JPS6221359B2

JPS6221359B2 -

Info

Publication number: JPS6221359B2
Application number: JP55107363A
Authority: JP
Inventors: Yatsuhiro Kamimura; Setsu Goto; Yoshiaki Kano; Satoru Funakoshi
Original assignee: Green Cross Corp Korea
Current assignee: GC Biopharma Corp
Priority date: 1980-08-05
Filing date: 1980-08-05
Publication date: 1987-05-12
Also published as: JPS5732228A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、静注に適した免疫グロブリンの製造
法に関するものである。

免疫グロブリンは多くの病原体に対する抗体を
有していることから、各種抗体欠損状態にある患
者の感染予防もしくは治療に用いられている。

免疫グロブリンには静注用製剤と筋注用製剤と
が開発され既に広く臨床に用いられている。

静注用製剤の製造方法としては、粗免疫グロブ
リンをペプシンやプラスミンなどの蛋白分解酵素
で処理する方法、免疫グロブリンをアシル化など
により化学修飾する方法、血漿、コーン血漿分画
などのポリエチレングリコールやプルロニツクな
どによる分画方法等が知られている。

ペプシン処理による方法で得られる静注用免疫
グロブリンは、ペプシンによる消化によつて
7SIgGがＦ（ab）′_２に変化し、このものは正常
の免疫グロブリンに比べて生体内での半減期が極
めて短いことが欠点とされている。

プラスミン処理法では60〜70％の免疫グロブリ
ンが正常免疫グロブリンの状態で残されてはいる
が、残りはプラスミンにより消化をうけて低分子
化され、このものは上記ペプシンのものと同様に
生体内での半減期が短い。

化学修飾する方法では修飾する基、その他の条
件などによつては新たな抗原性が出現することが
考えられ、反復投与する場合の安全性に問題があ
る。

ポリエチレングリコールやプルロニツクによる
分画法は、生体内に存在すると同じ状態の免疫グ
ロブリン、即ち非修飾、非分解の免疫グロブリン
を回収する方法として最も好ましいものと考えら
れている。

その分画方法としては既にボルソンらやコーバ
ルにより詳細な報告がなされている（特開昭50−
46814、51−91321および53−20415号公報）。しか
しこれら既知の方法による条件でポリエチレング
リコール分画やプルロニツク分画を行つた場合、
重合型免疫グロブリンを含まない免疫グロブリ
ン、即ち静注に適した免疫グロブリンを得ること
はできるが、その収率はいずれも低く、従つてこ
の点の改善が望まれていた。

発明者らはこの収率が低くなる原因につき検討
を行つた結果、ポリエチレングリコールの低濃度
添加において重合型の免疫グロブリンを除去する
段階で、非重合型の免疫グロブリンも同時に除去
されていることを見出した。

また重合型の免疫グロブリンを比較的多く含有
するものに対して同様のポリエチレングリコール
分画を行うと、非重合型の免疫グロブリンの損失
も大きくなることを見出した。

そこで、本発明者らは、従来技術中に内存して
いる上述の如き欠点、即ち新らたな技術的課題を
解決し、ひいては非重合型免疫グロブリンの収率
を向上させるべく研究を重ねた結果、酸処理によ
り重合型の免疫グロブリンを一旦非重合型の免疫
グロブリンに解離させた後、前記の分画を行うこ
とにより、非重合型の免疫グロブリンの回収率は
著しく改善されることを初めて見出し本発明を完
成せしめた。即ち、本発明は従来技術における低
い収率の原因をつきとめ、それに基づいてさらに
種々研究を重ねた結果完成されたものであり、そ
の構成はもとよりのこと、その技術的課題におい
ても新規なものである。

本発明は、血漿あるいは血漿をコーン氏の冷ア
ルコール分画法に付して得られる分画＋＋
、分画＋、分画または分画（以下、こ
れらを出発原料とも総称する）をPH3.2〜4.2で酸
処理した後、分子量2000〜20000のポリエチレン
グリコールによる分画に付すことによる静注用に
使用しうる免疫グロブリンの製造法である。

本発明において出発物質として用いられる血漿
は、抗原性の問題などから、ヒト由来のものが好
ましい。また、コーン血漿分画＋＋、＋
、およびは実質的には、アルフア、ベータ
ーおよびガンマーグロブリン（IgG、IgA、
IgM）である。血漿のガンマーグロブリン分画は
冷エタノールによる連続沈澱により得られ、ジヤ
ーナル、オブ、クリニカル、インベスチゲイシヨ
ン、23、417、1944年およびジヤーナル、オブ、
ジ、アメリカン、ケミカル、ソサエテイ、68、
479、1946年に詳述されている。

酸処理は、出発原料を酸性条件下に保つことに
よつて行われる。酸処理を行う際のPH条件はPH
3.2〜4.2、好ましくはPH3.8〜4.2であり、イオン
強度は0.002〜0.30、好ましくは0.10〜0.20であ
る。またこの時の蛋白濃度は特に規制する必要は
ないが、操作しやすい面から２〜10w／ｖ％が好
ましい。酸処理における濃度は、３゜〜20℃、好
ましくは４゜〜15℃であり、酸処理を行う時間は
30〜180分間であり、これよりも長過ぎることは
時間的に不経済であり、却つて逆効果となる場合
もある。

ここで酸処理に用いられる酸としては、塩酸な
どの無機酸、酢酸などの有機酸があげられる。

かかる酸処理を行つた後に分子量2000〜20000
のポリエチレングリコールによる分画を行うこと
により、高収率、高純度で非重合型免疫グロブリ
ンを得ることができる。

ところで、本発明者らは分子量2000〜20000の
ポリエチレングリコールによる分画においては、
そのPH条件の設定が極めて重要であり、PH4.6〜
5.4、好ましくはPH4.8〜5.2の極めて限定されたPH
条件下においてのみ、免疫グロブリンの回収率お
よび純度が顕著に高くなることを見出した。この
ことは、たとえば、分画＋ペイストを蛋白濃
度が５％になるように0.6％塩化ナトリウム溶液
に溶解せしめ、PH3.5、温度110℃にて60分間酸処
理を行つた溶液を用いて、PH4.0〜7.0の間でポリ
エチレングリコール分画を行つた時の非重合型免
疫グロブリンの収率およびその純度を調べた実験
結果（表１）からも明らかである。

このようにして分画された上清に、更にポリエ
チレングリコールを10〜15％になるように追加
し、PHを７〜８に調整することにより目的とする
非重合型の免疫グロブリンが沈澱となるため、た
とえば、遠心分離によりこれを回収することがで
きる。

得られた沈澱は、たとえば生理食塩溶液または
0.02M酢酸緩衝液に0.6％の塩化ナトリウム、２
％マンニツトおよび１％アルブミンを加えた溶液
に再溶解せしめ除菌ろ過を行うことにより、臨床
に使用できる静注用免疫グロブリンとなしうる。
またこの溶液は少量ずつ分注し凍結乾燥を行つて
も、凍結乾燥前後で性状の変化はみられないた
め、長期保存を目的とする場合は凍結乾燥製剤と
することも可能である。

本発明の方法で製造される免疫グロブリンは実
質上重合型免疫グロブリンを含まず、抗補体活性
は５％蛋白濃度溶液で測定して20単位以下であ
り、IgGとしての純度は90％以上を示す。

表１ポリエチレングリコール分画時のPH条件 PH IgG回収率 IgG純度 4.1 60％ 35％ 4.3 58％ 60％ 5.0 70％ 98％ 5.5 45％ 95％ 6.0 10％ 93％本発明の特徴を更に判り易くするために実施例
をもつて説明するが、本発明がそれによつて限定
されるものではない。

なお、本発明における免疫グロブリンの回収率
は一元免疫拡散法により求め、その純度はセルロ
ースアセテート膜電気泳動法により求めた。

抗補体価はカバツトとマイヤーの方法〔エクス
ペリメンタル、イムノケミストリー、225、
（1961）〕および西岡、岡田の方法〔免疫の生化
学、103、昭46（共立出版）〕に従つた。

実施例１コーン氏の冷アルコール分画法で得られた分画
＋ペイスト１Kgを0.6％塩化ナトリウム10
に溶解せしめ、1N−HclでPH3.8となし、４℃で
60分間撹拌し酸処理を行つた。

この溶液にポリエチレングリコール（平均分子
量4000）を500ｇ添加し溶解させながら、1N−
NaOHでPHを除々に上昇せしめ、最終的にはPH
5.0に調整した。PH5.0に到達後直ちに遠心分離に
より沈澱を除き澄明な上清を得た。

この上清中のIgGの回収量は分画＋を100
％として85％であり、その純度は97％であつた。
更にこの上清にポリエチレングリコール（平均分
子量4000）を700ｇ追加し、ゆるやかに撹拌しな
がら1N−NaOHでPHを8.0に修正した。

この条件下で沈澱してくる免疫グロブリンを遠
心分離して回収した。

回収した沈澱の全量を0.6％塩化ナトリウム、
２％マンニツト、１％ヒトアルブミンを含む
0.02M酢酸緩衝液（PH6.6）に溶解し、同じ溶媒
で蛋白濃度を５％とした。

ミリポアフイルター（ミリポア社）を用い除菌
ろ過後、無菌的に小容器の分注した。分注したも
のの半量は直ちに凍結乾燥を行い乾燥製剤とし
た。

最終的な出発原料からのIgGの回収率は84％
（対照として出発原料の酸処理（PH3.8）をおこな
わなかつた場合は63％）であり、純度は添加した
アルブミンを除き95％であつた。また液状製剤お
よび凍結乾燥製剤の溶解液とにつき、蛋白濃度５
％における抗補体価を測定した処、それぞれ14と
16であつた。

５％溶液を５匹のマウス（約20ｇ）に１mlずつ
尾静脈より投与後１週間観察したが、体重の減少
や立毛等に異常は全く認められなかつた。

凍結乾燥製剤につき４℃で１ケ年間保存後に再
検査を行つたが、製造当時と比べ溶解性、抗補体
価等に変化は認められなかつた。

実施例２コーン氏の冷エタノール分画法で得られた分画
ペイスト500ｇを0.1％塩化ナトリウム10に溶
解せしめ、実施例１と同様にして重合型免疫グロ
ブリンを含まない免疫グロブリンを回収した。

IgGとしての回収率は80％（対照として酸処理
（PH3.8）を出発原料に施さなかつた場合は62％）
で、その純度は97％であつた。

実施例１と同様にして0.5％塩化ナトリウム溶
液に蛋白濃度が５％になるように溶解せしめ、更
に１％のマンニツトを添加した後、除菌ろ過を行
い凍結乾燥を行つた。

凍結乾燥品を注射用蒸留水に蛋白濃度が５％に
なるように溶解せしめ、この濃度での抗補体価を
測定した結果は13であつた。

Claims

【特許請求の範囲】１血漿あるいは血漿をコーン氏の冷アルコール
分画法に付して得られる分画＋＋、分画
＋、分画または分画を、PHを3.2〜4.2で酸
処理した後、分子量2000〜20000のポリエチレン
グリコールによる分画に付すことを特徴とする静
注用に使用しうる免疫グロブリンの製造法。２酸処理におけるPH条件がPH3.2〜4.2、温度条
件が４℃〜15℃、処理時間が30〜180分端である
特許請求の範囲第１項記載の免疫グロブリンの製
造法。３分子量2000〜20000のポリエチレングリコー
ルによる分画を、PH4.6〜5.4で、当該重合体を３
〜5w／ｖ％になるように添加し、重合型の免疫
グロブリンを除去したのち、更にPH７〜８で、当
該重合体を10〜15w／ｖ％になるように追加して
重合型免疫グロブリンを実質上含まない免疫グロ
ブリンを回収すことによつて行うことを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の免疫グロブリンの
製造法。４血漿あるいは血漿をコーン氏の冷アルコール
分画法に付して得られる分画＋＋、分画
＋、分画または分画を、PHを3.2〜4.2で酸
処理した後、PH4.6〜5.4で分子量2000〜20000の
ポリエチレングリコールを３〜5w／ｖ％になる
ように添加して上清を回収し、さらにPH７〜８で
当該重合体を10〜15w／ｖ％になるように添加し
て沈澱を回収することを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の免疫グロブリンの製造法。