ｋ　ｂを含むプラスミドｐ
ＳＶ２−ＨＩＧＩをＭｌｔｌＩで切断し、ヒトエンハン
サ−及びＣγｌを含む遺伝予約１７Ｋ　ｂのフラグメン
トを得、分離精製した。この約１７Ｋｂのフラグメント
にモレキュラークローニング［−「。

マニアティス他著、コールドスプリングハーバ−ラボラ
トリ−（１９８２）　　（Ｔ　、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　
　ｅｔａｌ。

“Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉｎｃ＋”、　Ｃ
ｏ１ｄ　　３ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂ、　
　（１（１８２）　）　］の方法に準シテＢａ１ｌｌＨ
Ｉリンカ−（宝酒造社製）を連結し、両端にＢａ１ｌｌ
ＨＩサイトを付与したくこれを“フラグメント−４″と
略称する）。

このフラグメン１−−４と先に得たフラグメント−２と
をＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、更に大腸菌Ｍ
　Ｃ１０００を形質転換してヒトエンハンサ−（Ｅｈ　
）を介してＶ領域がマウス由来のもの、Ｃ領域がヒト由
来のものであるキメラ抗体遺伝子を得た。（この遺伝子
を’ｌ）ＭＨ−１と略称する）。上記遺伝子ｐＭ　Ｈ−
１を得る系統図を添付図９に示した。

実施例１５（キメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐＭ　Ｈ
−２の作成） ヒト抗体Ｈ鎖遺転子約２１Ｋｂを含むプラスミド１）Ｓ
Ｖ２−ＨＩＧＩを制限酵素Ｂａ１ＨＩで切断し、ヒトエ
ンハンサ−（Ｅｈ　）及びＣ１０を含む約１．４Ｋ　ｂ
のフラグメントを常法により得た。このフラグメントを
先のフラグメント−２とＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて
連結した後、大腸菌ＭＣ１０００に形質転換して、■領
域がマウス由来であり、Ｃ領域及びエンハンサ−がヒト
由来のキメラ抗体遺伝子を得たくこの遺伝子を“’ｐＭ
Ｈ−２′′と略称する）。この遺伝子ｐＭ、　１１−２
を得る系統図を図９に示した。

実施例１６（キメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐＭ　Ｈ
−３の作成） 前記プラスミドｐＢＲ−ＮＬ−１−Ｈを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＶ、ＥｃｏＲＩｔ’切断し、マウスＨ１￥Ｂ領域の全
域とマウスエンハンサ−（Ｅｍ　’）を含む約４．７Ｋ
　ｂのフラグメントを実施例５に準じて得た。

次に前記ベクター１）Ｓ　Ｖ　２−　ｆｌｌｌ）ｔをＥ
　ＣＯＲＩ　。

ト１ｐａＩで切断し、Ｅ　ｃｏｇｐｔ遺伝子を含む約４
．５Ｋｂのフラグメントを得、分離し′Ｍ！ｌｌした。

かくして得られたフラグメントと先のマウス■遺伝子の
フラグメント（約４．７Ｋｂ　）とをＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結し、次いでＥＣ０ＲＩで切断し、ＮＬ
−１−Ｈの■領域約４．７Ｋ　ｂを含む線状ベクター遺
伝予約９．２Ｋ　ｂを得、これを分離し精製したくこれ
を“フラグメント−３″と略称する）。

また、ヒト抗体Ｈ鎖遺転子約２１Ｋｂを含むプラスミド
ｐｓＶ２−ＨＩＧＩからＭｌｕＩｒ切断し、ヒトエンハ
ンサ−（Ｅｈ　）及びＣ１０を含む約１７Ｋｂのフラグ
メントを得、分離して精製した。この約１７Ｋ　ｂのフ
ラグメントと前記と同様のモレキュラー・クローニング
の方法に準じて、ＥＣ０ＲＩリンカ−（宝酒造社製）を
連結し両端にＥＣ０ＲＩサイトを付与したくかくして得
たフラグメントをフラグメント−５と略称する）。

このフラグメント−５と前記フラグメント−３とをＴ４
−ｒ）ＮＡリガーゼを用いて連結し、ヒト及びマウスの
エンハンサ−、マウス由来のＶ領域。

ヒト由来のＣ領域を有するキメラ抗体遺伝子を得た（こ
の遺伝子を’ｐＭＨ−３”と略称する）。

この苗転子ｐＭ　ｌ−１−３を得る系統図を図９に示し
た。

実施例１７（キメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐＭ　ｌ
−１−４の作成） 前記プラスミドｐＢＲ−ＮＬ−１−ＨをＥＣ０ＲＶ及び
ＢａｍＨＩで切断し、マウスＶＷ転子全域を含む２，７
Ｋｂのフラグメントを得、分離して精製した。次にこの
フラグメントのＥＣ０ＲＶ端にＥＣ０ＲＩリンカ−を用
いてＥＣ０ＲＩサイトを付与し、Ｅ　ｃｏＲＩ　−Ｂ　
ａｍｌ−Ｉ　Ｉ約２．７Ｋｂのフラグメントを得た。

一方、前記ベクターｐＳ　Ｖ　２−　ＩＪＩ）ｔをＥＣ
０ＲＩ及びＢａ１ＨＩで切断し、Ｅ　ｃｏｇｐｔ遺伝子
を含む線状ベクター４．６Ｋ　ｂを得、分離して精製し
た。このベクターと前記ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ約２
．７ＫｂのフラグメントとをＴ４−ＤＮＡリガーゼを用
いてライゲーションし、次いでＢａ１ｌｌＨＩで切断し
、ＮＬ−１−Ｈの■領域遺伝子を含むベクター遺伝予約
７．３Ｋ　ｂを得たくこれを“フラグメント−６″と略
称する）。

このフラグメント−６と前記実施例１で得たヒトエンハ
ンサ−（Ｅｈ　）及びＣγを含むフラグメント−４とを
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、次いで大腸菌Ｍ
　Ｃ４０００に形質転換し、ヒトエンハンサー（Ｅｈ　
）を介して、マウス由来のＶ領域、ヒト由来のＣ領域を
有するキメラ抗体遺伝子を得たくこの遺伝子を”ｌ）Ｍ
Ｈ−４”と略称する）。この遺伝子ＣＭ　Ｈ−４を得る
系統図を図１０に示した。

実施例１８（キメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐＭ　Ｈ
−５の作成） 前記プラスミドｐＢＲ−ＮＬ−１−ＨをＢａｍＨＩ及び
ＥＣ０ＲＩで切断し、マウスエンハンサ−（Ｅｌｌｌ　
）を含む約２Ｋｂのフラグメントを得、分離して精製し
た。この約２Ｋｂのフラグメントを前記実施例１６で得
た。フラグメント−５とをＴ４リガーゼを用υ）で連結
し、次いでＢａｍＨＩで切断して、マウスとヒトのエン
ハンサ゛−及びヒトＣγ１を有する約１３ＫｂのＢａ１
ｌ−ＩＩフラグメントを得た。

この３．ａｍＨ■フラグメントを前記実施例１７で得た
フラグメント−６とＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、次いでこれを大腸菌Ｍ　Ｃ１０００に形質転換し、
マウスとヒトのエンハンサ−を介して、マウス由来の■
領域、ヒト由来のＣ領域を有するキメラ抗体遺伝子を得
たくこの遺伝子を’ｐＭＨ−５″と略称する〉。この遺
伝子ｐＭ　Ｈ−５を得る系統図を図１０に示した。

実施例１９（キメラ抗体遺伝子の発現）前記実施例１４
〜１８で得られたキメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐＭ
Ｈ−１〜ｐＭ　Ｈ−５を、実施例５の方法に準じて大腸
菌Ｍ　Ｃ１０００に形質転換し、得られた形質転換体を
アンピシリンを含む培地で培養したのち、クロラムフェ
ニコールによってプラスミドを増巾した。次にリゾチー
ム（シグマ）処理によってプロトプラスト化を行なった
。得られたプロトプラストを、２　Ｘ　１０’個のマウ
スミエローマＪ　　５５８Ｌ又はＮ５−１と、０．５７
５０％ＰＥＧ　４０００中２〜７分で細胞融合し、ＭＥ
Ｍ培地（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　　ｌ　５ｌａｎｄ
　、　ＮＹ）で希釈俊、遠心によりＰ　Ｅ　Ｇ　４００
０を除去した。それぞれの細胞をＲＰＭ　Ｉ　１６４０
完全培地（Ｑｉｂｃｏ、　Ｑｒａｎｄ（ｓｔａｎｄ　、
　ＮＹ）中で４８〜７２時間成育させた。しかる少、Ｆ
ＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトｒａＧ（Ｃａｐｐｅｌ　　１ａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ　　ｉｎｃ、）を用いて細胞表面を
螢光染色し、キメラ抗体遺伝子の発現を調べた結果、発
現プラスミドｐＭｆ−１−１，ｐＭＨ−２及びｐＭ　Ｈ
−４を組込ｌνだ細胞には強い発現が認められ、一方、
発現プラスミドｐＭ　Ｈ−３及びｐＭ　Ｈ−５を組込ん
だ細胞には比較的弱い発現が観察された。

また、それぞれのｍ胞がらｌ”（ＮＡを抽出し、得られ
たＲＮＡそれぞれ２０μ９を用い、マウス■ＤＪ遺伝子
を含むプラスミドｐＢＲ−ＮＬ−１−ＨのＢ　ａｍＨＩ
　−Ｐ　ｖＪ断片、及びヒトＣγ１遺伝子の一部を含む
プラスミドｐｓＶ２−１−ＩＩＧＩのＰｓｔＩ　−（２
）　−ＰｓｔＩ−（３）の断片を３２ｐで標識し、ノー
ザンハイブリダイゼーション［Ｔ、マニアティス他茗、
［モレキュラークローニング」コールドスプリングハー
バ−ラボラトリ−（１９８２）　　（Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔａｌ、、“Ｍ　ｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　　ｃＩｏｎｉｎｇ”Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂ、　　（１９８２）　）参照
１を行なったところ、発現プラスミドｐＭｌ−１−１，
ｐＭＨ−２及びｐＭ　Ｈ−４を組込んだ細胞のＲＮＡと
は強くハイブリダイズし、一方、発現プラスミドｐＭ　
ｌ−１−３及びｐＭ　１−１−５を組込んだ細胞のＲＮ
Ａとは比較的弱くハイブリダイズした。

本実施例１９における前記発現の程度は、マウスミエロ
ーマＪ　　５５８Ｌ及びＮ５−１のいずれにおいても同
じ傾向を示した。

また前記発現プラスミドｐＭ　Ｉ−１−４をマウスミニ
ローマＪ　　５５８Ｌにプロトプラスト融合により導入
し、選択培地に移した。選択培地には２５０γ／−キサ
ンチン、１５γ／−のハイポキサンチン、６γ／ｄのｍ
ｙｃＱＩ）ｈｅｒｌｏＩｉｃ　　ａｃｉｄを含む。２日
間連続してメディウム交換の後、２週間後、 ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　　ａｃｉｄ抵抗性の形質転
換体が得られた。

１１られた形質転換体からｍ　ＲＮＡを抽出し、マウス
ＶＤＪ遺伝子のＶ　ｆｒＸ域及びヒトＣＴｔｉ転子をプ
ローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行った
ところ１．７Ｋｂの位置に完全な分泌型ト１鎖のｍ　Ｒ
ＮＡに対応するバンドが観察された。

上記形質転換体を３５８−メチオニン（アマーシｔム社
ｔＪ）存在下Ｔ’［ｆｉＬＴｉｎｔｅｒｎａｌ　　１ａ
ｂｅｌヲ行い得られた培養上清を抗ヒトＩｇＧ抗体を用
いて免疫沈降を行った。沈澱を５Ｄｓ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけて、フルオログラフィーを行な
ったところ、キメラ抗体Ｈ鎖蛋白は培養上清中にＨ２１
２の形で存在していることが確認された。

また、サザーンハイプリダイゼーションによって、キメ
ラ抗体遺伝子の検出を試みたところ、細胞１個当り平均
的０．５コピーのキメラ抗体遺伝子の存在が確認された
。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明によるマウス−ヒトキメラ抗体１」鎖の典
型的なアミノ酸配列の一例を示すものであり、 図２及び図３は、それぞれ本発明の実施例で得られたヒ
ト抗体１」鎖遺転子のサブクローンの制限エンドヌクレ
アーゼ切断点地図を示すものであり、図４は、ヒト抗体
（」鎖遺転子におけるエンハンサ−領域のＤＮＡ塩基配
列を示すものであり、図５は、ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子にお
ける定常領域（Ｃ）のＤＮＡｔ３ｉ基配列を示すもので
あり、図６は、本発明の実施例８で得られた発現型プラ
スミドの制限エンドヌクレアーゼ切断点地図を示すもの
であり、 図７は、マウス抗体Ｈ鎖遺伝子の制限エンドヌクレアー
ゼ切断点地図を示すものであり、図８は、マウス抗体Ｈ
鎖Ｖ、Ｄ、Ｊ領域のＤＮＡ塩基配列を示すものであり、 図９及び図１０はそれぞれマウス−ヒトキメラ抗体Ｈ鎖
を含む発現型プラスミドを得る系統図を示したものであ
る。 特許出願人　帝　人　株　式　会　社 Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＶａｌＧｉｎ
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Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　ＡｌａＳｅｒ　　Ｇ
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Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ園２ ｎ−Ａ−（１）　　Ｉ［−Ａ−＋２） （切４ ５’−ＴＴＧＧＣＧＡＧＣ丁ＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡ
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ＣＣＴＣＣＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＡＣＴＴ
ＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧ（ｇＪ９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）マウス抗体Ｈ鎖Ｖ領域アミノ酸配列と（ｂ）
   ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域アミノ酸配列 とから成りヒト急性白血病リンパ腫共通抗原と特異的に
   反応するマウス−ヒトキメラ抗体Ｈ鎖。 ２、該Ｖ領域アミノ酸配列がヒト急性白血病リンパ腫共
   通抗原に対して特異的に反応するマウス抗体Ｈ鎖に由来
   するものである第１項記載のキメラ抗体Ｈ鎖。 ３、該Ｃ領域アミノ酸配列がヒト抗体ＧのＨ鎖由来のも
   のである第１項記載のキメラ抗体Ｈ鎖。 ４、ヒト抗体Ｇがヒト抗体Ｇ＿１である第３項記載のキ
   メラ抗体Ｈ鎖。 ５、該Ｖ領域アミノ酸配列が下記のアミノ酸配列である
   Ｖ−断片を含有するものである第１項記載のキメラ抗体
   遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ［但し上記配列中各記号は下記意味を示す。 Ｇｌｙ；グリシン　ＡＳｐ；アスパラギン酸Ａｌａ；ア
   ラニン　Ｌｙｓ；リジン Ｖａｌ；バリン　Ａｒｇ；アルギニン Ｌｅｕ；ロイシン　Ｈｉｓ；ヒスチジン Ｉｌｅ；イソロイシン　Ｐｈｅ；フェニルアラミンＳｅ
   ｒ；セリン　Ｔｙｒ；チロシン Ｔｈｒ；スレオニン　Ｔｖｐ；トリプトファンＣｖｓ；
   システイン　Ｐｒｏ；プロリン Ｍｅｔ；メチオニン　Ａｓｎ；アスパラギンＧｌｕ；グ
   ルタミン酸　Ｇｌｕ：グルタミン］（以下本明細書につ
   いて同じ） ６、該Ｖ領域が下記のアミノ酸配列を有する第５項記載
   のキメラ抗体Ｈ鎖。 【アミノ酸配列があります】 （ここで各アミノ酸の略称は第５項におけると同義であ
   る。） ７、該Ｃ領域が下記アミノ酸配列を有する第１項記載の
   キメラ抗体Ｈ鎖。 【アミノ酸配列があります】 （ここで各アミノ酸の略称は第５項におけると同義であ
   る） ８、下記のアミノ酸配列を有する第１項記載のキメラ抗
   体Ｈ鎖。 【アミノ酸配列があります】 ９、第１項で示されるマウス−ヒトキメラ抗体Ｈ鎖アミ
   ノ酸配列をコードするキメラＤＮＡ配列。 １０、該Ｖ領域Ｖ−断片として下記ＤＮＡ塩基配列をも
   つ第９項のキメラＤＮＡ断片及びその相補鎖。 【遺伝子配列があります】 ［但し、上記単位中Ａはデオキシアデニル酸、Ｔはチミ
   ジル酸、Ｇはデオキシグアニル酸、Ｃはデオキシシチジ
   ル酸を表わす。］ １１、該Ｖ領域遺伝子として下記ＤＮＡ塩基配列をもつ
   第１０項のキメラＤＮＡ断片及びその相補鎖。 【遺伝子配列があります】 １２、下記ＤＮＡ断片から成るヒト抗体Ｃ領域ＤＮＡ断
   片をもつ第９項記載のキメラＤＮＡ断片。 （１）下記のＤＮＡ塩基配列をもつＣＨ＿１断片及びそ
   の相補鎖、 【遺伝子配列があります】 （２）下記ＤＮＡ塩基配列をもつヒンジ（ｈ）断片及び
   相補鎖 【遺伝子配列があります】 （３）下記ＤＮＡ塩基配列をもつＣＨ＿２断片及び相補
   鎖 【遺伝子配列があります】 （４）下記ＤＮＡ塩基配列をもつＣＨ＿３断片及び相補
   鎖 【遺伝子配列があります】 １３、Ｖ領域のＤＮＡ配列とＣ領域のＤＮＡ配列とが少
   なくともヒトエンハンサーを含むＤＮＡ配列を介して結
   合されている第９項記載のキメラＤＮＡ配列 １４、該ヒトエンハンサーが下記 【遺伝子配列があります】 で示されるＤＮＡ配列、及びそれに相補的なＤＮＡ配列
   を有する第１３項記載のキメラＤＮＡ配列。 １５、第９項のキメラＤＮＡ配列が組み込まれた組換え
   ＰＳＶ２−ｇｐｔプラスミド。 １６、第１５項の組換えプラスミドを用いて第９項のＤ
   ＮＡ配列が導入されたマウスミエローマＪ　５５８Ｌ細
   胞、及びＮＳ−１細胞。