JPS6223A - 組織由来腫瘍増殖阻害物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 Ｂｉｃｈｅｌ　［Ｂｉｃｈｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ　２３１
；　４４９−４５０（１９７１）］は、腫瘍増殖平衡時
期に腹水腫瘍担持マウスから多くの腫瘍を切除すると残
少の腫瘍細胞が著しく増殖すると報告している。十分に
進行した腹水腫瘍を担持したマウスから得た無細胞腹水
を増殖性腹水腫瘍を有するマクスに注入すると、腹水細
胞の増殖が著しく抑制された。Ｂｉ　ｃｈｅ　１（同上
）は、進行した腫瘍を有するマウスと早期腫瘍を有する
マウスの２匹のマウスを外科的に結合した〔併体結合（
ｐａｒａｂｉｏｔｉｃ　）　）　？ウスでは、早期腫瘍
の増殖が著しく抑制されることも知見している。これら
の知見に基いて、併体結合マウスの腹膜中を循環し、十
分に進行した腹水腫瘍（よシ産生される無細胞腹水中に
存在する分散可能な抑制因子（ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ　
１ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）の存在を
仮定した（Ｂｉｃｈｅｌ、　Ｅｕｒｏｐ、　Ｊ、Ｃａｎ
ｃｅｒ　６　：２９１−２９６　（１９７０）およびＢ
ｉｃｈｅｌ　（同上）〕。

との抑制因子の性質は明らかにされていなかったが、腹
水腫瘍の増殖率は腫瘍組織の量に依存し、産生される抑
制因子の量によって決定されると推測された。

腫瘍増殖抑制活性を有する物質についても記載されてい
る（Ｈａｌｌｅｙら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７７　：　５９８９　　（１９８０）およびＩ
−Ｔｏ　１１　ｅｙら。

Ｃｅ１ｌＢｉｏｌ、Ｉｎｔ、Ｒｅｐｏｒｔｓ　７　　：
　５Ｚ５−５２６（１９８３）］。

これらの刊行物には、アフリカミドリザルＥＳＣ−１細
胞から単離した増殖抑制物質がＢＳＣ−ＩＭ胞、ヒト乳
癌細胞および正常ヒト乳細胞の増殖を抑制した旨の報告
がある。最近この物質がＢ−ＴＧＦ（Ａｓｓｏｉａｎら
、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５８：　７１５５
−７１６０（１９８３））　　と呼称される２５０００
ダルトンの２本領ヒト血小板由来ポリペブチＰと同一も
しくは極めて近似しているととが判明した［Ｔｕｃｋｅ
ｒら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２６　：　７０５−７０７
　（１９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、８２　（Ｊａｎ）：１１
９−１２３（１９８５））、またＢｋ　Ｍａｈｏｎらは
、ラット肝から非悪性ラット肝細胞の増殖を抑制するが
悪性ラット肝細胞の増殖を抑制しない２６０００ダルト
ンの物質を取シ出した（　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７９．４５６−４６０（１９
８２））。他の増殖抑制物質は培養雛（ｃｈｉｃｋ）を
髄細胞中で同定された（Ｋａｇｅｎら＋　Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　５８　：　３４７
−３６０（１９７０）　：　Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、
　Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７：　４２３−４２７（１９８０）
および５ｔｅｃｋら、　Ｊ、Ｃｅ１Ｉ　Ｂｉｏｌ、　８
３　：　５６２−５７５（１９７９）：ｌ。

Ｉｗａｔａら（Ｊ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　５ｕｐｐ１．５：４０１（１９８２））は；増′
殖刺激および増殖抑制活性を検定するためのマイクロ力
価プレートシステムについて記載している。Ｔｏｄａｒ
ｏらＣＴｏｄａｒｏら、　ＴｕｒｒＩＤｒＣｅｌｌ　Ｈ
ｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　：　Ｏｒｉｇｉｎｓ　ａｎ
ｄ　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

Ｂｒ１ｓｔｏｌ　−Ｍｙｅｒｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｙｍ
ｐｏｓｉａ＋　Ｖｏｌｕｍｅ　４＋Ｏｗｅｎｓ＋　Ａ、
Ｈ０＋　Ｃｏｆｆｅｙ、　Ｄ、Ｓ、およびＢａｙｌ　ｉ
ｒｂ　Ｓ。

８０編（Ａｃａｄｅｎｌｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　、　１９Ｂ
２）　＊ｐｐ、２０５−２２４　：ｌおよびＩｗａ　ｔ
　ａら［Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　Ｆｅｄ、ＡＭ、　Ｓｏ
ｃ、Ｅｘｐ。

Ｂｉｏｌ、４２：１８３３（１９８３））は、培養中に
増殖したヒト腫瘍細胞の組繊細胞液から腫瘍抑制活性を
単離したと報告した。これらの報告中に記載された知見
は予備的で６Ｄ、詳細ではない。

１９８４年４月２０日付で米国特許商標局に出願された
（Ｕ、　Ｓ、　５ｅｒｉａｌ　ＩＫ　６０２．５２０）
共同発明者としてＫｅｎｅｎｔｈ　Ｋ、Ｉｗａｔａ　が
含まれている特許出願（発明の名称”５ｕｂｓｔａｎｔ
ｉａｌｌｙ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＴｕｍｏｒＧｒｏｗｔ
ｈ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＴＩＦ）
つは、培養中に増殖したヒト腫瘍細胞中に存在、由来す
る余り特定されていない物質の予備同定に関する。前記
物質は、既に報告された（Ｔｏｄａｒｏら、　Ｔｕｍｏ
ｒ　Ｃｅｌ　ｌＨｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　　ｅ　　
Ｏｒｉｇｉｎｓ　　ａｎｄ　　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ＋Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｙ
ｍｐｏｓｉａ＋　Ｖｏｌ、　４＋　Ｏｗｅｎｓ＋Ａ、Ｈ
ｏ、　Ｄ、Ｓ、、およびＢａｙｌｉｎ、　Ｓ、Ｂ、編（
Ａｃａｄｅｍｉ　ｃＰｒｅｓｓｔ　１９８２）　＋ｐｐ
、２．０５−２２４；　Ｉｗａｔａら＊　Ｆｅｄ　。

Ｐｒｏｃ、　Ｆｅｄ、　、Ａｍ、　Ｓａｃ、　Ｅｘｐ、
　Ｂ（ｏｌ、４２：　１８３３（１９８３））腫瘍抑制
活性に類似している。

Ｔｏｄａｒｏ　　（Ｔｏｄａｒｏ、　　Ｇ、　　Ｊ、ｌ
　Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ
　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｔｅｒｒｙ　ＦＯＸ　Ｃａｎｃｅｒ
　ｋｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（カナダ、バ
ンク−バー、ブリテラシュ・コロンビア大学）Ａｂｓ、
　１３　（１９８４）　）は最近、腫瘍細胞増殖抑制作
用を有し夫々７０および９０個のアミノ酸残基から構成
される２個の因子を報告した。これらの因子のソース即
ち種の細胞、組織タイプ或いは因子の精製方法はついて
の開示はなかった。

発明の要旨 本発明は、複数の酸性ポリペプチドから成るヒト組織由
来の酸性化エタノール抽出物に関し、前記ポリペブチｒ
の各々は約２００００ダルトン未満の分子量を有してお
り、正常なヒト包皮フィブロブラストの成長を刺激しな
がらヒト腫瘍細胞および樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６
４）の増殖を抑制する性質を有する。ヒ）Ｉｌｌ瘍細胞
増殖に対する抑制活性は、酸性化エタノール抽出物の温
度を約３分間約１００℃に上げても、或いは酢酸を添加
してもこわれず、約２３℃よりむしろ約４℃で酸性化エ
タノール抽出物を作成したときの方が抑制活性は高い。

本発明はまた、実質的に全ての血液、全ての細胞外可溶
性成分および実質的に全ての細胞内可溶性成分を除去す
べく処理されたヒ）！帯から誘導された酸性化エタノ−
？ル抽出物に関する。前記抽出物は、非還元条件下で約
３００００ダルトン未満の見かけ分子量を有しており、
正常なヒト包皮フィブロブラストの成長を刺激しながら
ヒト腫瘍細胞および樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）
の増殖を抑制する性質を有する。ヒト腫瘍細胞増殖の抑
制活性は、酸性化エタノール抽出物の温度を約１００℃
に約３分間上げても、また酸性化エタノール抽出物が酢
酸中最高約１．０モルまで酢酸を添加してもこわれない
。

本発明はまた、複数の酸性ポリペブチ１から成るヒト組
織例えばヒト鎖帯あるいはヒト胎盤から誘導された酸性
化エタノール抽出物の製造方法に関し、前記ポリペプチ
ドの各々は約２００００ダルトン未満の分子量を有して
お）、正常なヒト包皮フイブロブラストの成長を刺激し
ながらヒト腫瘍細胞および樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ
６４）の増殖を抑制する性質を有する。前記方法は、適
当な条件下で、組織を処理して溶解細胞（Ｉｙｓｅｄ　
ｃｅｌｌ）および細胞由来の溶解（ｓｏｌｕｂｉ　ｆｉ
ｚｅｄ）りｙ／Ｑり質を産生し、溶解タンパク質を回収
し、溶解タン／ｑり質から見かけ分子量約２００００ダ
ルトン未満のポリペプチドを別個に回収し、こうして回
収されたポリペプチドを検定してヒト腫瘍細胞の増殖を
抑制するか、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の増殖
を抑制するか、或いは正常なヒト包皮線維芽細胞の成長
を促進するポリペプチドを同定し、こうして同定された
ポリペプチドを含む酸性化エタノール抽出物を回収する
ことから成る。

本発明はまた、約２００００〜３００００ダルトンの見
かけ分子量を有しており、正常なヒト包皮フィブロブラ
ストの成長を刺激しながらヒト腫瘍細胞および樹立ミン
ク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の増殖を抑制する性質を有す
る組織由来増殖阻害物質（ｔｉｓｓｕｅ　−ｄｅｒｉｖ
ｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ、　ＴＧＩ）
から成るヒト臍帯からの酸性化エタノール抽出物の製造
方法拡間する。前記方法は、適当な条件下で、調帯組織
から静脈および動脈を除去し、組織を洗浄して痕跡血液
を全て取シ除き、組織を処理して溶解細胞を産生、細胞
由来の可溶性エタノ９り質を除去し、酸性化エタノール
抽出によって分解細胞から残シのタン、ｅり質を溶解、
単離させて溶解タンパク質を産生し、溶解タン／Ｑり質
から見かけ分子量約２００００〜３００００　　ダルト
ンのＴＧＩを別個に回収し、こうして別個に回収された
ＴＧＩを検定してヒト腫瘍細胞の増殖を抑制し、樹立ミ
ンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の増殖を抑制し正常なヒト
包皮フイブロブラストの成長を促進する活性を同定し、
こうして同定され・たＴＧＩを含む酸性化エタノール抽
出物を回収することから成る。

本発明はまた、約５０００〜１６０００ダルトンの見か
け分子量を有しており、ヒト腫瘍細胞および樹立ミンク
肺細胞系（ＣＣＬ６４）の増殖を抑制するが正常なヒト
包皮フイブ賞プラストの成長を抑制しない性質を有する
少なくとも１個のポリペプチドから成シ組織由来増殖阻
害物質−１（ＴＧＩ−１）と呼称される物質を提供する
。前記物質は、ａ）約２６−３４％の７−１＝トニトリ
ｗテ０．０５　％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル
の直線勾配を用いて酸性化エタノール抽出物を高性能液
体クロマトグラフィーＫかけたとき規定された活性とし
て回収可能であ）、約１７−２３％の２−ゾロ７９ノー
ルで０．０５　％　、）　ＩＪフルオロ酢酸含有２−プ
ロパノールの直線勾配を用いて酸性化したエタノール抽
出物を高性能液体クロマトグラフィーにかけたとき規定
された活性として回収可能であり、ｂ）０．０５％トリ
フルオロ酢酸含有２−プロ／Ｑノールの直線勾配を用い
て高性能液体クロマトグラフィーＫかけたとき、約２６
チ２−エタノールで溶出され優先的にヒト腫瘍細胞の増
殖を抑制するが樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の増
殖は抑制しない活性と約２３チ２−エタノールで溶出さ
れ優先的に樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の増殖を
抑制するがヒト腫瘍細胞の増殖を抑制しない活性の２個
の活性に分離されうる。本発明は更にＴＧＩ−１の製造
方法も提供する。

本発明はまた約２００００〜ａｏｏｏｏダルトンの見か
け分子量を有しており、正常なヒト包皮フイブロブラス
トの成長を抑制しないがヒト腫瘍細胞および樹立ミンク
肺細胞系（ＣＣＬ６４）の増殖を抑制する性質を有する
少なくとも１個のポリペプチドから成シ組織由来増殖阻
害物質（ＴＧＩ）と呼称される物質を提供する。前記物
質は、約２８−３４％のアセトニトリルで０．０５％ト
リフルオロ酢酸含有アセトニトリルの直線勾配を用いて
酸性化エタノール抽出物を高性能液体クロマトグラフィ
ーにかけたとき規定された活性として回収可　　　　　
−能であり、約０．６−０．７　Ｍ　ＮａＣｌでＮａＣ
ｔの直線勾配を用いて陽イオン交換樹脂にかけたとき規
定された活性を有するシングルピークとして溶離されう
る。

本発明はまた、約５０００〜１６０００ダルトンの見か
け分子量を有しており、正常なヒト包皮フイブロブラス
トの成長を抑制しないがヒト腫瘍細胞および樹立ミンク
肺細胞系（ＣＣＬ６４）の増殖を抑制する性質を有する
少なくとも１個の、ｌ？　ＩＪペプチドから成シ組織由
来増殖抑制因子−２（ＴＧＩ−２）と呼称される物質を
提供する。前記物質は、約３５−３９％のアセトニトリ
ルで０．０５％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリルの
直線勾配を用いて酸性化エタノール抽出物を高性能液体
り資マドグラフィーにかけたとき規定された活性として
回収可能であり、約２３−２７％の２−プロパノールで
０．０５％）リフルオロ酢酸含有２−プロ／Ｑノールの
直線勾配を用いて酸性化したエタノール抽出物を高性能
液体クロマトグラフィーにかけたとき規定された活性と
して回収可能である。本発明は更ＫＴＧＩ　−２の製造
方法も提供する。

更に、本発明は、ＣＭ−１、ＣＭ−Ｉｆ　、ＣＭ−１［
１およびＣＭ−ＩＶと呼称されるポリペプチドの不均一
集合体（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　）を提供する。前記ポ
リペプチドの各々は、ヒト腫瘍細胞の増殖を実質的に抑
制する゛性質を有し、ＣＭ−Ｉを除き樹立ミンク肺細胞
系（ＣＣＬ６４）の増殖を実質的に抑制する作用を有し
、何れのペプチドも正常なヒト包皮フイブロブラストの
成長を抑制しない。前記集合体は酸性化エタノール抽出
物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけることによ
シ回収可能である。

本発明は、ＣＭ−１、ＣＭ−ｎ　、ＣＭ−Ｉｌｌおよび
ＣＭ−■と呼称されるポリペプチドの不均一集合体の製
造方法をも提供する。

有効量の抽出物ＴＧＩ−１、ＴＧＩ　、ＴＧＩ−２ある
いはＣＭ−Ｉ　、ＣＭ−ＩＩ　、ＣＭ−ＩＩＩおよびＣ
Ｍ−ＩＶと呼称されるポリペプチドの不均一集合体と適
当な薬学的キャリアを含む薬剤組成物が提供され、前記
組成物と細胞を接触させることＫよってヒト腫瘍細胞の
増殖を抑制するための方法が提供される。

組成物は火傷の治瘍、創傷の治癒にも使用される。

本発明はまた、腫瘍の存在を検出する方法にも関する。

前記方法は、検体サンプル中に存在するＴＧＩ−１、Ｔ
ＧＩ本しくはＴＧＩ−２の量或いはＣＭ−１、ＣＭ−Ｉ
Ｉ　、ＣＭ−ＩＩＩもしくはＣＭ−ＩＶと呼称されるポ
リペプチドの不均一集合体の量を定量的に測定し、こう
して得られた測定量と正常な検体サンプル中に存在する
量とを比較することから成り、量に有意差があれば腫瘍
が存在することが示される。更に、本発明は、検体サン
プル中に存在する形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−
α）の量とＴＧＩ−１、ＴＧＩもしくはＴＧＩ−２の量
或いはＣＭ−Ｉ、ＣＭ−１［、ＣＭ−１ｌｌもしくはＣ
Ｍ−ＩＶと呼称されるポリペプチドの不均一集合体の量
とを別個に定量的に測定し、存在するＴＧＦ−αの量に
対するサンプル中のＴＧＩ−１、ＴＧＩ　、ＴＧＩ−２
あるいは不均一集合体の量の比率を測定し、正常な検体
サンプルの対照比率を測定し、正常検体の比率と検体の
比率とを比較することから成り、比率に有意な変動があ
れば腫瘍の存在が示唆されるものである、腫瘍の検出方
法にも係る。

最後に、本発明は、腫瘍担持検体からのサンプルについ
てサンプル中の１種もしくはそれ以上のＴＧＩ−１、Ｔ
ＧＩ　、ＴＧＩ−２，ＣＭ−Ｉ　、ＣＭ−ｎ。

ＣＭ−ＩＩＩおよびＣＭ−■の存在を測定することから
成υ、それ等の特定な組合せの存在の有無、或いはそれ
等の特定量もしくは相対量の存在が特定の腫瘍の型の指
標となる腫瘍型の決定方法に関する。

以下、図面についての説明をする。

第１図はヒトの腰帯の粗酸性エタノール抽出物の２３℃
に於けるゲル濾過クロマトグラフィの溶出パターンであ
る。１．０　Ｍ酢酸１．５０−中の酸性エタノール抽出
物２ｔをパイオーゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐ　１０を含
む１４Ｘ１００ＣＩｌｌカラム（アミコン（Ａｍｉｃｏ
ｎ　）　；　＋８６０１２　）にかけ、７−７分の流速
で溶出した。Ｃ型コレクションラック（ＬＫＢ）装備の
スーツ−ラック（Ｓｕｐｅｒ　Ｒａｃ）α、ＫＢ２２１
１）で１ｔずつの７ラクシヨンを回収した。各７２クシ
ヨン（１ｔ／各フラクシヨン）から１−を１１２Ｘ７５
Ｈの滅菌スナップトップチューブ（ファルコン（Ｆａｌ
ｃｏｎ）　２０５８　）に移した。ＴＧＩ活性は物質及
び方法の欄に記載した方法で測定した。

Ａ３４９ヒト肺ガン細胞の阻害効果は白い三角で、ミン
ク肺細胞（ＣＣＬ６４　）のそれは白丸で表示すしてい
る。最大吸収スケールレンジｄｉ　１．　ＯＡＵＰＳの
ユビコードＳ　（Ｕｖｉｃｏｏｄ　Ｓ）　（ＬＫＢ　２
１３８　）と１チヤンネルチヤート記録計（ＬＫＢ２２
１０Ｘチャート速度１鵡／分）を使用して２８０ｎｍの
吸収（−）を測定した。

第２図はヒトの鎖帯の粗酸性エタノール抽出物の４℃に
於けるゲル濾過クロマトグラフィの溶出／ｅターンであ
る。１．０　Ｍ酢酸１５０ｄ中の酸性エタノール抽出物
２２をパイオーデル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐｌｏを含む１
４×１００αカラム（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　；　
４８６０１２　）にかけ、７−７分の流速で溶出した。

Ｃ型コレクションラック（ＬＫＢ）装備の、（＋）ｅ−
ラック（Ｓｕｐｅｒ　Ｒａｃ）　（ＬＫＢ　　２２１１
　）で１ｔずつの７ラグクシヨンを１収した。各フラク
ション（１ｔ／各フラクシヨン）から１１１ｔをとＪ１
２Ｘ７５ｍの滅菌スナップトップチューブ（７ア＃：Ｆ
７　（Ｆａｌｃｏｎ）　１０５８　）に移した。ＴＧＩ
活性は物質及び方法の欄に記載した方法で測定した。Ａ
３４９ヒト肺ガン細胞の阻害効果は白い三角で、ミンク
肺細胞（ＣＣＬ６４）のそれは白丸で表示されている。

最大吸収スケールレンジが↓ １．０ＡＵＦのユビ：ｙ　−１’　Ｓ　（Ｕｖｉｃｏｒ
ｄ　Ｓ　）　（ＬＫＢ２１３８）と１チヤンネルチヤー
ト記録計（ＬＫＢ２２１０）（チャート速度１鵡／分）
を使用して２８０ｎｍの吸収（−）を測定した。

第３図はヒトの鎖帯の粗酸性化エタノール抽出物の４℃
に於けるゲル濾過クロマトグラフィの溶出ノ９ターンで
ある。１．０Ｍ酢酸１５０ＩＲｔ中の酸性エタノール抽
出物をパイオーデル（Ｉ３ｉｏ　−Ｇｅ１）ＰＩＯを含
む１４Ｘ１００ｆｉカラム（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）
　；≠８６０１２）にかけ、７ｄ／分の流速で溶出した
。Ｃｍコレクションラック（ＬＫＢ）装備のス　、ｅ−
ラック（５ｕｐｅｒ　Ｒａｃ）　（ＬＫＢ２２１１）で
１ｔずつのフラクションを回収した。各フラクション（
１ｔ／各フラクシヨン）から１Ｉｎｔをとシ１２Ｘ７５
ｆｌの滅菌スナップトップチューブ（７アルコｙ（Ｆａ
ｌｃｏｎ）２０５８）に移した。ＴＧＩ活性は物質及び
方法の欄に記載した方法で測定した。

Ａ３４９ヒト肺ガン細胞の阻害効果は白い三角で、ミン
ク肺細胞（ＣＣＬ６４）のそれは白丸で表示されている
。正常ヒトフィブロブラストの刺激はと１チヤンネルチ
ヤート記録計（ＬＫＢ　　２２１０）（チャート速度Ｉ
ＪＩＪ／分）を使用して２８０　　ｎｍの吸収（−）を
測定した。

ヒト鎖帯の酸性化エタノール抽出物（タンパク質６５．
８１Ｆ）のパイオーデルＰＩＯによるゲル濾過クロマト
グラフィに於けるフラクション４を凍結乾燥し、０．０
５−のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１〇−中に再懸濁さ
せた。フラクション４は２８０ｎｍに於ける吸収の主ピ
ーク後の最初のフラクションであった（第２図参照）。

この試料をベックマンテーブルトップ遠心機（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ　ＴＪ　−６）　Ｋかけ３０００ｒｐｍ　　で２
０分間遠心し不溶物質を除去した。２−の試料ループ付
つォーターズ（％ｔｅｒｈ）Ｕ６に注入装置を用いて上
記の上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）をミロに分けて注
入した。次いで試料をＵボンジノ９ツク（ｕ　ＢＯＮＰ
ｌＡＦＡＫ　）　Ｃ１８カラム（０，７８Ｘ３０ｚ）（
ウォーター賃≠８４１７６）Ｉｃかけた。流速は２１ｎ
ｔ／ｍｉｎであり、ウォーターズＵＶ測定器（Ｗａ　ｔ
　ｅ　ｒ　ｓＭｏｄｅｌ　　４８１　）を用いて感度２
．０ＡＵＦＳにて２０６ｎｍ（−）　　で溶出をモニタ
ーした。０．０５％ＴＦＡ含有アセトニトリルの０．２
５％からの直線濃度勾配（３０分間）、次いで０．０５
饅ＴＦＡ含有アセトニトリルの２５〜４５−直線濃度勾
配（２４０分間）、そして０．０５％ＴＦＡ含有アセト
ニ）　ＩＪルの４５〜１００％直線濃度勾配（３０分間
）によって溶出を実施した。スー／Ｑ−ラック（ＬＫＢ
２２１１）を用いて１２ｍずつのフラクションに回収し
た。各７ラクシヨンから１−を牛血清アルブミン（シグ
マＢ　）　５０　ｐ？及び１．０Ｍ酢酸５０μｔヲ含ｔ
ｒホリスチレンチユーブ（ファルコン２０５８　）（１
２Ｘ７５ｍ）に移し、ＴＧＩ活性を物質及び方法に記載
した如くアッセイした。Ａ３４９ヒト肺ガン細胞阻害を
白い三角でミンク肺細胞（ＣＣＬ６４）のそれを白丸で
表示する。溶媒勾配は点線（−−−−−’　＞で示す。

第４図のＨＰＬＣクロマトグラフィに於いて２８〜３４
％アセトニトリルにて溶出されたＴＧＩ活性のプール７
ラクシヨン（１，５ｑ）（フラクション１３−２２　）
を凍結乾燥し、０．０５−のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）２−中に再懸濁させた。この試料をベックマンテーブ
ルトップ遠心機Ｑ３ｅｃｌａｎａｎＴＪ−６）にかけ３
０００　ｒｐｍで２０分間遠心し不溶物質を除去した。

２ｄの試料ループ付つォーターズ（Ｗａｔｅｒ’ｓ）　
Ｕ　６　Ｋ注入装置を用いて上記の上清（５ｕｐｅｒｎ
ａｔａｎｔ　）を三回に分けて注入した。次いで試料を
Ｕボンダパック（ＬＩ　ＢＯＮＦ３ＡＰＡＫ　）　Ｃ１
８カラム（０，３９Ｘ３０ｃｍ）（ウォーターズ＋２７
３２４）Ｋかけた。流速は１ｍ／ｍｉｎであり、ウォー
ターズＵＶ測定器（Ｗａｔｅｒｓ　Ｍｏｄｅｌ　４８１
　）を用いて感度２．０ＡＵＦＳ　　にて２０６ｎｍ（
−）で溶出をモニターした。０．０５チＴＦＡ含有２−
プロパノールの０−１５％直線濃度勾配（２０分間）、
次いで０．０５％ＴＦＡ含有２−プロノｑノールの１５
〜３５％直線濃度勾配（１２０分間）によって溶出を実
施した。スーパーラック（ＬＫＢ２２１１）を用いて４
−ずつのフラクションに回収した。各７ラクシヨンから
１−を牛血清アルブミン（ジグ−＝ｒＡ−６００３）５
０７７Ｆ及び１．０Ｍ酢酸５ｏｐｔを含むポリスチレン
チューブ（ファルコン２０５ｇ　）（１２Ｘ７５ｍ）に
移し、ＴＧＩ活性を物質及び方法に記載した如くアッセ
イした。Ａ３４９ヒト肺ガン細胞阻害を白い三角で、ミ
ンク肺細胞（ＣＣＬ６４）のそれを白丸で表示する。溶
媒勾配は点線（−−−−）で示す。

第４図のＨＰＬＣり四マトグ２フイに於いて３５〜３９
％アセトニトリルにて溶出されたＴＧＩ活性のブー／ｌ
／　７　：ｌＦクション（ｏ、ｓｍｔ）（７ラクシヨン
２５〜３１）を凍結乾燥し、０．０５％のトリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）２ｄ中に再懸濁させた。

この試料をペックマンテーブルトップ遠心機（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ　Ｔ　Ｊ　−６）にかけ３０００ｒｐｍで３０分
間遠心し不溶物質を除去した。２Ｍｔの試料ループ付つ
ォーターズ（Ｗａｔｅｒ’ｓ）　Ｕ　６　Ｋ注入装置を
用いて上記の上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を二回に
分けて注入した。次いで試料をＵボンダパック（ｕＢＯ
ＮＢＡＰＡＫ）Ｃ１８カラ！　（０，３９Ｘ３０ｃ１１
）　（ウォーターズ＋２７３２４）Ｋかけた。流速は１
ｍ／ｍ、ｉｎ　　であり、ウォーターズＵＶ測定器（Ｗ
ａｔｅｒｓ　Ｍｏｄｅｌ　４８１　）を用いて感度１．
０ＡＵＦＳにて２０６ｎｍ（−）で溶出をモニターした
。０．０５＊ＴＦＡ含有２−ゾ’ＣＩ　／Ｑノールの０
．１５−からの直線濃度勾配（２０分間）、次いで０．
０５％ＴＦＡ含有２−プロノｑノールの１５−３５−直
線濃度勾配（１２０分間）によって溶出を実施した。ス
ーパ−ラック（ＬＫＢ２２１１）を用いて４ｄずつのフ
ラクションに回収した。各フラクションから１−を牛血
清アルブミン（シダｗＡ　−６００３）　５０　ｐｆ　
及Ｕ１．０Ｍ酢酸５ｏｐｔを含むポリスチレンチューブ
（ファルコン２０５８　）（１２Ｘ７５ｉｍ）に移し、
ＴＧＩ活性を物質及び方法に記載した如くアッセイした
。Ａ３４９ヒト肺ガン細胞阻害を白い三角でミンク肺細
胞（ＣＣＬ６４）のそれを白丸で表示する。溶媒勾配は
点線（−−−−）で示す。

ヒト腰帯の酸性化エタノール抽出物のバイオ−ゲルＰＩ
ＯＫよるゲルｐ過クロマトグラフィに於ける７ラクシヨ
ン５を凍結乾燥し、０．０５％のトリフルオロ酢酸（Ｔ
　Ｆ　Ａ　）　４　ｍｅ中に再懸濁させた。

７ラクシヨン５は２８０　ｎｍ　Ｉ／Ｃ於ける吸収の主
ピーク後の二番目の７ラクシヨンであった（第２図参照
）。この試料をベックマンテーブルトップ遠心機（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ　ＴＪ　−６）　Ｋかけ３０００ｒｐｍで２
０分間遠心し不溶物質を除去した。２−の試料ループ付
つォーターズ（Ｗａｔｅｒ’ｓ）　Ｕ　６　Ｋ注入装置
を用いて上記の上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を二回
に分けて注入した。次いで試料（１，３−総量）をＵボ
ンダ、ｌ／／（ｕＢＯＮＤＡＰＡＫ）Ｃ，８，ＩＡ（０
，７８Ｘ３０２）（ウオーターズ＋８４１７６）Ｋかけ
た。流速は２ｍ／ｍ　ｉ　ｎであプ、ウォーターズＵＶ
測定器（ＷａｔｅｒｓＭｏｄｅｌ　　４８１　）を用い
て感度２．０ＡＵＦＳＫて２０６ｎｍ（−）で溶出をモ
ニターした。Ｏ，ＯＳ％ＴＦＡ含有アセトニトリルの０
．２５％からの直線濃度勾配（３０分間）、次イテ０．
０５　％　ＴＦＡ含有アセトニトリルの２５〜４５％直
線濃度勾配（２４０分間）、モしてｏ、ｏｓ％ＴＦＡ含
有アセトニトリルの４５〜１００％直線濃度勾配（３０
分間）によって溶出を実施した。スーパーラック（ＬＫ
Ｂ２２１１）を用いて１２１ｄずつの７ラクシヨンに回
収した。各７ラクシヨンから１ｄを牛血清アルブミン（
シグマＡ６００３）５０μ？及び１、０　Ｍ酢酸５０μ
ｔを含むポリスチレンチューブ（ファル：＋ｙ２０５８
）（１２ｘ８７ａｍ）Ｋ移し、ＴＧＩ活性を物質及び方
法に記載した如くアッセイした。Ａ３４９ヒト肺ガン細
胞阻害を白い三角で、ミンク肺細胞（ＣＣＬ６４）のそ
れを白丸で表示する。溶媒勾配は点線（−−−−）で示
す。

第７図の２９−３４−アセトニトリルにて溶出されたＴ
ＧＩ活性のプールフラクション（１，１■）（フラクシ
ョン１４−２５）を凍結乾燥し、０．０５優のトリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）２−中に再懸濁させた。この試料を
ベックマンテーブルトップ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｔ
　Ｊ　−６）にかけ３０００　ｒｐｍで２０分間遠心し
不溶物質を除去した。２−の試料ループ付つォーターズ
（Ｗａｔｅｒ’５）Ｕ６に注入装置を用いて上記の上清
、（１，６ｄ　）　（５ｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　）を二
回に分けて注入した。次いで試料をＵボンダ、Ｑｙり（
ｕＢＯＮＤＡＰＡＫ）Ｃ□８カラム（０，７８Ｘ３０Ｉ
８ｓＩ）（ウォーターズ４８４１７４）にかけた。流速
はｌａｌ／ｍｉｎであり、ウォーターズＵＶ測定器（Ｗ
ａｔｅｒｓ　Ｍｏｄｅｌ　４８１　）を用いて感度１．
０ＡＵＦＳＫて２０６ｎｍ（−）で溶出をモニターした
。

０．０５チＴＦＡ含有２−プロノ９ノールの０−１０−
の直線濃度勾配（２０分間）次いで０．０５チＴＦＡ含
有２−プロ／Ｑノールの１０−３５％直線濃度勾配（２
２０分間）、そして０．０５チＴＦＡ含有２−プロ／Ｑ
ノールの３５〜４５−直線濃度勾配（２０分間）及び０
．０５＊ＴＦＡ含有２−ゾロノＱノールの４５〜１００
−直線濃度勾配（２０分間）ｋよって溶出を実施した。

スーパ−ラック（ＬＫＢ２２１１）　　を用いて８−ず
つのフラクションに回収した。各フラクションから１ｄ
を牛血清アルブミン（シグマ６００３　）５０μ？及び
１．　ＯＭ酢酸５０１１ｔを含むポリスチレンチューブ
（ファルコン２０５８）（１２Ｘ７５關）に移し、ＴＧ
Ｉ活性を前記の如くアッセイした。Ａ３４９ヒト肺ガン
細胞阻害を白い三角で、ミンク肺細胞（ＣＣＬ６４）の
それを白丸で表示する。溶媒勾配は点線（−一−−）で
示す。

グラフィ ＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬを等量の０．１Ｍ酢酸アンモ
ニウム、ｐＨ４，０（１，０Ｍ　　ＮａＣ２含有）に再
懸濁した。この樹脂を３時間平衡化させ４℃にて脱気し
た。この樹脂２０−を１．６Ｘ４０Ｃ１１カラム（７ア
ルーｒシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　；４１１９−０３
６２−０１）に詰めて２カラム容量の１．０Ｍ酢酸アン
モニウム、ｐＨ４，０次いで０．ＯＩＭの酢酸アンモニ
ウムで洗浄した。溶出液の電導率及びｐＨが平衡化バッ
ファ（０，０１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４，０）のそ
れと等しくなるまでカラムを洗浄した。ヒト調帯の酸性
化エタノール抽出物１ｔを１．０　Ｍ酢酸５〇−中に再
懸濁させ、カラム平衡化バッファに対して、ｐＨ及び電
導率がバッファのものに等しくなるまで４℃で透析した
。この透析した酸性化エタノール抽出物を４℃にて流速
１ｍ／分でカラムにかけ、カラムを平衡化バッファで、
２８０ｎｍに１．０ＡＵＦＳＫてそニターした）。次に
、グラジェントミキサー（ファルマシアＧＭ−１、＄１
９−０４９５−０１）を用いて０．０１−１．０Ｍ酢酸
アンモニウム、　ｐＨ４，０の上昇直線モル濃度勾配（
２００１Ｌｔ）をかけた。勾配の終了時に、更に３０ｄ
の１．０　Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４，０をカラムに
流した。２−ずつのフラクションをスーツぐ−ラツクフ
ラクションコレクター（ＬＫＢ２２１１）を使用して１
２Ｘ１００ｊｎポリスチレンチユーブ（コロンビアダイ
アグノスティクス（ＣｏｌｕｍｂｉａＤｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ　）　Ｂ　−２５６４）中に回収した。各フラク
ションから１ｍを５０μ？牛血清アルブミン（シグマＡ
６００３）及び１．０Ｍ酢酸５０μｔを含む１２Ｘ７５
ｍチューブ（ファ＃　コｙ　２０５８）　Ｋ移した。こ
れを凍結乾燥し物質及び方法の欄に記載の方法によって
ＴＧＩ活性をアッセイした。

Ａ３４９ヒト肺ガン細胞の阻害効果を白い三角でミンク
肺細胞（ＣＣＬ６４）の阻害を白丸で表示する。塩勾配
は点線（−−−）で示す。

ラフイ ＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ　　を第９図の説明中に述べ
たように調製した。ＣＭ　■及びＣＭＩＶ−を含むフラ
クションからの材料をプールし凍結乾燥して１．０Ｍ酢
酸５０ＩＩｔ中に再懸濁させ、カラム平衡化バッファに
対して、ｐＨ及び電導率がバッファのものに等しくなる
まで４℃で透析した。この試料を４℃にて流速１１／分
でカラムにかけ、カラムを１２０−の平衡化バッファで
洗浄した。ユビコード５（ＬＫＢ２１３８）、感度１．
０ＡＵＰＳ　にて２８０　ｎｍの吸収（−）をモニター
した。次Ｋ。

グラジェントミキサー（ファルマシアＧＭ−１゜＄１９
−０４９５−０１）を用いて０．０１−１．０Ｍ酢酸ア
ンモニウム、ｐＨ４，０の上昇直線モル濃度勾配（ｉ　
ｏ　ｏＩＩＩｇ）をかけた。勾配の終了時に、更に３０
ｍの１．０Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４，０をカラムに
流した。２ｄずつのフラクションをスーツｑ−ラックフ
ラクションコレクター（ＬＫＢ２２１１）を使用して１
２Ｘ１０（１ｍポリスチレンチューブ（コロンビアダイ
アグノステイクスＢ−２５６４）中に回収した。各フラ
クションからＩＩＩｔを５０μ？牛血清アルブミン（シ
グマＡ６００３）及び１．０Ｍ酢酸５０μｔを含む１２
Ｘ７５Ｍチューブ（ファルコン２０５８）に移した。こ
れを凍結乾燥し物質及び方法の欄に記載の方法によって
ＴＧＩ活性をアッセイした。Ａ３４９ヒト肺ガン細胞の
阻害を白い三角で、ミンク肺細胞（ＣＣＬ６４）の阻害
を白丸で表示する。塩勾配は点線（−−−）で示す。

実験の第二部に記載したように調製されたタン１９り質
抽出物１．６５■を２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４
，５）に対して徹底的に透析し、２０ｍＭ酢酸アンモニ
ウム（ｐＨ４，５）で予め平衡化されたＣＭ−ＴＲＩＳ
ＡＣＲＹＬの５１Ｒｔカラム（ＩＸ６．３α）にかけ１
．６５ｍずつの７ラクシヨン（１２×１１００ＪＩ、ｆ
？リスチレンチューブ）に回収した。試料添加後に、１
ｍ光路石英キュベツトを用いてパラシュ・アンド−ｏ−
ム（Ｂａｕｓｃｈ　ａｎｄ　Ｌａｍｂ）　１００１分光
光度計により測定された２　８０　ｎｍに於ける吸収が
４−スジイン値（０，００３よシ小）に戻るまで、カラ
ムを２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４，５で洗浄した。

直線塩勾配（２０ｍＭ酢酸アンモニウム、　ｐＨ４，５
中で０−１．０　Ｍ　ＮａＣ１＞をかけ、上記のように
して１．６５ｄずつのフラクションの２８０ｎｍの吸収
を測定した。各フラクションから１０μｔを５０μｍ牛
血清アルブミン（シグマＡ６００３）及び１．０Ｍ酢酸
５０μｔを含む１２×７５ｎチユーブに移し、凍結乾燥
し、物質及び方法の欄に記載された方法に従ってＡ３４
９ヒト肺ガン細胞に対する阻害活性（・・・）アッセイ
を行った。適当な試料を水で１００ＡＫ希釈したものの
電導率によシＮａＣｔ勾配（−−−）を測定した（ＹＳ
Ｉモデル３２電導率測定計）。

実験の第二部に記載したように、調製されたり／バク質
１．６５１ｆｆｌＦを２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−圧ｔ　
（ｐＨ８，０）ｋ対して徹底的に透析し３．００Ｏｆで
１５分間遠心にかけ透明にした。樹脂をまず１．０　Ｍ
　ＮａＣ１含有２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ　（ｐ
Ｈ８，０）中で３時間、次いで０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ　
−１４Ｃｔ（ｐＨ８，０）中で１時間懸濁させてＤＥＡ
Ｅ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬを調製した。

沈降した樹脂をブフナー漏斗上で１０００−の水で洗浄
し、最後Ｋ　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−１−ＩＣ６（ｐ
Ｈ８，０）中に再懸濁させ脱気し５ｍカラム（１ｘ６．
３ｍ）Ｋ注ぎ、樹脂を２０　ｍＭ　Ｔｒ！、ｓ　−ＨＣ
Ｌ（ｐＨ８，０）で平衡化した。透明になった試料をカ
ラムにかけ、２８０　ｎｍに於ける吸収（−）　、　ミ
ンク肺細胞（○・・・○）に対する阻害活性及びＮａＣ
１勾配（−−−）を第１１図及び物質及び方法に於いて
記載したように測定した。ＮａＣ２勾配は２０ｍＭＴｒ
ｉｓ　−ＨＣＬ　（ｐＨ８，０）中でＯから１．０Ｍ　
ＮａＣ４の範囲で実施した。

第１３図　陽イオン交換クロマトグラフィ（４℃）ＣＭ
−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬを最終平衡化バッファが２０ｍＭ
酢酸アンモニウム、ｐＨ４，５であること以外は第９図
の説明に於いて記載した如く調製した。前述のように調
製したタンパク質抽出物（９６９ＩＩＦ）を２０ｍＭ酢
酸アンモニウム（ｐＨ４，５）に対して徹底的に透析し
、２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，５）　　中のＣ
Ｍ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬの１５ｄカラム（１，５Ｘ　８
．５ａＲ）にかけた。２８０　ｎｍに於ける吸収（−）
及びＡ３４９ヒト肺ガン細胞に対する阻害活性（Ｖ・・
・Ｖ・・・）を第１１図の説明に於いて記載した如く測
定した。ＮａＣｔの０〜１．０Ｍの直線勾配の容量は１
５０ｄでおシンラクション容量は３．７ｄであった。

ヒト腰帯のＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬを用いた陽イオン
交換クロマトグラフィ（第１３図参照）のフラクション
５９〜７８を集め、それを凍結乾燥し、０．０５−のト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１０ＩＲｔ中に再懸濁させた
。２ゴの試料ループ付つォーターズ（Ｗａｔｅｒ’ｓ）
　Ｕ６に注入装置を用いて２４０ｐ？のタン／ｅり質を
含む透析物質の総計２０％をミロに分けて注入した。次
いで試料をｕ　ＢＯＮＤＡＰＡＫ　Ｃ□８カラム（Ｑ、
３９ｘ３０ａＲ）　（ウォーターズ２７３２４）ｋかけ
た。流速は１　ｍ　／　ｍ　ｉ　ｎであり、ウォーター
ズＵＶ測定器（Ｗａｔｅｒｓ　Ｍｏｄｅｌ　４８１　）
を用いて感度０．５ＡＵＦＳ　にて２０６ｎｍ（−）で
溶出をモニターした。０．０５＊ＴＦＡ含有アセトニト
リルの０−２５％の増加直ＩＩｉ！濃度勾配（５分間）
、次すで０．０５＊ＴＦＡ含有アセトニトリルの２５〜
４５％直線濃度勾配（１５分間）、そして０．０５＊Ｔ
ＦＡ含有アセトニトリルの４５〜８０％直線濃度勾配（
１５分間）、最後に０．０５＊ＴＦＡ含有アセトニトリ
ル８Ｏ−Ｚｏｏ％直線濃度勾配（５分間）Ｋよって溶出
を実施した。スーパーラック（ＬＫＢ２２１１）を用い
てｌｄずつの７２クシヨンに回収した。各フラクション
から５００μｔを牛血清アルブミン（シグマＡＯ２８１
）５０μ？及び１．０Ｍ酢酸５０μｔを含むポリスチレ
ンチューブ（ファルコン２０５８）（１２Ｘ７５Ｍ）に
移し、ＴＧＩ活性を物質及び方法に記載した如くアッセ
イした。Ａ３４９ヒト肺ガン細胞阻害を白い三角で、ミ
ンク肺細胞（ＣＣＬ６４）のそれを白丸で表示する。溶
媒勾配は点ｍ（−−−−）で示す。

発明の詳細な説明 複数のポリペプチドを含むヒト組織由来の酸性化エタノ
ール抽出物を調製した。この抽出物の各ポリペプチドは
分子量約２０，０００ダルトン未満であり、各々は、正
常ヒト包皮フィプロブシストの増殖を元通させるが、ヒ
ト腫瘍細胞と樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）との増
殖を阻害する特性をもつ。酸性化エタノール抽出物を約
１００℃に加熱し約３分間維持しても、又は、抽出物に
約１．０モル濃度までの酢酸を添加しても、ヒト腫瘍細
胞増殖の阻害活性は破壊されない。酸性化エタノール抽
出物を約２３℃でなく約４℃で調製すると該抽出物の阻
害活性が増進される。好適具体例によればヒト組織はヒ
トａ帯であるが、ヒト胎盤の如き別の組織の使用も勿論
可能である。

また、実質的に血液全部と細胞外可溶性成分全部と細胞
内可溶性成分全部とを除去すべく処理したヒト調帯から
、少なくとも１つの酸性ポリペプチドを含む酸性化エタ
ノール抽出物を調製した。

このポリペプチドは非還元性条件下で約３０，０００ダ
ルトン未満の見掛は分子量を示し、正常ヒト包皮フイブ
ロブラストの増殖を大過させるがヒト腫瘍細胞と樹立ミ
ンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）との増殖を阻害する特性を
本つ。酸性化エタノール抽出物を約１００℃に加熱し約
３分間維持しても酸性化エタノール抽出物に約１．０モ
ル濃度までの酢酸を添加してもヒト腫瘍細胞増殖の阻害
活性は破壊されない。

酸性化エタノール抽出物の種々の成分を調製するＫは、
当業者に公知の技術、例えば、高性能液体クロマトグラ
フィー及びカチオン交換クロマトグラフィーを使用する
とよい。これにより、ヒト腫瘍細胞と樹立ミンク肺細胞
系（ＣＣＬ６４）とに対する増殖阻害性をもちヒト包皮
フイブロプ２ストの増殖を阻害しない見掛は分子量約５
　、０００〜１６．０００ダルトンの少なくとも１つの
ポリペプチドを含む物質が調製される。この物質は、組
織由来増殖阻害物質（ＴＧＩ−１）と指称され、酸性化
エタノール抽出物の高性能液体クロマトグラフィーによ
って回収できる。即ち、Ｏ，ＯＳ＊のトリフルオロ酢酸
を含有するアセトニトリルの約２６〜３４％アセトニト
リル直線勾配、及び、０．０５％トリフルオロ酢酸を含
有する２−プロパノールの約１７〜２３チ２−プロ／９
ノール直線勾配で酸性化エタノール抽出物を高性能液体
クロマトグラフィーＫかけると、所定活性として回収で
きる。

ＴＧＩ　−１を更に、０．０５％トリフルオロ酢酸を含
む２−プロ／９ノール直線勾配の高性能液体クロマトグ
ラフィーで溶出させると２つの活性成分に分割される。

１つの活性は約２６％２−プロ、ｅノールで溶出されヒ
ト腫瘍細胞の増殖を優先的に阻害するが樹立ミンク肺細
胞系（ＣＣＬ６４）の増殖を阻害しない。もう１つの活
性は約２３１２−プロパノールで溶出され樹立ミンク肺
細胞系（ＣＣＬ６４）の増殖を優先的に阻害するがヒト
腫瘍細胞の増殖を阻害しない。

また、組織由来増殖阻害物質（ＴＧＩ）と指称され、少
なくとも１つのポリペプチドから成シこのポリペプチド
が同じく正常ヒト包皮フィブロブラストの増殖を阻害し
ないがヒト腫瘍細胞と樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４
）とに対する増殖阻害性をもつ別の物質が調製される。

ＴＧＩの見掛は分子量は約２０，０００〜３０，０００
ダルトンの範囲であ、ｂ、ｏ、ｏｓ＊のトリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルの約２８〜３４−アセトニトリ
ル直線勾配の高性能液体クラマドグラフィーによって酸
性化エタノール抽出物から所定活性として回収され、ま
た約０．６〜０．７　Ｍ　ＮａＣｔのＮａＣ１直線勾配
を溶出するとカチオン交換樹脂例えばＣＭ−）リスアク
リル（ＴＲＹＳＡＣＲＹＬ　）樹脂から単一ピークの所
定活性として回収される。

更に、組織由来増殖阻害物質−２（ＴＧＩ　−２）と指
称される物質が得られる。この物質は、ヒト腫瘍細胞と
樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）とに対する増殖阻害
性を有するが正常ヒト包皮フィブロシラストの増殖を阻
害しない見掛は分子量約５．０００〜１６，０００ダル
トンのポリペプチドを１つ以上含んでおシ、０．０５％
）！Ｊフルオロ酢酸含有のアセトニトリルの約３５〜３
９％アセトニトリル直線勾配の高性能液体クロマトグラ
フィーによって酸性化エタノール抽出物から所定活性と
して回収され、また、０．０５１）！Ｊフルオロ酢酸を
含む２−プロパノールの約２３〜２７％２−プロパノー
ル直線勾配の高性能液体クロマトグラフィーによって酸
性化エタノール抽出物から所定活性として回収される。

更に、酸性化エタノール抽出物のカチオン交換クロマト
グラフィーによって、ポリペプチドの不均一集合体、即
ちＣＭ−Ｉ　、ＣＭ−ＩＩ　、ＣＭ−１及びＣＭ−■が
回収される。各集団はヒト腫瘍細胞の増殖阻害性を有し
ており、ＣＭ−１以外の全部が樹立ミンク肺細胞系（Ｃ
ＣＬ６４）の増殖を実質的に阻害する特性を有しており
、いずれも正常ヒト包皮フイブロブラストの増殖を阻害
しない。

ＴＧＩ−１、ＴＧＩ　、ＴＧＩ−２又はＣＭ−ｉ、ＣＭ
−ｎ、ＣＭ−１１１及びＣＭ−ＩＶと指体されるポリペ
プチドの不均一集合体又はこれらの種々の組合せは、薬
剤組成物として使用され得る。薬剤組成物は、有効量の
ＴＧＩ−１、ＴＧＩ　、ＴＧＩ−２又はＣＭ−１、ＣＭ
−Ｕ　、ＣＭ−Ｉ［１及びＣＭ−ＩＶと指体されるポリ
ペプチドの不均一集合体を適当な薬剤担体と共に含む。

種々の腫瘍増殖阻害物質の有効量は、処置の指示、患者
又は腫瘍の発達時期次第で当業者に公知の方法で変更す
るとよい。また、生理食塩水又はその他の水溶液、ゲル
、クリーム等の適当な担体も当業者に公知である。

ＴＧＩ−１，ＴＧＩ、ＴＧＩ−２又はＣＭ−４，ＣＭ−
ｎ、ｃＭ−ｍ及びＣＭ−■と指体されるポリペプチドの
不均一集合体は、ヒト腫瘍細胞例えば癌腫、黒色腫又は
白血病細胞の増殖阻害に使用され得る。

このためには、増殖阻害に有効な量のＴＧＩ−１゜ＴＧ
Ｉ　、ＴＧＩ−２又はＣＭ−Ｉ、ＣＭ−Ｉ［、ＣＭ−Ｉ
ＩＩ及びＣＭ−Ｒ／　と指体するポリペプチドの不均一
集合体を細胞と接触させる。ＴＧＩ　−１、ＴＧＩ　、
ＴＧＩ−２又はＣＭ−１、ＣＭ−ＩＩ　、ＣＭ−ＩＩＩ
及びＣＭ−■と指体するポリペプチドの不均一集合体は
また火傷の治療又は傷の治癒を助けるために使用される
。

このためには、有効量のＴＧＩ−１、ＴＧＩ　、ＴＧＩ
−２又はＣＭ−１、ＣＭ−ＩＩ、ＣＭ−ＩＩ及びＣＭ−
ＩＶと指体するポリペプチドの不均一集合体と適当な薬
剤担体とを含有する薬剤組成物を火傷又は傷と接触させ
る。

本発明によれば、複数のポリペプチドを含んでおシ各ポ
リペプチドが約２０．０００ダルトン未満のｌ正常ヒト
包皮フイブロブラストの増殖を元通させるような酸性化
エタノール抽出物をヒト組織からｖ４製する方法が開示
される。該方法では、適当な条件下で、例えば組織の凍
結−解凍又は均質化によって組織を処理して溶解細胞と
溶解細胞由来の溶解タン、ｅり質とを生成し、溶解タン
パク質を回収し、溶解タン１９り質から別個に見掛は分
子量約２０，０００ダルトン采満のポリペプチドを分離
回収し、分離回収したポリペプチドをアッセイしてヒト
腫瘍細胞の増殖阻害又は樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６
４）の増殖阻害又は正常ヒト包皮フイブロブラストの増
殖先進を示すポリペプチドを同定し、このように同定さ
れたポリペプチドを含有する酸性化エタノール抽出物を
回収する。

本発明方法の好ましい実施態様によれば、組織の処理は
、凍結組織を約４℃で適当な時間例えば６時間を要して
解凍し、約４℃のエタノール含有の適当な酸性抽出用バ
ッファーに組織を懸濁させ、適当な時間を要して組織を
均質化して均質組織を形成し、均質組織を約４℃で適当
な時間例えば１晩攪拌して溶解細胞を生成し且つ細胞由
来のエタノｑり質を可溶化するステップから成る。

本発明によれば、好ましい酸性抽出バッファは、約３７
５ｄの９５（容量／容量）チェタノールと、７．５−の
濃塩酸と３３岬のフフ化フェニルメチルスルホニル（Ｐ
ＭＳＦ）、！＝１ｍのアプロチニン（シグマＡ６０１２
　、　０．９％ＮａＣ２及びｏ、９ｓベンジルアルコー
ル中で９．８ユニツト／コのトリプシン阻害単位をもつ
）とを約１９２−の４℃蒸留水と混合したものである。

本発明の好ましい実施態様によれば、可溶タンパク質の
回収は、例えば遠心分離によって溶解細胞から溶解タン
、ｅり質を分離し、例えば水酸化アンモニウムの添加に
よってｐＨを約５．０に上昇させ、例えば遠心分離によ
って沈殿物を除去し、例えばアルコール、エーテル又は
双方の添加によって上清からタンパク質を沈殿させ、例
えば溶液を約４℃で約４８時間静置し遠心分離すること
によって溶液から沈殿物を除去し、沈殿物から有機相を
除去し、例えば換気フード（ｆｕｍｅ　ｆｏｏｄ）で沈
殿物を乾燥させ、乾燥沈殿物を適当な溶媒例えば１Ｍ酢
酸に再溶解し、例えば透析によって低分子量溶質を溶液
から取出すステップから成る。

本発明は更に、見掛は分子量が約２０　、０００〜３０
．０００ダルトンでＪｆｉヒト腫瘍細胞と樹立ミンク肺
細胞系（ＣＣＬ６４）との増殖阻害性と正常ヒト包皮フ
イブロブラストの増殖先進性とをもつ組織由来の増殖阻
害物質（ＴＧＩ）を含む酸性化エタノール抽出物をヒト
調帯から調製する方法を開示している。この方法では、
適当な条件下で、臍帯組織から静脈と動脈とを除去し、
痕跡血液を完全に除去すべく組織を洗浄し、溶解細胞を
生成すべく組織を処理し、細胞由来の可溶性タン／Ｑり
質を除去し、酸性化エタノール抽出によって残留エタノ
ｑり質を可溶化し分離して溶解エタノＱり質を生成し、
見掛は分子量約２０　、０００〜３０　、０００ダルト
ンのＴＧＩを溶解エタノ９り質から分離回収し、分離回
収したＴＧＩを検定してヒト腫瘍細胞の増殖阻害、樹立
ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の増殖阻害及び正常ヒト
包皮フィブロブラストの増殖先進を示す活性を同定し、
前記の如く同定されたＴＧＩを含有する酸性エタノール
抽出物を回収する。

本発明の好適実施態様によれば、組織の処理は、凍結組
織を約４℃で適当な時間例えば２時間を要して解凍し、
約４℃で切開して静脈と動脈とを除去し、約４℃の適当
なバッファに組織を懸濁させ、適当な時間を要して組織
を均質化して溶解細胞と可溶性タンパク質とを形成し、
例えば遠心分離によって溶解細胞から可溶性エタノ９り
質を分離し、約４℃の抽出バッファ中で溶解細胞を適当
な時間例えば１晩攪拌して溶解化したエタノ２り質を生
成するステップから成る。

本発明の好ましい酸性抽出用バッファは、約３７５−の
９５（容量／容量）％のエタノールと７．５−の濃塩酸
と３３りのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ
）、！＝ｌＩｔのアプロチニン（ＳｉｇｍａＡ６０１２
．０．９　％　ＮａＣｔ及びＯ，’ｌベンジルアルコー
ル中で９．８ユニット／−のトリプシン阻害単位を４つ
）とを約１９２＋ｄの４℃蒸留水に混合したものである
。

本発明の好ましい実施態様によれば、可溶タンパク質の
回収が、例えば遠心分離によって溶解細胞から溶解タン
ツク質を分離し、例えば水酸化アンモニウムの添加によ
ってｐＨを約５．０に上昇させ、例えば遠心分離によっ
て沈殿物を除去し、例えばアルコール、エーテル又は双
方の添加によって上清からエタノぐり質を沈殿させ、例
えば溶液を約４℃で約４８時間静置し遠心分離すること
によって溶液から沈殿物を除去し、沈殿物から有機相を
除去し、例えば換気フード（ｆｕｍｅ　ｆｏｏｄ）で沈
殿物を乾燥させ、乾燥沈殿物を適当な溶媒例えば１Ｍ酢
酸に再溶解し、例えば透析によって低分子量溶質を溶液
から取出すステップからなる。

本発明の好適実施態様によれば、溶解エタノ？り質から
のポリペプチドの別個の分離回収が、例えばパイオーデ
ル（Ｂｉｏ−αＩ）Ｐ　−１０樹脂を用いたエタノ？り
質のゲル沖過クロマドグ２フィーによる。

本発明の好適実施態様によれば、ポリペプチドの検定が
、ヒト腫瘍細胞例えばヒト肺癌系（Ａ５４９）又は樹立
ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）又は正常ヒト包皮フィブ
ロプラス）　（ＨｕＦ）を個別に適当な条件下で適当な
時間にわたシポリペプチドと接触させヒト腫瘍細胞の増
殖阻害又は樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の増殖阻
害又は正常ヒト包皮フィブロブラストの増殖亢進を示す
ポリペプチドを同定するステップから成る。

組織由来の増殖阻害物質−１（ＴＧＩ−１）と指称され
る物質の調製方法は、先ず酸性化エタノール抽出物を調
製し、次に酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマ
ドグ２フイー例えば逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーに
よって、（１）０．０５％トリフルオロ酢酸含有のアセ
トニトリルの約２６〜３４チアセトニトリル直線勾配か
又は（Ｉ＋）　０．０５％トリフルオロ酢酸含有の２−
プロパｑノールの約１７．２３１２−プロパノール直線
勾配を用い、酸性化エタノール抽出物からＴＧＩ−１を
所定活性として回収することから成る。

組織由来の増殖阻害物質（ＴＧＩ）と指称される物質の
調製方法は、先ず酸性化エタノール抽出物を調製し、次
に酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマドグ２フ
イー例えば逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって、
０．０５９６トリフルオロ酢酸含有のアセトニトリルの
約２８〜３４チアセトニトリル直線勾配を用いて、酸性
化エタノール抽出物からＴＧＩを所定活性として回収す
るか、又は、約０．６−０．７　Ｍ　ＮａＣ１のＮａＣ
１直線勾配で溶出させカチオン交換樹脂例えばＣＭ−ト
ＩＪスアクリルから単一活性ピークとして回収すること
から成る。

組織由来の増殖阻害物質−２（ＴＧＩ−２）と指称され
る物質の調製方法は、先ず酸性化エタノール抽出物を調
製し、次に酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマ
トグラフィー例えば逆相Ｉ（ＰＬＣクロマトグラフィー
によって、（１）０．０５％トリフルオロ酢酸含有のア
セトニトリルの約３５〜３９チアセトニトリル直線勾配
か又は（ＩＩ）　０．０５％トリフルオロ酢酸含有の２
−プロ／Ｑノールの約２３〜２７％２−プロ・Ｑノール
直線勾配を用い、酸性化エタノール抽出物からＴＧＩ−
２を所定活性として回収することから成る。

ＣＭ−１、ＣＭ−ＩＩ　、ＣＭ−ＩｌｌびＣＭ−ＩＶと
指称されるポリペプチドの不均一集合体の調製方法では
、先ず酸性化エタノール抽出物を調製し、次にイオン交
換クロマトグラフィー例えばカチオン交換クロマトグラ
フィーによって酸性化エタノール抽出物からポリペプチ
ド不均一集合体を回収する。

本発明によれば、腫瘍の存在の検出方法が開示される。

該方法は、被検者から採取したサンプル例えば血液、羊
水、腹膜液、腹腔液、脳を髄液又は尿中に存在するＴＧ
Ｉ−１、ＴＧＩ、ＴＧＩ−２又はＣＭ−１、ＣＭ−ｎ　
、ＣＭ−Ｉｌｌ及びＣＭ−■と指称されるポリペプチド
の不均一集合体の量を定量的に測定し、この測定量と正
常被検者のサンプル中の同じ物質の存在量とを比較する
ことから成り、この量の有意差、例えば有意な増量は腫
瘍の存在の指標となる。

本発明によれば、腫瘍の存在のまた別の検出方法が開示
される。該方法は、被検者のサンプル中に存在するＴＧ
Ｉ　−１、ＴＧＩ　、ＴＧＩ　−２又はｌ−Ｉ　、ＣＭ
−ＩＩ　、ＣＭ−ＩＩＩ及びＣＭ　−■と指称するポリ
ペプチドの不均一集合体と形質転換増殖因子アルファ（
ＴＧＦ−α）との双方を別々に定量的に測定し、該サン
プル中のＴＧＩ−１、ＴＧＩ　。

ＴＧＩ−２又はＣＭ−ｉ　、ＣＭ−ＩＩ　、ＣＭ−１［
及びＣＭ−■と指称するポリペプチドの不均一集合体の
存在量の該サンプル中のＴＧＩ−αの存在量に対する比
率を決定し、正常被検者のサンプルについて上記同様の
比率を決定し、被検者のサンプルで得られた比率と正常
被検者のサンプルで得られた比率とを比較する。両者の
値の有意な変化が腫瘍の存在の指標となる。

本発明によれば、腫瘍の減決定方法が提供される。該方
法では、腫抑をもつ被検者のサンプルについてＴＧＩ−
１、ＴＧＩ　、ＴＧＩ−２又はＣＭ−Ｉ。

ＣＭ−］１　、ＣＭ−［１及びＣＭ−１’／と指称する
ポリペプチドの不均一集合体のうちの１種以上の存在を
測定する。これらの成分の特異的結合例えばＴＧＩとＣ
Ｍ−［又はＴＧＩ−１とＴＧＩ−２の如き結合の有無に
よって特定腫瘍型例えば黒色腫又は癌腫を判定できる。

最後に、もう一つの腫瘍の槃決定方法が開示される。該
方法では、腫瘍をもつ被検者のサンプルについてサンプ
ル中のＴＧＩ−１、ＴＧＩ　、ＴＧＩ−２又はＣＭ−ｉ
　、ＣＭ−Ｉｆ　、ＣＭ−Ｉ［１及びＣＭ−■と指称さ
れるポリペプチドの不均一集合体の存在量を定量的に測
定し、夫々の特異的な量又は相対量の存在、例えばＴＧ
Ｉの量の有意な増加、又はＴＧＩ−１対ＣＭ−Ｉ［の比
の如き比の有意な変化から腫瘍の型を判定する。

実験の第１部でｒＴＧＩ活性」なる用語は、特に注釈が
なければＴＧＩ−１、ＴＧＩ−２、ＣＭ−Ｉ。

ＣＭ−■、ＣＭ−ＩＩＩ及びＣＭ−■の活性を意味する
。

単離 デイボレン（Ｄａｖｏｒｅｎ　）等、バイオケミカル・
バイオフイジカＡ／、アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）６３：１５０（１９６２）及び
ロパート（Ｒｏｂｅｒｔ）等、プロシーデインダス・オ
プ・ナショナル・アカデミツク・サイエフ　ス（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、）米国、７７
：３４９４（１９８０）によシ記載の酸／エタノール抽
出法の変ｉを用いヒトＭ帯又は胎盤の組織を抽出した。

抽出用バッファーは、３７５ｍの９５（容量／容量）％
エタノール（）♀ンクチリアス、標準強度１９０、ニー
・ニス・インダストリアル・ケミカルズ（Ｕ、　Ｓ、　
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｃｈｅｒｎｉｃａｌｓ）＋≠Ｕ
Ｎ　１１７０と７．５ｄの濃塩酸と３３ｆｎｇの７ツ化
フエニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（シグマＰ−７
６２７）と１−のアブ四テニン（シダＷＡ６０１２　、
０．９チＮ　ａｃＬ及ヒ０．９％ベンジルアルコール中
で１９．８ユニツト／Ｉｌｔのトリプシン阻害単位をも
つ）とを４℃の蒸留水１９２ｍと混合したものである。

４００〜６００ｔの凍結ヒト腰帯又は胎盤（アドバンス
ト・バイオテクノロジイー（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））（−８０℃で保存）を４
℃で６時間を要して解凍した。解凍した組織を４℃の冷
却キュイジナール（Ｃｕ１ｓｉｎａｒｔ　）フードプロ
セッサ（型式ＤＬＣ−７−ＰＲＯ）に入れ、４℃の抽出
用バッファ２００艷に懸濁した。懸濁した組織をフード
プロセッサで均質化した。最初の１分間の均質化によっ
て懸濁液が黄白色（クリームホワイト）になった。との
白色懸濁液に４℃の抽出用バッファを更に２０〇−加え
た。懸濁液は暗褐色に変色した。組織懸濁液を４℃で合
計１０分間均質化した。抽出用バッファをこの均質組織
混合物に添加し、組織均質液１２当シの最終容量を６ｍ
ｌとした。

均質組織懸濁液を３インチの撹拌棒を備えた大型４ｔビ
ーカーに移し、ラブ・ライン・マルチマグネスチア（Ｌ
ａｂ−１ｉｎｅ　Ｍｕｌｔｉｍａｇｎｅｓｔｉｒ）多段
ミキサー、型式＋１２７８　、の％最大攪拌能力で攪拌
した。４℃で攪拌を伴って１晩抽出し、均質液を１を遠
心ボトル（ソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）　）に移し、ソ
ーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）　Ｈ−６０００Ａｏ−夕を備
えたソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ−３Ｂ遠心機で４
℃で３５０Ｏｒｐｍ（ＲＣＦ＝３５０）を３０分間維持
して遠心した。

上清を大型４ｔビーカーに移し、濃水酸化アンモニウム
を徐々に添加してｐＨ５，０に調整した。ｐＨが上昇す
ると上清が茶色から橙色に変色する。２．０Ｍ酢酸アン
モニウム、　りＨ５，２を総量の１％になるように添加
し、溶液を沈殿させた。ソーパルＲＣ−３Ｂで４℃で４
５０　Ｏｒｐｍ（ＲＣＦ　＝５９００）で４時間遠心し
て沈殿物を除去した。上清を大型６ｔフラスコに移し、
４倍容の無水エーテル（−２０℃）（ベイカー（Ｂａｋ
ｅｒ）　９２４４−３　）と２倍容の９５チエタノール
（４℃）とを加えた。混合物を一２２０℃で４８時間靜
漬し生じた沈殿物を沈降させた。

４８時間の沈殿の終了後、エーテル化した材料を換気フ
ードで室温に戻した。酸性化エタノール抽出物を室温ま
で加温すると、沈殿物の凝集が促進される。工゛−チル
とエタノールとの透明有機相を水吸引器で除去し、沈殿
物を換気フードに数時間維持して残留有機相を蒸発させ
た。「乾燥した」沈殿物を１．０Ｍ酢酸に溶解し、排除
限界分子量３５００の透析膜（スペクトロポー（Ｓｐｅ
ｃｔｒｏｐｏｒ）３、スペクトラム・メジカル・インダ
ストリー（ＳｐｅｃｔｒｕｎＭｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉｅｓ）、　ｏスΦアンジェルス、カリフォルニ
ア）を用い１，０Ｍ酢酸（ベイカー４９５０７−５　）
　Ｋ大まかに透析した。透析した酸性化エタノール抽出
物を２５０ｍのコーニング（Ｃｏｒｎ　ｉｎｇ）円錐遠
心管（コー二：ｙグ２５３５０）で凍結乾燥し、未精製
の酸性化エタノール抽出物として保存した。

酸性化エタノール抽出物からＴＧＩを沈殿させる変形手
順として、４倍容のエーテルと２倍容のエタノールとの
添加に代えて、４℃で２倍容のエタノールだけを添加し
てもよい。酸性化エタノール抽出物沈殿ステップからエ
ーテルを削除する利点は、引火性の溶媒を要するステッ
プが削除゛されるので、大量の材料の処理及び大規模化
に伴なう難点が解消されることである。

ゲ／Ｉ／濾過クロマトグラフィー 凍結乾燥した酸性化エタノール粗抽出物を１．０Ｍ酢酸
（１０−３０岬／ｌｄ　’）　Ｋ再懸濁させ、ソーノ々
ルＨ−６０００Ａロータを備え九ソーパルＲＣ−３Ｂ遠
心機で４℃で３５００ｒｐｍで３０分間遠心して清澄化
した。次にサンプルをカラムで処理する。２３℃又は４
℃の１．０　Ｍ酢酸を用いパイオーデルＰ１０，１００
−２００メツシュ（バイオーラッＦ’（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
）：１５０−１０４０）で１ｏｏ〜１５０−のサンプル
をクロマトグラフィーにかけた。

カラム（１４Ｘ１００α）（アミコンθｍ１ｃｏｎ　）
＊４８６０１２）は２３℃又は４℃Ｏ１，ＯＭ酢酸中に
、平衡しガス抜きしたパイオーゲルＰＩＯを１３．８を
収容していた。２１ｎｆ／ａｄのブルーデキストラン（
シダｆ＋Ｄ５７５１　）を含む１．０Ｍ酢酸５ｏ−を添
加して間隙体積を測定した。較正後、ｌＱＱｍｙ／ゴの
ウシ血清アルブミン（シグマ４ＰＡ−４５０３）を含む
１．０Ｍ酢酸１００−を加え続いて１．０Ｍ酢酸で大ま
かに洗浄してカラムを「コンデショニング」した。

サンプルを適用した後、Ｃタイプ収集ラックを備えたス
ノーラック（５ｕｐｅｒＲａｃ）（ＬＫＢ　２２１１　
）を使用し、各ＩＬの両分を、２ｔプラスチック組織培
養ローラボトル（ファル＝ｒｙ　（Ｆａｌｃｏｎ）　＋
　３２０７　）釦流量７−／分で収集した。画分を吸光
範囲２．０ＡＵＰＳに設定した２　８０　ｎｍのユビコ
ード（Ｕｖｉｃｏｒｄ）　Ｓ　（ＬＫＢ　２１３８　）
でモニターしシングルチャネルチャートレコーダ（ＬＫ
Ｂ２２１０）で記録した。１ｍずつの部分サンプルを各
画分から取出し、凍結乾燥し、後述の如くにＴＧＩ活性
を検定した。各画分の残シは、ヴアーチス（Ｖｉｒｔｉ
ｓ）凍結装置２４型を使用し２を凍結乾燥ジャー（ヴア
ーチス−＃＝６５０３−２０１１ｒ５）Ｃ’凍結乾燥し
た。

高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）パイオーデ
ルＰ−１０カラムから得たＴＧＩ活性を含む個々の画分
を凍結乾燥し、各画分中のエタノｑり質の量に応じて１
〜１０−の０．０５％）リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ピ
アス（Ｐｉｅｒｃｅ）＄２８９０１　）に再懸濁させた
。ＨＰＬＣ用の水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水精製システムで
得た。全てのＨＰＬＣクロマトグラフィー処理に於いて
出発ノ々ツファは０．０５％ＴＦＡ含有のＭｉｌｌｉ−
Ｑ水から成る。注入以前に、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ　）卓上遠心機（ベックマンＴＪ−６）で３００Ｏｒ
ｐｍで２０分間サンプルを遠心して不溶物質を除去した
。上清をウォーターズＵボンダ、Ｑｙり（Ｗａｔｅｒｓ
　ｕＢｏｎｄａｐａｋ）分析Ｃ□８カラム（０，３９Ｘ
３０Ｉ２）　（Ｗａｔｅｒｓ　ＰＮ２７３２４　）か又
は準完成（ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）カラム（
０，７８Ｘ３０ｎ）（Ｗａｔｅｒｓ　ＰＮ８４１７６　
）に注入した。いずれを使用するかは個々の実験で特定
する。ウォータース全自動勾配制御装置（ウォータース
　５１０型）をカラム溶出に使用し、２０６ｎｍに設定
した可変波長Ｕ　、Ｖ　、デテクタ（ウォータースラム
ダマツクス（Ｌｏｍｂｄａ　−ｍａｘ）　４８１型）で
モニタした。溶出用溶媒として０．０５％ＴＦＡ含有の
アセトニトリル（ベイカー９０１７−３）又は２−プロ
ノノール（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）　Ａ　４５２
　）を使用した。

画分を、Ｂ型収集ラックを備えたスー／Ｑ−ラック（Ｓ
ｕｐｅｒＲａｃ　）　（ＬＫＢ　２２１１　）によって
１３Ｘ１００１ｍ又は１６Ｘ１００ｍのシリカガラス（
ｓｉｌｆｃｏｎｉｚｅｄ　）（ピアス、アクアシル（Ａ
ｑｕａｓｉｌ）　＄４２７９９　）試験管に収集した。

各収集画分の部分サンプルを採取し後述の如（ＴＧＩ活
性を検定した。

酸性化エタノール及びエーテル抽出により得られた凍結
乾燥物質とパイオーデルｐ−ｉｏゲル濾過りμマドグラ
フィーより得られた種々の凍結乾燥画分との双方を別々
にイオン交換クロマトグラフィーで処理した。これらの
処理ではＣＭ、ＳＰ及びＤＥＡＥ−）　！Ｊスアクリル
（ＬＫＢ）イオン交換樹脂を使用した。クロマトグラフ
ィー用サンプルを１．０Ｍ酢酸で最終濃度約２０ｔｎｇ
／−に希釈した。

ｐＨと導電率との双方が出発（平衡）バッファに等しく
なるまでサンプルを４℃で透析した。全部のイオン交換
クロマトグラフィー処理を４℃で実施した。

樹脂を１．０　Ｍ　ＮａＣｌを含む等容の０．１　Ｍ酢
酸アンモニウム、ｐＨ４，０に水性懸濁液として懸濁さ
せた。樹脂を少なくとも３時間平衡させ、４℃でガス抜
きした。２０ｍの樹脂を１．６Ｘ２０αのカラム（ファ
、＋＋／マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）Φ１９−０３６
２−０１）に充填しカラムの２倍容の１．０Ｍ酢酸アン
モニウム、　ｐＨ４，０、及び０．０１Ｍ酢酸アンモニ
ウム、　ｐＨ４，０、で順次洗浄した。流出液が平衡用
バッファー（例えば０．０１Ｍ酢酸アンモニウム。

フィッシャーＡ６３７）、ｐＨ４，０の導電率に正確に
一致するまでカラムを洗浄した。サンプルを流量１ｍ／
分で樹脂に与え（Ｉｇｍ／２０＋ｊ樹脂）、光学濃度が
（例えば光学濃度Ｏの付近で）平準化するまで平衡バッ
ファで洗浄し、濃度ｏ、ｏｉ〜１．０Ｍ酢酸アンモニウ
ム、ｐＨ４，０のカラム流アダプターを介して２００ｍ
の上昇モル濃度直線勾配（ファルマシア勾配ミキサーＧ
Ｍ−１，≠１９−０４９５−０１）を作用させた。いく
つかの実験では同じカラムに第２の勾配を作用させた。

この第２勾配は１．０　Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４，
０から５０−アセトニトリルを含む１．０　Ｍ酢酸アン
モニウム＋ｐＨ４，０の範囲であった。Ａ型収集ラック
を備えたスーツｑ−ラック（ＳｕｐｅｒＲａｃ）画分コ
レクター（ＬＫＢ２２１１）で１３Ｘ１００鵡のポリス
チレン管（コロンビア・ダイアグノステイクス（Ｃｏｌ
ｕｍｂｉａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　＋　Ｂ　２５
６４　）に２−の画分を収集した。全部のカラムクロマ
トグラフィーに２８０ｎｍフィルター（ＬＫＢ２１３８
）とシングルチャネルレコーダ（ＬＫＢ２２１０）とを
備えたユヴイコード（Ｕｖｉｃｏｒｄ）　Ｓを使用した
。画分を光学濃度に基いて１００ｐｔ〜１ｄの部分サン
プルにしＴＧＩ活性を検定した。

グラフィー クロマトグラフィー用樹脂の調製と処理とをＣＭ−及び
Ｓ　Ｐ　−トＩＪスアクリルの場合と全く同様に行なっ
た。但し、平衡バッファとしては、０．１Ｍ酢酸アンモ
ニウム、　ｐＨ６，０、を使用し、０．１Ｍ〜１．０Ｍ
酢酸アンモニウム、ｐＨ６，０，の範囲の勾配溶出を使
用し、サンプルを前記平衡バッファで平衡した。

１０チのウシ胎仔血清（ホイットテーカーエム・ニー・
パイオープロダクｙ　（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、　Ａ
。

１３ｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）　１４−５０１　Ｂ　）
と２−のＬ−グルタミン（ホイットテーカーエム・ニー
・パイオープロダクツ１７−６０５−Ａ）と１−のペニ
シリンと１チのストレプトマイシンとを含む５ｏｐｔの
ダルベツコ改質イーグル培地（ホイットテーカーエム・
ニー・パイオープロダクツ１２−６１４３）を用い９６
ウエルの組織培養プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ）１６７
００８）で被検細胞を継代培養した。

ヒト肺癌細胞Ａ３４９と正常ヒトフィブロブラスト（Ｈ
ｕＦ）とは、ウェル当り５Ｘ１０”細胞の播種密度を要
した。ミンク細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ６４）はウェル当
り４−５ＸＩＱ”細胞の播種密度を要した。

ＴＧＩ活性を検定すべきカラム画分の部分サンプルを、
　　ｌｔｎｇ／ｄのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：シグ
マＡ−６００３）を含むＩＭＭ酢酸　ｏ　ｐｔを入れた
１２Ｘ７５鵡の無菌試験管（ファルコン２０５８）に移
し凍結乾燥した。アッセイの直前に、凍結乾燥サンプル
を、被検細胞型毎に４００μｔに再懸濁させた。再懸濁
サンプルの１００μｔの部分サンプルを、被検細胞収容
ウェルに加えた。

各サンプルを３組ずつ検定した。５％ＣＯ，／９５チ空
気の湿潤雰囲気中で３７℃で細胞を７２時間インキュベ
ートした。インキュベート期間が終ると、１μＣｉ　／
　ｄの５−［”　　　１．）ヨード−２′デオキシウリ
ジン（ＩＵｄＲ）（＝ニー・イングランド・ニュークリ
ア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）　：　
ＮＥＸ−０７２）を含む１００μｔの完全培地で各ウェ
ルを２４時間パルスした。単層を洗浄バッフ７Ａ（ダル
ベツコのリン酸緩衝生理食塩水、１００ｍＭＭｇＣｔｚ
　、１岬／−のＢＳＡ含有、ｐＨ６，８）で洗い、メタ
ノール（フィッシャーＡ４５２）中で１０分間固定し、
１５分間風乾した。細胞に取込まれた１２５ＩＵｄＲを
２００ｐｔの１．ＯＮ　　ＮａＯＨで可溶化しプレート
を６０℃で２０分間インキュベート１．７’ｃ。可溶化
　　ＩＵｄＲをタイターチク・スーパーナタント・コレ
クション・システム（Ｔｉ　ｔｅｒｔｅｋＳｕｐｅｒｎ
ａｔａｎｔ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）　
（スカトロン・インコーホレーテッド（Ｓｃａｔｒｏｎ
　Ｉｎｃ、）　１７０７２　）で収集した。細胞増殖量
を対数増殖期に細胞の江伍に取込まれた　　ＩＵｄＲの
程度によって概算した。

アッセイ以前に、採取した各ウェルをツアイス（Ｚｅｉ
ｓｓ）倒立顕微鏡で観察し細胞増殖量を肉眼で測定した
。増殖の阻害又は光通を、被検サンプルを含む試験細胞
（例えばヒト腫瘍細胞）Ｋ取込まれた　　ＩＵｄＲと未
処置コントロール細胞に取込まれた　　ＩＵｄＲとの比
で示した。処理細胞を顕微鏡検査で観察したときの光通
又は阻害か　ＩＵｄＲの取込み量の増減にそれぞれ一致
していた。

パイオーゲ＃Ｐ　−１０のゲル濾過クロマトグラフィー
で得られた画分２，４及び６のＩＭｔの部分サンプルを
１２Ｘ７５Ｍのポリスチレン管（ファルコン２０３４）
で凍結乾燥し１１ｄの１．０　Ｍ酢酸に再懸濁させた。

サンプルを沸騰湯浴で３分間加熱し、凍結乾燥し、前記
同様にＴＧＩ活性を検定した。

ｂ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）による処理パイオー
デルＰ−１０でのゲル濾過クロマトグラフィの結果得た
画分２，４及び６からの３−アリコートを１７Ｘ１２５
ａｍポリスチレン製スクリューキャップ管（コロンビア
・ダイアグノステイツク（Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ　）≠２５７０）内で凍結乾燥した。処
理した試料に最終濃度で０．１ＭＤＤＴ（カルビオケム
（Ｃａｌ　−ｂｉｏｃｈｅｍ）　４２３３−１５３）を
含む０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム２００μｔ、ｐＨ７
，４を加えた。対照試料には２００μｔの０．１Ｍ炭酸
水素アンモニウム（パイシャ（Ｆｉｓｈｅｒ）　＊Ａ６
４３　）　、　ｐＨ７，４を含ませた。これらの試料を
２３℃で１時間インキュベートし、１．０Ｍ酢酸で１−
に希釈し、３，５００ダルトンの分子量カットオフの１
８鵡透析膜（スペクトロポー（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒ　
）３、スペクトラム・メディカル・インダストリーズ（
Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ｅｓ　）を用いて０．１Ｍ酢酸４ｔを４回交換しながら
透析した。これらの試料を１２Ｘ７５ｍポリスチレン管
（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）＋２３０４　）内で凍結
乾燥し、前述の如（ＴＧＩ活性を分析した。

各クロマトグラフィ処理によって得た試料からのアリコ
ートを電気泳動用に凍結乾燥した。これらの試料を０．
１　Ｍ　）すｘ−ＨＣＡ（ジグ−ｒ　（Ｓｉｇｍａ）：
Ｔ−１５０３）、＄）Ｈ６，８と、１５％Ｏグリ七ロー
ル（コダック（Ｋｏｄａｋ）：１１４−９９３９）と、
２％の硫酸ドデシルナトリウム（ＱＤＳ）（パイオーラ
ッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；１１６−０３０２）と、５−
の２−メルカプト−エタノール（パイオーラッド；　１
６１−０７１０）とを含む試料バッファ８０μｔに希釈
し、本質的に前述の方法によ９５〜２０％アクリルアミ
ドモノマー勾配で電気泳動処理した（ラエンムリ（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ）　、Ｕ、に、（１９７０年）ネーチー誌２
２７．６８０−６８５）。これらの試料を２分間煮沸し
た後、一定の電流３０　ｍＡ　／デルを加えながら（ホ
７ア（Ｈｏｅｆｆｅｒ）電源；　ＰＳ１２００ＤＣ）９
℃で４時間パイオーラッドモデル１５５バーチカル電気
泳動セル（パイオーラツｒ１６５−１４２０）内の幅１
．５　ｍのスラブゲル上に配置した。水浴サーキュレー
タ（ハーク（Ｈａａｋｅ）　、　Ａ　８１　）により一
定の温度を維持した。ゲルを酢酸５．７チ及びメタノー
ル４７チ中でクマシーブルーＲ２５０（パイオーラッド
≠１６−０４００）０．５％によシー晩着色し、次いで
着色剤を含まない前記と同じ溶液で脱色した。低いタン
、ｅり質濃度を示す特定ゲルをメリル（Ｍｅ　ｒ　ｒ目
）＆Ｃよるシルバー技術（メリル。

シー・アール（Ｃ，Ｒ，）、ゴールドマン、ティー（Ｇ
ｏｌｄｍａｎ、　Ｄ、　）　＋セドーｒ　：ｙ　、　ｘ
ス（Ｓｅｄｍａｎ、　Ｓ、）及びエパート、エム・エッ
チ（Ｅｂｅｒ　ｔ　、　Ｍ、Ｈ、（１９８１年）２１１
：　　１４３７−１４３８）、によシ再着色処理した（
パイオーラッド、シルバーステイニングキッド（ｓｉｌ
ｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｋｉｔ）　；　４１６１−
０４４３　）。

結果 性の比較 ヒト調帯の酸性化エタノール抽出物に由来する成長抑制
活性を見掛は分子量５．０００〜１６　、０００ダルト
ンでパイオーゲルＰ、１０樹脂を用いるゲル濾過クロマ
トグラフィによシ溶出した。時には、３．０００〜５．
０００ダルトンの分子量で別の活性ピークも観察された
。分子量の計算は４Ｘ１００ｃｍカラム内で１ｔの樹脂
を用いてクロマドグ２フイにかけた分子量基準（即ち炭
酸脱水酵素−２９，０００：ＲＮアーゼ−１４，４００
；インシュリン−６，０００）の溶離プロフィルに基づ
く。前記カラムによって得られる溶離プロフィルと１４
Ｘ１００ｃ１１大カラムによって得られるプロフィルと
は互に重ね合わせることができた。同じ方法でクロマト
グラフィにかけたヒト胎盤からの酸性化エタノール抽出
物は臍帯抽出物に極めて類似した溶離プ四フィルを示し
た。

腰帯酸性化エタノール抽出物からの分画１〜３は極めて
濃い茶色を有するが、この色は分画が進むＫつれて徐々
に消失する。幸いなことに、腫瘍細胞増殖阻害活性（Ｔ
ＧＩ）は最も高いタン／ｅり質濃度を有する分画１，２
及び３に溶出されるにも拘らず、この活性の大部分が第
１図及び第２図から明らかなように、観察されるエタノ
ｑり質ピークを越えて延びる。ヒト胎盤物質からの抽出
物は主要タンツク質ピークに対するＴＧＩ　の重なりが
ヒト腰帯からの物質について観察される重なシよすも大
きかった（データ図示せず）。５〜２０チポリアクリル
アミド勾配での５ＤＳ−ＰＡＧＥ　によるゲル濾過クロ
マトグラフィ電気泳動からの複数の同量アリコートも、
分画４では分画１〜３よりかなシ少ない量のタン／Ｑり
質が検出されることを示した。分画５及び６では５６０
０及び１４，０００の主要タン／Ｑり質帯が観察され、
分画７に関しては抑制活性が第２図の如く分画１０まで
延びているＫも拘らず極めて少量のタンパク質しか残ら
ない。

よシ少ないタンパク質の領域に溶出する大きな活性の顕
著な利点はＴＧＩの更に高度な精製を容易にするという
点にある。

第１図及び第２図に夫々示した室温でのバイオ−ゲルＰ
ＩＯクロマトダラムと４℃でのそれとを比較すると、抑
制活性は明らかに４℃での方がよシ良く保存される。２
３℃では分画６を越えると活性が全く観察されない（第
１図）が、４℃では活性が更に４分画分延びて分画１０
まで広がる。

極めて重要なことに１回収される活性の正味量は抽出物
を４℃でクロマトグラフィＫかけると少なくとも２倍大
きくなる。８０チ以上のＴＧＩ活性は４℃では７つの分
画に得られる（第２図）のに対し、２３℃では３つの分
画にしか得られないからである。これは、３つの分画に
溶出する（２３℃）同一量の活性が７つの分画に亘って
広がる（４℃）ことに起因するのではなく、明らかＫＴ
ＧＩ活性の収量の実際的増加に起因していた。２つのカ
ラムから別個に得た分画５の１ｔＲｔアリコートと、こ
れら分画の１１５〜１／１２５希釈物とをヒト肺腺癌（
Ａ５４９）とミンク、肺細胞（ＣＣＬ６４）とに関して
テストした（表Ｉ）。未希釈分画のＴＧＩ活性は４℃で
のクロマトグラフィによって得られる分画５の方が２倍
大きかった。また、４℃のクロマトグラフィによる分画
５の２５倍希釈物はヒト腫瘍細胞系に対して最大ＴＧＩ
活性を示し続けた。

２３℃でのクロマドグ２フイによる同等希釈度の分画は
検出し得る活性を全く示さなかった。ミンク細胞系につ
いても同様の観察がなされた。このデータは第１図及び
第２図に見られる活性に基づくものではなく、夫々の第
５分画において同等のＴＧＩ活性を示した２つの別個の
カラムから得たものである。

ヒト正常フィブロブラスト（ＨｕＦｓ）Ｋ対するＴＧＩ
のバイオ−ゲルＰ−１０樹脂でクロマトグラフィー（４
℃）Ｋかけたヒト鎖帯酸性化エタノール抽出物から得た
分画のアリコートを、材料及び方法の項で述べたように
ヒト正常細胞とヒト形質転換細胞とについてＴＧＩ活性
テストした。第３図から明らかなようにヒ）Ａ５４９細
胞（白い三角）Ｋ対するＴＧＩ活性は分画３から分画１
２までに及ぶが、これらの分画はヒト正常フイブロブラ
ストの成長刺激作用において８５％も増大させた。この
ように前記抑制活性はヒト腫瘍細胞に特異的なものであ
る。この観察された抑制活性は光線顕微鏡検査で示され
且つヒト正常フィブロブラストに対する刺激作用によっ
て間接的に示されるように、細胞毒性に起因するもので
はない。

ＴＧＩを予め正常な上皮由来細胞についてテストしたが
、同様の結果が観察された。

表　　　　　　　１ ゲル濾過クロマトグラフィによる ＴＧＩ活性の回収に対する温度の影響 テスト細胞系 Ａ３４９（ヒト癌種） 未希釈　　　　　　　　　５７　　　３゜ミンク肺細胞
（ＣＣＬ６４） 未希釈　　　　　　　　　９１　　　４３１２０μｔを
含む分画５のゲル濾過による１ゴアリコート（第１図及
び第２図）を用いてＴＧＩ活性分析を行なった。

高性能液体クロマドグ２フイ（ＨＰＬＣ）バイオーゲ／
Ｉ／Ｐ１０カラムでのゲル濾過によシ部分的に精製し、
次いで逆相ＨＰＬＣ（ｕボンダパック（ｕＢｏｎｄａｐ
ａｋ）　Ｃｚｓ樹脂）を用いて更に精製したヒト戻帯の
酸性エタノール抽出物からのＴＧＩは、Ａ３４９　ヒト
癌種及び樹立ミンク肺細胞系ＣＣＬ６４の成長を双方共
抑制したが、正常たヒトフィブロブラストの成長は抑制
しなかった。第４図はパイオーデルＰ−１０クロマトグ
ラフィステップから得られた凍結乾燥分画４（１９，８
岬／３ｍ０．０５％トリフルオロ酢酸）のアセトニトリ
ル直線勾配を用いるＨＰＬＣＫよって得たＴＧＩ活性の
溶離プロフィルを示している。

Ａ３４９ヒト癌種及びミンク細胞の両方に対する成長抑
制活性のピークが２つの別個のものであることが観察さ
れた。２８〜３４％のアセトニトリルで溶離する分画（
分画１３〜２２）と、３５〜３９％のアセトニトリルで
溶離する分画（分画２５〜３１）とを別個にプールし、
２−プロ、ｅノール直線勾配を用いてＣ１ｓ　ｕボンダ
ノ？ツクカラムで再びクロマトグラフィＫかけた。

ＴＧＩ活性の第１ピークをＴＧＩ−１と称し、第２ピー
クをＴＧＩ−２と称することにした。第５図はＴＧＩ　
−１（第４図）の溶離プロフィルとＴＧＩ活性とを示し
ている。注入材料の濃度は０．０５％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）１．５ｄ当１．５ｑであった。ＴＧＩ−１活
性は２−プロ、ｅノール直線勾配を用いると１７〜２３
−の間で溶出する。同様にして第６図は、ＴＧＩ　−２
（ｏ、ｓｆｎｇ／ｉ、ｓｄ　ｏ、ｏ　５　％ＴＦＡ）（
、第５図）が２−プロ、ｅ／−ル直線勾配を用いると２
３〜２７チの間（分画１７〜２３）で再クロマトグラフ
ィ処理されることを示している。

第４図及び第５図のＴＧＩ活性は一貫して、Ａ３４９ヒ
ト癌腫細胞に対するよりミンク細胞に対する方が２０％
高い。

パイオーデルＰ−１０クロマトグラフィステップがらの
別の分画全量、即ち分画５（第３図参照）をアセトニト
リル直線勾配を用いるＨＰＬＣによシクロマドグラフィ
処理した（第７図）。第４図で使用されている材料（分
画４）より後の分画である分画５はＴＧＩ−１として溶
出する抑制活性を主に含んでいた。第７図ではＴＧＩ−
１は２９〜３４％アセトニトリルで溶出した。増殖阻害
活性はＡ３４９ヒト癌腫細胞に対するよシミンク細胞に
対する方が３５％高かった。ここでＴＧＩ活性の大部分
は前記タンパク質ピークから分離された。活性分画（１
４〜２５）をプールし、凍結乾燥し、且つ２−プロパノ
ール直線勾配を用いる逆相ＨＰＬＣＩＣよりクロマトグ
ラフィ処理した（第８図）。差動的阻害活性の証拠が観
察された。ＴＧＩ活性は２３％２−プロパノール（分画
２２〜２５）の活性ピークで溶出するミンク細胞に特異
的な成長抑制活性と、２６チ２−プロパノール（分画２
５〜２６）で溶出するＡ３４９ヒト癌腫細胞に特異的な
増殖阻害活性とに分割された。従って後でゲル濾過クロ
マトグラフィによυ溶出され、汚染性タンパク質をよシ
少なく有する分画［２８０ｎｍでの吸光度がより小さく
（第２図）、且つゲル電気泳動によるタン、Ｑり質がよ
シ少ない］は２つの異なる細胞特異的阻害活性を有する
。

ヒト胎盤の酸性エタノール抽出物は、ゲル濾過クロマト
グラフィステップの後で、０．０５％ＴＦＡ含有直線ア
セトニトリル勾配を用いるＣＩ８カラムのアセトニトリ
ル２６〜３４チでやはシ溶出するＴＧＩ活性を含んでい
た。

ヒトａ帯の凍結乾燥した酸性化エタノール抽出物１ｆを
０．０１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４，０中でＣＭ−）
リサクリル（ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ）を用いて直接イオン
交換クロマトグラフィにかけた。

０．０１から１．０Ｍまでの酢酸アンモニウム、ｐＨ４
，０の直線勾配を適用した。第９図は少なくとも４つの
別個のＴＧＩ活性、ＣＭ−）、ＣＭ−ＩＩ、ＣＭ−１及
びＣＭ〜■を示している。ＣＭ−１はその時点ではＡ３
４９ヒト癌腫細胞のみを６０％の抑制率で抑制していた
（表２）。ＣＭピーク■及び■はＡ３４９ヒト癌腫に対
しても（夫々８０％及び６３％）ミンク細胞に対しても
（夫々６１チ及び７６チ）同程度の増殖阻害活性を示す
。最後の活性ピーク（ＣＭ−ＩＶ）はミンクに対する活
性特異性を示す（即ちミンク細胞の抑制率（９５％）の
方がＡ３４９ヒト癌腫細胞の抑制″＊（６９１）よシ高
かった）。

負電荷樹脂を用いるとＣＭ−７は保持されず、ＣＭ−■
は多少遅れた。これはＣＭ−１もＣＭ−Ｉ［も０．０１
Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４，０により勾配が開始され
る前に溶出されたからである。

阻害活性を有するタン、ｅり質はいずれもｐＨ４，０で
溶解し得且つ負電荷樹脂に結合するため酸性タン１９り
質であるが、ピークＣＭ−ＩＩＩ及び■はＣＭ−トリス
アクリル樹脂（０，５Ｍ以上の酢酸アンモニウムで溶離
）によシ強く結合するため、恐らくそれよシ少し塩基性
である。このことは正電荷樹脂（即ちＤＥＡＥ−トリス
アクリル）Ｋよって保持されるＴＧＩ活性は皆無であっ
たという事実によって実証される（データ図示せず）。

より酸性の阻害因子は夫々の活性がＡ３４９ヒト癌盾細
胞に対してより大きな特異性を示すと思われる。これら
４つのＴＧＩ活性ピーク（ＣＭ−）％　ＣＭ−Ｉｔ、Ｃ
Ｍ−１１及びＣＭ−７％／）は繰返し観察された（ＣＭ
−トリスアクリルを用いる６つの別個のクロマトグラフ
ィ処理）。ＣＭ−１［１及びＣＭ−ＩＶＩＣ観察される
ＴＧＩ活性がカラムからよシ早ぐ溶離され得るような物
質を生じないようにし、且つ各活性ピークが別個の存在
であるという概念を裏付けるために、ＣＭ−１及びＣＭ
−■からの物質をプールし、凍結乾燥し、且つこの物質
が由来するカラムと同じ条件下でＣＭ−）りスアクリル
を用いて再びクロマトグラフィＫかけた。ＣＭ−１１及
びＣＭ−■はこれらを誘導せしめた元のカラム分画と全
く同じ位ｔＫ溶出した（０．５Ｍ酢酸アンモニウムより
大）（第１０図）。ミンク細胞に対するよシ高いＴＧＩ
阻害活性は保持され、２つの細胞系に対する阻害活性相
互間の差は活性ピークを中心に２５〜３０％で全く同等
釦維持された。

バイオ−ゲルＰＩＯによるゲル濾過クロマトグラフィの
結果得られた分画２．４及び６を熱処理するか（表３）
、又はジチオトレイトール（ＤＴＴ）処理による還元（
表４）にかけた。テストした分画はいずれも熱処理又は
酸処理の後でＴＧＩ活性を保持していた（表５参照）。

分画２．４及び６はヒト癌細胞の成長を抑制し且つヒト
正常細胞の成長を刺激することが判明した。分画２及び
６のＴＧＩ活性はＤＴＴで処理すると減少したが、分画
４のＴＧＩ活性は少し増加した（表４）。このデータも
別個のＴＧＩの存在を立証する。

表　　　　　　２ 陽イオン交換クロマトグラフィによるＴＧＩ活性Ａ３４
９　　　　　Ｍｉｎｋ ＣＭＩ　　　　　　　　　　６０　　　　　　０ＣＭ［
８０６１ ＣＭＩ［［６３７６ ＣＭ■６９　　　　　９５ ＴＧＩ活性テストにかけた分画のタンパク質濃度は１５
〜３００μｍであった。

表　　　　　　３ ゲル濾過クロマトグラフィによる分 画のＴＧＩ活性に対する熱処理の効果 Ａ３４９　　　　ミンク ＴＧＩ活性テストにかけた分画のタンパク質濃度は１５
〜３００μ？であった。

表　　　　　　４ ゲル濾過クロマトグラフィによる分画のＴＧＩ活性に対
するＤＴＴ処理の効果 Ａ　５４９　　　　　　　　　ミ　　ン　　りＴＧＩテ
ストにかけた分画のタンパク質濃度は５〜３００μ？で
あった。

表　　　　　５ 組織由来腫瘍細胞増殖阻害活性（ＴＧＩ）の物理学的及
び生物学的特性 カラム分画 分画　　分画　　分画 １．０Ｍ酢酸まで安定　　　　　　＋　　　　＋　　　
　＋１００℃の煮沸まで安定　　　　＋　　　　＋　　
　　＋ヒト癌細胞を抑制　　　　　＋　　　　＋　　　
＋ヒト正常細胞を抑制　　　　　−−− 実験の第２部 ヒトＭ帯組織から静脈及び動脈を除去し、残シの組織を
入念に洗浄して血液を除去した後、第１部の実験で説明
したように酸／エタノール抽出Ｋかけた。

この組織の洗浄及び均質化に用いたバッファー（ＰＢＳ
−ＰＡ）はＮａＣ１１６ｔと、Ｎａ鵞ＨＰＯ４・Ｈ＊０
　２．５　ｆと、ＮａＨ鵞ＰＯ４＋７Ｈρ　０．４ｆと
、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（シグ
マ（Ｓｉｇｎｌａ）　Ｐ７６２７）１１６ｔｎｇと、ア
プロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）　（０，９％　Ｎａ
Ｃｔ及び０１９−％ベンジルアルコール中にトリプシン
抑制因子１９．８単位／−を有するシグマＡ６０１２）
とを含む水２１．をＨＣｔ及びＮａＯＨでｐＨ７，４Ｋ
調整したもので構成した。抽出バッファは９５％（ｖ／
ｖ）エタノール（）ぐンクチリマス、　１９０フルー７
、米国インダストリカルケミカルズ（Ｕ−８，Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ−ｃａｌｓ）、４ＵＮ　　
１１７０）３７５−と、濃ＨＣｔ７．５ｄと、フッ化フ
ェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（シグマＰ−７６
２７）、３３■とアプロチニン（シグマＡ６０１２）１
ｍとを４℃の蒸留水１９２ｍと混合したもので構成した
。８００〜１．００Ｏｆの凍結したヒト鎖帯（アドバン
スト・バイオチクノロシーズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）　；　−８０℃で保存）
をＰＢＳ　−ＰＡ中に４℃で２時間浸漬するととＫよシ
解凍した。個々の鎖帯を取出し、ＰＢＳ−ＰＡで洗浄し
た。４℃で切屑して腰帯から静脈及び動脈を除去した。

切屑処理した鎖帯を新しいＰＢＳ　−ＰＡで洗浄して残
留血液と血管破片とを除去した。

この組織を４Ｃ冷却キュイジナ−Ａ／　（（！ｕｉｓｉ
ｎａｒｔ　）７−ドプロセツサ（モデルＤＬＣ−７−Ｐ
Ｒ，Ｏ”）内に配置し、２００−の４ｃＰＢＳ−ＰＡ中
に懸濁した。この懸濁組織を前記フードプロセッサによ
シ均質化した。最初の１分間の均質化後、更に２００−
の４ＣＰＢ８−ＰＡを加えた。この組織懸濁液を４Ｃで
合計１０分間均質化した。得られたホモジネートを２０
０ｄ遠心分離ボトル（ソーノｚル（５ｏｒｖａｌｌ　）
　）に移シ、ソーパルＧＳＡロータを備えたソーＩＮ　
Ａ／　ＲＣ５Ｂ遠心分離器で４Ｃで５分間９０００　ｒ
ｐｍ　（ＲＣＦ＝　１３，０００　）の遠心分離処理に
かけた。上澄み流体を除去して廃棄し、ペレットを新し
いＰＢＳ−ＰＡで元のホモジネート量まで再懸濁した。

上澄み流体が透明になシ、汚染血液又は血液生成物から
の赤い色がなくなるまで前述の如き遠心分離及び再懸濁
を繰返して硬レットを洗浄した。

洗浄後得られたベレットは白色であった。この洗浄ペレ
ットを元の切屑組織１ｐ当り６−の最終容量で抽出用バ
ッファ中に再懸濁した。得られたホモジネートを３イン
チ攪拌棒付４ノ大ビーカーに移し、ＬＡＢ−ラインマル
チマグネスター（Ｍｕｌｔｉ−ｍａｇｎｅｓｔｉｒ　）
−ｒ＋チミキサー、モデル＋１２７８の最大攪拌能力の
十で攪拌した。４Ｃで攪拌しながら一晩抽出処理した後
ホモジネートを１ノ遠心分離ボトル（ソーパル）に移し
、ソーパルＨ−６０００Ａロータを備えたソーパルａｃ
−３Ｂ遠心分離器内４Ｃで３０分間３５００　ｒｐｍ　
（ＲＣＦ　＝　３５７０　）の遠心分離にかけた。上澄
みを４ノ大ビーカーに移し、濃水酸化アンモニウムをゆ
つ〈シ加えながらｐＨ５，０Ｊこ調整した。ｐＨを増大
しても上澄みは薄い黄色を帯びた透明のままであった。

酢酸アンモニウム２．０Ｍ溶液、ｐＨ５，２を合計量の
１俤の量で加えた。このステップで生じた沈殿物はソー
パルＲＣ−３Ｂによシ４Ｃで４時間４５００　ｒｐｍ　
（ＲＣＦ＝５９００　）で遠心分離するととｌこよシ完
全に除去した。上澄みを６ノ大フラスコに移し、これに
４倍容の無水エーテル（−２００）（ベーク−（Ｂａｋ
ｅｒ　）＋９２４４−３　）と２倍容の９５１エタノー
ル（４Ｃ）とを加えた。この混合物を静止状態下−２０
ｔｌ’で４８時間放置し、形成される沈吟物を定着させ
た。

４８時間沈殿処理した後、この物質を換気フード（ｆｕ
ｍｅｈｏｏｄ　）内で室温にした。酸性化エタノール抽
出物を室温まで暖めると前記沈殿物の凝集が促進される
。水吸引器によりエーテル及びエタノールの透明有機相
を除去し、残留有機相を蒸発させるべく沈殿物を換気フ
ード内に数時間放置した。乾燥窒素ガスを抽出物の上に
緩やかに流して、沈殿物と共に存在する残留有機溶媒の
蒸発を促進した。「乾燥」した沈殿物を１．０Ｍ酢酸中
に溶解し、分子量カットオフ３５００の透析膜（スペク
トロポー３．スペクトラム・メディカル・インダストリ
ーズ、ロスアンゼルス、カリフォルニア）ヲ用いて１．
０　Ｍ酢酸（４−カー４Ｐ９５０７−５）に対し十分に
透析した。透析後の酸性化抽出物をコーニング（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ）の２５０−円錐状遠心分離管（コーニング２
５３５０　）内で凍結乾燥し、粗酸性化エタノール抽出
物として保存するか、又は２０・Ｉ’１ｍＭＮＨ４Ｏ，
Ｃ，Ｈ，、ｐＨ４，５に対して入念に透析した。

！ 組織を前述の如く処理した場合に見られる特異的活性と
合計回収活性との増加を表６に示す。この表は実験の第
１部で説明した手順（以後「最初の手順」と称する）に
従って処理した時の凍結腰帯と前述の如く（以後「改良
手順」と称する）処理した凍結鎖帯とに関するタン、ｅ
り質及びＴＧＩ活性の収量を比較するものである。

これら２つの手順には、後で行なわれるＴＧＩ精裂精製
って重要な明らかな差異が幾つか存在する。例えば組織
の湿潤重量に基づくと、最初の手順による酸性化エタノ
ール抽出ではタン／９り質として０．３３係（１０００
，９の組織から３．３　ｉ　）が回収されるのに対し、
改良手順に従うと０．０１５１がタンパク質として（３
４０Ｆの組織からｏ、ｏｓｙ）抽出されるにすぎない。

改良手順を用いた場合の活性収量（３，３Ｘ　１０’単
位）は最初の手順の場合よシロ６多少ない組織（３４０
Ｉ！対１０１００Ｏカラ得うれ、最初の手順によシ得ら
れる収率（２×１０６単位）よシ５０係大きいため、全
体的抽出効率は増大したことになる。最初の手順では鎖
帯１１（湿潤重量）当、り　２０００単位のＴＧＩ活性
が得られた。

改良手段では鎖帯１ｇ（湿潤重量）当シ９７００単位の
ＴＧＩ活性が得られた。全体的抽出効率は改良手順に従
うと５倍増加した。また、酸性化エタノールによってよ
シ少ないエタノ♀り質が抽出されたことから、抽出エタ
ノｑり質を沈殿させるのに必要なエーテル及びエタノー
ルの量もよプ少ない。

要に、改良手順では抽出されるエタノ９り質の量及びタ
ン、ｅり質の種類の数がよシ少ないため、後で用いるべ
き精製過程でもよシ少ないクロマトグラフィ材料と、よ
り短い処理時間と、より少ないステップとで純粋生成物
を得ることができる。

場イオン交換樹脂ＣＭ−）ＩＪサクリルでの改良手順に
より抽出したＴＧＩの分別は、結合物質を０〜１．０　
Ｍ　ＮａＣノの直線勾配ｌこよって溶離した時に施用タ
ン／ｅり質の大部分から単一ピークとして溶出された。

第１１図はＴＧＩをＣＭ−）リサクリルカラムに施用し
た場合、この樹脂に結合していない材料（即ち分画１〜
２４）からは阻害活性が全く検出されなかったという事
実を示している。

ＮａＣノを増量しながら直線的に加えると（−一）、樹
脂に結合したタンパク質の大部分（分画２５〜３８）が
除去され、次いで有意量の阻害活性（・・・。

分画３９〜４９）が除去された。結合ＴＧＩの除去に最
も有効なＮａＣノ濃度は約０．６Ｍであった（分画４４
）。第１１図と第１０図との比較から推察されるように
、第１１図の実験で溶出される阻害活性は、溶出用塩濃
度（第１１図ではＮａＣ）、第１０図ではＮＨ４Ｏ，Ｃ
，Ｈ，）が互に類似している（第１１図では０．６Ｍ、
第１０図では０．６〜０．７Ｍ）ため、第９図に示した
ようなＣＭ−）リスアクリルからのＣＭ−１及びＣＭ−
■の溶離に極めて近いと思われる。このデータも、改良
手順によって組織を処理すればシングルタイプのＴＧＩ
が優先的に分離され、従ってその後の該因子の特徴が向
上することを示唆している。

改良手順ｔこよる組織から抽出されるＴＧＩの別の特徴
は陰イオン交換樹脂に結合しないことにある。

第１２図は、この図の説明の項で述べたようにＩ）Ｈを
８，０に調整し、且つ抽出物を（第１１図の場合と同じ
量）陽イオン交換樹脂ＤＥＡＲ−）リスアクリルに施用
した結果、大部分の阻害活性が非結合物質（分画１〜３
０）に対応する一方で、施用エタノｑり質の大部分（２
８０ｎｍでの吸光度によって規定）（−）がカラム樹脂
に結合したことを示している。これらの結果は第１２図
の条件では汚染タン・９り質がＴＧＩから除去され得、
従ってＴＧＩ精製に有用な方法であることを意味する。

これらの結果は更にＴＧＩがｐＨ８，０では陰イオン交
換樹脂に結合しないため陽イオンであることを示してい
る。また、改良手順によって抽出されるＴＧＩがイオン
特性において、最初の手順でイオン交換樹脂によシ抽出
されるポリペプチド（ＴＧＩ−１，ＴＧＩ−２，ＣＭ−
１，ＣＭ−［、ＣＭ−１及びＣＭ−ＩＶ）に類似してい
ることも第１２図の結果から知見窄れる。

何故なら前記ポリペプチドはいずれも陰イオン交換樹脂
に結合しないからである。

大量の試料がＣＭ−）Ｉ７サクリルによって再現可能に
分別され得、そのため後のｆｆＩ製過程用ｉこよシ多く
のＴＧＩを供給し得る。第１３図では組織抽出物９．９
ＴＩｑを、よシ小さい試料サイズ（２，６５岬のタン／
９り質）とより小さいＣＭ−）リサクリルカラム（５−
）とを用いる第１２図の条件と同じクロマトグラフィ条
件でＣＭ−）リスアクリルカラム（１５ｍ／）に施用し
た。ＮａＣｊ直線勾配による大部分のタン−にり質物質
からのＴＧＩ活性の溶出は本質的にこれら２つの実験の
いずれでも同じであった。

第４４図はＵボンダ／ｑツクＣ１８カラムを用いるＨＰ
ＬＣによるＣＭ−トリサクリルヵラムからのプール試料
（第１３図、分画５９〜７８）の分別を示している。試
料施用後、アセトニトリル濃度をＯ〜２５チまで直線的
に増加しても有意な阻害活性は観察されなかった。しか
しながら、Ａ３４９（ヒト肺癌腫）及びＣＣＬ　６４　
（ミンク肺、０−０）の双方に対するＴＧＩ活性は２８
〜３４チアセトニトリル（分画２１〜３１）で単一ピー
ク状に溶出し、一方２０６ｎｍで吸光する材料の大部分
はよシ低いアセトニトリル濃度（分画１１〜１９）とよ
シ高いアセトニトリル濃度（分画３７〜５０）とで溶出
した。活性プロフィルと、２０６ｎｍでの吸光度と％Ｔ
ＧＩ活性を有効に溶出せしめるアセトニトリル濃度とが
第７図と第１４図との間で類似しているという事実は、
改良手順により分離されるＴＧＩが実験の第１部でＴＧ
Ｉ−１と名付けたものに類似しているか、又はこれと同
じであることを強く立証するものである。

既知分子量の適切なタンパク質基準を用いて、ゲル濾過
クロマトグラフィ（セファデックスＧ−５０、データ図
示せず）によ、９ＴＧＩ（最初の手順でＴＧＩ−１、Ｃ
Ｍ−１及びＣＭ−■と称するもの）の見掛は分子量を測
定した。成る種の干渉タンパク質（例えばヘモグロビン
）が存在しない場合には、ＴＧＩ見掛は分子量は非変性
条件下で２０　ｋＤａ〜３０　ｋＤａの間であると判明
した。

ここで詳述した改良手順は、最初の手順で説明したよう
に調製したＴＧＩ含有抽出物から不活性又は干渉性化合
物を除去するための強力で簡単な方法を表わしている。

この改良手順はまた、必要なりロマトグラフイ材料の量
を減らし、従ってＴＧＩの処理時間を減らすことＫより
ＴＧＩの分離釦用いられる穏々のクロマトグラフィ操作
ステップの効率を向上せしめる。加えて、既述の如く、
ここで説明した如き腰帯からのＴＧＩ抽出法は、先に説
明した手順によるよ）も高い再現性をもってＴＧＩ及び
他のタンパク質をクロマトグラフィ処理せしめる。

改良手順に従って分離したＴＧＩの特徴を逆相高性能液
体クロマトグラフィ及びＣＭ−）リスアクリルイオン交
換クロマトグラフィの双方におけるクロマトグラフィ特
性に関して調べた。ＴＧＩはｒｐ−ＨＰＬＣによるＴＧ
Ｉ−１と類似した、又は同じ特性を示しく第７図及び第
４４図を比較せよ）従って類似の、又は同等の疎水性を
有し、且つ陽イオン交換樹脂ではＣＭ−ＩＩＩ及びＣＭ
−ＩＶと類似又は同じ特性を示しく第９図及び第１１図
を比較）、従って類似又は同等のイオン特性を有するこ
とが判明した。従って、改良手順で分離されたＴＧＩと
、ＴＧＩ−１と、ＣＭ−［［及びＣＭ−ＩＶとは類似又
は同等のイオン特性及び疎水性を有する類似又は同じ化
合物であり、従って類似又は同じ組成を有すると結論さ
れる。従って、本明細書で説明した改良手順を用いれば
、よシ高度な分析及び特徴検査に必要なよシ純粋な形態
のＴＧＩを得るためのよシ有効な方法が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第１４図は、本発明の抽出物からの種種の条件
での活性成分の溶出パターンを示す図である。 ＦＩＧ、　ＩＩ。 ＦＲＡＣＴ工０Ｎ ＦＩＧ、　１２゜ ＦＲＡＣＴＩＯＮ 手続？ＦｆＴ　ＪＥ書（方式） 昭和６１年７月、２３日 特許庁長官　　黒　１）明　雄　殿 謁 １、事件の表示　　　昭和６１年特許願第８９８４４号
２、発明の名称　　　組織由来腫瘍増殖阻害物質３、補
正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　　オンコジーン・サイエンス・インコーホ
レーテッド ４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号　山田ビル（郵便番号１６０）　ｆ話（０３）　　３
５４−８６２３７、補正の対象　　　願書中、出願人の
代表者の欄、明細書、図面及び委任状 ８、補正の内容 （１）　　出願人の代表者を記載した適正な願書を別紙
の通り補充する。 ■　鮮明に浮塵した明細書を別紙の通り補充する。 （内容に変更なし） ■　黒色で鮮明に描いた適正な図面を別紙の通り補充す
る。 （内容に変更なし） （４）　　委任状及び同訳文を別紙の通り補充する。

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト組織由来の酸性化エタノール抽出物であつて
   、それぞれ分子量が約２０，０００ダルトン未満の複数
   の酸性ポリペプチドから成り、それぞれのポリペプチド
   はヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）
   の成長を阻害するが正常ヒト包皮フイブロブラストの成
   長を促進する性質を有しており、ヒト腫瘍細胞に対する
   前記阻害活性は酸性化エタノール抽出物の温度が約３分
   間約１００℃に増加してもあるいは酸性化エタノール抽
   出物に１．０モル酢酸まで酢酸を加えても破壊されるこ
   とがなく、前記阻害活性は酸性エタノール抽出物を約２
   ３℃で調製したときよりも約４℃で調製したときの方が
   増強されるものである前記酸性化エタノール抽出物。
2. （２）ヒト組織が臍帯である特許請求の範囲第１項に記
   載の酸性化エタノール抽出物。
3. （３）ヒト組織が胎盤である特許請求の範囲第１項に記
   載の酸性化エタノール抽出物。
4. （４）ヒト臍帯由来の酸性化エタノール抽出物であつて
   、実質的に全ての血液、全ての細胞外可溶成分及び実質
   的に全ての細胞内可溶成分を除去処理されたものであり
   、非環元条件下で約３０，０００ダルトン未満の見かけ
   分子量を有し、ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（
   ＣＣＬ６４）の成長を阻害するが正常ヒト包皮フイブロ
   ブラストの成長は促進する性質を有する少なくとも１種
   の酸性ポリペプチドから成り、ヒト腫瘍細胞に対する前
   記阻害活性は酸性化エタノール抽出物の温度が約３分間
   約１００℃に増加してもあるいは酸性化エタノール抽出
   物に１．０モル酢酸まで酢酸を加えても破壊されること
   がない前記酸性化エタノール抽出物。
5. （５）ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６
   ４）の成長を阻害するが正常ヒト包皮フイブロブラスト
   の成長は阻害しない性質を有し、約５，０００−１６，
   ０００ダルトンの範囲の見かけ分子量を有する少なくと
   も１種のポリペプチドから成る組織由来増殖阻害物質−
   １（ＴＧＩ−１）と指称される組成物であつて、（ａ）
   特許請求の範囲第１項に記載の酸性化エタノール抽出物
   の、０．０５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニト
   リルの約２６−３４％アセトニトリル直線勾配による高
   性能液体クロマトグラフイーにより規定の活性で回収可
   能であり、また特許請求の範囲第１項に記載の酸性化エ
   タノール抽出物の、０．０５％トリフルオロ酢酸を含有
   する２−プロパノールの約１７−２３％２−プロパノー
   ル直線勾配による高性能液体クロマトグラフイーにより
   規定の活性で回収可能であり、（ｂ）０．０５％トリフ
   ルオロ酢酸を含有する２−プロパノール直線勾配による
   高性能液体クロマトグラフイーにおいて溶出すると２つ
   の活性物に分離可能であり、それ等の１つは約２６％２
   −プロパノールで溶出されるものであつてヒト腫瘍細胞
   の成長を優先的に阻害するが樹立ミンク肺細胞系（ＣＣ
   Ｌ６４）の成長は阻害しないものであり、他の１つは約
   ２３％２−プロパノールで溶出されるものであつて樹立
   ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の成長を優先的に阻害す
   るがヒト腫瘍細胞は阻害しないものである、前記組成物
   。
6. （６）ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６
   ４）の成長を阻害するが正常ヒト包皮フイブロブラスト
   の成長は阻害しない性質を有し、約２０，０００−３０
   ，０００ダルトンの範囲の見かけ分子量を有する少なく
   とも１つのポリペプチドから成る組織由来増殖阻害物質
   （ＴＧＩ）と指称される組成物であつて、（ａ）特許請
   求の範囲第４項に記載の酸性化エタノール抽出物の、０
   ．０５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの
   約２８−３４％アセトニトリル直線勾配による高性能液
   体クロマトグラフイーにより規定の活性で回収可能であ
   り、（ｂ）約０．６−０．７％ＭＮａＣｌのＮａＣｌ直
   線勾配で溶出するとカチオン交換樹脂から規定の活性の
   単一のピークとして溶解されるものである、前記組成物
   。
7. （７）ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６
   ４）の成長を阻害するが正常ヒト包皮フイブロブラスト
   の成長は阻害しない性質を有し、約５，０００−１６，
   ０００ダルトンの範囲の見かけ分子量を有する少なくと
   も１種のポリペプチドから成る組織由来増殖阻害物質２
   （ＴＧＩ−２）の指称される組成物であつて、特許請求
   の範囲第１項に記載の酸性化エタノール抽出物の０．０
   ５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの約３
   ５−３９％アセトニトリル直線勾配による高性能液体ク
   ロマトグラフイーにより規定の活性で回収可能であり、
   また特許請求の範囲第１項に記載の酸性化エタノール抽
   出物の、０．０５％トリフルオロ酢酸を含有する２−プ
   ロパノールの約２３−２７％２−プロパノール直線勾配
   による高性能液体クロマトグラフイーにより規定の活性
   で回収可能である、前記組成物。
8. （８）ＣＭ− I 、ＣＭ−II、ＣＭ−III及びＣＭ−IVと
   指称するポリペプチドの不均一集合体であつて、それぞ
   れのポリペプチドはヒト腫瘍細胞の成長を阻害する性質
   を有し、ＣＭ− I を除く全ては樹立ミンク肺細胞系（
   ＣＣＬ６４）の成長を実質的に阻害する性質を有してお
   り、正常ヒト包皮フイブロブラストの成長を阻害するも
   のはなく、特許請求の範囲第１項に記載の酸性化エタノ
   ール抽出物のカチオン交換クロマトグラフイーにより回
   収可能な前記集合体。
9. （９）特許請求の範囲第１項に記載の酸性化エタノール
   抽出物の有効量と適当な薬剤担体から成る薬剤組成物。
10. （１０）特許請求の範囲第４項に記載の酸性化エタノー
    ル抽出物の有効量と適当な薬剤担体から成る薬剤組成物
    。
11. （１１）特許請求の範囲第５項に記載の組成物の有効量
    と適当な薬剤担体から成る薬剤組成物。
12. （１２）特許請求の範囲第６項に記載の組成物の有効量
    と適当な薬剤担体から成る薬剤組成物。
13. （１３）特許請求の範囲第７項に記載の組成物の有効量
    と適当な薬剤担体から成る薬剤組成物。
14. （１４）特許請求の範囲第８項に記載の不均一ポリペプ
    チド集合体の有効量と適当な薬剤担体から成る薬剤組成
    物。
15. （１５）特許請求の範囲第９項に記載の組成物の腫瘍増
    殖阻害有効量とヒト腫瘍細胞を接触させることから成る
    該細胞の増殖阻害方法。
16. （１６）特許請求の範囲第１０項に記載の組成物の腫瘍
    増殖阻害有効量とヒト腫瘍細胞を接触させることから成
    る該細胞の増殖阻害方法。
17. （１７）特許請求の範囲第１１項に記載の組成物の腫瘍
    増殖阻害有効量とヒト腫瘍細胞を接触させることから成
    る該細胞の増殖阻害方法。
18. （１８）特許請求の範囲第１２項に記載の組成物の腫瘍
    増殖阻害有効量とヒト腫瘍細胞を接触させることから成
    る該細胞の増殖阻害方法。
19. （１９）特許請求の範囲第１３項に記載の組成物の腫瘍
    増殖阻害有効量とヒト腫瘍細胞を接触させることから成
    る該細胞の増殖阻害方法。
20. （２０）特許請求の範囲第１４項に記載の組成物の腫瘍
    増殖阻害有効量とヒト腫瘍細胞を接触させることから成
    る該細胞の増殖阻害方法。
21. （２１）特許請求の範囲第９項に記載の薬剤組成物と火
    傷又は創傷を接触させることから成る火傷又は創傷の治
    療方法。
22. （２２）特許請求の範囲第１０項に記載の薬剤組成物と
    火傷又は創傷を接触させることから成る火傷又は創傷の
    治療方法。
23. （２３）特許請求の範囲第１１項に記載の薬剤組成物と
    火傷又は創傷を接触させることから成る火傷又は創傷の
    治療方法。
24. （２４）特許請求の範囲第１２項に記載の薬剤組成物と
    火傷又は創傷を接触させることから成る火傷又は創傷の
    治療方法。
25. （２５）特許請求の範囲第１３項に記載の薬剤組成物と
    火傷又は創傷を接触させることから成る火傷又は創傷の
    治療方法。
26. （２６）特許請求の範囲第１４項に記載の薬剤組成物と
    火傷又は創傷を接触させることから成る火傷又は創傷の
    治療方法。
27. （２７）ヒト組織由来の酸性化エタノール抽出物であつ
    て、それぞれ分子量が約２０，０００ダルトン未満の複
    数のポリペプチドから成り、それぞれのポリペプチドは
    ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の
    成長を阻害するが正常ヒト包皮フイブロブラストの成長
    を促進するものである前記抽出物の調製方法であつて、 ａ、組織を処理して溶解細胞を生成し、細胞由来の溶解
    タンパク質を除去し、 ｂ、該溶解タンパク質を回収し、 ｃ、別に溶解タンパク質から約２０，０００ダルトン未
    満の見かけ分子量を有するポリペプチドを回収し、 ｄ、別に回収した該ペプチドをアツセイしてヒト腫瘍細
    胞の成長を阻害するか、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６
    ４）の成長を阻害するか、あるいは正常ヒト包皮フイブ
    ロブラストの成長を促進するかを同定し、 ｅ、前記のように同定されたポリペプチドを含有する酸
    性化エタノール抽出物を回収する、 ことを適当な条件下で行なう前記方法。
28. （２８）ヒト臍帯からの酸性化エタノール抽出物であつ
    て、約２０，０００−３０，０００ダルトンの見かけ分
    子量を有する組織由来増殖阻害物質（ＴＧＩ）を含有し
    、該阻害物質はヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（
    ＣＣＬ６４）の成長を阻害するが正常ヒト包皮フイブロ
    ブラストの成長を促進する性質を有するものである前記
    抽出物の調製方法であつて、 ａ、臍帯組織から静脈及び動脈を除去し、該組織を洗浄
    して全ての血液痕跡を除去し、 ｂ、該組織を処理して溶解細胞を生成し、該細胞由来の
    可溶タンパク質を除去し、 ｃ、溶解細胞の残りのタンパク質を溶解化及び単離して
    溶解化タンパク質を生成し、 ｄ、該溶解化タンパク質を回収し、 ｅ、別に溶解化タンパク質から約２０，０００−３０，
    ０００ダルトンの見かけ分子量を有するＴＧＩを回収し
    、 ｆ、別に回収した該ＴＧＩをアツセイして、その活性が
    ヒト腫瘍細胞の成長を阻害し、樹立ミンク肺細胞系（Ｃ
    ＣＬ６４）の成長を阻害し、正常ヒト包皮フイブロブラ
    ストの成長を増強するものであることを同定し、 ｇ、そのように同定されたＴＧＩを含有する酸性化エタ
    ノール抽出物を回収する、 ことを適当な条件下で行なうことから成る前記方法。
29. （２９）組織処理段階（ａ）が、組織をエタノールを含
    有する適当な酸性抽出バツフアー中に約４℃で懸濁し、
    該組織を適当な時間均一化して均一化組織を形成し、均
    一化組織を適当な時間約４℃で攪拌して溶解細胞を生成
    し細胞由来タンパク質を溶解化することから成る特許請
    求の範囲第２７項に記載の方法。
30. （３０）溶解化タンパク質からポリペプチドを別に回収
    する段階（ｃ）が該タンパク質の分子ふるいクロマトグ
    ラフイーである、特許請求の範囲第２７項に記載の方法
    。
31. （３１）ポリペプチドのアツセイ段階（ｄ）が、ポリペ
    プチドと、ヒト腫瘍細胞、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ
    ６４）あるいは正常ヒト包皮フイブロブラストとを別々
    に適当な条件下で接触させて、ヒト腫瘍細胞の成長を阻
    害するか、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の成長を
    阻害するか、あるいは正常ヒト包皮フイブロブラストの
    成長を増強するものであるか同定することから成る特許
    請求の範囲第２７項に記載の方法。
32. （３２）組織処理段階（ｂ）が、組織を適当なバツフア
    ー中に約４℃で懸濁し、該組織を適当な時間均一化して
    溶解細胞及び可溶タンパク質を形成し、可溶タンパク質
    を溶解細胞から除去することから成る特許請求の範囲第
    ２８項に記載の方法。
33. （３３）溶解細胞から残りのタンパク質を溶解化及び単
    離して溶解化タンパク質を生成する段階（ｃ）が、溶解
    細胞を適当な抽出バツフアー中に約４℃で適当な時間懸
    濁して溶解化タンパク質を生成し、溶解細胞から溶解化
    タンパク質を単離することから成る特許請求の範囲第２
    ８項に記載の方法。
34. （３４）溶解化タンパク質からポリペプチドを別に分離
    する段階（ｅ）が該タンパク質の分子ふるいクロマトグ
    ラフイーである特許請求の範囲第２８項に記載の方法。
35. （３５）ＴＧＩのアツセイ段階（ｆ）が、ＴＧＩと、ヒ
    ト腫瘍細胞、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）あるい
    は正常ヒト包皮フイブロブラストを別々に適当な条件下
    で適当な時間接触させ、ヒト腫瘍細胞の成長を阻害する
    か、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の成長を阻害す
    るかあるいは正常ヒト包皮フイブロブラストの成長を増
    強する活性を同定することから成る特許請求の範囲第２
    ８項に記載の方法。
36. （３６）組織由来増殖阻害物質−１（ＴＧＩ−１）と指
    称する組成物の調製方法であつて、先ず特許請求の範囲
    第２７項に記載の方法により酸性化エタノール抽出物を
    調製し、次に該酸性化エタノール抽出物から、ｉ）０．
    ０５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの２
    ６−３４％アセトニトリルの直線勾配、あるいはｉｉ）
    ０．０５−トリフルオロ酢酸を含有する２−プロパノー
    ルの１７−２３％２−プロパノールの直線勾配のいずれ
    かによる該酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマ
    トグラフイーによりＴＧＩ−１を規定の活性で回収する
    ことから成る前記方法。
37. （３７）組織由来増殖阻害物質（ＴＧＩ）と指称する組
    成物の調製方法であつて、先づ特許請求の範囲第２８項
    に記載の方法により酸性化エタノール抽出物を調製し、
    次に該酸性化エタノール抽出物からＴＧＩを、ｉ）０．
    ０５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの約
    ２８−３４％アセトニトリル直線勾配による該酸性化エ
    タノール抽出物の高性能液体クロマトグラフイーで規定
    された活性で回収するか、あるいはｉｉ）約０．６−０
    ．７ＭＮａＣｌのＮａＣｌ直線勾配で溶出してカチオン
    交換樹脂から活性の単一のピークとして回収することか
    ら成る前記方法。
38. （３８）組織由来増殖阻害物質−２（ＴＧＩ−２）と指
    称する組成物の調製方法であつて、先ず特許請求の範囲
    第２７項に記載の方法により酸性化エタノール抽出物を
    調製し、次に該酸性化エタノール抽出物から、ｉ）０．
    ０５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの３
    ５−３９％アセトニトリル直線勾配、あるいはｉｉ）０
    ．０５％トリフルオロ酢酸を含有する２−プロパノール
    の２３−２７％２−プロパノール直線勾配のいずれかに
    よる該酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマトグ
    ラフイーによりＴＧＩ−２を規定の活性で回収すること
    から成る前記方法。
39. （３９）ＣＭ− I 、ＣＭ−II、ＣＭ−III及びＣＭ−I
    Vと指称するポリペプチドの不均一集合体の製造方法で
    あつて、先ず特許請求の範囲第２７項に記載の方法によ
    り酸性化エタノール抽出物を調製し、次にカチオン交換
    クロマトグラフイーにより該酸性化エタノール抽出物か
    ら前記ポリペプチドの不均一集合体を回収することから
    成る前記方法。
40. （４０）特許請求の範囲第２７項に記載の方法により調
    製した酸性化エタノール抽出物。
41. （４１）特許請求の範囲第２８項に記載の方法により調
    製した酸性化エタノール抽出物。
42. （４２）特許請求の範囲第３６項に記載の方法により調
    製したＴＧＩ−１。
43. （４３）特許請求の範囲第３７項に記載の方法により調
    製したＴＧＩ。
44. （４４）特許請求の範囲第３８項に記載の方法により調
    製したＴＧＩ−２。
45. （４５）特許請求の範囲第３９項に記載の方法により調
    製したＣＭ− I 、ＣＭ−II、ＣＭ−III及びＣＭ−IVと
    指称するポリペプチドの不均一集合体。
46. （４６）標本からの試料中に存在するＴＧＩ−１の量を
    定量し、同様に測定した正常標本からの試料中に存在す
    る量と比較することから成り、その量に有意な差がある
    ことが腫瘍の存在を示すものである腫瘍の存在の検知方
    法。
47. （４７）標本からの試料中に存在するＴＧＩの量を定量
    し、同様に測定した正常標本からの試料中に存在する量
    と比較することから成り、その量に有意な差があること
    が腫瘍の存在を示すものである腫瘍の存在の検知方法。
48. （４８）標本からの試料中に存在するＴＧＩ−２の量を
    定量し、同様に測定した正常標本からの試料中に存在す
    る量と比較することから成り、その量に有意な差がある
    ことが腫瘍の存在を示すものである腫瘍の存在の検知方
    法。
49. （４９）標本からの試料中に存在するＣＭ− I 、ＣＭ
    −II、ＣＭ−III及びＣＭ−IVと指称するポリペプチド
    の不均一集合体の量を定量し、同様に測定した正常標本
    からの試料中に存在する量と比較することから成り、そ
    の量に有意な差があることが腫瘍の存在を示すものであ
    る腫瘍の存在の検知方法。
50. （５０）標本からの試料中に存在するＴＧＩ−１と形質
    転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）の量を別々に測定
    し、試料中に存在するＴＧＩ−１の量のＴＧＦ−αの量
    に対する比率を測定し、正常標本からの試料に関して比
    較比率を測定して前記標本についての比率と正常標本か
    らの比率を比較することから成り、前記比率の有意な変
    化が腫瘍の存在を示すものである腫瘍の存在の検知方法
    。
51. （５１）標本からの試料中に存在するＴＧＩと形質転換
    増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）の量を別々に測定し、
    試料中に存在するＴＧＩの量のＴＧＦ−αの量に対する
    比率を測定し、正常標本からの試料に関して比較比率を
    測定して前記標本についての比率と正常標本からの比率
    を比較することから成り、前記比率の有意な変化が腫瘍
    の存在を示すものである腫瘍の存在の検知方法。
52. （５２）標本からの試料中に存在するＴＧＩ−２と形質
    転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）の量を別々に測定
    し、試料中に存在するＴＧＩ−２の量のＴＧＦ−αの量
    に対する比率を測定し、正常標本からの試料に関して比
    較比率を測定して前記標本についての比率と正常標本か
    らの比率を比較することから成り、前記比率の有意な変
    化が腫瘍の存在を示すものである腫瘍の存在の検知方法
    。
53. （５３）標本からの試料中に存在するＣＭ− I 、ＣＭ
    −II、ＣＭ−III及びＣＭ−IVと指称するポリペプチド
    の不均一集合体と形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−
    α）の量を別々に測定し、試料中に存在するＣＭ− I
    、ＣＭ−II、ＣＭ−III及びＣＭ−IVと指称するポリペ
    プチドの不均一集合体の量のＴＧＦ−αの量に対する比
    率を測定し、正常標本からの試料に関して比較比率を測
    定して前記標本についての比率と正常標本からの比率を
    比較することから成り、前記比率の有意な変化が腫瘍の
    存在を示すものである腫瘍の存在の検知方法。
54. （５４）腫瘍を有する標本からの試料について試料中の
    ＴＧＩ−１、ＴＧＩ、ＴＧＩ−２あるいは、ＣＭ− I
    、ＣＭ−II、ＣＭ−III及びＣＭ−IVと指称するポリペ
    プチドの不均一集合体の１つあるいはそれ以上の存在を
    検知することから成り、それ等の特異的な組合せの存在
    あるいは非存在が腫瘍の特異的な型を示すものである腫
    瘍の型の決定方法。
55. （５５）腫瘍を有する標本からの試料について試料中の
    ＴＧＩ−１、ＴＧＩ、ＴＧＩ−２あるいは、ＣＭ− I
    、ＣＭ−II、ＣＭ−III及びＣＭ−IVと指称するポリペ
    プチドの不均一集合体のそれぞれの量を測定することか
    ら成り、それ等の特異的な量あるいは相対量の存在が腫
    瘍の特異的な型を示すものである腫瘍の型の決定方法。