JPS62215872A - 上皮小体特異的放射性映像化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、　Ｈのｉ　な量゛■ （産業上の利用分野） 本発明は、モノクローナル抗体、および所望の標的！ｌ
Ｊ１ｍを映像化してその正確な局在化（ｌｏｃａｌｉ−
ｚａｔｉｏｎ）を明らかにする手法に関する。特に１本
発明は、抗体を用いて上皮小体組織の局在化を同定する
こと、およびそれら抗体の治療用の用途に関する。

（従来の技術） 合衆国には、上皮小体ホルモンの異常に高い分泌を示す
人々が推定２５万人存在する。このホルモンは、８４個
のアミノ酸の線状ペプタイドであり。

血湘中のカルシウムイオン濃度を制御する機能を包含す
る。このホルモンは明らかに、骨再吸収および腎臓にお
けるカルシウムおよび燐、の細管再吸収を制御する働き
をする。原発性上皮小体機能先進症では９組織中の貯蔵
のカルシウムが減少し。

その結果、骨の無機分減少を引きおこす。通常。

上皮小体機能先進症は、上皮小体に腫瘍が形成されるた
めに起こる。この上皮小体は４つの卵形をした小さな腺
で甲状腺と密接に関連している。

上皮小体機能先進症に対する標準的な治療法は。

異常に太き（なった腺をすべて外科手術で切除すること
である。しかし、その手術を成功させるためには、腺の
位置が正確に決定される必要がある。

この腺の位置を決定することが困難なのは周知の通りで
９機能が先進している上皮小体の組織を完全に除去する
ことに失敗したために１手術後ですら、症候が持続する
場合がある。

上皮小体のだいたいの位置は推定されているが。

正確な位置は確定されていない。またさらに、これらの
腺は１首部、喉部および胸部という種々の領域に偏在（
ｅｃｔｏｐｉｃ）　Ｌ得る。従って、正常の位置または
偏在した位置のいずれであろうと、外科医が上皮小体組
織の位置を決定し得る映像化法が特に望まれる。このよ
うな手法は現在、公知の技術としては利用されていない
。

上皮小体組織に対し特異的な物質は、このような手法を
開発するのに有用である。抗体は、適切に選択されれば
、必要とされる特異性を示す。上皮小体と反応しうるモ
ノクローナル抗体は１分泌機能の調節に使用されている
（Ｐｏｓｉｌｌｉｃｏ、　Ｊ、　Ｔ、＋ら、　Ｃ１１ｎ
　Ｒｅｓ　（１９８５）　３３　：　４７３Ａ　）　、
　しかし、これらの抗体は、映像化には適切でないかも
しれない。

（発明の構成） 本発明は９手術に先立って、上皮小体を可視化するとい
う高度に特異的な映像化法を提供する。

この方法は、上皮小体組織に結合した抗原と高度に免疫
反応性を有する標識化モノクローナル抗体調製物を利用
する。この抗体調製物は他の型の細胞とは反応しない。

手術に先立ち、この標識化モノクローナル抗体を投与す
ることにより２首、喉および胸の領域を映像化し、上皮
小体組織の位置の明瞭な画像を得ることが可能となる。

さらに１本発明の抗体は上皮小体ホルモンの分泌を刺激
し、従って、このホルモンの分泌能力を欠（患者の治療
に役立つ。この抗体は、また、毒性成分と結合して、上
皮小体の肥厚の治療に治療学的に有効な免疫毒素を形成
することもできる。

一つの局面として１本発明は、上皮小体組織の放射映像
化に有用なモノクローナル抗体の調製を目的とする。こ
れらのモノクローナル抗体は、他の形の組織は除外して
、上皮小体組織と特異的に反応する。そして、これらの
抗体は、　ＩｇＭクラスのモノクローナルを包含するが
、このような目的のための使用には、　　ＩｇＧ抗体を
含む調製物が好ましい。さらに本発明は、標識化した形
のこれらの抗体を包含する。上皮小体機能低下症の治療
に使用するためには、　　ＩｇＭクラスの抗体が好まし
い。

両りラス共、免疫毒素の形成に採用され得る。さらに、
放射映像化への使用および免疫毒素調製のためへの使用
に、抗原特異性を保持する抗体断片が利用され得る。従
って、　　ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片もまたこの
目的に使用され得る。

他の局面では９本発明は、所望の特異性を有する抗体の
生産を可能にする永続的な細胞培養を目的とする。さら
に他の局面では２本発明は８本発明の抗体を使用した放
射映像化法；上皮小体機能低下症の上皮小体特異的モノ
クローナル抗体による治療方法；そして１本発明の抗体
により調製される免疫毒素を用いた上皮小体機能亢進症
の治療方法に関する。

本発明のモノクローナル抗体またはその断片は。

ヒト上皮小体に特有の抗原に特異的な免疫反応性がある
。この抗原は９例えば、上皮小体に特有な１９１ｋｄの
抗原である。このモノクローナル抗体またはその断片は
、標識に共有結合している。標識としては１例えば、　
　ｌ−１２５，Ｉｎ−１１１，Ｔｃ−９９がある。

本発明の永久増殖細胞系は、上記モノクローナル抗体ま
たはその断片を分泌する。

本発明の上皮小体組織ば、上記モノクローナル抗体また
はその断片と免疫反応する。

本発明の精製抗原は、１９１ｋｄの分子量を有するヒト
上皮小体組織と特異的かっ固を的に結合する。

本発明の上皮小体組織の位置決定方法は、ヒト対象にお
ける上皮小体組織を位置決定する方法であって、上記モ
ノクローナル抗体またはその断片を該対象に投与するこ
とを包含する。

本発明の上皮小体機能低下症の治療法は、抗原が上皮小
体に特有な１９１ｋｄの抗原であるモノクローナル抗体
またはその断片の有効量、またはその有効量を含有する
薬剤組成物を、このような治療を要する対象に投与する
ことを包含する。

未発皿夏大庭ｑ方式 特定の抗原と「特異的に免疫反応性を有する」抗体とは
、他の抗原を除外して該抗原と肯定的に反応する能力を
意味する。充分に高い濃度においては、一般に免疫グロ
ブリンは、非特異的に基質と結合することが認められて
いる。しかし、この非特異的結合は、その試料を適当に
希釈し、この希釈の効果を、特異的に反応する抗体の希
釈物と比較することにより識別することができる。

「上皮小体特異的抗原」とは、上皮小体組織に特異的に
見出され、該生体に由来する他の組織には見出されない
抗原性決定因子を含有する物質を意味する。

ｒ　１９１ｋｄｌ抗原とは、特異的モノクローナル抗体
調製物（ここでは８８５）に結合する上皮小体組織と特
異的に結合する抗原をいう。この抗原は。

２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）の不存在下で。

５ＯＳ−ＰＡＧＥを用いた方法によれば１９１ｋｄの分
子量を示し、　　ＢＭＨの存在下での見掛けの分子量は
１７１ｋｄである。この抗原は上皮小体細胞の表面と結
合し。

明らかに分泌されない。

「細胞」、「細胞系統」および「細胞培養物」は１通常
、特に記載されない限り、交換可能であるように使用さ
れる。そして、これらの用語は。

個々の細胞、収穫された細胞、細胞を含んだ培養物など
を包含するが、これらに限定されない。さらに、ある命
名は、最初に調製したものの子孫を包含する。自然のあ
るいは誘発された変異が、　ＤＮＡおよび細胞の形態に
数世代にわたって起こり得るということが理解され得る
。このような変異を有する子孫は２本発明に関連した本
質的な特徴が維持される限り、なお、この定義内に包含
される。

例えば、上皮小体組織に特異的であるモノクローナル抗
体を分泌するハイブリドーマについては。

最初に同定された分泌細胞の子孫のいかなるものも、所
望の特性を有する抗体の分泌を続ける限り包含される。

便宜上、永久増殖性細胞のクローンおよびその細胞が分
泌するモノクローナル抗体には同じ名称が与えられる。

例えば、　　ＢＢＳ−Ｍは抗体およびその抗体を分泌す
る細胞をいう。

「永久増殖性細胞系統」とは、永続的に（実際的な目的
に）細胞培養を持続できる。すなわち永続的に世代交代
する細胞系統をいう。通常の非変形細胞系統に融合され
たときの融合産物にもこの性質が与えられる。

Ｂ、概説 以下に、ヒトの上皮小体に固有の抗原に特異的に免疫反
応性を有するモノクローナル抗体の調製についての方法
、これらの抗体を標識化する方法。

およびこれらの標識化抗体を使用してヒト被検者の上皮
小体組織の位置を決定する方法を開示する。

さらに１本発明の抗体を投与することによる上皮小体機
能低下症の治療法、およびこれらの抗体から調製した免
疫毒素を投与することによる上皮小体機能亢進症の治療
法についても記載する。

モノクローナル　　の９．！？１１１ 通常、所望の抗体の調製には、　Ｋｏｈｌｅｒおよび旧
１−ｓｔｅｉｎの方法が適用される。必要に応じて９次
に。

Ｄａｎｇｌ、　Ｊ、　Ｌ、　　およびＨｅｒｚｅｎｂｅ
ｒｇ、　Ｌ、八、　（−シ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈ　（１９Ｂ２）　５２　：　
１　）の方法を使用して。

適当な切換え変種（ｓｗｉｔｃｈ　ｖａｒｉａｎｔｓ）
を得る。

所望のモノクローナル抗体を分泌し得るハイブリドーマ
が次の方法によりつくり出される。つまり、上皮小体組
織で免疫性が与えられた哺乳動物由来の脾細胞あるいは
末梢血リンパ球を、永久増殖性細胞系統と融合すること
により、つくり出される。この永久増殖性細胞系統とは
９代表的には。

抗体を分泌する細胞が由来しているのと同種の骨髄種系
統である。利用しやすい骨髄種系統はマウスおよびう７
）から入手可能であり、従って、これらの哺乳動物は、
ポリクローナル抗血清および免疫グロブリン分泌細胞を
生産するための好適な対象となる。しかし、入手可能な
永久増殖性細胞系統のいずれもが、適合した種から得ら
れる分泌細胞とともに使用され得るということが理解さ
れる。さらに、　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスで
処理するように、ある抗体分泌細胞は、ウィルスの感染
により永久増殖化し得る。本発明の永久増殖化免疫グロ
ブリン分泌細胞を得るために、これらの永久増殖化の別
の手法もまた採用され得る。

ハイブリドーマは、抗体分泌細胞系統を、永久増殖性細
胞系統と、ポリエチレングリコールのような活性化剤の
存在下に、融合することによりつくられる。現在標準的
な手法となっているこの製法の詳細は、公知技術として
知られており、ここで詳述する必要はないであろう。成
功か失敗かを決定する臨界パラメータは１通常、永久増
殖性細胞系統の選択あるいは永久増殖化の手法、および
抗体産生細胞集団の選択に関係する。他方、この後者の
調製は、これらの細胞を産生ずる哺乳動物に投与される
正確な免疫化剤の使用に依存している。

本発明においては、原発性上皮小体機能亢進症患者から
入手した上皮小体のホモジネートが適当である。上皮小
体組織は、最初に１周囲の異質の混入組織から物理的に
分離され、そして燐酸塩で緩衝化した食塩水（ＰＢＳ）
中でホモジナイズされる。

このホモジネートは１次に、　Ｆｒｅｕｎｄの完全アジ
ュバントで乳濁化し、適当な宿主生体、好ましくはマウ
スに注射される。

好ましい方法においては、免疫化したマウスから分離し
た脾細胞は１同じ種に由来する骨髄種系統と融合され、
その結果生成した細胞を選択培地上で生育させる。容易
に入手しうる骨髄種系統の多くはＨＡＴまたはＡＨに感
受性を有する。すなわち。

ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有
する培地、またはアザセリンおよびヒポキサンチンを含
有するＡＨ培地上では、生育できない。

この両培地は、新たにプロセスが阻害された状況下で（
この場合は、アミノプテリンまたはアザセリンによる）
　、　ＤＮＡ合成の回収経路（ｓａｌｖａｇｅ　ｐａｔ
ｈｗａｙ）を利用する正常細胞の能力を利用している。

ヒポキサンチンおよびチミジン（またはヒポキサンチン
単独）は、この回収経路において、必要とされる物質で
ある。

従って、正常細胞に融合された永久増殖性細胞だけが、
この選択培地で生き残ることが可能である。ＨＡＴまた
はＡＩｌ惑受性の非融合永久増殖性細胞は死滅する。も
ちろんいずれにしても、融合により永久増殖化されてい
ない正常細胞は死滅する。

従って、融合細胞を含んだ培養物だけが、所望の抗体の
産生を見い出すためのスクリーニング用として最終的に
利用され得る。

選択培地中で生きのびた融合細胞または他の方法で永久
増殖化された細胞の培養物は２次に、所望の特性を備え
た抗体の分泌を求めるスクリーニングにかけられる。培
養培地は、免疫反応に基づいた分析法を使用して分析さ
れる。この分析法は特に制限されないが、ウェスタンプ
ロット、　ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ法が包含される。こ
の選別に使用される抗原は、正確な特異性を確保するた
めに選ばれねばならない。精製した上皮小体ホモジネー
トまたは上皮小体組織切片が（適当な交叉反応性を有す
る他の種のものも含めて）、この点において有用である
。ここで同定された上皮小体に特異的な分子１１９１ｋ
ｄの抗原を利用したスクリーニングが特に望ましい。上
皮小体の特異性を確証するために、否定的選別もまた包
含される。

目的とする抗体を分泌すると同定された系統からの抗体
は、必要に応じて、標準晴製法を使用して培地から回収
し得る。標準法はまた。単離された抗体を標識化するの
にも利用され得る。

本発明の放射性映像化法で使用するために、血管壁を通
過し得る種類のモノクローナル抗体を得ることが望まし
い。以下に説明するように、所望の特異性を有する抗体
を分泌するとして最初に同定された細胞系統が、　　Ｉ
ｇＭクラスの抗体を産生じたが、この抗体は三量体であ
って　１環系の血管壁を通過する能力が比較的弱いため
に、　ｉｎ　ｖｉｖ。

での使用に困難である可能性がある。そのような使用に
対しては、この免疫グロブリン単量体を得ることが望ま
しい。さらに、治療用に使用する場合には、他のサブク
ラスの機能特性が望まれ得る。

切換え変種を得る方法としては、　　Ｄａｎｇｌおよび
Ｆｌｅｒｚｅｎ−ｂｅｒｇにより記載された方法が利用
され得る（前出）。

これらの方法は、単一の祖先から生まれたある特殊な一
組の子孫が、完全にモノクローナルな性質を欠損してい
ることを利用するものである。これは細胞分裂の過程で
、１０７個の細胞から約１子孫を生ずれば充分というほ
どの低頻度で発生する自然発生的な突然変異の結果によ
るものであるが。

事実、これにより異なったクラスの免疫グロブリンが産
生される。「切換え変種」を入手する方法というものは
、まさに、所望の性質を有するごく少数の細胞を求めて
、集団のスクリーニングを繰り返し行う手法である。

これらの集団を同定する典型的な手法としては。

所望の特異性を有する表面免疫グロブリンを分泌するハ
イブリドーマは、所望のイソタイプに特異的な抗血清（
フルオレセイン化され、あるいは他の方法で標識されて
いる）により染色される。次に、これらの細胞は、蛍光
活性化細胞選別器（ＦＡＣ３）で選別され、もっとも蛍
光の強い０．５〜１％の細胞が選択される。死滅した細
胞は、非特異的に蛍光を発する細胞が選別されるのを避
けるために。

ヨウ化プロピジウムで除去されねばならない。選別され
た集団は２次に２組織培養で成長させ、所望のイソタイ
プを示す細胞の純度を高めるために。

同じ方法で選別される。正確なイソタイプを分泌するこ
とが確認できる細胞集団を得るためには。

スクリーニングを数回繰り返す必要があろう。この同定
されたサブタイプからの細胞を培養し、単一のコロニー
を得るのに使用される。

所望の抗体を産生ずる１選別されスクリーニングされた
ハイブリドーマは、標準的な手順によりｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏまたはｉｎ　ｖｔｖｏで生育する。この抗体は。

その時の事情に応じて培養媒体から、あるいは体液から
単離され２通常の免疫グロブリン精製方法。

例えば、硫酸アンモニウム沈澱、ゲル電気泳動。

透析、クロマトグラフィーおよび限外濾過法により、使
用される用途に適切な純度にまで精製される。

放射映像化または免疫毒素調製用に、抗原特異的断片が
所望されるときは、　　ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）。

断片が標準的な方法により調製されれる。この標準法は
、　Ｗｅｉｒ、　Ｄ、　Ｍ、によるＨａｎｄｂｏｏｋ　
ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉ−ｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ　　（３ｄ　Ｅｄ＋　１９７８　：　Ｂｌａｃｋｗ
ｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌ、０ｘｆｏｒｄ、　）
に記載されたような方法である。

Ｂ　　′−におＧる。ｆ′　　モノクロ−ル　−の、用
− 標識化モノクローナル標本は、上皮小体切除術において
被術者の上皮小体Ｍｉ織の位置を決定するのに有用であ
る。抗体またはその副断片を標識化する手法は公知であ
り、そして、免疫グロブリンの使用目的に応じて種々の
標識が使用されている。

この標識には、蛍光性２色素性および放射性の標識が包
含される。代表的には、　ｉｎ　ｖｉｖｏへの適用には
、放射標識化抗体が好ましい。これは内部に移行した抗
体を検出できるからである。

数多くの放射性同位元素が通常使用される。例えば、ヨ
ウ素−１２３，ヨウ素−１２５，ヨウ素−１３１，テク
ネチウム−９９，ガリウム−６７、およびインジウム−
１１１がある。ヨウ素の同位元素は甲状腺と相互作用し
、副作用を示す可能性があるので好ましくない。しかし
、それ以外の点では充分である。テクネチウム−９９（
このテクネチウムは、ある目的に適合させることが困難
である。）は約６時間の半減期を有し、特に、放射水準
が所望のレベルよりも高い本発明の方法で使用され得る
。これに対して、インジウム−１１１は３日の半減期を
有しており、好ましい同位元素であろう。

これらの同位元素を抗体または抗体断片に結合させる方
法は、公知である。そのような公知技術には、　　１．
３，４．６−チトラクロロー３ａ、　　６ａ−ジフェニ
ルグリコクリルをヨード化に使用すること（Ｆｒａｋｅ
ｒ。

Ｐ、　Ｊ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒ
ｅｓ　Ｃｏｍｍ　（１９７Ｂ）別二８４９−８５７　）
　　？そしてインジウム−１１１のような金属イオンの
結合を可能とするキレート剤の共有結合（ｌｌｎａｔｏ
ｗｉｃｈ、　Ｄ、　Ｊ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９
８３）　２２０　：　６１３−６１５に記載）の開示が
包含される。このｆｌｎａｔｏｗｉｃｈの論文はタンパ
ク質に標識するさらに別の試みについての記載を包含す
る。もちろん、他のヨウ素化法およびキレート化法が、
抗体またはその断片に前述の同位元素を結合させるのに
使用され得る。

適当な輸液中の標識化モノクローナル製剤は。

患者の静脈中に９組織が映像化される数時間から４日前
に投与される。この期間に、結合しなかった部分は体外
に排泄される。残留した標識化モノクローナル抗体は、
上皮小体組織に結合した抗体のみである。この時、被検
者は適当なガンマ−カメラの前に置かれ同位元素の存在
が検出される。

この結果、標識された組織の「像」が得られる。

この像は、患者の身体の既知のマーカーと関連し得、外
科医に上皮小体の位置を細部に到るまで示す。

本発明の抗体製剤は、系内での上皮小体ホルモンの水準
が異常に高いもしくは低い患者の直接の治療にもまた有
効である。抗体のあるものはそれ自体、上皮小体に結合
して、この腺ホルモンの分泌増加に影響を与えることが
できる。逆に、これらおよび他の上皮小体特異的抗体、
およびこれら抗体の抗原特異的断片は、毒性成分にもま
た結合する。毒性成分としては２例えば、リシンＡ、ジ
フテリャ毒素９アブリン、モデクシン、またはシュード
モナスもしくはシゲラからの細菌性毒素などがある。毒
素およびその誘導体は、特定の標的組織（しばしば癌ま
たは腫瘍細胞である）に特異的な抗体と結合体を形成さ
せて、特殊な毒性を得るために利用されている。例えば
、　Ｍｏｏｌｔｅｎ、　Ｆ。

Ｌ、、らのＩｍｍｕｎ　Ｒｅｖ　（１９８２）　６２　
：　４７−７２．および。

Ｂｅｒｎｈａｒｄ、　Ｍ、　１．　のＣａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅｓ　（１９８３）　４３　：　４４２０を参照された
い。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂのようなあるサブクラ
スの抗体は、それ自体が相対的に細胞毒性を有する。

この毒性部分と上皮小体特異的部分との結合体は、公知
の標準的な方法により行われ得る。市販の二官能性架橋
剤の多数が利用され得る。例えば。

Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ＋　
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ＋　（Ｌ、の製品が挙げられる。この
ような架橋剤の中で主要なものは、　Ｎ−スクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰ
Ｄｒ’）のようなヘテロ２官能性架橋剤である。これは
、一方の末端にジスルフィド結合を形成し、他の末端で
対象分子上の結合しうるアミノ基とアミド結合を形成す
る。

マレイミドを含有する化合物もまた多数利用し得る。こ
の化合物は、対象分子上の結合可能なスルフヒドリル基
と、他の末端のアミド基とともに。

チオエーテルを形成する。例えば、スクシンイミジル４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロ−ヘキサン−１−カ
ルボキシレート（ＳＭＣＣ）が形成される。

多数のホモ三官能性架橋剤およびヘテロ２官能性架橋剤
が利用され得、その使用法は公知である。

この抗体または免疫毒素を治療の用途のために投与する
ときには、静脈経路によるのが最も好都合であるが、適
当に製剤化することにより、腹腔内、経口、経皮性投与
のような他の投与経路を使用することも可能である。適
当な９選択された投与方式で、ヒトを対象として投与す
るための組成物の処方の方法は、公知である。静脈投与
法に関しては、溶液または懸濁液という通常の形で７あ
るいは、注射前に溶解したり再懸濁するのに適した固体
の形で、あるいはエマルシコンとして、注射可能な製剤
が調製され得る。例えば、適当な構成成分としては、水
９食塩水、デキストロース。

グリセロ゛−ル、エタノール、　Ｈａｎｋの溶液、リン
ゲル溶液などが包含される。さらに、これらの組成物は
、少量の非毒性補助物質を含有しうる。それには９例え
ば、酢酸ナトリウム、ソルビタン　モノラウレート、ま
たはトリエタノールアミン　オレエートのような湿潤剤
または乳化剤、ｐｔｔ緩衝溶剤などである。

ＰＴＩＩの分泌を強化するのに有用な抗体は、１９１ｋ
ｄ上皮小体特異的抗原に結合する抗体である。ＢＨ３−
Ｇ１およびＢＨ３−Ｍの両者が使用され得、そしてそれ
らが好ましい。適当な投与量は５０μｇ〜１■の範囲で
ある。反復投与が必要であり得、そのため。

自分で服用するのに適した処方が望ましいであろう。

上皮小体機能先進症を制御するための免疫毒素の投与は
、結合毒素の毒性に依存した投与水準が使用されるが２
通常、０．１〜ｌｎｇ／ｋｇの範囲内である。この免疫
毒素は通常、非経口的投与の賦形剤に処方される。例え
ば、バンクの溶液またはリンゲル溶液を用い、約１■／
　ｍｌから１０■／−の濃度で、比較的少ない容量で注
射ができるように処方される。これらの製剤を使用した
上皮小体機能亢進症患者の治療は１通常、慢性の場合よ
りも急性の場合であり、静脈内注射はまった（この目的
に適合している。

土工上 この標識化抗体試薬は、投与量単位の形で包装され得る
。必要に応じて、注射筒のような投与手段が含まれる。

直接治療に使用される標識化されていない物質もまたキ
ットとして包装され得る。特に、上皮小体ホルモンの分
泌増加を誘発するために使用される抗体調製物は、自己
投与のために、製剤化された組成物を、１日投与量また
は１週間投与量の単位で包装され得る。

（以下余白） Ｃ０次Ｊ１舛 次の実施例は例示のためであって９本発明を限定するつ
もりはない。

成体のＢａ１ｂ／Ｃマウスを、上皮小体組織のホモジネ
ートにより、腹腔内投与で免疫化した。この上皮小体組
織は、原発性上皮小体機能先進症の患者から得た。この
組織は９周囲の組織から分離され。

ＰＢＳ中でホモジナイズされ、そしてフロイント完全ア
ジュバントでエマルジョン化された。数日後。

このマウスは屠殺され、この脾細胞は、　Ｋｏｈｌｅｒ
およびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準方法を用いて、非分泌性
マウス骨髄腫５Ｐ−２１１０−ｈ系統と融合された。Ｈ
ＡＴ選択選択上地上長させた後、ハイブリドーマ培地か
らの上澄液は、標準の間接的な免疫蛍光分析法により、
上皮小体との結合性を求めるスクリーニングを行なった
。この分析にはヒトの上皮小体の凍結切片を使用した。

この切片は０．２μの厚さに切断され、直ちに無水アル
コール中で固定されていた。

この切片を上澄液と共にインキュベートし、洗滌を行い
、それから、ヤギの抗マウスＩｇＭおよびヤギの抗マウ
スＴｇＧの混合物と共にインキュベートした。このヤギ
の抗体は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）で結合されていた。この切片は、顕微鏡的により、
蛍光物質の結合が検査された。

上澄液を備えた培地は、この上皮小体組織と特異的に結
合する。この培地は、柔らかい寒天中でクローン化され
、この上皮小体切片と甲状腺切片および扁桃腺切片を有
する負のスクリーンとを用いて、再試験された。

さらに詳細にいうと、このアルコール処理した切片を、
１：１０に希釈したハイプリドーマ上澄液と、４℃で３
０分間インキュベートし、洗滌し、そして、１：５０に
希釈したＦＩＴＣ結合のヤギの抗−マウス抗体（Ｔａｇ
ｏ、　Ｉｎｃ）と、４℃で３０分間インキュベートした
。この切片を再び洗滌し、蛍光顕微鏡で検査した。

ハイブリドーマＢＢ５−Ｍ上澄液は、このように。

切片にした上皮小体組織に結合するが、甲状腺切片ある
いは扁桃腺切片には結合しない。このＢＢ５−Ｍ細胞系
統は、柔らかい寒天上で数回クローン化され、そしてこ
の抗体は、無血清培地で培養して産生させた。この抗体
は、　ＩｇＭであることが示された（下部参照）。そし
てこの上澄液を、　Ｍ２Ｒ−６と結合したセファローズ
４Ｂを用いて、アフィニティクロマトグラフィーにかけ
ることにより、この抗体を精製した。このＭ２Ｓ−６は
、　５Ｏ５−ＰＡＧＥで決定されたように、　９０〜ｂ ットの抗マウスＩｇＭモノクローナル抗体である。

ＢＢ５−Ｍ培地から分泌された抗体は、　１５の異なっ
たヒト上皮小体の凍結切片試験検体の各々、および分散
したヒト上皮細胞の４つの標本と結合した。

この抗体は、アヵゲザル、ピッグテールモンキー。

およびモングレル犬の上皮小体組織と交叉反応し。

ウシの上皮小体組織と弱く反応し、そして、ウサギまた
はラットの上皮小体腺と全く反応しながった。ヒト上皮
小体に対するＢＢ５−Ｈの特異性は完全であると思われ
る。交叉反応性は、試験した他のどの組織に対しても得
られなかった。試験した組織には次の組織が包含される
：ヒト甲状腺、扁桃腺、胸腺、リンパ腺、牌、唾液腺、
副腎、膵、小島、下垂体、署丸、松果腺、好りローム性
細胞腫。

食道、肝、腎、肺、心房、心室、胆嚢、十二指腸。

胃洞、大脳、小脳、を髄および視床下部、サルにおける
大部分の同じ組織、およびイヌの甲状腺組織およびリン
パ腺組織。

このイソタイプはＩｇＭ、にであることが放射性免疫分
析法で決定された。このことは、　Ｐｅｒ１ｍ＋ｊｔｔ
ｅｒ。

Ｒ，Ｍ、らにより、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９７８）
　　１２１　：　５６６に記載されている。

８Ｂ５−Ｍ抗体が結合する抗原を、ウェスタンプロット
法、および１表面をＩＺＪで標識した上皮小体組織の免
疫沈降したホモジネートを５ＯＳ−ＰＡＧＥおよびオー
トラジオグラフィーにかける方法により。

固定した。

上皮小体組織は、原発性上皮小体機能亢進症の患者から
得た。この組織を細断し、コラゲナーゼ／ＤＮアーゼを
使用して消化した。これは、　Ｂｒｏｗｎ、Ｂ、Ｍ。

らがＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９７６）９９　：　１５
８２に記載しているとおりである。この分散した細胞を
４８〜７２時間培養し、消化期間中に除去した細胞表面
の決定因子を再生させた。このコラゲナーゼ標本中のプ
ロテセーゼ不純物が消化をおこし得るからである。次い
で、　Ｍａｒｋｗｅｌｌ、　Ｍ、Ａ、に、らの方法−Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ　　（１９７８）１７　：　８０７−に従
って、この細胞の表面を沃化した。

この細胞を溶解し、細胞表面の高分子は、ウサギの抗マ
ウス１ｇＭ抗血清をブドウ球菌に間接的に結合させたＢ
Ｈ３−Ｍで、免疫沈降させた。次いで、この免疫沈降物
を５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析し、放射性映像化した。

非還元的な条件下で、　ＢＨ３−Ｍで免疫沈降した大部
分の種を、　　１９１ｋｄ一本鎖ポリペプチドタンパク
として泳動した。このタンパクは、　　１６２ｋｄおよ
び１２９ｋｄの、２つの小さな一本鎖タンパク沈澱を伴
っていた。還元的な条件下（ＢＭ［Ｅ）で、このタンパ
クを、　　１７１ｋｄ、　　１４０ｋｄおよび１１０ｋ
ｄのバンドに相当して泳動した。沈降した抗原は、この
標的細胞により分泌されるように思われない。それゆえ
。

ＢＨ３−Ｍは、この分泌器官に永久に会合したタンパク
に結合している。

ＤａｎｇｌおよびＩｌｅｒｚｅｎｂｅｒｇ　（前出）の
方法により。

上皮小体組織に特異的なＩｇＧ１抗体を分泌するＢＨ３
−Ｍから切り換え変種を得た。このハイブリドーマ／免
疫グロブリンはＢＨ３−Ｇｌと命名した。この変種の特
異性は、上記実施例２に記述の方法で確認した。

このＩｇＧ１抗体は、　１８７．１−ラットの抗マウス
に軽鎖モノクローナル抗体−と結合したセファローズ４
Ｂを使用したアフィニティクロマトグラフイーにより、
この上澄液から精製した。

斂■比里血止鼠λ 上皮小体切除手術を受けた患者から得た新鮮な上皮小体
を細断し、ヌードＢａ１ｂ／Ｃマウスの後方腿筋中に移
植した。このヌードマウスは、　５ａＳＣＯ＋ＩＤＣ０
＋０’　Ｆａｌｌｏｎ、　ＭＯおよびＳｔ、　Ｌｏｕｔ
ｓ児童病院から入手した。Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯは
顕微解剖技術を持っている。対照のヒト甲状腺組織ある
いは胸部組織を。

反対側の腿に移植した。この上皮小体Ｍｉ織に新制管系
を形成させるために、２〜３週放置後、精製しかつ放射
線標識したＢＨ３−Ｇｌをこのマウスに注射した。

二１■ソＵ人 この移植片を含むマウスに　１２５１で標識したＢＨ３
−６１を注射した。種々の時点で、このマウスを層殺し
、移植片を取出し、秤量し、そして移植片中の組織１グ
ラム当りの注射薬量のパーセント（％ＩＤ／ｇｍ）を決
定するべ（算出した。ある移植片は、固定し、切片にし
、スライドを字真用乳剤中に浸すことにより放射性映像
化した。数日間露出した後。

このスライドを現像し、エオシンかへマドキシリンで染
色し、そして顕微鏡下で検査した。非特異的な摂取を評
価するために、他の組織を比較した。

ｔｚｓｌで標識したＢＨ３−Ｇｌの、ヒト上皮小体への
特異的結合が証明された。対照のヒト胸部腫瘍ＢＴ２０
移植片は、この抗体の摂取を示さなかった。この抗体の
除去率はＩｇＧ１の正常な半減期と一致した。

役亙ｉΩ次足 各群マウス３匹で３群に　＋　ｚＳＩで標識したＢＨ３
−６１の１５μｇ、５０μｇあるいは１５０μｇ（益性
度）を使用して注射し、４日後２種々の組織の放射能を
算出することにより、特異的結合を測定した。

この上皮小体組織は、それぞれ、１５μｇ、５０μｇ。

または１５０μｇの投与水準に対し、て、１１％、１８
％および７％ＩＤ／ｇｍを示した。３つの投与水準から
の抗体は全て、４日後には血液中に残留した。しかし、
この抗体は、他の組織には結合しなかった。

他の組織は、バックグラウンド水準の放射を示したに過
ぎなかった。

詩皿裟在性 各群マウス３匹で３群を用いて、標識した抗体５０μｇ
を注射し、１，４．および７日目に層殺し。

そして記述のように種々の組織の放射能を算出して、放
射性標識の時間的経過を決定した。７日後の２６％Ｉｎ
／ｇｍに達するまでの期間にわたって、上皮小体に対す
る結合が９時間とともに直線的に増加した。そして、こ
の血液除去率は、このパターンと矛盾しないことが確認
された。ＪＱＩ日後の動物の血中の抗体濃度が最高であ
り９屠殺動物の最低血中濃度は７日月であった。

凪臘皿片 前節において抗体の含有が確認された上皮小体の移植片
を１周囲の筋肉から切り取り、ホルマリンで固定し、パ
ラフィンで埋め込み、そして、切片にした。スライドを
コダックの核証跡用乳剤中に浸け、１４〜２１日間露出
して、放射性映像化した。

このスライドを現像し、ヘマトキシリンで染色した。抗
体の存在は、細胞全面の銀色粒子の出現で示された。第
１図および第２図は、固定した組織の明領域および暗領
域の顕微写真を示す。この上皮小体組織は、これらの両
相のいずれかを用いて。

結合している抗体により、鮮明に規定されている。

結合度の最高の場所は、中央の線維質の領域を離れた周
辺部である。

インジウム−１１１による岬−゛ さらに　Ｉ　ｌ　ｌ　■ｎで標識したＢＨ３−Ｇｌを５
０μｇ投与したマウス４匹を当日に４匹とも層殺し、そ
の組織を分析して％１０／ｇｍを求めた。上皮小体組織
はほぼ６５％のＩＤ／ｇｌｌを示した。これに対して、
他の組織は非特異的結合を示したにすぎなかった。

ウシとヒトの上皮小体細胞をＢ、Ｍ、Ｂｒｏｗｎらのコ
ラゲナーゼ／ＤＮアーゼ法（前出）で調製した。ヒト細
胞を急速な分散細胞として同日に使用した。

ウシ細胞は、同日使用するか、あるいは後述のように４
％仔ウシ血清および５μｇ／−インシュリンを含有する
等量の）ｌａｍｍｓ’　Ｆ１２およびＤｕ　ｌ　ｂｅｃ
ｃｏｓ　’修正１！ａｇｌｅ培地に１〜２日間）Ｕ濁さ
せて培養した。

初期の実験では、急速分散ウシ細胞を高カルシウム濃度
と低カルシウム濃度のＢＨ３−Ｍモノクローナル抗体５
０００ｎｇ／　ｄで処理し、上皮小体ホルモン（ＰＴＨ
）の分泌量を、標識抗血清（これは、アミノ酸３５−８
４含有ＰＴＨのカルボキシ末端断片に高めた）を用い、
放射免疫定量法によりｎｇ　ＰＴＩＩ／１０’細飽／時
間の単位で測定した。それゆえ、この抗血清は正常ＰＴ
ＩＩとＣ−末端断片との両方を検出する。

表１は、高カルシウム濃度と低カルシウム濃度でのＰＴ
１１分泌に関するＢＨ３−Ｍ　　５０００ｎｇ／ｍｊ！
の影響を示す。

紅 」蝕ユと　一対一皿一　　ＢＨ３−Ｍ　　　　ＩＩＰＣ
μ２−Ｍｏ、５ｍＭ　　　８．４±１．１　１６．４±
２．３　　８．６±１．５２．０ｍＭ　　　４．７±０
．５　　８．８±２．３　　４．８±０．９表１は、低
カルシウム濃度と高カルシウム濃度の両方において、　
８８５−ＭがＰＴＩ＋分泌レベルをほとんど倍増させる
が、対照抗体ＨＰＣμ２は検出可能な効果を与えないこ
とを示している。表示の数値は別個の細胞標本３個に対
する平均値上標準偏差である。

急速分１１にヒト上皮小体細胞についても１表２に示す
ように同様の結果が得られた。この分散ヒト上皮小体標
本は、　　０．５ｍＭカルシウムイオン存在下でＢＨ３
−Ｍ　　５０００ｎｇ／−にさらし、　　ＰＴＨ分泌量
を再びｎｇ　ＰＴＩ＋／１０’細胞／時間で表した。

表１ 鳳凰４本　　対−皿　　　ＢＨ３−門　　　１１ＰＣμ
２−Ｍｌ　　　１１．４±１．３　１９．６±２．６　
１１．２±１．５２　　１７．３±２．１　２４．９±
２．８　１６．８±２．４３　　１０．４±１．７　２
０．７±２．１　１０．６±１．９再現性のあるＰＴＩ
＋分泌促進が再び生じる。この数値は個々の標本の反復
５回のインキュベーションに対する数値である。

イソプロテロノールのようなベータ作用薬と異なり、　
ＢＨ３−Ｍの作用は、第３図に示すような直線的な時間
依存性を示す。０．５ｍＭカルシウムイオン中の急速分
散ウシ細胞を１３８５−Ｍ　　５０００ｎｇ／−で処理
（対照細胞は未処理）シ、この上澄液のｎｇ　ＰＴＩＩ
／１０’細胞を上記のごとく定量した。ラグタイム１５
分後。

このＢＨ３−Ｍ処理細胞の分泌曲線は対照の曲線からそ
れて、予期された分泌レベルの増加を示す。それゆえ２
表１および表２に示す結果は、明らかに。

時間当たりの分泌率に基づいている。

ＰＴ１１分泌に関するＢＨ３−１１の効果の適用量作用
曲線を、急速分散ウシ細胞および１〜２日間の培養によ
る表面マーカー再生後の分散ウシ細胞について測定した
。これらの結果を第４図に示す。予想どおりＢＨ３−Ｍ
適用量が高（なるにつれてＰＴＩＩ分泌促進効果も上昇
した。さらに、　ＢＨ３−Ｈに作用する表面マーカー発
生の機会を有する培養細胞には。

より低い適用量が必要である。分散細胞に関するＢＨ３
−Ｍの効果は、適用量５μｇ／−の供給時までは不明瞭
であった。これに反して、２日間培養した細胞の場合は
５０ｎｇ／−のみの適用量の使用により、また１日間培
養した細胞の場合は５００ｎｇ／−の使用により、　　
ＰＴＨ分泌に関する類偵の効果が得られた。第４図に示
す結果は、　　０．５ｍＭのカルシウムイオン濃度に対
する。４０％減少したＰＴ１１分泌レベルでは、２ｍＭ
カルシウムイオンの存在下で同様の結果が得られた。

周期性ＡＭＰレベルと分泌されたＰＴｌｌの性質に関す
るこの抗体の効率を調べて、この促進の本質のらなるキ
ャラクタリゼーションを行なった。

０．１Ｎ　ＩＩｃＩを用いて細胞ベレットから抽出する
ことにより９同期性ＡＭＰを測定し、この抽出物中の周
期性＾ＭＰ濃度を放射性免疫定量法で測定した。

周期性ＡＭＰ標準品とこの抽出物の両方をアセチル化し
た後、この定量を行なった。この定量で用いた抗血清は
アセチル化した周期性ＡＭＰに高めた。

０．５ｍＭカルシウムイオン存在下および５０００ｎｇ
／ｍｆｆｉＢＢ５−Ｍ添加あるいは無添加の場合の分散
ウシ上皮小体細胞の周期性ＡＭＩ’含存置を、　ＢＨ３
−Ｍ処理後９０分までの間隔で定量した。対照細胞とＢ
Ｈ３−Ｍ処理細胞の両方の周期性ＡＭＰレベルは約４０
０　ｆｍｏｌｅｓ／１０’細胞であり、この期間中変動
しなかった。

さらに、正常部分とカルボキシ末端部分のこのＰＴｌｌ
の分泌レベルに関する効果を調べた。通常。

低カルシウム濃度では、この上皮小体は９合成されたＰ
Ｔｌｌの約５０％を正常ＰＴＨとして分泌し、約１０％
を残している。この合成ＰＴＨの４０％は分解され。

その一部はペプチドのカルボキシ末端部分（アミノ酸３
５−８４）として分泌される。

０．５ｍＭカルシウムイオン中の急速分散ウシ細胞を５
０００ｎｇ／ｄ　ＢＨ３−Ｍで処理し、あるいは対照と
して非処理で、１．５時間後に８Ｍ尿素（ｐＨ４，５）
中のポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて上澄液
を調べた。

ＰＴＨタンパクはＰＴ）ＩのＣ−末端部分に高めた抗血
清を用いる放射性免疫沈降法によりセグメントゲル上に
置かれた。これらの結果を第５図に示す。

このＢＨ３−Ｈの刺激作用が正常タンパクに特異的に向
かっていることは明らかであり１分泌Ｃ−末端断片のレ
ベルは不変である。

４、　′　　の　　　なｉ゛■ 第１図および第２図は　１１２５に結合したＢＨ３−Ｇ
ｌをヌードマウスに注射した後における該マウス中の上
皮小体の移植組織のＢ微鏡写真（逆相で撮影）；第３図
は１本発明のモノクローナル抗体により刺激されたＰＴ
Ｈ分泌の時間依存性を示すグラフ；第４図は、　ＢＨ３
−Ｍ抗体で処理され鋭敏に分散したウシの上皮小体細胞
に対する投与量−作用曲線；そして第５図は、　ＢＨ３
−Ｍ抗体処理による正常な上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）
の分泌、およびアミノ酸３５〜８４個を含有するＣ末端
断片のＰＴＨの分泌におよぼす効果を示すグラフである
。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト上皮小体に特有の抗原に特異的な免疫反応性の
   あるモノクローナル抗体またはその断片。 ２、前記抗原が、上皮小体に特有な１９１ｋｄの抗原で
   ある特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体
   またはその断片。 ３、標識に共有結合した特許請求の範囲第１項に記載の
   モノクローナル抗体またはその断片。 ４、前記標識が、Ｉ−１２５、Ｉｎ−１１１またはＴｃ
   −９９である特許請求の範囲第３項に記載のモノクロー
   ナル抗体またはその断片。 ５、ヒト上皮小体に特有の抗原に特異的な免疫反応性の
   あるモノクローナル抗体またはその断片を分泌する永久
   増殖細胞系。 ６、単離されたヒト上皮小体で免疫化したマウスの血液
   リンパ球または脾細胞を、ネズミ骨髄種系と融合するこ
   とにより調製される特許請求の範囲第５項に記載の永久
   増殖細胞系。 ７、前記抗原が、上皮小体に特有な１９１ｋｄの抗原で
   ある特許請求の範囲第５項に記載の永久増殖細胞系。 ８、前記モノクローナル抗体またはその断片が標識に共
   有結合した特許請求の範囲第５項に記載の永久増殖細胞
   系。 ９、前記標識が、Ｉ−１２５、Ｉｎ−１１１またはＴｃ
   −９９である特許請求の範囲第８項に記載の永久増殖細
   胞系。 １０、ヒト上皮小体に特有の抗原に特異的な免疫反応性
   のあるモノクローナル抗体またはその断片と免疫反応し
   た上皮小体組織。 １１、前記抗原が、上皮小体に特有な１９１ｋｄの抗原
   である特許請求の範囲第１０項に記載の上皮小体組織。 １２、前記モノクローナル抗体またはその断片が標識に
   共有結合した特許請求の範囲第１０項に記載の上皮小体
   組織。 １３、前記標識が、Ｉ−１２５、Ｉｎ−１１１またはＴ
   ｃ−９９である特許請求の範囲第１２項に記載の上皮小
   体組織。 １４、１９１ｋｄの分子量を有するヒト上皮小体組織と
   特異的かつ固有的に結合した精製抗原。 １５、ヒト対象における上皮小体組織を位置決定する方
   法であって、 ヒト上皮小体に特有の抗原と特異的な免疫反応性のある
   標識されたモノクローナル抗体またはその断片を該対象
   に投与することを包含する上皮小体組織の位置決定方法
   。 １６、前記抗原が、上皮小体に特有な１９１ｋｄの抗原
   である特許請求の範囲第１５項に記載の上皮小体組織の
   位置決定方法。 １７、前記モノクローナル抗体またはその断片が標識に
   共有結合した特許請求の範囲第１５項に記載の上皮小体
   組織の位置決定方法。 １８、前記標識が、Ｉ−１２５、Ｉｎ−１１１またはＴ
   ｃ−９９である特許請求の範囲第１７項に記載の上皮小
   体組織の位置決定方法。 １９、上皮小体機能低下症の治療法であって、抗原が上
   皮小体に特有な１９１ｋｄの抗原であるモノクローナル
   抗体またはその断片の有効量、またはその有効量を含有
   する薬剤組成物を、このような治療を要する対象に投与
   することを包含する上皮小体機能低下症の治療法。 ２０、前記モノクローナル抗体またはその断片が標識に
   共有結合した特許請求の範囲第１９項に記載の上皮症体
   機能低下症の治療法。 ２１、前記標識が、Ｉ−１２５、Ｉｎ−１１１またはＴ
   ｃ−９９である特許請求の範囲第２０項に記載の上皮小
   体機能低下症の治療法。