JPS62209358A - 自動臨床分析システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト血中リポタンパクサブフラクション中のコ
レステロール分布の自動分析を行う自動臨床分析システ
ムに関する。

〔従来の技術〕

ヒト血中リポタンパクサブフラクション中に含まれるコ
レステロール分布を求めるためには、リポタンパクサブ
フラクションを分画しなければならない。これには、従
来より超遠心法及び電気泳動法が用いられてきた。超遠
心法は各フラクションの密度の興なりを識別する方法で
あり、一方電気泳動法はりボタンバクの表面電荷及び大
きさの異なりを識別する方法であるが、これらの方法を
用いた場合長時間を要するし、更にはこの後分離された
各フラクションについて含有されるコレステロールの測
定を行わなくてはならず、この二つの方法は現在の臨床
分析に於いて最も重要な点である迅速性、正確さ、経済
性を満たしていない。

しかしながら、血中リポタンパクサブフラクション中の
コレステロール分布を決定することによって現代社会の
最も高い死亡原因の一つである心筋梗塞に対する予防を
行うことが出来るばかりでなく、これらの患者に対して
薬物治療及び食事療法後の治癒経過をモニターすること
も可能であり、これがこの重大な疾患に対する現存する
唯一の確立された方法であることから専ら用いられてい
る。

これに代わる方法としては、排除クロマトグラフィーに
よってリポタンパクサブフラクションを分離した後に、
流路中にコレステロールエステルヒドラーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ及び発色剤を含んだ水溶液を通液す
ることによって、分離した各リポタンパクサブフラクシ
ョンを発色せしめて検出する方法が提案されているが、
この方法では高価でしかも寿命の短い酵素を大量に用い
るという短所があるために未だ実用化されていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、ヒト血中リポタンパクを排除クロマトグラフ
ィーによって自動的に分画した後、固定化シたコレステ
ロールエステルヒドラーセ及ヒコレステロールオキシダ
ーゼを充填したカラム内での反応を利用し、引続き各フ
ラクション中に含ま療の効果をモニターすることの出来
る簡便で経済性に優れた自動臨床分析システムを提供す
ることを目的としている。

〔問題を解決するための手段〕

上記目的を達成するための本発明は、粒径が２０ミクロ
ン以下の親水性多孔質高分子粒状体に、その重量％が５
％以上になるようにコレステロールエステルヒドラーゼ
及び／ｌ？：、はコレステロールオキシダーゼを固定化
し、それを充填した耐圧ガラスカラムを、親水性多孔質
高分子粒状体を充填した分離用耐圧ガラスカラム後に接
続し、これを金属表面を有しない高速液体クロマトグラ
フ中に組み込むことを特徴とするものである。

本発明を更に詳細に説明するに、この発明に用いるコレ
ステロールエステルヒト２−ゼ及ヒ／マたはコレステロ
ールオキシダーゼを固定化する担体には、親水性高分子
であるポリアクリル酸共重合体及びボリビ÷ルアルコー
ル共重合体より成る多孔質粒状体を用いることが重要で
ある。従来、酵素固定化用担体としては、多孔性シリカ
ガラス。

多孔性ガラスのアミン誘導体、ポリチオール、ポリチオ
ラクトン、カルボキシメチルセルロースのヒドラジド誘
導体、臭化シアンで活性化したアガー−ス等があり、こ
れ等も本発明に係る両酵素を固定化して用いることは可
能であるが、上記した親水性多孔質高分子と比較して、
基質であるリポタンパクとの親和力が強く、このため酵
素活性発現の低下を招き、また、試料として用いる生体
液に含まれる成分の吸着も生じ易く、固定化酵素の寿命
が短くなる。更には、本発明で用いる親水性多孔質高分
子粒状体は高速液体クロマトグラフィー分離用充填剤と
して開発されたものをもちいるのが望ましく、これ等は
機械的強度が優れており、本発明の重要な特徴である流
路系での自動分析に適したものであるが、一方従来より
用いられて来た担体は機械的強度が劣る。また高速液体
クロマトグラフィー用充填剤として用いる親水性多孔質
高分子粒状体は粒径も整っており、２０ｊクロン以下の
粒径を有する。ここで２０ミクロンを超えた粒径を有し
た担体を用いると分離されたりボタンバクサブフラクシ
ョンが固定化酵素上で再混合するために得られる結果は
悪い。本発明で用いる親水性多孔質高分子粒状体の更に
大きな特徴は、これらが大きさの整えられた細孔を有し
ていることであり、５００Ａ以上の細孔径を有したもの
を用いた場合には固定化が細孔内まで行われ、更には測
定中に固定化酵素カラムに到達したりボタンバクサブフ
ラクションは総て細孔内に侵入することが可能であり、
結果固定化された酵素の活性が有効に発現する点は他に
類をみない特徴である。

本発明に於いては担体として親水性多孔質高分子粒状体
を用いるため、固定化に際しては架橋剤を使用する。本
発明で用いる担体は水酸基を有しているため、この基を
直接用いて、例えば臭化シアン法によって共有結合を導
入するか、あるいはこの基にスペーサーを介してこれと
酵素を反応させて固定化を行５ことができるが、本発明
には後者が適している。導入するスペーサーとしては、
導入後の担体の形が末端にカルボキシル基を有するよう
担体を誘導体化できるものより、末端にアミノ基を有す
るよう誘導体化できるもののほうが後の処理に有利であ
る。スペーサー導入によってアミノ基を担体に付与した
後は、ゲルタールアルデヒドを用いる方法、ジアゾ化法
、カルボジイミド試薬を用いる方法等を用いることが出
来るが、本発明九於いてはゲルタールアルデヒドを介し
て固定化を行うのが最も簡便で且つ得られる固定化酵素
の活性維持に有効であるため好ましい。

コレステロールエステルヒドラーゼとコレステロールオ
キシダーゼは両者を個々に担体に固定化し、二本の別々
のカラムに充填し、接続して用いてもよいし、二種類の
固定化酵素を混合し、一本のカラムに充填して用いても
よいが、両者を同時に固定化して用いるのが最もよい結
果を与えるため好ましい。固定化の場合、固定化された
酵素量が担体重量の５％以上になるよう調製することが
必須である。この値より低い酵素量を用いた場合には、
所期の目的であるリポタンパクサブ７ラクシヨン中のコ
レステロールを検出できない。

調製された固定化酵素は耐圧ガラスカラムに充填して用
いることが必須である。充填に際しては、充填用リザバ
ーもガラス製のものを用いて、リザバーとカラムの接続
にはテフジンテユープをもちいることも必須である。リ
ザバーからカラムへ固定化酵素を充填する際は、ポンプ
及びそれに付随する流路系から総ての金属表面を除去し
なければならない。もし金属が存在すれば固定化酵素は
失活する。

次に自動臨床分析システムを第１図に基すいて説明する
。

第１図は、分離カラム（５）の入口側が溶離液（１）、
第一ポンプ（３）および試料導入装置（４）と直列に、
また、分離カラム（５）の出口側が固定化酵素ガラスカ
ラム（６）、発色反応コイル（７）および検出器（８）
と直列に接続され、かつ、分離カラム（５）の出口側と
固定化酵素ガラスカラム（６）の入口側との間の分岐路
に発色剤を含む緩衝液（２）と第二ポンプ（３りとが直
列に接続されているフローダイアダラムである。

なお、総タンパク検出のために、分離カラム（５）の出
口と分岐路の間にモニター用の検出器、また固定化酵素
ガラスカラム（６）と発色反応コイル（７）とが恒温槽
内に設置されていてもよい。

上述のように調製された固定化酵素ガラスカラム（６）
は、同じく耐圧ガラスカラムに充填して調製した分離用
カラム（５）にテフロンチェープで接続する。分離用カ
ラム（５）入り口は金属表面を有しない高速液体クロマ
トグラフィー用の第一ポンプ（３）にテフロンチェーブ
で接続する。接続用部品も耐圧用プラスチック製のもの
をもちいる。第一ポンプ（３）は少なくとも毎分マイク
ロリットルの流量を制御できるものを用いるのが必須で
あり、これを下回る精度のものを用いた場合所期の目的
であるリポタンパクサブフラクション中のコレステロー
ル分布の測定精度は悪くなる。第一ポンプ（３）によっ
て送液される溶離液（１１は高精度の分析結果を得るに
は緩衝液を用いることが必須であるが、トリス緩衝液並
びにリン酸緩衝液が望ましく、この中にエチレンジアミ
ン四酢酸を（１５−５ミリモル添加して溶離液中に存在
する酵素阻害作用を持った金属の固定化酵素カラムへの
沈着を防がなければならない。

本発明に係るシステムで用いられる検出法はコレステロ
ールとコレステロールオキシダーゼの反ためのキノンジ
イミン染料を生成する発色反応系を用いる。このため、
固定化酵素ガラスカラム（６）入り口部ヘテフロンチェ
ーブを介して第二ポンプ（３つより発色剤を含む緩衝液
（２）を導入することが要求される。第二のポンプ系も
金属表面を完全に除去したもので流量制御が少なくとも
毎分１０マイクロリツトルで行えるものでなくてはなら
ない。

発色剤としては過酸化水素を分解するペルオキシダーゼ
と４−アミノアンチピリンならびＶＣＭ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシスルフォグロビル）−メタトルイジン
を用いた場合に良好な結果が得られたが、これを含む水
滴液としてはトリス緩衝液及びリン酸緩衝液が好ましい
。以上の発色剤混合系は第二のポンプによって排除クロ
マトグラフィーで分離の終了したりボタンバクサブフラ
クションを含む流路系へ添加され、その後固定化酵素ガ
ラスカラム（６）へ導入され、ここで酵素反応を受ける
ことになるが、基質であるリポタンパクは親油性の強い
物質であるため固定化酵素との親和力は十分でなく、こ
のため第二ポンプ（３つによって送液される水溶液中に
は界面活性剤を添加して用いなければならない。第一ポ
ンプ（３）で送液される水溶液中に界面活性剤を添加し
た場合、試料中のりボタンパクサブフラクシ冒ンの構造
破壊を招くため、これは避けるべきである。ここで使用
することのできる界面活性剤はノニオン系のものであっ
て、好ましくはトリトンＸ、カーボンワックス等である
。中でもトリトンＸを用いた場合に優れた結果が得られ
るが、第二ポンプ（５／）で送液されるトリトンＸの添
加量は１１３−Ｎｏ重量％が適当である。

本発明のヒト血中リポタンパクサブフラクシミン中のコ
レステロール分布の自動分析を行５自動臨床分析システ
ムは、上述したよ５に固定化酵素失活の要因を総て除去
したものであり、また酵素活性発現を有効に引き出すた
めの反応液の条件も考慮して考案されたものであり、長
期間にわたり安定な分析結果を供給しうるものである。

〔発明の効果〕

次に、この発明の主として効果を実施例に基づいて詳細
に説明する。

〔実施例〕

固定化酵素用担体としてアクリル酸共重合体を用いて製
造された東洋曹達工業製排除クロマトグラフィー用ゲル
Ｇ６０００ＰＷを用いた。

Ｇ６０００ＰＷのアミノ化は以下の方法で行った。

８ｇの０６０００Ｆをピリジン５００ｄ中で膨潤した後
、トシルクロライド２４ｇを加え、５℃で約２４時間反
応した。その後、精製水、２規定硫酸、精製水、５％炭
酸ナトリウム水溶液、精製水。

アセトニトリルの順で洗浄した後、この２ｇをアセトニ
トリル５〇−中で膨潤し、トリメチレンジアミン５ｇを
加え、５時間環留した。この後、精製水、１０％炭酸ナ
トリウム、精製水で洗浄した。

この膨潤ゲルα５−に１５％ゲルタールアルデヒド水溶
液１０１１ｔを加え、水流ポンプで５０分間室温で脱気
し細孔内の気泡を除去した後に大気圧で１時間反応した
。この後、精製水で洗浄して未反応のゲルタールアルデ
ヒドを除去した後、コレステロールエステルヒドラーゼ
（Ｋ、Ｏ，五１．１．　Ｉ　Ｓ　）１６ｗｉ及びコレス
テロールオキシダーゼ＜　Ｘ、　Ｏ。

１．１．五６）９．４ｗｉを２ｍｍｏｌのエチレンジア
ミン四酢酸塩を含む１５０ｍｍｈｔ緩衝液（ＩＩＨ７）
５−に溶解したものを加え、室温で３０分間脱気した後
に５℃で１時間反応した。この後、反応液を口過し、口
部の紫外線吸収スペクトルを測定し、この吸光度を牛血
清アルブミンを用いて作成した検を線から求めたところ
、ゲルは約１０重量％の酵素含有量を示した。これらの
操作は総てガラス容器中で行った。このようＫして得ら
れたコレステロールエステルヒドラーゼ及びコレステロ
ールオキシダーゼ同時固定化酵素カラムを内径２１１Ｊ
ｌ　ｓ長さ１０Ｑ７１のガラスカラムに充填した。充填
には樹脂加工した金属表面のない東洋曹達工業製高速液
体クロマトグラフィー用ポングＯＧ　Ｐ　Ｍヲ用イた。

このポンプの吐出口を内径２ｕのテフロンチューブでガ
ラス製すザバー（内径ａ５ｍ、長さ７、５　ｃｍ　）入
り口へプラスチ、り誤接続部品を用いて連結し、リザバ
ーとガラスカラムを接続した後、リザバー中の固定化酵
素を２ｍｍｏｌエチレンジアミン四酢酸を食酢酸５０ｍ
ｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ７）を送液して充填した。こ
のようにして調製した固定化酵素ガラスカラムを、前述
のポンプに接続した排除クロマトグラフィー用ガラスカ
ラム（東洋曹達工業部、Ｇ５０００ＦＷ＋〇３０００Ｓ
Ｗ、各一本）の後に連結し、４０℃湯洛中に浸した。こ
の時、分離カラムと固定化酵素カラムの間にはテフロン
製７字接続部品を接続し、一つは分離用カラム吐出口に
、一つは固定化酵素カラム入り口部に１残りの一つは第
二の樹脂加工００ＰＭポンプへ接続した。固定化酵素ガ
ラスカラムの吐出口には１０ｍの内径（１４，０テフロ
ンチエープを接続し、これを４０℃の反応洛中に浸し発
色反応を行った。この反応コイル吐出部はｓ　ｓ　ｏ　
ｎｍに設定した東洋曹達工業部ｔｒｖ８０００紫外可視
フロー検出器に接続した。第一ポンプからは、２ｍｍｏ
ｌのエチレンジアミン四酢酸を含む１５０ｍｍａｌｌＪ
ン酸緩衝液から成る溶離液を毎分α３―で流し、第二ポ
ンプからは０．５ｍｍｏｌの４−アミノアンチピリン、
（ｌＬ！ｍｍｏｌのＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
スルホプロピル）−メタトルイジン、ペルオキシダーゼ
（１−中＆７ユニ、ト）（１，０，１゜１１．１．７）
及び１重量％のトリトｙｘを含む水溶液を毎分α１ｗｔ
で通液した。以上のように準備した分析システムに樹脂
加工した表面に金属表面のないインジェクターから高脂
血症患者血清三種類及び健常人血清な溶離液で５倍に希
釈したものを各々１００マイクロリ、トル注入したとこ
ろ、第１表に示すリポタンパクサブフラクションの分離
パターンかえられた。このとき得られたクロマトグラム
の代表例として健常人のものを第２図に示す。また、こ
れらのパターンからは以下の情報が得られた。高脂血症
と判定を受けた治療中の患者（サンプル４ｌ−７）と健
常人（Ａ８）に対して本発明に係るシステムを用いて検
査を行ったところ、第−及び第二ピークがえられ、これ
らはそれぞれ低比重リポタンパク（ＬＤＬ　）及び高比
重リポタンパク（ＨＤＬ）によるピークであることを確
かめた。第１表に示したのは得られたりボタンパクサブ
フラクシ冒ン分離パターンから計算して求めた第一ピー
ク及び第二ビークの溶出容量、第一ピークの理論段数な
らびに第一ピーク及び第二ビークの相対高さである。こ
こでヰ相対高さは、サンプルＡ８のピークの高さを１と
して計算した。溶出容量はサンプルＡ１のピーク１以外
は総て一致した。サンプル厘１のピーク１ではピーク頂
点が前へ移動した。よってこの患者血清では、Ｉ、ＤＬ
の溶出位置に超低比重リポタンパク（７１１）Ｌ）が重
なっていると判定出来た。またサンプルＡ１のピーク高
の理論段数が極めて低いことからも、このピークがＩＪ
ＤＩＩＪ単一のピークでないことが明かであり、これは
この血清がＶＬＤＬも含んでいることを示すことから、
この患者を、心筋梗塞に最も関係の深いフレデリクソン
の分類による典型的型高脂血症疾患であると判断出来た
。

またサンプルＡ２はピーク１の相対高さが極めて大きい
ことから、同様に、ＬＤＬの多い心筋梗塞に最も関係の
深い典型的型高脂血症患者に相当すると判定出来た。ま
たサンプルＡ１−７の高脂血症患者の血清から得られた
ピーク１の高さは健常人のそれよりも高値を示し、この
システムでの高脂血症患者検出の可能性の高さを確認出
来た。この測定は、引き続き連続して、健常人の血清を
用いて２００回、２ケ月間にわたり行ったが、この間に
ピーク高さの減少ならびにピーク形状の変化は観測され
ず、本システムの実用性の高さを確認出来た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の自動臨床分析システムを示すフローダ
イアダラム、第２図は得られたりボタンバクサブフラク
ションのクロマトグラムである。 １　：溶離液　　　　　　　６：固定化酵素ガラスカラ
ム２：発色剤を含む緩衝液　７：発色反応コイル５：第
一ポンプ　　　　８：検出器 ５１：第二ポンプ　　　　１１：低比重リポタンパク４
：試料導入装置１２：高比重りボタンバク５：分離カラ
ム 特許出願人　東洋曹達工業株式会社 第２図 溶記号　（ｒｎＬ） 手続ネ市正書（方式） 昭和６１年６月１９日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 粒径が２０ミクロン以下の親水性多孔質高分子粒状体に
   、その重量％が５％以上になるようにコレステロールエ
   ステルヒドラーゼ及び／またはコレステロールオキシダ
   ーゼを固定化し、それを充填した耐圧ガラスカラムを、
   親水性多孔質高分子粒状体を充填した分離用耐圧ガラス
   カラム後に接続し、これを金属表面を有しない高速液体
   クロマトグラフ中に組み込むことを特徴とする自動臨床
   分析システム。