JPS63258497A - 組織から誘導された腫瘍成長阻害剤、その調製方法及び使用 - Google Patents

組織から誘導された腫瘍成長阻害剤、その調製方法及び使用

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JPS63258497A
JPS63258497A JP62265201A JP26520187A JPS63258497A JP S63258497 A JPS63258497 A JP S63258497A JP 62265201 A JP62265201 A JP 62265201A JP 26520187 A JP26520187 A JP 26520187A JP S63258497 A JPS63258497 A JP S63258497A
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tgi
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ケニス・ケイ・イワタ
レスリー・アイ・ゴールド
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 」」へ１１ 本明細書全編にわたり各種の刊行物を引用している。こ
れらの刊行物は、本明細書及び特許請求の範囲に記載さ
れた発明の時点で当業者に周知の技術状態をより十分に
説明するために、その全体を本願の一部として本明細書
に組み入れる。
Ｂｉｅｈｅｌ［Ｂｉｃｈｅｌ、　　Ｎａｔｕｒｅ　　２
３１：　　４４９−４５０　　（１９７１）］は、腹水
腫瘍を有するマウスから腫瘍成長プラＩ〜−期に腫瘍の
ほとんどを除去すると、残りの腫瘍細胞の成長が著しく
増加したと報告している。十分成長した腹水腫瘍を有す
るマウスから得られた無細胞腹水を、成長中の腹水腫瘍
を有するマウスに注射すると、腹水成長に顕著な阻害か
もたらさ　　　“れな。前出のＢｉｃｈｅｌは更に、一
方か進行した腫瘍を有しており他方が初期の腫瘍を有す
る２匹のマウスを外科的に結合（益体結合）すると、初
期の腫瘍の成長に顕著な阻害がもたらされたとも述べて
いる。これらの報告［Ｂｉｃｈｅｌ、　Ｅｕｒｏｐ、　
Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒす２９１−２９６　（１９７０）及
び前出のＢｉｃｈｅｌ］に基づくと、皿体結合マウスの
腹膜中を循環し、十分に成長した腹水腫瘍により形成さ
れる無細胞腹水液中に存在する拡散性阻害成分の存在が
仮定された。この阻害成分の性質は特徴付けられていな
いが、腹水腫瘍の成長速度はマウスに存在する腫瘍組織
の量に依存すること、及び腫瘍組織の量は阻害成分の生
成量により決定されることが推測された。
腫瘍成長阻害活性を有する物質については既に記載され
ている。ＭｃＭａｈｏｎ他［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾
ｃａｄ　。
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９．４５６−４６０　（１９８２
）］は、非悪性ラット肝肝細胞の増殖を阻害し且つ悪性
ラット肝臓細胞の増殖を阻害しない２６０００ドルトン
の物質をラットの肝臓から精製した。他の成長阻害物質
も培養ニワトリを髄細胞中で同定されている［Ｋａｇｅ
他、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　
５８：　３４７−３６０　（１９７０）；１１ａｒｒｉ
Ｂｔｏｎ他、　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ！、　　Δｃａｄ
、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　７７：４２３−４２７　
（１９８０）及び５ｔｅｃｋ他、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ
ｏｌ、　８３５６２−５７５　　（１９７９）］。
Ｈｏ１ｌｅｙイ也［Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃ
ａｃ１．　　Ｓｃｉ、　　７７：　　５９８９（１９８
０）及びＣｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　Ｉｎｔ、　Ｒｅｐｏｒ
ｔｓ″７：　５２５−５２６（１９８３）］ハ、アフリ
カミドリザルＢ５Ｃ−１１ｍ胞から単離した物質がＢ５
Ｃ−１細胞、ヒト乳房腫瘍細胞及び正常ヒト乳房細胞の
成長を阻害すると報告している。より最近ではこの阻害
物質の生化学的特徴付け［Ｔｕｃｋｅｒ他、５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２２６：　７０５−７０７　（１９８４）；Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Δｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　８２：　１１９−１２３（１９８５）］の結果、
該物質は２５０００ドルトンの２本鎖ヒト血小板から誘
導されたＴＧＦ−βと呼称されるポリペプチドと同一で
あるかあるいは高度に関連することが判明した［Ａｓ５
ｏｉａｎ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｎ２５８：　
７１５５−７１６０　（１９８３）］。ヒト血小板［５
ｐｏｒｎ及びＲｏｂｅｒｔｓ、国際特許出願第ＷＯ３４
１０１１０６号］又はヒ１へ胎盤［Ｆｒｏｌｉｋ他（１
９８３）　ＰＮＡＳ　８０３６７６−３６８０；　５ｐ
ｏｒｎ及びＲｏｂｅｒｔｓ　（１’１０８４１０１１０
６）］のいずれがから誘導したＴＧＦ−βは、形質転換
成長因子α又は上皮成長因子の存在下で非腫瘍性うット
腎臓線維芽細胞及び他の細胞の軟寒天的基質非依存性コ
ロニー成長をもたらす。
より最近では、細胞成長調節剤としてのこの分子の三機
能性がＲｏｂｅｒｔｓ他［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ　。
Ｓｃｉ、　８２：　１１９−１２３　（１９８５）］に
より確認された。
Ｉｕ＋ａｔａ他［Ｊ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　５ｕｐｐ１．５：　４０１（１９８２）］は、
成長刺激及び成長阻害活性をアッセイするマイクロタイ
タープレートシステムについて記載している。Ｔｏｄａ
ｒｏ他［Ｔｏｄａｒｏ他、Ｔｕｍｏｒ恒且」旦７立山工
Ｊ吐れＵ」懐」ｎ月μ土ｌ旺。
Ｂｒ１ｓｔｏトＭｙｅｒｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｙｍｐｏ
ｓｉａ、　Ｖｏｌｕｍｅ　４゜Ｏｗｅｎｓ、八、１１．
、　Ｃｏｆｆｅｙ、　Ｄ、Ｓ、、及びＢａｙｌｉｎ、　
Ｓ、Ｂ、。
編（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８２）、　
ｐｐ、　２０５−２２４）］及びＬｕａｔａ他［Ｆｅｄ
、　Ｐｒｏｃ、　Ｆｅｄ、八Ｍ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、
　Ｂｉｏｌ。
４２：　１’８３３　（１９８３）］は、培養で繁殖し
たヒト腫瘍細胞の組織培養液から腫瘍阻害活性を単離し
たと報告している。これらの報告中に記載されている所
見は緒言に止どまり、詳細についてはほとんど記載して
いない。
１９８４年４月２０日、本発明の発明者のひとりである
Ｋｅｎｅｎｔｈ　Ｋ、　Ｉｗａｔａが共同発明者として
名を連ねる米国特許出願第６０２５２０号発明の名称［
実質的に精製された腫瘍成長阻害因子（ＴＩＦ）”５ｕ
ｂｓＬａｎｔｉａｌ−ｌｙ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｔｕｍ
ｏｒ　Ｇｒｏｕ＋ｔｈ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃ
ｔｏｒ（ＴＩＦ）”Ｊが米国特許庁に出願された。この
出願は、培養で繁殖したヒト腫瘍細胞中に存在し且つ該
細胞から誘導された十分に規定されていない物質の予備
同定に係る。この物質は、先に報告されている腫瘍阻害
活性に類似している。［Ｔｏｄａｒｏ他、ｋ眩り販旦」
旦竺ゴ朋凪遣エルｊ力Ｉｓ　ａｌ■±１匡−ｃａｔｉｏ
ｎｓ、　Ｂｒ１ｓｔｏトＭｙｅｒｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓ
ｙｍｐｏｓｉａ。
Ｖｏｌｕｍｅ　４．　Ｑｕｅｅｎｓ、＾Ｈ，，Ｄ、Ｓ、
及びＢａｙｌｉｎ、　Ｓ、Ｂ、。
編（八ｃａｄｅｍｉｃ　　ｌ’ｒｅｓｓ、　　１９８２
）、　　ｐｐ、　　２０５−２２４；　　Ｉｗａｔａ他
、Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　Ｆｅｄ、八ｍ、　Ｓｏｃ、　
Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　４２：１８３３　　（１９８３
）］。
次いでＴｏｄａｒｏ［Ｔｏｄａｒｏ、　Ｊ、Ｇ、、　Ｅ
ｉｅｎｅｔｉＣ圏ｔ±ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ
、　Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃ
ｈ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
　ｏｆ　ＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａ；　Ｖａｎｃ
ｏｕｖｅｒ、　Ｂ、Ｃ，、Ｃａｎａｄａ）＾ｂｓ、　１
３といわれる腫瘍細胞成長阻害特性を有する２つの因子
を報告した。しかしなから、Ｔｏｄａｒｏは該因子の出
所、その組織型、因子が誘導された種、又は因子精製方
法について報告していない。
発明の要約 本発明は、夫々約２６０００ドルトンの分子量を有して
おり、各々約１３０００ドルトンの見掛けの分子量を有
しており且つ１個以上のジスルフィド結合により相互に
結合された２つのポリペプチドから構成される二量体で
ある複数の酸性タンパク質を含むヒト組織から誘導され
た酸性化エタノール抽出物に係る。該抽出物は、ヒト腫
瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長
を阻害し且つ正常なヒト包皮線維芽細胞の成長を刺激す
る特性を有している。ヒト腫瘍細胞成長に対する阻害活
性は、酸性化エタノール抽出物の温度を約３分間約１０
０℃に上げた場合、あるいは酢酸を加えた場合に破壊さ
れず、該阻害活性は酸性化エタノール抽出物が約２３℃
でなく約４℃で調製される場合に強化される。
本発明はまた、実質的に全血液、全細胞外可溶性成分及
び実質的に全細胞内可溶性成分を除去するように処理さ
れたヒト腰帯から誘導された酸性化エタノール抽出物に
も係り、該抽出物は、夫々約２６０００ドルトンの見掛
けの分子量を有しており、各々約１３０００ドルトンの
見掛けの分子量を有しており且つ非還元条件下でジスル
フィド結合により相互に結合された２つのポリペプチド
から構成される二量体である少なくとも２つの酸性タン
パク質を含む。各抽出物は、ヒト腫瘍細胞及び樹立ミン
ク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を阻害し且つ正常な
ヒト包皮線維芽細胞の成長を刺激する特性を有しており
、ヒト腫瘍細胞成長に対する阻害活性は、酸性化エタノ
ール抽出物の温度を約３分間約１００℃に上げた場合、
あるいは酸性化エタノール抽出物が酢酸中に約１．０モ
ルとなるまで酢酸を加えた場合に破壊されない。
本発明は更に、夫々約２６０００ドルトンの分子量を有
しており、ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣ
Ｌ　６４）の成長を阻害し且つ正常なヒト包皮線維芽細
胞の成長を刺激する特性を有する複数の酸性タンパク質
を含む酸性化エタノール抽出物を、例えばヒト腰帯又は
ヒト胎盤のようなヒト組織から調製する方法に係る。該
方法は、酸可溶性タンパク質を産生させるように適当な
条件下で組織ソースを処理し、可溶化タンパク質を回収
し、約２６０００ドルトンの見掛けの分子量を有するタ
ンパク質を可溶化抽出物から分離回収し、該回収したタ
ンパク質をアッセイし、ヒト腫瘍細胞の成長を阻害する
が、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を阻害
するが、又は正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を強化する
タンパク質を同定し、こうして同定したタンパク質を含
む酸性化エタノール抽出物を回収することから成る。
本発明はまた、ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（
ＣＣＬ　６４）の成長を阻害し且つ正常なヒト包皮線維
芽細胞の成長を刺激する特性を有する約２６０００ドル
Ｉ〜ンの見掛けの分子量のタンパク質の混合物である組
織誘導型（ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ）成長阻害剤
（ＴＧＩ）を片む酸性化エタノール抽出物をヒトＭＷ帯
から調製する方法に係る。該方法は適当な条件下に、組
織を除去し、全痕跡量の血液及び汚染タンパク質を除去
するように組織を洗浄し、酸性化エタノール抽出により
組織から残りのタンパク質を可溶化及び単離させて可溶
化タンパク質を生し、約２６０００トルｌ〜ンの見掛（
つの分子量を有するＴＧＩを可溶化タンパク質から分離
回収し、分離回収したＴＧ＋タンパク質をアッセイし、
ヒト腫瘍細胞の成長を阻害し、樹立ミンク肺細胞系（Ｃ
ＣＬ　６４）の成長を阻害し、正常ヒト包皮線維芽細胞
の成長を強化する活性を同定し、こうして同定したＴＧ
Ｉを含む酸性化エタノール抽出物を回収することから成
る。
本発明は更に、夫々約１３０００ドルｌ〜ンの見掛けの
分子量を有しており且つジスルフィド結合により相互に
結合された２つのポリペプチドから構成される二量体で
あるタンパク質を含む組織誘導型成長阻害剤１（ＴＧＩ
Ｉ）と呼称される組成物を提供する。ＴＧＩ−１はヒト
腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成
長を阻害し且つ正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を阻害し
ない特性を有している。
ＴＧｉｌは約２６０００ドルＩ−ンの見掛けの分子量を
有しており、エーテル−エタノール沈降後、フェニル−
セファロースを用いた疎水性相互作用クロマトクラフィ
で約１．５Ｍの酢酸アンモニウム及び約３１％エチレン
グリコールて、及び０．０５％のトリフルオロ酢酸を含
むμＢｏｎｄａｐａｃｋ（登録商標）０１８カラム上ア
セ）・二ｌ・リルの分離勾配を使用する酸性化エタノー
ル抽出物の高性能液体クロマ１へグラフィて約２７％ア
セトニトリルて定義される活性として回収可能であり、
０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む２−プロパノール
の分離勾配を使用する酸性化エタノール抽出物の高性能
液体クロマトグラフィで約４０〜４１％の２−プロパノ
ールて回収可能である。本発明＝４３− は更にＴＧＩ−１の調製方法も提供する。
本発明はまた、少なくとも２つのタンパク質を含んでお
り、ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６
４）の成長を阻害し且つ正常ヒト包皮線維芽細胞の成長
を阻害しない特性を有しており、各タンパク質が約２６
０００ドルトンの見掛けの分子量を有する組織誘導型成
長阻害剤（ＴＧＩ）と呼称される組成物も提供する。該
組成物は、０．０５％の１〜リフルオロ酢酸を含むアセ
トニトリルの直線勾配を使用する酸性化エタノール抽出
物の高性能液体クロマトグラフィて約２８〜３４％のア
セトニトリルで定義される活性として回収可能であり、
直線ＮａＣｌ勾配により約０．６〜０．７ＭのＮａＣｌ
て溶離するとき力チオン交換樹脂から定義される活性の
単一ピークとして分解され、フェニル−セファロースの
分離勾配を使用するヒト臍帯からの酸性化エタノール抽
出物の高性能液体クロマトグラフィで定義される活性と
して回収可能である。
４４一 本発明は更に、ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（
ＣＣＬ　６４）の成長を阻害し且つ正常ヒト包皮線維芽
細胞の成長を阻害しない特性を有しており、約２６００
０ドルトンの見掛けの分子量を有するタンパク質を含む
組織誘導型成長阻害剤２（ＴＧＩ−２）と呼称される組
成物を提供する。ＴＧＩ〜２は、夫々約１３０００ドル
１〜ンの見掛（つの分子量を有しており且つジスルフィ
ド結合により相互に結合された２つのポリペプチドから
構成される二量体である。
ＴＧＩ−２は、エーテル−エタノール調製後、フェニル
−セファロースを用いた疎水性相互作用クロマトグラフ
ィで約１．５Ｍの酢酸アンモニウム及び約３１％のエチ
レングリコールで、及び０．０５％のＩ−リフルオロ酢
酸を含むアセトニトリル する酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマｌ−グ
ラフィてＣ１８カラム上の約２８〜３０％のアセトニト
リルで定義される活性として回収可能であり、０、０５
％のトリフルオロ酢酸を含むＣＮカラムで２−プロバノ
ールの直線勾配を使用する酸性化エタノール抽出物の高
性能液体クロマ１へグラフィで約４４％の２−プロパノ
ールで定義される活性として回収可能である。本発明は
更に、ＴＧＩ−２の調製方法も提供する。
本発明はまた、約３００００ドルトン未満の見掛けの分
子量を有しており、実質的にヒト腫瘍細胞系（Ａ５４９
）の成長を阻害し且つ樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６
４）の成長を阻害しない特性を有するへ４３１細胞の条
件付は培地からのポリペプチドも提供する。
更に本発明は、ヒト腫瘍細胞系 阻害し且つ樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長
を阻害しない特性を有するＣＭ−Ｉと呼称されるポリペ
プチドを提供する。
本発明は更に、約２６０００１＜ルＩ・ンの見掛けの分
子量を有するタンパク質も提供する。該タンパク質は、
約１３０００ドル１ヘンの見掛けの分子量を有しており
且つジスルフィド結合により結合された２つのポリペプ
チドから構成される二量体である。
該タンパク質は、ヒ１へ腫瘍細胞系（八５４９）及び樹
立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の腫瘍成長阻害活性
を示す。該タンパク質は１．０Ｍ酢酸及び０．１％１−
リフルオロ酢酸の酸中に可溶性であり、約１００°Ｃま
ての熱に安定であり、３９％までのアセＩ〜二Ｉ・リル
及び４９％まての２−プロパノールに安定である。該タ
ンパク質はＴＧＩ−１又はＴＧＩ２と呼称される。
本発明はまた、１位のアラニンから開始して１１２位の
セリンて終止する第２９図に示す１１２個のアミノ酸を
含む腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質も提供する。
好ましくは、このタンパク質は第２９図に示すように１
位のアラニンから開始して１１２位のセリンで終止する
１１２個のアミノ酸を有する精製タンパク質である。該
タンパク質は、−９３位のセリンから開始して１１２位
のセリンで終止する第２９図に示す２０５個のアミノ酸
から構成されてもよい。従って、この２０５個のアミノ
酸から成る配列は、成熟タンパク質の完全配列と共に腫
瘍成長阻害活性を有するタンパク質の部分的前駆配列を
含んでいる。
本発明は更に、１位のアラニンから開、始して１１２位
のセリンで終止する第２９図に示す１１２個のアラニン
を含む腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードす
る核酸分子も提供する。該核酸分子は、−９３位のセリ
ンから開始して１１２位のセリンて終止する第、２９図
に示す全タンパク質をコードしてもよい。あるいは、核
酸分子は１位のアラニンから開始して１１２位のセリン
て終止する第２９図に示す機能タンパク質に見いだされ
る１１２個のアミノ酸のみをコードしてもよい。これら
の核酸分子はｃＤＮΔ、ゲノムＤＮへ又は＋ｎ　ＲＮ　
八であり得る。
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むプラスミド、及
び適当な宿主細胞中に該プラスミドを含む宿主ベクター
システムも提供する。この宿主ベクターシステムは、本
発明のタンパク質を産生ずるのに適当であるとして従来
技術で知られているものであればどのようなプラスミド
及びベクターシステムでもよい。適当な宿主細胞は細菌
細胞又は真核細胞であり得る。
本発明は更に、本発明の宿主中でタンパク質を産生させ
るべく、ベクターシステムを成長させ、こうして産生さ
れたタンパク質を回収することから成るタンパク質の産
生方法も提供する。
本発明は更に、抽出物、ＴＧＩ−Ｉ、ＴＧＩ、　ＴＧＩ
２、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質、Δ４３１細
胞の条件付は培地から回収可能なポリペブチ１〜、又は
ＣＭ−１のいずれか１種の有効量と、適当な医薬キャリ
アとから成る医薬組成物、並びにヒト腫瘍細胞系 を阻害するための方法も提供する。該組成物は熱傷の治
療又は創傷の癒合にも使用され得る。
本発明はまた、特許請求の試料中に存在しているＴＧＩ
Ｉ、ＴＧＩ又はＴＧＩ２、腫瘍成長阻害活性を有するタ
ンパク質、Ａ４３１細胞の条件付は培地から回収可能な
ポリペプチド、又はＣＭ−１の量を定量し、こうして定
量された量を正常な被験体からの試料中に存在している
量と比較し、量の顕著な差の存在により腫瘍の存在を指
示することから成る腫瘍の存在の検出方法にも係る。更
に本発明は、特許請求の試料中に存在しているＴＧｉｌ
、ＴＧＩ、　ＴＧＩ２、腫瘍成長阻害活性を有するタン
パク質、ＣＭ−Ｉ、又はＡ４３１細胞の条件付＋−１培
地から回収可能なポリペプチドの量、及び被験体からの
試料中に存在している形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α
）の量を別々に定量し、試料中に存在しているＴＧｉｌ
、ＴＧＩ、　ＴＧＩ２、腫瘍成長阻害活性を有するタン
パク質、ＣＭ−Ｉ、又はＡ４３１細胞の条件付は培地か
ら回収可能なポリペプチドの量、又はその異種混合物の
量と存在しているＴＧＦ−αの量との比を決定し、正常
特許請求の試料における比較比を決定し、被験体におけ
る比を正常被験体における比と比較し、これらの比の顕
著な相違により腫瘍の存在を指示することから成る腫瘍
の存在の検出方法にも係る。
最後に本発明は、腫瘍を有する特許請求の試料について
、試料中に存在するＴＧｉｌ、ＴＧＩ、ＴＧＩ２、腫瘍
成長阻害活性を有するタンパク質、ＣＭ−Ｉ、又はＡ４
３１細胞の条件付は培地から回収可能なポリペプチドの
１種以上の存在を決定し、これらの特異的組み合わせの
有無、又はその特異的量もしくは相対量の存在により特
定の腫瘍型を指示することから成る腫瘍の分類方法にも
係る。。
口のｉ、旧ｆモロ ヒト組織から誘導された酸性化エタノール抽出物か製造
された。この抽出物は複数のタンパク質を含んでいる。
タンパク質の各々は、約３００００Ｆルトン未満、特定
的には約２６０００ドルトンの見掛けの分子量を有して
おり、夫々約１３０００ドル１〜ンの見掛けの分子量を
有する２つのポリペプチドから構成される二量体であっ
て、各二量体は非還元条件下でジスルフィド結合により
相互に結合されている。抽出物は、ヒト腫瘍細胞及び樹
立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を阻害し、且
つ正常ヒ１へ包皮線維芽細胞の成長を刺激する特性を有
している。ヒト腫瘍細胞成長に対する抽出物の阻害活性
は、酸性化エタノール抽出物の温度を約３分間約１００
℃に上げた場合、あるいは抽出物が酢酸中に約１０モル
となるまで酢酸を加ええた場合に破壊されない。酸性化
エタノール抽出物の阻害活性は、約２３℃でなく約４℃
で調製した場合に強化される。
好適具体例において、ヒト組織はヒト腰帯であるが、例
えばヒト胎盤のような他の組織も使用できる。
実質的に全血液及び全細胞外可溶性成分を除去するよう
に処理されたヒト請帯から誘導され、少なくとも２つの
酸性タンパク質を含む酸性化エタノール抽出物も製造さ
れた。タンパク質の各々は約３００００ドルトン未満、
特定的には約２６０００ドルトンの見掛けの分子量を有
しており、夫々約１３０００ドル１ヘンの見掛けの分子
量を有しており且つ非還元条件下にジスルフィド結合に
より結合された２つのポリペプチドから成る二量体であ
る。抽出物は、ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（
ＣＣＬ６４）の成長を阻害し、且つ正常ヒト包皮線維芽
細胞の成長を刺激する特性を有している。ヒト腫瘍細胞
成長に対する阻害活性は、酸性化エタノール抽出物の温
度を約１００℃に約３分間上げた場合、あるいは酸性化
エタノール抽出物が酢酸中に約１．０モルとなるまで酢
酸を加えた場合に破壊されない。
当業者に周知の技術、例えば高性能液体クロマトグラフ
ィ及びカチオン交換クロマトグラフィを使用して、酸性
化エタノール抽出物の各種の成分を製造することができ
る。従って、組織誘導型成長阻害剤１（ＴＧＩ−１）と
呼称されるタンパク質は、ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク
肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を阻害し、且つ正常ヒ
ト包皮線維芽細胞の成長を阻害しない特性を存する。Ｔ
Ｇｉｌは、約２６０００ドルトンの見掛けの分子量を有
しており、夫々１３０００ドル１〜ンの見掛けの分子量
を有しており且つ非還元条件下てジスルフィド結合によ
り相互に結合された２つのポリペプチドから構成される
二量体である。ＴＧｉｌは、エーテルエタノール沈降後
のフェニル−セファロースを用いた疎水性相互作用クロ
マトグラフィで約１．５Ｍの酢酸アンモニウム及び３１
％のエチレングリコールて、及び０．０５％トリフルオ
ロ酢酸を含むＣ１Ｂカラム上アセトニトリルの分離勾配
を使用する酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマ
トグラフィで約２６〜３４％好ましくは２７％のアセト
ニトリルで定義される活性として回収可能であり、また
、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む２−プロパノー
ルのＣＮカラム上分離勾配を使用する酸性化エタノール
抽出物の高性能液体クロマトグラフィて約４０〜４１％
の２−プロパノールで定義される活性として回収可能で
ある。
ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）
の成長を阻害し、且つ正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を
阻害しない特性を有する少なくとも２つのポリペプチド
を含む組織誘導型成長阻害剤（ＴＧＩ）と呼称される別
の組成物らついても記載する。
ＴＧＩハ約２００００〜３００００ドルＩ−”ｙ　（１
）範囲、好ましくは約２６０００ドルトンの見掛けの分
子量を有している。ＴＧＩは、直線ＮａＣｌ勾配により
約０．６〜０．７８のＮａＣｌで溶離するとき例えばＣ
Ｍ−ＴＩｔｌＳＡＣＲＹＬ（登録商標）樹脂のようなカ
チオン交換樹脂から定義される活性の単一ピークとして
分解され、０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニ
トリルの直線勾配を使用する酸性化エタノール抽出物の
高性能液体クロマトグラフィて約２８〜３４％のアセト
ニトリル定義される活性として回収可能であり、フェニ
ル−セファロースの分離勾配を使用するヒト腰帯からの
酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマトグラフィ
上の定義される活性として回収可能である。
ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）
の成長を阻害し、且つ正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を
阻害しない特性を有するタンパク質である組織誘導型成
長阻害剤２（ＴＧＩ−２）と呼称される別の組成物につ
いても記載される。ＴＧＩ−２は約２６０００ドルトン
の見掛けの分子量を有しており、夫々約１３０００ドル
トンの見掛けの分子量を有しており且つ夫々非還元条件
下にジスルフィド結合により相互に結合された２つのポ
リペプチドから構成される二量体である。ＴＧＩ−２は
、０．０５％トリフルオロ酢酸を含むＣ１８カラム上ア
セト二１ヘリルの分離勾配を使用する酸性化エタノール
抽出物の高性能液体クロマトグラフィで約３５〜３９％
のアセトニトリルで定義される活性として、及びエーテ
ルエタノール沈降後のフェニル−セファロースを用いた
疎水性相互作用クロマトグラフィで約１．５Ｍの酢酸ア
ンモニウム及び３１％のエチレングリコールで、更＝５
６− に０．０５％のトリフルオロ酢酸を含むＣＮカラム上２
−プロパノールの分離勾配を使用する酸性化エタノール
抽出物の高性能液体クロマトグラフィで約４３〜４５％
好ましくは４４％の２−プロパノールで定義される活性
として回収可能である。
更に、ヒト腫瘍細胞の成長を阻害するが、樹立ミンク肺
細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を阻害しない特性を有し
ており、酸性化エタノール抽出物のカチオン交換クロマ
トグラフィにより回収可能なＣＭ−Ｉと呼称されるポリ
ペプチドも提供される。
最後に、約３００００ドルトン未満の見掛けの分子量を
有しており、ヒト細胞系（Ａ５４９）の成長を実質的に
阻害するが、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成
長を阻害しないへ４３１ｉ胞の条件付は培地から回収可
能なポリペプチドが提供される。
本発明はまた、約２６０００ドルトンの見掛けの分子量
を有するタンパク質も提供する。該タンパク質は、約１
３０００ドルＩ〜ンの見掛けの分子量を有しており且つ
ジスルフィド結合により結合された２つのポリペブチ１
〜から構成される二量体である。
該タンパク質は、ヒト腫瘍細胞系（Ａ５４９）及び樹立
ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の腫瘍成長阻害活性を
示す。該タンパク質は１．０Ｍ酢酸及び０１％トリフル
オロ酢酸の酸に可溶性であり、約１００℃までの熱に安
定であり、３９％までのアセ１ヘニトリル及び４５％ま
での２−プロパノールに安定である。該タンパク質はＴ
Ｇｉｌ又はＴＧＩ−２と呼称され得る。
本発明は更に、１位のアラニンから開始して１１２位の
セリンて終止する第２９図に示す１１２個のアミノ酸を
含む腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質も提供する。
好ましくは、このタンパク質は第２９図に示すように１
位のアラニンから開始して１１２位のセリンて終止する
１１２個のアミノ酸を有する精製タンパク質てあり得る
。この１１２個のアミノ酸から成るタンパク質は、腫瘍
成長阻害活性を有するタンパク質の成熟形である。該タ
ンパク質はま。
た、−９３位のセリンから開始して１１２位のセリンで
終止する第２９図に示す２０５個のアミノ酸を含んでも
よい。従って、この２０５個のアミノ酸から成る配列は
、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質の部分的前駆配
列と、成熟タンパク質の完全配列とを含んている。
本発明は更に、１位のアラニンから開始して１１２位の
セリンで終止する第２９図に示す１１２個のアミノ酸を
含む腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする
核酸分子も提供する。核酸分子は、−９３位のセリンか
ら開始して１１２位のセリンで終止する第２９図に示す
全タンパク質をコードし得る。
あるいは、核酸分子は１位のアラニンから開始して１１
２位のセリンで終止する第２９図に示す機能タンパクに
見いだされる１１２個のアミノ酸のみをコードし得る。
これらの核酸分子はｃＤＮ八、ゲノムＤＮΔ又はｍＲＮ
八であり得る。
所定のアミノ酸及びこれらのアミノ酸をコードする核酸
がタンパク質の機能を変えずに変化し得ることは、当業
者に自明である。本発明は、機能タンパク質を産生ずる
アミノ酸及びヌクレオチド配列の全変形種を包含する。
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むプラスミド、及
び適当な宿主細胞中に該プラスミドを含む宿主ベクター
システｌ＼も提供する。この宿主ベクターシステムは、
本発明のタンパク質の産生に適当であるとして当業者に
周知のものであればどのようなプラスミド及びベクター
であってもよい。
適当な宿主細胞は細菌細胞又は真核細胞であり得る。
本発明は更に、宿主中に腫瘍成長阻害活性を有するタン
パク質を産生させるべく本発明の宿主ベクターシステム
を成長させ、こうして産生されたタンパク質を回収する
ことから成るタンパク質の産生方法も提供する。
本発明は更に、１位のアラニンから開始して１１２位の
セリンで終止する第２９図に示す１１２個のアミノ酸を
含む腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質から誘導され
たポリペプチドも提供する。該ポリペプチドは、９位の
アルギニンから開始して２８位のロイシンで終止する第
２９図に示す２０個のアミノ酸を含んでいる。本発明は
更に、該ポリペプチドに含まれるエピトープに特異的に
結合する抗体も提供する。該抗体はモノクローナルでも
ポリクローナルでもよい。
本発明はまた、１位のアラニンから開始して１１２位の
セリンで終止する第２９図に示す１１２個のアミノ酸を
含む腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質に含まれるエ
ピトープに特異的に結合する抗体も提供する。該抗体は
モノクローナルでもポリクローナルでもよい。
本発明はまた、抗体とタンパク質に含まれるエピトープ
との複合体を形成するべく適当な条件下でヒｌ−特許請
求の試料を本発明の抗体と接触さぜ、こうして形成され
た複合体を検出し、これにより腫瘍を診断することから
成る腫瘍の診断方法も提供する。適当な条件としては、
出願人らは複合体の形成を助長する当該技術分野で周知
の全条件を予想している。
本発明は、本発明の抗体及び医薬上許容可能なキャリア
を含む医薬組成物を提供する。医薬上許容可能なキャリ
アは当該技術分野て周知の全キャリアを含む。−例とし
てキャリアは食塩水であり得る。本発明は更に、有効腫
瘍治療量の該医薬組成物を被験体に投与することから成
る腫瘍の治療方法も提供する。本発明は更に、有効増殖
型障害治療量の該医薬組成１勿を被験体に投与すること
から成る、増殖型障害の治療方法も提供する。該組成物
は各種の増殖型障害を治療するために使用され得る。該
組成物が有効な増殖型障害の例は、動脈硬化症、炎症及
び乾せんである。
ＴＧＩ−Ｉ、ＴＧＩ、　ＴＧＩ２、腫瘍成長阻害活性を
有するタンパク質、ＣＭ−Ｉ、又は＾４３１細胞の条件
イ」す培地から回収可能なポリペプチド、又はこれらの
各種の組み合わせは、有効量のＴＧＩ−Ｉ、ＴＧＩ、　
ＴＧＩ２、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質、ＣＭ
−Ｉ、又はΔ４３１　＋４１胞の条件材は培地から回収
可能なポリペプチド又はこれらの生物学的に活性なフラ
グメントを適当な医薬キャリアと共に含有する医薬組成
物で使用され得る。有効量は、治療すべき適応症、患者
又は腫瘍進行段階に応じて当業者に周知の方法により各
種の腫瘍成長阻害剤の間で変化し得る。
同様に、食塩水又は他の水溶液、ゲル、クリーム等のよ
うな適当なキャリアも当業者に周知である。
ＴＧＩ−Ｉ、ＴＧＩ、　ＴＧＩ−２、腫瘍成長阻害活性
を有するタンパク質、ＣＭ−Ｉ、又はへ４３１細胞の条
件材り培地から回収可能なボリペプヂ１〜は、ヒト腫瘍
細胞を有効成長阻害量のＴＧＩ−Ｉ、ＴＧＩ、　ＴＧＩ
２、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質、ＣＭ−Ｉ、
又はΔ４３１細胞の条件材は培地から回収可能なポリペ
プチドと接触させることにより、例えば癌、黒色腫又は
白血病細胞のようなヒト腫瘍細胞の成長を阻害するため
に使用され得る。ＴＣ，１Ｉ、ＴＧＩ、ＴＧＩ２、腫瘍
成長阻害活性を有するタンパク質、ＣＭ−Ｉ、又はへ４
３１細胞の条件材は培地から回収可能なポリペプチドは
、熱傷又は創傷を、有効量のＴＧＩＩ、ＴＧＩ、ＴＧＩ
−２、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質、ＣＭ−Ｉ
、又はＡ　４３１　細胞の条件材は培地から回収可能な
ポリペプチド及び適当な医薬キャリアを含む医薬組成物
と接触させることにより、熱傷を治療するため、又は創
傷の癒合を助長するためにも使用され得る。
本発明はまた、被験体に投与することから成る被験体の
増殖型障害の治療方法も提供する。本発明の各種のタン
パク質の有効量は、増殖型障害の治療に有効な適当な医
薬キャリア中に１位のアラニンから開始して１１２位の
セリンで終止する第２９図に示す１１２個のアミノ酸を
含む腫瘍成長阻害剤−６４＝ 性を有するタンパク質の有効量を含む。本発明のタンパ
ク質を使用して各種の増殖型障害を治療することができ
る。増殖型障害の例は、動脈硬化症、炎症、及び乾せん
である。本発明の各種のタンパク質は免疫調節剤として
も使用され得る。
夫々約３００００ドルトン未満、好ましくは約２６００
０ドルトンの分子量を有しており、夫々ヒト腫瘍細胞及
び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を阻害し
且つ正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を刺激する特性を有
する複数のタンパク質から成る酸性化エタノール抽出物
をヒト組織から調製する方法も開示され、該方法は適当
な条件下で、例えばタンパク質を可溶化するように処理
して組織がち誘導された可溶化タンパク質を除去するこ
とにより組織を処理し、可溶化タンパク質を回収し、約
３００００ドル１〜ン未満の見掛けの分子量を有するタ
ンパク質を可溶化組織から分離回収し、分離回収された
タンパク質をアッセイし、ヒト腫瘍細胞の成長を阻害す
るか又は樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を
阻害するか又は正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を強化す
るタンパク質を同定し、こうして同定されたタンパク質
を含む酸性化エタノール抽出物を回収することから成る
。
本発明の一態様によると組織の処理は、約４℃のエタノ
ールを含む適当な酸性抽出緩衝液に組織を懸濁させ、均
質化組織を形成するのに適当な時間組織を均質化させ、
可溶化タンパク質を生成するのに適当な時間約４℃で均
質化組織を撹拌することから成る。
本発明の一態様によると、可溶化タンパク質からのポリ
ペプチドを別々に回収するには、タンパク質の分子ふる
いクロマトグラフィを用いる。
本発明の一態様によるとタンパク質のアッセイは、ヒト
腫瘍細胞、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）又は正
常ヒト豊肥線維芽細胞を適当な条件で適当な時間ポリペ
プチドと接触させ、ヒト腫瘍細胞の成長を阻害するが、
樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を阻害する
が、あるいは正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を強化する
ポリペプチドを同定する。
約２００００〜３００００ドルＩ〜ン、好ましくは約２
６０００ドルトンの見掛けの分子量を有しており、ヒト
腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成
長を阻害し且つ正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を刺激す
る特性を有する少なくとも２つのタンパク質から構成さ
れる組織誘導型成長阻害剤（ＴＧＩ）から成る酸性化エ
タノール抽出物をヒト臍帯から調製する方法も開示され
る。該方法は適当な条件下で、腰帯組織から静脈及び動
脈を除去し、全痕跡量の血液を除去するように組織を洗
浄し、可溶化タンパク質を生成するように組織を処理し
、細胞から誘導されたタンパク質を含む可溶性成分を除
去することから成る。次に、約２６０００ドルトンの見
掛けの分子量を有するＴＧＩを可溶化タンパク質から分
離回収し、分離回収したＴＧＩをアッセイし、ヒ６７一 ト腫瘍細胞の成長を阻害し、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣ
Ｌ　６４）の成長を阻害し、正常ヒト包皮線維芽細胞の
成長を強化する活性を拘定する。最後に、こうして同定
されたＴＧＩを含む酸性化エタノール抽出物を回収する
。
本発明の一態様によると組織の処理は、約４℃の適当な
緩衝液に組織を懸濁させ、可溶性タンパク質を生成する
のに適当な時間組織を均質化させることから成る。
本発明の一態様によると組織の処理は、均質化し洗浄し
た組織を、酸性可溶性タンパク質を抽出するのに適当な
時間酸性化エタノールに懸濁させることにより実施する
。
本発明の一態様によるとＴＧＩのアッセイは、例えばヒ
ト肺癌系（＾５４９）のようなヒト腫瘍細胞、又は樹立
ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）、又は正常ヒｌ〜包皮
線維芽細胞（ＨｕＦ）を適当な条件下で適当な時間ＴＧ
Ｉと接触させ、ヒト腫瘍細胞の成長を阻害するか又は樹
立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を阻害するか
又は正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を刺激する活性を同
定する。
本発明は、約２６０００ドルｌ〜ンの分子量を有してお
り、ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４
）の成長を阻害し且つ正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を
刺激する特性を有する組織誘導型成長阻害剤１（ＴＧＩ
−１）及び組織誘導型成長阻害剤２（Ｔにｌ−２）を含
む酸性化エタノール抽出物をヒト腰帯から調製する方法
を開示する。該方法は適当な条件下で、洗浄により血液
成分を除去し、可溶化タンパク質を生成するように組織
を処理し、組織から誘導された汚染タンパク質を除去し
、可溶化タンパク質を回収し、約２６０００ドルトンの
分子量を有するＴＧｉｌ及びＴＧＩ−２を可溶化タンパ
ク質から分離回収することから成る。次に、分離回収さ
れたＴＧｌをアッセイし、ヒト腫瘍細胞の成長を阻害し
、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を阻害し
、正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を強化する活性を同定
する。
最後に、こうして同定されたＴＧＩを含む酸性化エタノ
ール抽出物を回収する。
本発明の一態様によると組織の処理は、組織を適当な酸
性抽出緩衝液に懸濁させ、均質化組織を形成するのに適
当な時間約４℃で組織を均質化させる。
本発明の一態様によると酸性可溶化タンパク質の回収は
、洗浄した組織を約４℃のエタノールを含む適当な酸性
抽出緩衝液に適当な時間懸濁させることから成る。
本発明の一態様によるとＴにＩ−１及びＴＧＩ２のアッ
セイは、ヒト腫瘍細胞、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣｔ６
４）又は正常ヒト包皮線維芽細胞を適当な条件下で適当
な時間ポリペプチドと接触させ、樹立ミンク肺細胞系（
ＣＣＬ　６４）の成長を阻害するか又は正常ヒト包皮線
維芽細胞の成長を強化するＴＧＩ−１及びＴＧＩ−２を
同定する。
本発明の一態様によると、可溶化タンパク質からポリペ
プチドを分離回収するには、フェニル−セファロースを
使用する疎水性相互作用クロマトグラフィを使用する。
組織誘導型成長阻害剤１（ＴＧＩ−１）と呼称される組
成物の調製方法も開示され、該方法はまず酸性化エタノ
ール抽出物を調製し、次に例えばフェニル−セファロー
ス中で疎水性相互作用クロマトグラフィにより酸性化エ
タノール抽出物を精製後、ｉ　）０．０５％のトリフル
オロ酢酸を含むＣ１８カラム上アセトニトリルの分離勾
配を使用して約２６〜３４％のアセトニトリル、好まし
くは２７％のアセトニトリルで、又は１ｉ）０．０５％
のトリフルオロ酢酸を含む２−プロパノールの分離勾配
を使用して約４０〜４１％の２−プロパノールで逆相Ｈ
ＰＬＣを実施するといったような高性能液体クロマトグ
ラフィにより、定義される活性として酸性化エタノール
抽出物からＴＣＩ−１を回収することから成る。
組織誘導型阻害剤（ＴＧＩ）と呼称される組成物の調製
方法も提供され、該方法は、まず酸性化エタノール抽出
物を調製し、例えば０，０５％トリフルオロ酢酸を含む
アセトニトリルの直線勾配を使用して約２８〜３４％の
アセトニトリルで溶離する酸性化エタノール抽出物の逆
相肝ＬＣのような高性能液体クロマトグラフィで定義さ
れる活性として、又は直線ＮａＣｌ勾配により約０．６
〜０．７ＭのＮａＣｌで溶離するとき例えばＣＭ−ＴＲ
ＩＳＡＣＲＹＬ（登録商標）のようなカチオン交換樹脂
から単一つ活性ピークとして、酸性化エタノール抽出物
からＴＧＩを回収することから成る。
組織誘導型阻害剤２（ＴＧＩ−２）と呼称される組成物
の調製方法も開示され、該方法はまず酸性化エタノール
抽出物を調製し、次に例えばフェニル−セファロースカ
ラム中の疎水性相互作用クロマトグラフィにより酸性化
エタノール抽出物を精製後、ｉ　）０．０５％トリフル
オロ酢酸を含むＣ１８カラム上ア＝７２− セトニトリルの分離勾配を使用して約２８〜３０％のア
セトニトリルで、又は１ｉ）０．０５％のトリフルオロ
酢酸を含む２−プロパノールの分離勾配を使用して約４
３〜４５％好ましくは約４４％の２−プロパノールで溶
離する逆相ＨＩ’ＬＣを実施するといったよう高好性能
液体クロマトグラフィにより定義される活性として、酸
性化エタノール抽出物からＴＧＩ−２を回収する。
ＣＭ−Ｉと呼称されるポリペプチドの調製方法も開示さ
れ、該方法はまず酸性化エタノール抽出物を調製し、次
に例えばカチオン交換クロマトグラフィのようなイオン
交換クロマトグラフィにより酸性化エタノール抽出物か
らＣＭ−Ｉを回収することから成る。
腫瘍の存在を検出するための方法も開示される。
該方法は、特許請求の例えば血液、羊水、ｎ’ｕ膜液、
腹水液、脳を髄液又は尿のような試料中に存在している
ＴＧｉｌ、ＴＧＩ、　ＴＧ［−２、腫瘍成長阻害活性を
有するタンパク質、ＣＭ−Ｉ、又はＡ４３１細胞の条件
付（Ｊ培地から回収可能なポリペプチドの量を定量し、
こうして定量した量を正常特許請求の試料中に存在して
いる量と比較し、例えば著しく大きい量のように顕著な
量の差の存在により腫瘍の存在を指示することから成る
。
腫瘍の存在を検出するための別の方法も開示される。該
方法は、特許請求の試料中に存在しているｒｃｉ−Ｉ、
ＴＧＩ、　ＴＧＩ−２、ＩＩ！ｉ瘍成長阻害活性を有す
るタンパク質、ＣＭ−Ｉ、又はＡ４３１細胞の条件付は
培地から回収可能なポリペプチドの量、及び形質転換成
長因子α（ＴＧＦ−α）の量を別々に定量し、試料中に
存在しているＴＧＩＩ、ＴＧＩ、　ＴＧｌ２、腫瘍成長
阻害活性を有するタンパク質、ＣＭ−Ｉ、又はＡ４３１
細胞の条件（＝ｔ　４ｆ培地から回収可能なポリペプチ
ドの旦と、特許請求の試料中に存在しているＴＧＦ−α
の量との比を決定し、正常特許請求の試料における比較
比を決定し、特許請求の試料における比を正常特許請求
の試料にお（′Ｊる比と比較し、比の顕著な相違により
腫瘍の存在を指示することから成る。
腫瘍の分類方法も開示され、該方法は、腫瘍を有する特
許請求の試料についてＴＧｉｌ、ＴＧＩ、ＴＧＩ−２、
腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質、ＣＭ−Ｉ、又は
へ４３１細胞の条件付は培地から回収可能なポリペプチ
ドの１種以上の存在を決定し、例えばＴＧＩとＣＭ−［
又はＴＧＩ−ＩとＴＧｌ２のような特異的組み合わせの
有無により、例えば黒色腫又は癌のような特定の腫瘍型
を指示することから成る。
別の腫瘍分類方法も開示され、該方法は腫瘍を有する特
許請求の試料について試料中に存在しているＴＧＩＩ、
ＴＧｌ、ＴＧｌ２、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク
質、ＣＭ−Ｉ、又はＡ　４３１　Ｍ胞の条件イ」け培地
から回収可能なポリペプチドの各々の量を定量し、例え
はＴＧＩの量の著しい増加やＴＧＩＩとＣＭ−Ｉとの比
の著しい相違といった特異的量の又は相対量の存在によ
り特定の腫瘍型を指示することから成る。
（以下余白） 実験の詳細 以下に４組の実験を記述する。どの実験シリーズも腫瘍
成長阻害活性を示すタンパク質の分離方法を含む。第１
実験シリーズでは、腫瘍成長阻害活性を示した６つの別
個のタンパク質を精製する。
これらのタンパク質はＴＧＩ、　ＴＧＩ−Ｉ、ＴＧｌ２
、及びＣＭ−１〜ＩＶと名付けた。第２及び第３実験シ
リーズは腫瘍成長阻害活性を示す精製度のより高いタン
パク質を得るための精製方法の改良に係わる。第４実験
シリーズてはＴＧＦ−β１をクローニング処理して、腫
瘍成長阻害活性のあるタンパク質をコードする関連遺伝
子の分離に使用する。ＴＧＩ−１又はＴＧＩ−２のいず
れが腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質に対応するかは
また不明であるが、当業者には明らかなように、この種
の対応はその対応の性質が不明てあっても存在する。
７７１　　シリーズ 材」し又で−枦法□ 組織抽出物からの］織誘導腫瘍成長圀害物質（ＴＧＴ）
Ｄａｖｏｒｅｎ（也（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、　　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　　Ａｃｔａ、　　６３：１５０（１９６２）
）及びＲＯ１〕ｅ　ｒ　ｔ　ｓ他（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、Δｃａｄ、　Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、７７：３４９４（１９８０））により開示され
た酸／エタノール抽出法を改変した方法を用いて、ヒト
臍帯又は組織を抽出処理した。
抽出用緩衝液は、３７５ｍ　ｌの９５％（Ｖ／Ｖ）エタ
ノール（厳密、１９０プルーフ、Ｕ、Ｓ、Ｉｂｄｕｓｔ
ｒｉａｌ　Ｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌｓ。
＃ＵＮ１１７０）と、７．５ｍｌの濃１１ＣＩと、３３
ｍｇのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（
ＳｉｇｍａＰ−７６２７）と、１ｍｌの八ｐｏｒＬｉｎ
ｉｎ（ＳｉｇｍａΔ６０１２　：　０．９％ＮａＣｌ及
び０．９％ベンジルアルコール中１ｍｌ当たり１９．８
単位の１〜リプシン阻害剤を含む）とを４°Ｃの蒸留水
１９２ｍＩと混合したもので構成した。４００〜６００
．の凍結したヒト腰帯又は胎盤（＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｂ
ｉｏｌ：ｅｃｈｎｏｌｏＨｉｅｓｌｌ；−８０℃て貯蔵
）を４℃で６時間解凍した。解凍した組織を４℃に冷却
したＣｕ１ｓｉｎａｒｔフードプロセツザ（Ｍｏｄｅｌ
　ＤＬＣ−７−ＰＲＯ）内に配置し、４℃の抽出用緩衝
液２００ｍ　ｌ中に懸濁させた。懸濁した組織を前記フ
ードプロセッサでホモジナイズした。ホモジナイズ処理
開始後１分の時点で前記懸濁液はクリームがかった白色
になった。この白色懸濁液に４°Ｃの抽出用緩衝液を更
に２００ｍ１加えた。懸濁液は黒っぽいコーヒーブラウ
ンに変色した。この組織懸濁液を４℃て合計１０分間ホ
モジナイズ処理した。
このホモジネートした組織混合物に抽出用緩衝液を最井
冬量が組織ホモジネート１ｇ当たり６１ｎ１になるよう
に加えた。
このホモジナイズした組織懸濁液を、３インチ撹拌棒材
き４リツ１〜ル大ビーカーに移し、Ｌ　ａ　ｂ　−ｌｉ
１ｅＭ１１ｊｉｍａｇｎｅｓｔｉｒマルチミキサー、モ
デル＃１２７８の最大撹拌能の１７２で撹拌した。４℃
で撹拌しなから一晩抽出処理した後、ホモシネ−１へを
１リツ１ヘル遠心分離管（Ｓｏｒｖａｌｌ）に移し、５
ｏｒｖａ　ｌ　ｌＨ−６０００＾ローターを備えた５ｏ
ｒｖａｌｌ　ＲＣ−３Ｂ遠心分＾「器により４℃で３０
分間３５００ｒｐｍ（ＲＣｔ”３５０）の遠心分離にか
けた。上澄みを４リツトル大ビーカーに移し、濃水酸化
アンモニウムをゆっくり加えることによってｐＨを５．
０に調整した。ｐＨを増加させると、上澄みは褐色から
橙色の溶液に変化した。ｐｌ＋５．２の２．０Ｍ酢酸ア
ンモニウムを総容量の１％に等しい量で加えると、該溶
液から沈澱物が生じた。この沈澱物を５ｏｒｖａｌｌ　
ＲＣ−３Ｂによる４℃、４時間、４５００ｒｐｍ（ＲＣ
Ｆ−５９００＞の遠心分離によって除去した。
上澄みを６リツトル大フラスコに移し、これに４倍容の
無水エーテル（−２０℃＞（Ｂａｋｅｒ　９２４４−３
）と２倍容の９５％エタノール（４°Ｃ）とを加えた。
この混合物を一２２℃で４８時間静置し、生成物を沈澱
させた。４８時間沈澱処理した後、エーテル化した物質
をフユームフート（ｆｕｍｅ　ｈｏｏｄ）で室温にした
。酸性化したエタノール抽出物を室温まで暖めると沈澱
物の凝集（ａＢｒｅＨａｔ　１ｏｎ）が促進される。水
吸引器によってエーテル及びエタノールの透明有機相を
除去し、沈澱物をフユームフード内に数時間放置して残
留有機相を蒸発さぜた。「乾燥」沈澱物を１．ＯＮ酢酸
に溶解し、分子カットオフ３５００の透析膜（Ｓｐｅｃ
ｔｒｏｐｏｒ　３、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ
　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ。
ロサンゼルス、カリフォルニア）を用いて１．ＯＮ酢酸
（Ｂａｋｅｒ　＃９５０７−５）に対する透析を十分に
行った。
透析した酸性化エタノール抽出物を２５０ｍ１　Ｃｏｒ
ｎ−ｉｎｇ円錐遠心分離管（ＣｏｒｎｉＢ　２５３５０
）内で凍結乾燥し、未精製酸性化エタノール抽出物とし
て貯蔵した。
酸性化したエタノール抽出物からＴＧ＋を沈澱さぜる別
の方法では、４倍容のエーテルと２倍容のエタノールと
を加える代わりに、２倍容のエタノールのみを４℃で加
える。酸性化エタノール抽出物沈澱ステップでエーテル
を使用しないことの利点は、極めて引火し易い溶媒の使
用を必要とするステップの省略にある。このような溶媒
を用いると操作の実施及び大量の物質のスクールアップ
か困難になる。
ゲル゛−゛　クロマトクラフィー 凍結乾燥した未精製の酸性化エタノール抽出物を１．０
Ｍ酢酸中に再懸濁させ（１０〜ｂをカラムに適用する前
に、５ｏｒｖａｌｌ　Ｈ−６０００八ローターを備えた
５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−３Ｂ遠心分離器により４℃で３
０分間３５００　ｒ　ｐ　ｍの遠心分離にかけて清澄化
した。１００〜１５０ｍ１の試料を２３℃又は４℃の１
．０Ｍ酢酸中の１００〜２００メッシ、：Ｌ　Ｂｌｏ−
Ｇｅ１’　ＰＬＯ（ＢｉＯ−Ｒａｄ；１５０−１０４０
）でクロマトグラフィーにかけた。
カラム（１４ｘ　１００ｃｍ）　（Ａｍ１ｃｏｎ；＃８
６０１２）には、２３℃又は４℃で０，１Ｍ酢酸中の平
衡化し且つ脱ガス処理したＢｌｏ−Ｇｅ１’Ｒ１０を１
３．８リツトル導入した。
５０ｍ１のプループキス１〜ラン（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５７
５１）を１．ＯＮ酢酸中２ｍｇ／ｍｌの割合で加えるこ
とによってボイド容ｒｉ（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ）を
測定した。較正後カラムを１００ｍ１のウシ血清アルブ
ミン（Ｓｉｇｍａ＃八−４５０３）により１．ＯＭ酢酸
中１０Ｏｎ＋ｇ／ｍｌで「条件付け」し、次いで１．０
Ｍ酢酸で十分に洗浄した。
試料を適用した後、Ｃタイプコレクションラックを備え
た５ｕｐｅｒＲａｃＲ（ＬＫ［ｌ　２２１１）を用いて
、７ｍ１７分の流量で１リツＩ・ルのフラクションを２
リツＩ・ルのプラスチック製組織培養ローラ壜（Ｆａｌ
ｃｏｎ；３２０７）内に集めた。２．０　ＡＵＰＳの吸
光度範囲にセラ１〜した２８０ｎｍのＵｖｉｃｏｒｄ’
　５（ＬＫＢ　２１３８）でフラクションをモニターし
、単一ヂャネルチャートレコーダ＝（ＬＫＢ　２２１０
）によって記録した。各フラクションから１【ｎｌのア
リコートを採取し、凍結乾燥させ、腫瘍成長阻害活性を
分析した。各アリコートの残りはＶｉｒＬｉｓ　ｆｒｅ
ｅｚモデル２４を用いて２リッ１−ル凍結乾燥ジャー　
（Ｖｉｒｔｉｓｌｌ＃６５０３−２０５０）内て凍結乾
燥させた。
宮　、′　クロマトグラフィーＩＩ　Ｐ　Ｌ　ＣＢｌｏ
−Ｇｅ１’　Ｐ−１０カラムからのＴＧＩ活性を有する
個々のフラクションを凍結乾燥させ、各フラクションの
タンパク質量に応じて１〜１０【ｎの０．０５％Ｉ・リ
フルオロ酢酸（ＴＦ八）（Ｐｉｅｒｃｅ　＃２８９０１
’）に再懸濁させた。ＨＰＬＣに使用した水は旧１１ｉ
−Ｑ浄水システムを用いて製造した。総ての肝ＬＣクロ
マトグラフィー操作における出発緩衝液は０．０５％Ｔ
Ｆ八を含むＭｉｌｌｉ−〇水で構成した。注入に先立ち
、試料を１３ｅｃｋｍａｎテーブルトップ遠心分離器（
ＢｅｃｋｍａｎＴＪ−６＞により３０００ｒｐｍで２０
分間遠心分離処理して不溶性物質を除去した。上澄みを
、個々の実験で特定するように、Ｗａｔｅｒｓ　ｕＢｏ
ｎｄａｐａｋ１１分析ＣＩ８カラム（０，３９ｘ３０ａ
ｍ）（Ｗａｔｅｒｓ　ＰＮ２７３２４）又はセミプレパ
ラティブ（ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）カラム（
−０，７８ｘ　３０ｃｍ）　（ＷａｔｅｒｓＰＮ８４１
７Ｂ）のいずれかに注入した。２０６ｎｍにセットした
可変波長ｕ、ｖ、検出器（１’１ａｔｅｒｓ　Ｌａｍｂ
ｄａ−Ｍａｘ、モデル４８１）でモニターされるカラム
溶離にはＷａｔｅｒｓの自動的勾配制御器（ｌｉｌａｔ
ｅｒｓモデル５１ｏ）を使用した。溶離に使用した溶媒
は０．０５％ＴＦ八を含むアセトニトリル（［１ａｋｅ
ｒ　９０１７−３）又は２−プロパノール（Ｆｉｓｈｅ
ｒ、Δ４５２）であった。フラクションをＢタイプのコ
レクションラックを備えた５ｕｐｅｒＲａｃ’　（ＬＫ
Ｂ２２１１）により１３　ｘ　１００ｍｍ又は１６ｘｌ
ＯＯｍｍのシリコン含有試験管（１’１ｅｒｃｅ、＾ｑ
ｕａｓｉｌ　＃４２７９９）に回収した。
各回収フラクションからのアリコートを下記の方法で腫
瘍成長阻害活性について分析した。
イ　ン・　クロマトグラフィー 酸性化したエタノール及びエーテル抽出物からの凍結乾
燥物質と、Ｂｌｏ−Ｇｅ１″Ｐ−１０でのゲル沢過クロ
マトグラフィーによって得た種々の凍結乾燥フラクショ
ンとを別個にイオン交換クロマトグラフィーにかけた。
これらの処理にはＣＭ、ＳＰ及びＤＥ八へ−ＴＲＩＳＡ
ＣＲＹＬ’（ＬＫＢ）イオン交換樹脂を使用した。
クロマトグラフィーにかける試料は１．０Ｍ酢酢酸的約
２０Ｂ／ｌの最終濃度で希釈した。これらの試料はｐｌ
＋と導電性とが出発（平衡化用）緩衝液と同じになるま
で４℃で透析した。イオン交換クロマトグラフィーは総
て４℃で実施した。
ａ、ＣＭ−び５Ｐ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬＲイ　ン・　　
′を　いるクロマトグラフィーの古巣 樹脂は水性懸濁物として、等量の１．０ＭＮａＣｌ含有
０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐｌ（４，０、に懸濁さセ
ｆＬ。
この樹脂を少なくとも３時間放置して平衡化させ、４°
Ｃて脱ガス処理した。２０ｍ　ｌの樹脂を１．６ｘ２０
ｃｍのカラム（Ｐｂａｒｍａｃｉａ；　＃１９−０３８
２−０１）に詰め、カラｂ容ｘの２倍の１．ｏ酢酸アン
モニウム、ｐ！＋４．０、て洗浄し、その後ｐｌ＋４．
０の０．０１Ｍ酢酸アンモニウムで洗浄した。廃液がｐ
１１４．Ｏの平衡化用緩衝液（例えば０．０１Ｍ酢酸ア
ンモニウム、Ｆｉｓｂｅｒ＾６３７）の導電性と全く同
しになるまでカラムを洗浄した。試料（樹脂２０ｍ　ｌ
当たりＩｇ）を１ｍ１／分の流量で樹脂に適用し、光学
濃度が平らになる（例えばゼロ光学濃度に近付く）まで
カラムを平衡化用緩衝液で洗浄し、ｐＨ４，０の００１
〜１．ＯＭ酢酸アンモニウム濃度のカラムフローアダプ
タに２００ｍ　ｌの下降直線モル濃度勾配（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　ｇｒａｄｉｅｎＬ　ｍ１ｘｅｒ　にＭ−１，
＃１９−０４９５−０１）を適用した。実験によっては
第２の勾配を同一カラムに適用した。この第２勾配の範
囲は、ｐＨ４，０の１．０Ｍ酢酸アンモニウムからｐＨ
４，０の１．０Ｍ酸酢酸アンモニウム中０％のアセト二
トルに及ぶ。Ａタイプのコレクションラックを備えた５
ｕｐｅｒＲａｃ’フラクシヨンコレクタ（ＬＫＢ　２２
１１）内のポリスチレン管１３ｘ　１００ｖｎ（Ｃｏｌ
ｕ＋ｎｌ＋ｉａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｂ２５６４
）に２ｍｌのフラクションを集めた。カラムクロマトグ
ラフィーは総て２８０ｎｍフィルタ（ＬＫＢ　２１３８
）及び単一チャネルレコーダー（ＬＫＩＩ　２２１０）
付き１Ｊｖｉｃｏｒｄ　Ｓを用いて実施した。フラクシ
ョンは１００μｍ〜１＋ｎｌの光学濃度に基づいてアリ
コート化し、腫瘍成長阻害活性について分析した。
ｂ、ＤＥ八へ−Ｔ［５ＡＣＲＹＬを１いるクロマトグラ
フィークロマトグラフイー用樹脂の準備及び処理手順は
Ｃト及び５Ｐ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬＩｌクロマｌ〜グラ
フィーの場合と同様に行った。但し平衡化用緩衝液とし
てはｐｌ＋６．０の０．１Ｍ酢酸アンモニウムを使用し
、グラジェント溶離の範囲は０．１Ｍ〜１．０Ｍ　ｐＨ
６，０酢酸アンモニウムにし、試料は前記平衡化用緩衝
液で平衡化した。
成層１Ｊ１［霞請−作必」す【分逝− ウシ胎児血清（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、八、　Ｂｉｏ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ１４−５０１８）１０％、Ｌ−グルタ
ミン（Ｗｌ＋１ｔｔａｋｅｒ　Ｍ、＾２１３ｉｏｐｒｏ
ｄｕｃＬｓ　１７−６０５−＾）２％、ペニシリン１％
及びストレプトマイシン１％を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの
改質Ｅａｇｌｅ培地（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Δ、　
Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　１２−６１４３）ＳｏＩＩｌ
中で、９６の井戸（ｗｅｌｌ）をもつ組織培養プレー）
　（Ｎｕｎｃ　１６７００８）を用いて被検細胞を継代
培養した。ヒト肺癌腫細胞へ５４９とヒト正常繊維芽細
胞（ｌｌｕＦ）は井戸当たり５ｘ１０３個の細胞に等し
い接種濃度を必要とした。ミンク細胞（＾ＴＣＣ：ＣＣ
Ｌ　６４）は井戸当たり４．５ｘ１０３個の細胞に等し
い接種濃度を必要とした。
腫瘍成長阻害活性の分析にかけるべきカラムフラクショ
ンからのアリコートを、ＩＭ酢酸中１ｍｇ／ｍ１のウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ＾−６００３）溶
液を５０，１含む殺菌処理した１２ｘ７５ｍｍ管（Ｆａ
ｌｃｏｎ　２０５８）に移し凍結乾燥させた。分析にか
ける直前に、前記凍結乾燥試料を各被検細胞タイプ毎に
、４００μｍに再懸濁させた。被検細胞の入っている井
戸に前記再懸濁試料の１００．　Ｉアリコートを導入し
た。試料は総て３回ずつ分析した。細胞を５％Ｃｏ２／
９５％空気の湿潤雰囲気下３７°Ｃで７２時間インキュ
ベートした。インキュベーション終了後、各井戸を１１
１Ｃｉ／ｎ＋Ｉ５−［電２５Ｉ］ヨードー２′デオキシ
ウリジン（１２５１ＵｄＲ）（Ｎｅｕ＋　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ；　ＮＥＸ−０７２）を含む完全培
地１００．１で２４時間パルス処理した。単層を洗浄用
緩衝液Ａ（１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２のＤｕｌｂｅｃｃ。
リン酸Ｍ’Ｓ液、ｐｌ＋６．８）で−回洗浄し、メタノ
ール（Ｆｉｓｈｅｒ　Ａ４５２）中で１０分間固定処理
し、１５分間空気で乾燥させた。細胞に合体された＋２
５ＩＵｄＲを２００ｐｌ（７１）１．ＯＮ　ＮａＯＨテ
可溶化し、７’　Ｌ／　−１−を６０℃で２０分間イン
キュベートした。可溶化した”５Ｉ［１ｄＲを、Ｔｉｔ
ｅｒｔｅｋ　５ｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ　ＳｙｓｔｅｍＰ（ＳｋａＬｒｏｎ　Ｉｎｃ、、
７０７２）により回収した。細胞成長量は対数増殖期に
おいて”５ＩｔｌｄＲが細胞のＤ　Ｎ　へ内に組み込ま
れる程度によって近似値が求められる。
分析の結果を得る前に、細胞成長量を視覚的に観察ずべ
く、Ｚｅｉｓｓ１１倒立顕微鏡を用いて各井戸を観察し
た。成長の阻害又は刺激は被検アリコー１〜を含む被検
細胞（例えばヒト腫瘍細胞）に組み込まれた＋２５１Ｕ
ｄＲと、未処理の対照細胞に組み込まれた１２ｓＩＵｄ
Ｒとの比によって表した。被検細胞の顕微鏡検査で観察
される阻害又は刺激は夫々”５１ＵｄＲの組込みの減少
又は増加に良く対応していた。
匹」晶」（Ｑ］Ｙ世ラド折− ａ、翫１１ Ｂｉｏ−にｅｌ’　Ｐ−１０て゛のゲルｉ濾過クロマト
グラフィーから得たフラクション２．４及び６からの１
ｍｌアリコートを１２ｘ７５ｍｍのポリスチレン管（Ｆ
ａｌｃｏｎ２０３４）内で凍結乾燥させ、１．０Ｍ酢酸
１．ｍｌ中に再懸濁させた。試料を沸騰水浴中で３分間
加熱し、凍結乾燥させ、前述のごとく腫瘍成長阻害活性
分析にかけた。
５ＤＳ−ボアクリルアミドスラブゲル電−」Ｊ１各りロ
マトグラフィー処理から得な試料のアリコートを電気泳
動にかりるべく凍結乾燥させた。
試料はｐ１１６．８の０．１Ｍ＋−リス−１１ＣＩ（Ｓ
ｉｇｍａ；Ｔ−１５０３）、１５％グリセロール（Ｋｏ
ｄａｋ；１１４−９９３９）、２％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；１１６−０３０２）
及び５％２−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−ＲａｄＪ
６１−０７１０）を含む試料！１Ａｆｒ液８０μＩ中に
希釈し、５〜２０％のアクリルアミド直線勾配で本質的
に前述のごとく電気泳動にかけた（Ｌａｅｍ＋ｎｌｉ、
　Ｏ，に、（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ■７．６８０−
６８５）。試料を２分間熱湯で処理し、その後３０ｍ＾
／ゲルの接触電流で４時間（ｔｌｏｅｆｆｅｒ給電器；
ＰＳ　１２００　ＤＣ＞９℃でＢｉｏ−Ｒａｄモデル＋
５５Ｖｅｒｔ　ｉｃａ　１Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ
ｉｓ　Ｃｅ１１（ＢｉｏＲａｄＲ１６５−１４２０）内
の幅１．５ｍｍのスラブゲルに適用した。温度は水浴ザ
ーキュレーター（Ｈａｋｅ、八８１）により一定に維持
した。
ゲルを５．７％＃酸及び４７％メタノール中０．５％Ｃ
ｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ　Ｒ２５０（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ　＃１６−０４００）で−晩染色処理し、その後染料
を含まない前記溶液中で脱染色処理した。低タンパク質
濃度を示す特定ゲルをＭｅｒｒｉｌ（Ｍｅｒｒｉｌ、　
Ｃ，Ｒ，、Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｄ、、Ｓｅｄｍａｎ、Ｓ。
及びＥｂｅｒＬ、　Ｍ、Ｈ，（１９８１）２上１：１４
３７−１４３８）（［Ｊｉｏ−Ｒａｄｓｉｌｖｅｒ　５
ＬａｉｎｉＢ　ｋｉｔ；＃１６１−０４４３）により開
示された銀染色法によって再度染色した。
ヒトＩｌｉ’ｌ帯の酸性化エタノール抽出物がち誘導し
た成長阻害活性は、Ｂｉｏ−Ｃ，ｅｌＲＰ−１０樹脂を
用いるゲル濾過クロマ）〜グラフィーによって見掛は分
子量５．０００〜ｉｅ、ｏｏｏダルトンて溶離した。時
には別の活性ピークが３０００〜５０００ダルトンの分
子■範囲で観察された。分子量の計算は、４ｘｌＯＯｃ
ｍのカラムに１リツＩ・ルの樹脂を用いてクロマトグラ
フィーを行った場合の分子量標準値（即ちカルボニック
アンヒドラーゼで２９，０００　；　ＲＮａｓｅで１４
，４００　、インシュリンで６，０００）の溶離プロフ
ィルに基づく。前記カラム及び１４ｘ１．００ｃｍカラ
ムから誘導される溶離プロフィルは互いに重ね合わせる
ことができた。
同じ方法でクロマトグラフィー処理したヒト胎盤からの
酸性化エタノール抽出物は、腰帯抽出物に極めて類似し
た溶離プロフィルを示した。
腰帯の酸性化エタノール抽出物からのフラクション１〜
３は極めて濃い褐色を呈する。この色はフラクションが
進行するにつれて徐々に消える。幸いなことに、タンパ
ク質濃度の最も高いフラクション１．２及び３では（Ｔ
ＧＩ）溶離するものの、活性の大部分は第１図及び第２
図に示すように観察されるタンパク質ピークを越えて延
びる。ヒト胎盤物質からの抽出物では、主要タンパク質
ピークをもつＴｆ、Ｉの重なりがヒト腰帯からの物質に
ついて観察されノごものより大きかった（データ示さず
）。
５〜２０％のポリアクリルアミド勾配で５ＯＳ−ＰＡＧ
Ｅにより電気泳動処理したゲル沢過クロマトグラフィー
からの同量のアリコートも、フラクション４から明らか
なように、フラクション１〜３てはタンパク質がかなり
少なかった。フラクション５及び６では５，６００及び
１４，０００ハントの主要タンパク質バンドが１１１察
され、フラクション７では極めて少量のタンパク質が残
っていが、阻害活性は第２図に示すようにフラクション
１ｏまて延ひている。活性の大部分かタンパク質量のよ
り少ない領域で溶離することの明らかな利点は、ＴＧＩ
を更に精製することが容易だということにある。
夫々第１図及び第２図に示した、室温てのＢｌｏ−Ｇｅ
１ＲＰ−１，０クロマトり°ラムと４°Ｃでのそれとを
比較から明らかなように、阻害活性は４℃の場合の方が
大きい。２３℃ではフラクション６を越える活性は観察
されない（第１図）が、４℃では活性が更に４つのフラ
クションを越えてフラクション１０まて延びている。最
も重要なことに、回復された活性の正味量は抽出物を４
°Ｃでクロマトグラフィーにかけた場合には２倍以」二
大きくなる。これは、８０％以上の腫瘍成長阻害活性が
４℃では７つのフラクションで得られる（第２図）のに
対し、２３℃では３つのフラクションでしか得られない
ことから明らかである。その原因は、７つのフラクショ
ンにわたって延びる（４℃）のではなく３つのフラクシ
ョンで溶離する（２３℃）同量の活性の濃度ではなく、
腫瘍成長阻害活性率の明らかな増加にある。前記２つの
カラムから別個に得たフラクション５の１１１１１アリ
コートと、これらフラクションの１１５〜１／１２５希
釈物とをヒト肺アデノ癌腫（Ａ５４９８）及びミンク肺
細胞（ＣＣＬ　６４）とに関してテストシた（表１）。
非希釈フラクションのｌｌｆｆ１瘍成長阻害活性は４℃
のクロマトグラフィーによって得たフラクション５では
２倍大きかった。また、４℃のクロマトグラフィーから
斜なフラクション５の２５倍希釈物は、ヒト腫瘍細胞系
に対して最大の腫瘍成長阻害活性を示し続けた。２３℃
のクロマＩ・クラフィーによって得た同等希釈率のフラ
クションは検出し得る活性を示さなかった。ミンク細胞
系についても同様のことが観察された。この情報は第１
図及び第２図に示した活性に基つくものではなく、夫々
の第５フラクシヨンで同等のＴＧＩ活性を示した２つの
別個のカラムから得られた。
Ｂｉｏ−ＧｅｌｌＩＰ−１０てクロマトグラフィー（４
℃）にがりなヒト珀帯酸性化エタノール抽出物がち得た
フラクションのアリコー１−を、「材料及び方法」の項
で述べたように、ヒトの正常細胞及び形質転換細胞に関
する腫瘍成長阻害活性について調へた。第３１’２１に
示したように、ヒト繊維芽細胞に対する腫瘍成長阻害活
性（開放三角形）はフラクション３〜１２に見られるが
、これらのフラクションは同時に、ヒト正常繊維芽細胞
の成長刺激を８５％も増加させた。従ってこの阻害活性
はヒト腫瘍細胞に特異的である。この阻害活性は、光顕
微鏡検査によって示されるように、且つ正常なヒト繊維
芽細胞に対する刺激効果からも間接的に示されるように
、細胞毒性に起因するものではない。ＴＧＩは予め正常
な上皮誘導細胞に関してテス）〜したが、やはり同様の
結果が観察された。
表　　１ ゲル濾過クロマ）・グラフィー　による腫瘍成長阻害活
性の回復に関する温度の影響 被検細胞阻害％ カラム操作温度　　　　　　４℃　　２３℃被検細胞系 ＾５４９（ヒト癌腫） 非希釈物　　　　　　　５７３０ ミンク肺（ＣＣＩ　６４） 非希釈物　　　　　　　９１４３ １１５　　　　　　　　　９０　　　１．３１２０ｕｇ
を含むフラクション５（第１図及び第２図）のゲル濾過
からの１ｍｌアリコー１〜を使用してＴＧＩ活性を分析
した。
高性能？１ｈＬＪＫ士ノラフィ−（１県Ｃ）−Ｂｉｏ−
Ｇｅｌリ−１０カラムでのゲル濾過により部分的に精製
し、次いて逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ（ｌＩＢ　ＯＮ　Ｄ　Ａ　
ＰΔＫ１ＩＣ，、樹脂）を用いて更に精製したし１〜膀
帯の酸性エタノール抽出物からのＴＧＩは、ヒト癌腫Δ
５４９及び樹立したミンク肺細胞系ＣＣＬ６４の成長を
両方共阻害したが、正常なし１へ繊維芽細胞の成長は阻
害しなかった。
第４図はＢｌｏ−Ｇｅ１ＲＰ−１０クロマトクラフイー
ステツプで誘導した凍結乾燥フラクション４　（０，０
５％トリフルオロ酢酸３ｍｌ中１９．８ｍｇ）を直線ア
セＩ〜二ｌ・リル勾配を用いる肝ＬＣにかけて得た腫瘍
成長阻害活性の溶離プロフィルを示している。
この図ては、へ５４９ヒト癌腫及び前記ミンク細胞の双
方に対する２つの異なる成長阻害活性ピークが観察され
る。２８〜３４％アセトニトリルて溶離するフラクショ
ン（フラクション１３〜２２）及び３５〜３９％アセト
ニ１−リルで溶離するフラクション（フラクション２５
〜３１）を別個にプールし、ＣＩ８ＩＩＢＯＮＤＡＰＡ
Ｋ’で２−プロパノールの直線勾配を用いてクロマトク
ラフィーにかけた。
腫瘍成長阻害活性の最初のピークをＴＣＩ−Ｉ、第２ピ
ークをＴＧＩ−２と名付けた。第５図はＴＧＩ−１の溶
離プロフィル及び腫瘍成長阻害活性を示すく第４図）。
注入した物質の濃度は０．０５％トリフルオロ酢酸（Ｔ
Ｆ八）１．５ｍ　ｌ当たり］、、５ｍＨてあった。、Ｔ
Ｇｉ］活性は２−プロパノール直線勾配を用いると１７
〜２３％で溶離する（第５図）。同様にして、第６図は
ＴＣＩ２（０，０５％ＴＦＡ１．８ｍｌ当たり０．８ｍ
ｇ）か２−プロパノール直線勾配を使用すると２３〜２
７％（フラクション１７〜２３）で再クロマ）〜グラフ
ィーされることを示している。第４図及び第５図に示し
た腫瘍成長阻害活性は一貫してΔ５４９ヒト癌腫細胞に
対するよりミンク細胞に対する方か２０％−高い。
ヒト胎盤の酸性エタノール抽出物は、ゲル濾過クロマｌ
ーグラフイースデップの後も、０．０５％ＴＦΔ禽有直
線アセ１〜二１〜リル勾配を用いるＣＩ８カラムで２６
〜３４％アセトニトリルて溶離するＴＧＩ？ｇ性を有し
ていた。
イーン・　クロマトグラフィー ヒト腰帯の凍結乾燥した酸性化エタノール抽出ｅｌＪ　
１　ｇヲｐｉ−１４．０ノ０．０ＩＭ酢Ｍ７　クモニウ
ム中ＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ’でのイオン交換クロマ
トグラフィーに直接かけた。直線勾配をｐＨ４．０、０
．０１〜１．叶酢酸アンモニウムで適用した。第７図は
ＣＭ−Ｉ，　ＣＬＩＩ、ＣＭ−ＩＩＩ及びＣＭ−ＩＶと
称する少なくとも４つの別個の腫瘍成長阻害活性を示し
ている。ＣＬＩは現時点ではΔ５４９ヒト癌腫細胞のみ
を６０％の阻害率で阻害した（表２）。ＣＭピークＴＩ
及びＩＩＩのΔ５４９ヒト癌腫に対する腫瘍成長阻害活
性（夫々８０及び６３％）及びミンク細胞に対する腫瘍
成長阻害活性（人々６１％及び７６％）はほぼ同しであ
る。最後の活性ピーク（ＣＭ−ＩＶ）はミンクに対して
特異的な活性を示すく即ちミンク細胞の阻害率（９５％
）の方がΔ５４９ヒト癌腫細胞の阻害率（６９％）より
大きかった）。負の電荷をもつ樹脂ではＣＭ−Ｉは保持
されず、ＣＭ−ＩＩはやや阻害された。これは、これら
のピークがいずれも、ｐ）１４．０の０．０ＩＭ酢酸ア
ンモニウムの勾配開始前に溶離されたことから明らかで
ある。
阻害活性をもつ総てのタンパク質は酸性タンパク質であ
るが、これらのタンパク質はｐＨ４，０で溶解し得且つ
負の電荷をもつ樹脂に結合するため、ピークＣＭ−ＩＩ
Ｉ及びＩＶは恐らくそれよりやや塩基性であると思われ
る。というのも、これらのピークはＣＭ−ＴＲＩＳ八Ｃ
ＲへＬ１１樹脂により強く結合するからである（０．５
Ｍ酢酸アンモニウムより大きい範囲て溶離する）。これ
は、正の電荷をもつ樹脂（即ちＤＥ八へ−ＴＲＩＳΔＣ
ＲＹＬＲ）に保持されるＴＧＩ活性は無がったという事
実によって立証される（データ示さず）。より酸性の阻
害ファクターは、夫々の活性において、＾５４９ヒト癌
腫細胞に対しより特異的であると思われる。これら４つ
のＴＧＩ活性ピーク（ＣＭ−Ｉ、　ＣＭ−ＩＩ、ＣＭ−
ＩＩＩ及びＣＭ−ＩＶ）を夫々別個に観察した（ＣＭ−
ＴＲＩＳΔＣＲＹＬＲを用いる６つの別個のクロマトグ
ラフィー処理）。ＣＭ−ＩＩ及びＣＭ−ＩＶに観察され
る腫瘍成長阻害活性が、カラムからより早く溶離し得る
物質を形成せしめないようにし、且つ各活性ピークが別
個の存在（エンティティ）であるという観念を支持すべ
く　、ＣＭ−ＩＩＩ及びＣＭ−ＩＶからの物質をプール
し、凍結乾燥させ、これら物質の誘導に使用したカラム
と同じ条件でＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ’を用いて再度
クロマトグラフィーにかけた。ＣＭ−ＩＩＩ及びＣＭ−
ＩＶはこれらを誘導した元のカラムフラクションと全く
同じ位置で溶離した（０．５Ｍ酢酸アンモニウムより大
きい範囲）（第１０図）。ミンク細胞に対するより大き
い腫瘍成長阻害活性は保持され、これら２つの細胞系に
対する阻害活性の差は活性ピークの周辺２５〜３０％で
全く同じであった。
表　　２ 陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られるＴＧ
Ｉ活性 ＴＧＩ活性ピーク　　　　　被検細胞の阻害率（％）Δ
５４９　　　　ミンク ＣＭ　Ｉ　　　　　　　　　　　６０　　　　　０ＣＭ
　ＩＩ　　　　　　　　　　８０　　　　６１ＣＭ　Ｉ
ＩＩ　　　　　　　　　　６３　　　　７６ＣＭ　ＩＶ
　　　　　　　　　　６９　　　　９５ＴＧＩ活性をテ
ストしたフラクションのタンパク質濃度は１５〜３ｏｏ
ｕｇであった。
ＢｉＯ−ＧｅｌＲＰ−１０によるゲル濾過クロマトグラ
フィーによって得たフラクション２．４及び６を熱処理
した（表３）。テストしたフラクションは総て、熱処理
又は酸処理の後でも腫瘍成長阻害活性を保持していた（
表４）。フラクション２，４．及び６はヒト癌細胞の成
長を阻害し且つ正常なヒト細胞の成長を刺激することが
判明した。
表　　３ ゲル？濾過クロマＩ・グラフィーからのフラクションの
ＴＧＩ活性に対する熱処理の影響 Δ５４９　　　　　　　　ミンク カラム　対照　　熱処理後　対照　　熱処理後７５９ジ
ヨン　阻害％　阻害％　　阻害％　阻害％ＴＧＩ活性を
テス１〜したフラクションのタンパク質濃度は１５〜３
００１１ｇであった。
表　　４ 組織誘導腫ｌ細胞成長阻害活性（ＴＧＩ）の物理的及び
生物学的特性 カラムフラクション フラクション２　　フラクション４　　フラクション６
１．０Ｍ酢酸に対して　　＋　　　」−→−安定 １００℃ての沸騰処　　＋　　　＋　　　　＋理に対し
て安定 ヒｌ〜癌細胞を　　　　士　　　士　　　　士阻害 ヒト正常細胞を　　　−　　　−− 阻害 ヒト腰帯組織から静脈及び動脈を除去し、残りの組織を
十分に洗浄して血液を除去した後、第１実験シリースで
説明した酸／エタノール抽出処理にかけた。
組織を洗浄し且つホモジナイズするためのＭｍ液（ＰＢ
Ｓ−ＰＡ）は、１６ＥのＮａＣｌと、２．５ｇのＮａ２
１１ＰＯ，、ｌＩ２０と、０．４ｇのＮａ２ＨＰＯ，，
７Ｈ２０と、１１６ｍｇのフッ化フェニルメチルスルボ
ニル（ＰＭＳＦ）（ＳｉＨｍａ　Ｐ７６２７）と、３．
３＋ｎｌのＡｐｒｏｔｉｎｉｎ（ＳｉｇｍａΔ６（Ｈ２
：　０．９％ＮａＣｌ及び０．９％ベヘンシルアルコー
ル中９．８単位／ｍｌのトリプシン阻害物質を含む）と
を含む２リツ１〜ルの水をＨＣＩ及びＮａ０ｌｌＴ’ｐ
Ｈ７，４に調整したもので構成した。
抽出用ＭＷＩ液は、３７５ｍ　ｌの９５％（ｖ／ｖ）エ
タノール（厳密、１９０プルーフ、Ｕ、Ｓ、Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉｃａｌ　Ｃｂｅｍｉｃａｌｓ。
＃ＵＮ１１７０）、７．５ｍｌの濃縮＋１ＣＩと、３３
ｍｇのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（
Ｓｉｇｍａ　Ｐ−７６２７）と、１輸１のＡｐｒｏｔｉ
ｎｉｎ（Ｓｉｇ１１ａ＾６０１２）とを４℃の蒸留水１
９２＋ｎｌと混合したもので構成した。８００〜１００
０ｇの凍結したヒト腰帯（＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＲ；−８０℃で貯蔵）を４°Ｃ
て２時間ＰＢＳ−ＰＡ中に浸漬して解凍した。個々の用
事を取り出し、ｌ’ｌ１ｓ−Ｉ’八て濯いた。４℃での
解離（ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）により腰帯から静脈及び
動脈を除去した。解離処理した腰帯を新しいＰＢＳ−Ｐ
Ａで洗浄して残留血液及び血管の破片を除去した。
組織を４℃に冷却したＣｕ１ｓｉｎａｒｔフードプロセ
ツサ（Ｍｏｄｅｌ　ＤＬＣ−７−ｒ’ＲＯ）内に配置し
、４℃のＰＢＳ−Ｐへ２０（ｈｌ中に懸濁させた。懸濁
した組織を前記フードプロセッザてホモジナイズした。
ホモジナイズ処理開始後１分の時点て４℃のＰＢＳ−Ｐ
Ａを更に２００ｍ１加えた。この組織懸濁液を４℃で合
計１００分間ホモジナイズ理した。得られたホモシネ−
１〜を２００ｍ１遠心分離管（Ｓｏｒｖａｌｌ）に移し
、５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳΔローターを備えた５ｏｒｖａ
ｌｌ　ＲＣ５Ｂ遠心分離器により４℃で５分間９０００
ｒｐｍ（ＲＣＦｌ、３，０００）の遠心分離にかけた。
」−澄み液を除いて廃棄し、ペレットを新しいＰＢＳ−
ＰΔて最初のホモシネ−１・容量が得られるように再懸
濁させた。
前述のごとく遠心分離と再懸濁とを繰り返し、上澄み液
が透明になって汚染血液又は血液生成物による赤い染み
が存在しなくなるまで、前記ペレッ１〜を洗浄した。こ
のように洗浄したペレットは白色であった。この洗浄し
たペレットを、もとの解離組織１ｇ当たり６ｍｌの最終
容量になるように抽出用Ｋｍ液中に再懸濁させた。この
ホモシネ−１・を、３インチ撹拌杯付き４リツ１〜ル大
ビーカーに移し、ＬＡＢ−ｌｉｎｅ　Ｍｕｌｔｉｍａｇ
ｎｅｓｔｉｒＲマルチミキザー、モデル＃１２７８の最
大撹拌能の１７２で撹拌した。４℃で撹拌しなから一晩
抽出処理した後、ホモジネートを１リツトル遠心分離管
（Ｓｏｒｖａ　ｌ　ｌ　）に移し、５ｏｒｖａｌｌ　１
トロ００〇八ローターを備えた５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−
３Ｂ遠心分離器により４°Ｃで３０分間３５００ｒｐｍ
（ＲＣＦ・３５７０）の遠心分離にかりた。上澄みを４
リットル大ビーカーに移し、濃水酸化アンモニウムをゆ
っくり加えることによってｐＨを５０に調整した。ｐｌ
＋を増加させると、上澄みは透明な状態のまま軽く黄色
味を帯びた。ｐＨ５，２の酢酸アンモニウム２．ＯＮ溶
液を総容量の１％に等しい量で加えた。このステップで
生した沈澱物は５ｏｒｖａｌｌＲＲＣ−３１１により４
℃で４時間４５００ｒｐｍ（ＲＣＦ＝５９００）の遠心
分離にかけることにより総て除去した。」−澄みを６リ
ツトル大フラスコに移し、これに４倍容の無水エーテル
（−２０℃）（Ｂａｋｅｒ　＃９２４４−３）と２倍容
の９５％エタノール（４℃）とを加えた。この混合物を
一２０℃て４８時間静置し、生成物を沈澱物さぜな。
４８時間沈澱処理した後、この物質をフユームフ−１’
で室温にした。酸性化エタノール抽出物を室温まで暖め
ると沈澱物の凝集（ａＢｒ＋４ａｔｉｏｎ）が促進され
る。水吸引器によってエーテル及びエタノールの透明有
機相を除去し、沈澱物はフユームフード内に数時間放置
して残留有機相を蒸発させた。
乾燥窒素ガスを抽出物上に静かに流して、沈澱物と共に
存在する残留有機溶媒の蒸発を促進した。
「乾燥」沈澱物を１．０Ｍ酢酸に溶解し、分子量カッｌ
−オフ３５００の透析ｙｌＡ（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒ　
’３Ｆ′、ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉｅｓ、ロサンゼルス、カリフォルニア）を用い
て１，０Ｍ酢酸に対する透析を十分に行った。透析した
酸性化抽出物を２５０ｍ　ｌのＣｏｒｎｉＢ円錐遠心分
離管（ＣｏｒｎｉＢ　２５３５０）内て凍結乾燥し、未
精製酸化エタノール抽出物として貯蔵するが、又はｐＨ
４，５の２０ｍＭ　ＮＨＪｚＣ２１１３に対して十分に
透析した。
組織を第２実験シリーズで説明したように準備した場合
に見られる比活性及び総回復活性の増加を表５に示す。
この表は、第１実験シリーズの方法（以後［最初の方法
（ｉｎｉＬｉａｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」と称する）
に従って処理した場合、及び第２実験シリーズの方法（
以後「改変方法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒ
ｅ）」と称する）に従って処理した場合の凍結腰帯から
得られるタンパク質及び腫瘍成長阻害活性の収率を比較
するものである。
（以下余白） 表５ 最初の方法で準備した組織及び改変方法によって準備し
た組織からの酸／エタノール抽出物における腫瘍成長阻
害活性の比較１０００１？　　　　最初　　　３．０ｇ
　　　　２ｘ１０６ｕ　　０．６７ｕ／μｇタンパク質
３４０Ｆｌ　　　　改変　　　５０ｍｇ３ｘ１０６ｕ　
　６７ｕ／ｐｇタンパク質１：ヒト珀帯 ２・１単位の活性は所与の細胞系に見られる最大阻害率
の５０％をもならずような物質量として定義される。例
えばΔ５４９（この表て使用）細胞系は最大て６０％阻
害されるため、１単位の活性は３０％の阻害率に等しい
。
これら２つの方法には、後のＴＧＩ生成にとって重要な
明らかな違いが幾つか存在する。例えば、組織の湿潤重
量に基ついて説明すると、最初の方法による酸性化エタ
ノール抽出処理では０，３３％がタンパク質として回収
される（１０００ｇの組織から３．３ｇ）のに対し、改
変方法では０．０１５％がタンパク質として抽出される
に過ぎない（３４０ｇの組織から０．０５ｇ）。改変方
法では組織が６６％少ない（３４０ｇ対１０１００Ｏの
に、活性率か最初の方法（２ｘ１０６単位）より５０％
大きい（３，３ｘ１０６単位）ため、全体的抽出効率が
向上した。最初の方法では珀帯１ｇ（湿潤重量）当たり
２０００単位の腫瘍成長阻害活性が得られた。
改変方法では両帯１ｇ（湿潤重量）当たり９７００単位
の腫瘍成長阻害活性が得られた。全体的抽出効率は改変
方法では５倍増大した。また、酸性化エタノールによっ
て抽出されるタンパク質がより少ないため、抽出タンパ
ク質の沈澱に必要なニーデル及びエタノール量もより少
ない。更に、改変方法では抽出されるタンパク質の量及
び種類数がより少ないため、後の精製に使用される方法
でもより少ないクロマトグラフィー材料、処理時間及び
ステップで精製物を得ることができる。
陽イオン交換樹脂ＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬＲ上で改変
方法を用いて抽出したＴＧＩの分別は、結合物質を０〜
Ｉ、ＯＭ　ＮａＣｌの直線塩勾配で溶離すると、適用タ
ンパク質の大部分から単一ピークとして解像された。
第９図は、ＴＧＩをＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ′″カラ
ムに適用した後では、樹脂に結合しなかった物質（即ち
フラクション１〜２４）から阻害活性が検出されなかっ
たことを示している。ＮａＣｌ（−−）の量を直線的に
増加させなから加えると、大量の阻害活性（−−−−−
）（フラクション３９〜４９）の除去に先立って、樹脂
に結合したタンパク質（フラクション２５〜３８）の大
部分が除去された。結合ＴＧＩを除去する上で最も効果
的なＮａＣＩ濃度は約０．６Ｍ（フラクション４４）で
あった。第９図を第８図と比較すると、溶離用塩濃度（
ＮａＣｌ、第９図；　Ｎ　Ｉｆ　、０２　Ｃ２Ｉｆ　３
、第８図）が類似している（０．６Ｍ、第１１図−０，
６〜０．７Ｍ、第８図）ことから、第９図の実験で溶離
した阻害活性は第７図に示したＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹ
Ｌ″樹脂からノＣＭ−１１１及びＣＭ−ＩＶ溶離に極め
て密接に対応することが知見される。前記情報はまた、
改変方法によって組織を処理するとＴＧＩの単一ピーク
が好ましく分離され、従ってその後のファクターの特性
検査も改善されることを示唆している。
改変方法によって組織から抽出されたＴＧＩの別の特性
は、陰イオン交換樹脂に結合しないことにある。第１０
図は、図面説明で述べるように、ｐＨを０．８に調整し
て抽出物（第９図の場合と同量）を陰イオン交換樹脂Ｄ
ＥＡＥ−ＴＲＩＳΔＣＲＹＬ’に適用すると、阻害活性
の大部分が非結合物質（フラクション１〜３０）に関連
得られる一方で、適用したタンパク質の大部分（２８０
ｎｍでの吸光度で測定）　（−−−−−−−−−）はカ
ラム樹脂に結合した。これらの結果は、第１０図の条件
ては汚染性タンパク質をＴＧＩから除去することがてき
るためＴＧＩの精製に有効であることを示している。こ
れらの結果はまた、ｐ　Ｉ＋　８　、０ではＴＧＩが陰
イオン交換樹脂に結合しないため陽イオンであることも
示している。第１０図の結果からは更に、改変方法によ
って抽出されたＴＧＩが陰イオン交換樹脂に結合しない
ことから、最初の方法でイオン交換樹脂により抽出され
たポリペプチド（ＴＧｉｌ、ＴＣ［−２、ＣＭ−Ｉ、Ｃ
Ｍ−Ｔ１．ＣＭ−１１１及びＣＭ−Ｉｖ）トイオン特性
が類似していることも知見される。
ＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬｌｌを用いれば大量の試料を
再現可能に分別でき、従って後の精製処理に使用するＴ
ＧＩをより多く得ることができる。第１１図では、９．
９．Ｈの組織抽出物をＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬＲカラ
ム（１５＋ｎｌ）に適用した。クロマトグラフィー条件
はより小さい試料サイズ（２，６５ｍｇタンパク質）及
びより小さいＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬＲカラム（５ｍ
ｌ）を用いる第１０図と同じである。ＮａＣｌ直線勾配
によりタンパク性物質の大部分から得た腫瘍成長阻害活
性の解像はこれら２つの実験で実質的に同しであった。
第１２図はμＢＯＮＤＡＰ八ＫＲＣ＋ａへラムでのＨＰ
ＬＣによりＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬＲカラムから得て
プールした試料の分別を示している。試料を適用した後
では、アセトニトリル濃度を０〜２５％で直線的に増加
しても大きな阻害活性は観察されなかった。しかしなか
ら、Ａ３４９　（ヒト肺癌腫）及びＣＣＬ　６４（ミン
ク肺、０−０）に対する腫瘍成長阻害活性は２８〜３４
％アセトニトリル（フラクション２１〜３１）で単一ピ
ークに溶離され、２０６ｎｍで吸光する物質の大部分は
より低いアセトニトリル濃度（フラクション１１〜１９
）及びより高いアセトニトリル濃度（フラクション３７
〜５０）で溶離した。
ＴＧＩ（最初）方法テＴＧ−Ｉ、ＣＭ−ＩＩＩ及びＣＭ
−ＩＶと名付けた）の見掛は分子量を既知の分子量をも
つ適当なタンパク質標準値を用いてゲル濾過クロマトグ
ラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０、データ示さず
）により測定した。例えば、特定の干渉タンパク質（例
えばヘモグロビン）が存在しないと、ＴＧ−１の見掛は
分子量の測定値は非変性（ｎｏｎｄｅｎａｔｕｒｉＢ）
条件下で２０ｋＤａ〜３０ｋＤａであった。
本明細書に記載の改変方法は、最初の方法で準備したＴ
ＧＩ抽出物から不活性又は干渉化合物を除去する効果的
で簡単な方法である。更に、この改変方法を使用すると
、必要なりロマトグラフィー材料の量及びＴＣＩ準備時
間かの減少するためＴＧＩ分離に使用される種々のクロ
マ）・グラフィーステップの効率が増加する。また、前
述のごとく、本明細書に記載の方法で腰帯からＴＧＩを
抽出すると、ＴＧＩ及び他のタンパク質を最初の方法よ
り高い再現性をもってクロマトグラフィーにかけること
ができる。
この改変方法によって分離したＴＧＩを、逆相高性能液
体クロマトグラフィー及びＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬＲ
イオン交換クロマトグラフィーでのクロマトグラフィー
特性に関して分析した。ＴＧＩはＩＩＰＩＩＩ’Ｌｃで
はＴに［Ｉと類似の又は同じ性状（第５図及び第１２を
比較）を示し、従って類似又は同じ疎水性を有すること
が判明し、また陽イオン交換樹脂上でＣトＩＩＩ及びＣ
Ｍ−ＩＶと類似の又は同じ性状を示すため類似の又は同
しイオン特性を示すことが判明した。
そのため、該改変方法によって分離したＴＧＩとＴＧＩ
−Ｉ、ＣＭ−ＩＩＩ及びＣＭ−ＩＶとは類似の又は゛同
じイオン特性及び疎水性を有し、従って類似の又は同じ
組成をもつ類似の又は同し化合物であると結論できる。
従って、本明細書に記載の改変方法は、後の分析及び特
性測定に使用するための純度のより高い形態のＴＧＩを
得るためのより効果的な方法を構成する。
第３実験シリーズ Ｌ」 使用する緩衝液及び装置は処理の各関連ステップ毎に第
２実験シリーズの場合と全く同様に準備しな。２００〜
４００ｇのヒｌ−Ｉｌｌ帯を、解離により血管を除去す
るか又は完全なまま１／２インチの小片に刻んで４℃の
ＰＢＳ−ＰＡ中で洗浄し血液の大部分を除去した。腰帯
は篩を介して一重カにより水切りし、４°Ｃに冷却した
フードプロセッサに移して最大量２００ｍ　ｌのＰＢＳ
−ＰＡ中でホモジナイズした。組織を１５分間ホモジナ
イズした後洗浄し、２８０ｎｍでの光学濃度が０．０５
未満になるまてＣＳΔローター（Ｓｏｒｖａ　ｌ　ｌ　
）付き５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５１１遠心分離器を用いて
２００ｍ　ｌプラスチック場内でＰＢＳ−陥と共に５０
００回転の遠心分離に繰り返しかけることによって血液
を除去した。
得られたペレットは本質的に白色であった。このペレッ
ｌ〜を、第１実験シリーズて説明したように、２リット
ルのガラスビーカーに移し、最終濃度が組織のもとの湿
潤１１ｇ当たり３ｍｌになるように抽出用緩衝液に懸濁
させ、４℃で２４時間撹拌した。
この懸濁液を、８６０００ローター（Ｓｏｒｖａ　ｌ　
ｌ　）付きＲＣ−３Ｂ遠心分離器（Ｓｏｒｖａｌｌ）を
用いて１．０リツトルプラスチツク管内で３０分間３，
５００ｒｐｍの遠心分離にかけた。得られた上澄みを２
リットルビーカーに移し、ｐＨを最初は濃水酸化すトリ
ウムて５．０に調節し、次いて２Ｍ酢酸アンモニウムを
最終濃度が総容量の１％になるように加えて５．２に調
節した。溶液は透明な又は極めて薄い黄色を保持した。
前述のごとくエーテル／エタノール沈澱処理を行った後
、サイフオンによって上澄みをフラスコから除去し、沈
澱物の入ったフラスコ底部から３７４インチのレベルま
でにした。沈澱物と残りのエーテル／エタノール溶液と
を５ｏｒｖａｌ　ＩＲｃ−５Ｂ遠心分離器内の２５０ｍ
１プラスチツク円錐壜（Ｃｏｒｎｉｎｇ。
−１，２３− ＃２５３５０）に入れて５．００ＯｒｐｍのＣＳΔロー
ターにより２０分間遠心分離にかけた。この処理ステッ
プは、沈澱物のすぐ上のエーテル／エタノール上澄みか
らのＴＧＩ損失を低下させるために行った。得られたペ
レットを１．０Ｍ酢酸に懸濁させ、エーテル／エタノー
ル沈澱物の入ったフラスコを１．０Ｍ酢酸で洗浄してフ
ラスコの壁に残っているＴＧＩタンパク質を完全に除去
した。２８０ｎｍでの光学濃度は０，５〜１．０であり
、最終容量はいずれの試料でも１００ｍ１以下であった
。分子量カッ１〜オフ３，５００の透析膜（Ｓｐｅｃｔ
ｒｏｐｏｒ　３）を用いて、このＴＧＩ含有含有タンパ
溶質溶液、０Ｍ酢酸に対して一日、ｐＨ４，５の４．０
Ｍ酢酸アンモニウムに対して］・〜２日透析した。
腫瘍成長阻害活性は、エーテル／エタノール沈澱処理ス
テップを省略しても組織の酸性化エタノール抽出物から
得ることができることに留意されたい。但し、これらの
試料はエーテル／エタノール沈澱処理を使用する標準試
料に比べて比活性が５０％少なく、総括性収率が１０〜
ｂ −７互−クロマトグラフィー゛ 透析したタンパク質を、クロマトグラフィー樹脂として
ｐｌ＋ｅｎｙ　トＳｅｐｈａｒｏｓｅＲ（Ｐｈａｒｍａ
ｃ　ｉａ）を用いて疎水性相互作用クロマｌルブラフィ
ーにがけな。。
このｐｈｅｎｙト５ｅｐｂａｒｏｓｅＰはｐＨ４，５の
４．０Ｍ酢酸アンモニウムで平衡化した。透析（少なく
とも２４〜４８時間）後前記タンパク質溶液の導電性及
びｐｌ＋を測定し、透析液と平衡化用緩衝液の導電性が
同じになったら透析を停止する。タンパク質を（Ｍｉｃ
ｒｏ−ｐｅｒｐｌｅｘＲポンプ＃２１．３２−ＬＫＢに
より）１．６ｘ　２．０ｃｍクロマトグラフィーカラム
（Ｋ−２０−Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）内の樹脂に１．０
ｍｌ／分てボンピングした。樹脂使用量はタンパク質２
．０ｍｇ当たり１ｍｌであった。前記カラムをＯＤ２．
、がゼロになるまで洗浄し、ｐｌ＋４．５のエチレング
リコール（Ｈａ　Ｉ　Ｉ　１ｎｋｒｏｄｔ）含有酢酸ア
ンモニウム濃度を４゜ＯＭから０．０４Ｍまでの減少勾
配にしてカラムから腫瘍成長阻害活性を溶離した。前記
酢酸アンモニウムのエチレングリコール濃度はＯから５
０％まて増加さぜた。溶離勾配の総容量は個々の試料に
使用する樹脂の総容量の１０倍てあった。結合タンパク
質は約５０のフラクションにわたって溶離した。、１０
１．＋１の試料をＢＳ＾５０μｇを含むプラスデック管
（ポリスチレン）に移して、第１実験シリーズのように
ミンクＣＣＬ　６４及びＡ３４９細胞系に対する腫瘍成
長阻害活性を分析した。
第１３図に示すように、腫瘍成長阻害活性は１．５Ｍ酢
酸アンモニウム、３１％エチレングリコールでカラムか
ら溶離し始め、４０ｍＭ酢酸アンモニウム及び５０％エ
チレングリコールでカラムから完全に溶離した。生物学
的に活性のフラクションをプールし、０．１Ｍ酢酸に対
して透析し、ポリプロピレン５０＋ｎｌ管（Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　１ｌｃ２３９０−５０
）又はケイ素含有ガラス凍結乾燥フラスコ（Ｖｉｒｔｉ
ｓ）内で凍結乾燥した。
ｊ　；　ゞ　クロマトグラフィー 凍結乾燥した生物学的活性物質を、１．０〜３．０ｍｌ
の１０％アセト二Ｉ・リル含有０．０５％１〜リフルオ
ロ酢酸（ＴＦ＾）で希釈し、１６　ｘ　１００ｍｍの使
い捨てケイ素含有カラス管内に導入し、２分間音波処理
し、１０分間３，０００ｒｐｍで遠心分離にかけて（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ　ＭｏｄｅｌＴ　、１−６　）不溶性物質
を除去し、その後１．１ＢＯＮＤＡＰＡＫＦ′ｃ、。
樹脂（ＷａｔｅｒｓΔ５ｓｏｃ　、　０．３９　ｘ　３
０ｃｍ　、　ＰＮ　２７３２４）を用いる逆相高圧液体
クロマ１へグラフィーにかけた。
各カラムには、各試料に必要なカラム処理の回数がｐｈ
ｅｎｙ　ｌ−５ｅｐｈａｒｏｓｅによるクロマトグラフ
ィーの後で得られる活性フラクションの総タンパク質濃
度に依存するように、１ｍｇ以下のＴＧＩを適用した。
この量は、タンパク質１ｍｌ当たり１．０ｍｇに等しい
１．０光学部度単位の値を用いて０Ｌａｏて近似値を求
めた。タンパク質は、溶離移動相として０．０５％ＴＦ
八を含む１００％アセ１〜二ｌ〜リルを用いて勾配式に
１．０ｍｌ／分で段階的にカラムから溶離させた。勾配
は１５分で２５％アセトニトリル ぜ、２５％（ＣＩｉ２ＣＮ）で１０分間溶離させ、２分
で２７％に増加させ、１０分間１７％にし、２分て２８
％に増加させ、１分間２８％にし、１０分で３０％に増
加させ、１０分て４４％に増加させ、１０分て１００％
に増加させた。タンパク質の吸光度を２１０ｎｍでモニ
ターし、Ｉ、０ｍｌフラクションから１つおきに０．０
０５ｍｌアリコーｈを採取し、ＣＣＬ　６４及びＡ５４
９細胞系に対する腫瘍成長阻害活性を分析した。腫瘍成
長阻害活性は第１４図へ及び第１４図Ｂに示すように、
最初２７％アセ）・ニトリルで溶離し、２８〜３０％ア
セトニトリルで溶離し続けた。精製の各ステップて生物
学的に活性のフラクションをプールし、後でアリコート
を採取して総腫瘍成長阻害活性を分析し、且つ該分析で
得られた活性に適当な希釈度を掛けた。当該プールに存
在する腫瘍成長阻害活性の量を出発材料のアリコートと
比較した。このようにすれば、活性及びタンパク質く測
定可能であれば）をカラムで回収することができる。
第１４図へに矢印で示されている領域（フラクション４
７〜５１）は２つの別個のＣｌａクロマトグラフィーか
ら誘導されたものであり（１つのｐｈｅｎｙ　Ｉ　−Ｓ
ｅｐｈａ−ｒｏｓｅカラム、１回の分離）、これをプー
ルして非還元条件下（第１５Ａ図）及び０．５％β−メ
ルカプ１〜エタノールの存在下（還元条件下）（第１５
図Ｂ）てＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。このクロマトグラ
ム領域（第１４八図）は最大の生物学的活性と最低の汚
染性タンパク質量（２１０ｎｍで最大の比活性及び最小
の吸光度）を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの実験的詳細を
第１５図に示した。
非還元条件下（第１５図へ）のレーン２では、生物学的
活性フラクションが少なくとも４つの主要タンパク質バ
ンドを含んでいる。レーン１は血小板から誘導したＴＧ
Ｆ−βの精製試ｆ′４（オレゴン州ボーＩ・ランド、Ｏ
ｒｅＨｏｎ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｌｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙのＢｒｕｃｅ　Ｍａｇｕｎから入手）を
含んでいる。このタンパク質に与えられた生物学的活性
とは、ＥＧＦのごとき成長因子が２．０〜２．５Ｂ／＋
ｎｌで存在する場合にのみ軟寒天アッセイで正常なラッ
ト腎細胞（ＮＲＫ）に足場依存性成長を与える能力であ
る。従ってその成長促進活性は別の生物学的活性タンパ
ク質に直接依存する（Ｒｏｂｅｒｔｓ他、　Ｃｏ１ｄ　
ＳｐｒｉｎｇＨａｒａｂｏｒＣｏｎｆ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐ
ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、　９：　３１９−３３２（
１９８２））：ＡｎＺａｎｏ他、＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　１２５：　２１７−２２４（１９８２）；Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４２：４７７６−４７
７８（１９８２））。
腫瘍成長阻害活性に関する我々の分析では、ＴＧＦ−β
はタンパク質Ｂ当たり１〜３０単位の阻害活性を有する
ことが判明した。これを比較すると、第１５図へのＴＧ
Ｉ試料のタンパク質バンドの１つ（レーン２）もＴＧＦ
−β（レーン１）と同じほぼＭｒ４５ｋＤａの位置に泳
動することが知見される。５％β−メルカプＩ・エタノ
ールの存在下で電気泳動した同し試料は、Ｍｒ２６ｋＤ
ａで泳動したタンパク質バンドが消失し、新しいバンド
がほぼ１２．５ｋＤａに現れることを示している（第１
５図Ｂ、レーン２）。第１５図ＢのＴＧＦ−β（レーン
１）も還元の後て泳動位置が１３ｋＤａに移動した。Ｔ
ＧＩ含有試料中の他の総てのタンパク質は同し泳動位置
に留どまり、従って還元には反応しなかった。各試料毎
にゲルに適用した阻害活性単位はレーン１のＴＧＦ−β
で約１　、００（１〜１　、５００　（５０ｎｇ）、レ
ーン２のＴＧＩで約１０，０００〜２０，０００であっ
た（第１５図Δ、第１５図Ｂ）。
ＲＰＩＩＰＬＣＣ，、クロマトグラフィー処理から誘導
したＴＧＩ生物学的活性フラクションを、ＣＮｐｌ１Ｏ
ＮＤＡＰＡＫＲカラム（０，３９ｘ３０ｃｍ、Ｗａｔｅ
ｒｓ　ＰＮ　８４０４２）を用いるＲＰＩＩＰＬＣによ
り更に精製したく第１６図）。この生物学的活性フラク
ションを１６ｘｌＯＯｍｍケイ素含有ガラス管内で凍結
乾燥させ、１０％プロパツールを含む０．０５％ＴＦ＾
１．０〜３．０ｍｌに溶解し、カラムに適用した。カラ
ム溶離は、１０分で１０％から２０％まで、１５分で２
０％から５０％まで（０，６％／分）次いで２０分で５
０％から１００％までという２−プロパノールの直線勾
配を用いて１．０ｍｌ／分で実施した。
５ＯＳ−１’ＡにＥによる　　に　　　るための生　″
′自ゞフラクションのヨウ素化 第１８図に示した凍結乾燥活性フラクション５６．５８
．５９〜６５．６６〜６８と、約４ｎｇのＴＧＦ−βと
をクロラミンＴ法でヨウ素化した（ＭａＣｏｎａｈｅｙ
、Ｐ、Ｊ、及びＤｉｘｏｎ、Ｆ、Ｊ、（１９６Ｂ）Ｉｎ
ｋ、八ｒｃｈ、ｏｆ　　ＡＩ！ｅｒｇｙ　　２９．　１
８５−１８９）。各フラクションを１００．　ｌの０．
１Ｍ酢酸に再懸濁し、３μｍの１．５Ｍ　トリス、ｐｌ
（８，８、を加えてｐＨを７．０に調節した。１０．Ｃ
の無キャリアヨウ化ナトリウムｌＩ２５Ｎａを加え、次
いで２ｐｌのクロラミンＴ（Ｓｉｇｍａｎ　＃Ｃ９８８
７）を１．０ｍｇ／ｎ＋Ｉ加えた。管を１分間振動させ
、２ν１のメタ亜硫酸水素すトリウム（Ｓｉｇｍａ　＃
５９０００）を０．１ｍｇ／ｍｌで加えることによって
反応を停止させた。２分後各試料０．０５ｍ１を、２度
濃縮した試料Ｍ＠液０．０５ｍＩと５％β−メルカプト
エタノールとを収容した管（１０ｘ　７５ｍｍ＞に移し
て５Ｏ３−ＰＡＧＥスラブゲル電気泳動にかけた。
試料の残りを２度濃縮した試料緩衝液０．０５ｍ１で希
釈して約２００　、０ＯＯＴＣＡの沈澱性放射能計数を
５ＤＳ−ＰＡにＥ用に個々のレーンに適用した（第１７
図）。ゲルを０．１２５％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕ
ｅで１０分間染色処理してタンパク質をゲル中に固定さ
せ、遊離放射性ヨウ素を除去すべく徹底的に脱染色した
。ガンマ計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｒｉａｇａ＋ｎｍａ
　＃１２９４）での脱染色溶液ｉ、。
ｍｌの計数に基づき、脱染色溶液が検出可能ラベルを含
んでいないと判断されたら、ゲル乾燥器（Ｈｏｅｆｆｅ
ｒ−ＳＥ１１５０）を用いてゲルを乾燥させオートラジ
オグラフィ用にＸ線フィルムに暴露したく１週間）。
生物学的活性ＴＧＩを付加した総てのレーンはＭｒ２４
ＫＤａで泳動する微弱なタンパク質バンドを含んでいた
。このタンパク質バンドはまた、血小板から誘導したＴ
ＧＦ〜βを２５６阻害単位含むレーン７内でＭｒ２６Ｋ
Ｄａバンドをもつ水平面上を直接泳動した（第１７図、
レーン７矢印）。
夫々的１８０．２，０００．４６及び４０８単位の腫瘍
成長阻害活性を含むレーン１．２．３及び５ではＭｒ２
５ＫＤａバンドが観察されたのに対し、腫瘍成長阻害活
性を示さなかったレーン４及び６はこのタン□　バク質
バンドを含んでいなかった。最も活性の高いフラクショ
ンを含むレーン２（第１６図）はＭｒ２６ＫＤａ及び３
０ＫＤａに２つの微弱バンドを示した。レーン３はＭｒ
２６ＫＤａのバンドを１つ有するにすぎないと思われた
。
ＴＧＩ精製の最終ステップの後では、タンパク質濃度は
検出レベルを下回るため標準的測定手段では測定できな
かった。そこて、Ｍｒ２６ＫＤａで泳動するバンド（レ
ーン２．３及び７から）を乾燥ゲルから切除して、レー
ン２及び３に適用されるタンパク質濃度を外挿すべくガ
ンマ計数器で計数した。
Ｍｒ２６ＫＤａで５，５９３ｃｐｍを有するゲルに０．
４ｎｇのＴＧＦ−βを適用したことは分かっているため
、２６ＫＤａ位置での３６２（レーン２）及び１９５（
レーン３）ｃｐｍは夫々２６ｐｇ及び１４ｐｇに等しい
ことになる。これらの計算はチロシンの数及び各チロシ
ンのヨウ素化の程度が同じであることを前提とする。
Ｍｒ２６ＫＤａバンドの存在は腫瘍成長阻害活性の存在
に呼応していた（第１７図）が、活性の量（単位）は特
にレーン２ではＴＧＦ−βタンパク質の量と相関関係を
もたなかった。これはゲル（０，４ｎｇ）に適用された
ヨウ素化タンパク質の強さによって判断される。従って
、ＴＧＩはＴＧＦ−βより少なくとも１対数分大きい阻
害活性を示した。
第１４八図及び第１４Ｂ図に示すように、ＲＰＨＬＣＣ
，、Ｒによって広い活性ピークが得られたことから、活
性ピークは２つ、即ち２７％と２８〜３０％とに１つず
つ存在し得ると考えられた。これら別個のピークによっ
て規定される領域をプールして、ＣＮカラムを用いるＲ
ＰＩＩＬＣにより別個にクロマトグラフィーにかけた。
プロパツール勾配の傾斜は２−プロパノール増分の増加
が０．６％／分ではなく０．３７５％／分になるように
変化させた。勾配をこのように浅くしたのは、４０〜４
５％２−プロパノールで活性タンパク質をより良く溶離
させ、るためである。
第１８図は、前述のＣ１８カラムから２７％アセトニト
リルでプールした活性フラクション（プール■）のＣＮ
カラム溶離プロフィルを示している。最も活性の高いフ
ラクション（フラクション＃１４）は４０〜４１％２−
プロパノールで溶離した。このピークの後ではより少量
の活性が約４４％２−プロパノールで二重ピークとして
溶離していた。同様にして、０１８カラムから２８〜３
０％アセトニトリルでプールした活性ピークから誘導し
た活性物質（プールＩＩ）を再クロマトグラフィーにか
けると、４４％２−プロパノールでのカラムＣＮからの
溶離に対応する活性ピークが示された（第１９図）。２
７％アセトニトリルで溶離する第１活性プール（プール
Ｉ）は２８〜３０％アセトニトリルで溶離するプールＩ
Ｉからの活性物質を幾らか含んでいた。そのため、この
活性ピークの少量が４０〜４１％２−プロパノールでの
プールＩのクロマトグラムに現れた（第１８図）。最も
重要なこととして、ＴＧＩを更に精製するとプール■に
関しては４０〜４１％、プールＩＩに関しては４４％で
溶離する２つのＴＧＩ活性主要ピークが解像された。
ＣＩＢカラムからのブール■は、プールＩｌと比べて８
２％大きい総阻害活性を含んでいた。
第２０図は第２０図（プールＩ）及びグイ２１図（プー
ルＩＩ）の２つの別個のクロマトグラフからの活性ピー
クを示している。この図（第２０図）は２つの別個の阻
害活性ピークを０１８カラムからの異なる活性フラクシ
ョン、即ちプールＩ及びプールＩＩを示す。
Ｃ１８カラムを用いるクロマトグラフィーの後でもＴＧ
Ｉ生物学的活性が保持されるようにするためには、ＣＮ
クロマトグラフィーに先だって活性フラクションを凍結
乾燥しない方が良いことが判明した。そこで試料は（完
全ではなく）部分的な凍結乾燥によって濃縮し一２０℃
で貯蔵した。
Ｉｌ、　　々の・　　　呉のｔらし１立（１から′１　
れる−　刺　ユ 腫瘍細胞ならし培地からのＴＧＩ活性に対するジチヒト
腫瘍細胞Ａ４３１．（エピデルモイド癌腫）、八６７３
（膀胱癌腫）、及びＴ２４（横絞筋肉腫）をＴ１５０（
１５０ｃｍ２）フラスコで、１０％ウシ胎児血清を補足
したＤＭＥＭを含む完全成長培地２０ｍ１中て集密的に
成長させた。
この集密細胞単層をＤｕｌｂｅｃｃｏ濃縮リン酸緩衝液
で２度洗浄し、フラスコ当たり１０〜１２ＩＩｌｌの無
血清ＤＭＥＭ中で２４時間インキュベートシな。ならし
培地（ＩＯＣＩ−１１５ｍｌ）を１〜４ｘ１０８個の細
胞から集めた。
赤白血病細胞系に５６２を１．０６個／ｍｌの細胞濃度
まで増殖させ、１リツ１〜ルの無血清ならし培地を採取
した。４°Ｃで６０分間８００ｒｐｍの遠心分離にがり
て前記ならし培地から細胞破片を除去した（ＲＣ−５Ｂ
　ＧＳＡローター５ｏｒｖａｌｌ）。上澄みを、ならし
培地１．００ｍ１当たり１１ｏ１の１Ｍ酢酸で処理し、
５ｐｅｃｔｒｏｐｏｒ３透析管（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍ
ｅｄｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて多
様な１Ｍ酢酸に対し十分に透析し、凍結乾燥した。
この凍結乾燥した酸処理ならし培地を八４３１．Δ６７
３及びＴ２４に関しては５．０ｍｌの容量、培地から誘
導したに５６２に関しては１．５ｍｌの容量でＡｍｍ　
ＩＩｃＩ中に再懸濁させた。不溶性物質をＲＣ−５Ｂ遠
心分離器＜５ｏｒｖａ１１．Ｓへ６００ローター）によ
り４℃、３４００ｒｐｍで１５分間遠心分離処理するこ
とによって除去し、上澄みを１．５ｍｌマイクロフユー
ジ、：Ｌ　（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管に移した。Ｅｐｐ
ｅｎｄｏｒｆマイクロフコー−ジュ内４℃て１５分間遠
心分離にかけた後、上澄みを１．．５ｍｌマイクロフユ
ージュ管に移し、−２０℃で貯蔵した。２８０ｎｍての
吸光度によりタンパク質濃度を測定した。
各試料の腫瘍成長阻害活性をジチ第１〜レイトール（Ｄ
ＴＴ）による還元に対する感度に関してテス１〜した。
各０．５１１１１のアリコートを４．５ｍｌの０．１Ｍ
　Ｎｌ＋、１ｌｃ、３の入った２つの管に移した。一方
の管には最終濃度６５ｍＭでＤＴＴを加え、これら２つ
の管を室温で２時間インキュベートシた。インキュベ−
１〜した混合物を次いで５ｐｅｃｔｒｏｐｏｒ　６透析
管に移し、ＩＭ酢酸に対して２日間透析してＤＴＴを除
去した。次いて透析した試料を最初の方法で述べたよう
に腫瘍成長阻害活性に関して分析した。ミンク細胞ＣＣ
Ｌ６４及びΔ５４９細胞をターゲラＩ・細胞として使用
する＾４３Ｉ、八６７３、Ｋ５６２及びＴ２４細胞から
のならし培地から誘導したＴＧＩ活性に対するＤＴＴの
作用を夫々表６及び表７に示す。この表は、ミンク細胞
及びへ５４９細胞の両方に対する八６７３、に５６２及
びＴ２４からのならし培地から得た腫瘍成長阻害活性が
還元後に消滅する（表６）のに対し、Δ５４９細胞に対
して好ま゛しい腫瘍成長阻害活性を示したへ４３１細胞
のならし培地からの腫瘍成長阻害活性は還元後に少しし
か低下しなかったことを示している（表７、第１列）。
表６ ミンクターゲラ１〜細胞、を用いる腫瘍細胞ならし培地
からの腫瘍成長阻害活性に対するジチオ１・レイトール
（ＤＴＴ）の作用阻害率（％〉 タシへり質　　　　　　へ４βＪ、　　　　　　　　　
　　へ６７ジ　　　　　　　　　Ｋ５漫２　　　　　　
　　　Ｔ２４−１ｇ　　　　−ＤＴＴ　　　　　＋ＤＴ
Ｔ　　　　　−ＤＴＴ　　　　＋ＤＴＴ　　　−ＤＴＴ
　　　＋ＤＴＴ　　　−ＤＴＴ　　　＋ＤＴＴ１２．４
　　　９３　　　　　　１９　　　　　　９５　　　　
　　０　　　　９１　　　　１４　　　　９３　　　　
２１２．５　　　７０　　　　　　１１　　　　　　９
４　　　　　　０　　　　９２　　　　１８　　　　９
２　　　　１５０．５　　　２６　　　　　　１１　　
　　　　８７　　　　　１．４　　　　８６　　　　　
０　　　　９２　　　　　７０．１２９　　　　　　　
６　　　　　　５０　　　　　　０　　　　４９　　　
　１２　　　　７５　　　　　１１；八４３Ｉ、Δ６７
３、Ｋ５６２及びＴ２４細胞からのならし培地を６５ｍ
Ｍジチオｌ−レイ１〜−ル（ＤＴＴ）で処理し且つター
ゲット細胞に対する腫瘍成長阻害活性をテス１〜して対
照と比較した。
表７ へ５４９ターゲッ１〜細胞を用いる腫瘍細胞ならし培地
からの腫瘍成長阻害活性に対するジチオトレイトールの
作用阻害率（％） ６１．８　　７５　　４５　　　７１　　　８　　７４
　　１２　　７９　　２８１２．４　６９　　　５６　
　　７０　　　２　　７１　　−２　　７７　　１１２
．５　４９　　　４２　　　５８　　　４　　６１　　
０　　７６　　２００．５２８　　　３５　　　３４　
　　０　　３６　　９　　６０　　２０．１１０　　　
　ｔｏ　　　　７　　　１　　１４　　０　　４７　　
５１：Ａ４３Ｉ、＾６７３．　Ｋ５６２及びＴ２４から
のならし培地を６５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）
で処理し且つ八５４９に対する腫瘍成長阻害活性をテス
トして対照と比較した。
Ａ４３１ならし培地の逆　１１　Ｐ　Ｌ　Ｃ４ｘ＋、０
８個のへ４３１細胞の凍結乾燥したならし培地（１１，
０ｍ１）を前述のごとく処理した。但し凍結乾燥物質の
溶解には５．０ｍｌの４ｍＭ　ＩＩｃＩを使用した。不
溶性沈澱物を前述のごとく遠心分離によって除去し、タ
ンパク質濃度を測定した。０．２ｍｌアリコート（６８
０１Ｉｇタンパク質）を１．８ｍｌの０．１Ｍ二炭酸ア
ンモニウム、又はこの緩衝液に６５ｍＭ　ＤＴＴを添加
したものに加えた。室温で２時間インキュベー１−　し
た後、還元試料及び非還元試料を双方共凍結乾燥させ、
ＲＰ　ＨＰ　Ｌ　Ｃにかけるべ（２，０ｍｌの０．０５
％１〜リフルオロ酢酸（ＴＦ＾）に再懸濁させた。Ｃ１
８セミプレパラテイブ力ラムに注入した後、５０分で０
〜５０％のアセ１へニトリル直線勾配を用いてタンパク
質を１゜０ｍ１７分て溶離した。１．０ｍｌアリコート
を各２．０ｍｌフラクションから除去して最初の方法で
述べたようにミンク細胞及びへ５４９細胞系に対する腫
瘍成長阻害活性を分析した。第２１図は阻害活性ピーク
が２つあることを示している。１つは２５％アセトニト
リルで溶離し、ＣＣＬ６４及びΔ５４９細胞を両方とも
阻害し、１つは３０〜３６％アセト二Ｉ〜リルで溶離し
てへ５４９細胞系の方により大きい阻害活性を示す。Ｄ
ＴＴ処理（第２２図）の後では第１活性ピーク（２５％
アセ１−二トリル）は消滅し、Δ５４９細胞に対して選
択的活性を示すピークは活性を保持した。
「７３　　シリーズ　から′尋られる′士ｔＩ、ｒ改変
方法」と名付けた第２実験シリーズで既に示したように
、胆帯から血液及び血管を除去すると第１実験シリーズ
の場合に比べてＴＧＩの特異的活性が約１００になる（
表５）。「変形方法」と名付けた第３実験シリーズでは
、第２実験シリーズと同程度の平均特異的活性をもつＴ
ＧＩを得るためには、血液のみを除去し血管は除去しな
いことが必要であることが明らかになった。実際、基質
組織から解離した腰帯の血管組織は、腋帯基質組織のみ
の場合と同程度の腫瘍成長阻害活性を示した（データ示
さず）。更に、腫瘍成長阻害活性は抽出物をエーテル／
エタノール沈澱処理にかけなくても回収できることが判
明した。
抽出に使用する酸性化エタノールの組織ＩＢ当たりの容
量は、最初の方法及び改変方法で述べたものより５０％
少なかった。従って、抽出したタンパク質の総容量も少
なく、そのため沈澱処理に使用されるエーテル及びエタ
ノールの必要量も半分であった。その結果、フラスコの
壁に付着するタンパク質の量は最少限に抑えられる。ま
た、沈澱物の溶解及びフラスコの洗浄に必要な１，０Ｍ
酢酸の量もより少なく、そのため最終容量が最少限に維
持された。明らかな利点は、タンパク質／活性損失が最
低限に抑えられ、従って試薬の必要量が少ない等、より
効果的な抽出方法が実現されることにある。更に、解Ｍ
Ｗ４帯ではなく完全な膳帯を刻むため、面倒な準備時間
が短縮される。２００〜４００ｇの両帯（湿潤重量）か
ら誘導した最終試料の平均的特異活性は、クロマＩ・グ
ラフィーにより更に精製する前で約１〜３．０ｘ１０６
単位／４０〜５０ｍｇてあった（表８参照）。
表８ 腰帯からのＴＧＩの精製の概要 ステップ　タシバク質　　単位　　　　単位／ｌｌ１ｇ
　　　　回数　単位回（ｍｇ）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　複重（ｚ）女 Ｉ、エーテル／　　　　２０−５０　　　　　１−３ｘ
１０６　　　　　５ｘｌＯ’　　　　　　　　　１　　
　　　　１００エタノール 沈澱物 ２、ｐｈｅｎｏｌ　１−３　　　１−５ｘ１０６１−２
ｘｌＯ６２０−４０１００Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｋ′＃来 ３、ＲＰＨＰＬＣ−０，０２０，２−２，３ｘ１０６１
−２ｘｌＯ９２−４ｘｌＯ’　６０−１００１Ｂ ＣＮ 犬２００〜４００１？湿潤組織。
実大　Ｎ、Ｄ、検出不可。
絶轄　　タンパク質濃度が検出不可であったため推定し
たもの。
これらの結果は「改変方法」に関して述べた実験結果の
範囲内にあり、従って最初の方法に比べて「改変方法」
と同程度のタンパク質回収率及び特異的活性の改善を表
す（表５）。従って全体的抽出効率は改変方法で述べた
ように約５倍大きい。
表８は、ヒト腋帯からＴＧＩ活性を得るために使用され
る当該方法に係わる。精製の最初の２つのステップ（０
１８でのＨＩＣ及びＲＰＨＰＬＣ）を通して６０〜１０
０％の活性単位回復が観察された。これは、１．０ｘ１
０６単位／ｕｇ（湿潤重量で３００ｇの腰帯から２．３
ｘ１０６の総単位）の特異的活性の４０，０００の増加
を表す。
精製が進むにつれて活性が不安定になったことから、汚
染性タンパク質がＴＧＩの生物学的活性の安定化を助け
ていた可能性が考えられた。最大回復損失はＣ１８カラ
ムでのＲＰ　ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃの後に得られた活性フラ
クションの凍結乾燥後に生した。このために、精製の最
終ステップでＣＮカラムに適用される単位の総数が大幅
に減少した。この損失は活性フラクジョンを完全にでは
なく凍結乾燥させることによって改善された。この精製
最終ステップからの単位の回復は６０〜１００％であっ
た。
「最初の方法」ではクロマトグラムが準備段階の最初で
変化したため、改良を行うための後続ステップを案出す
ることが難しかった。改変方法及び変形方法で述べた手
法では、個々の腋帯試料から誘導した物質を用いること
によって総てのクロマトグラム、タンパク質収率及び各
ステップの活性収率の再現性が得られることを示してい
る。この改善は酸性化エタノール抽出処理前のヘモグロ
ビン（変性したもの）除去、及びｐｈｅｎｙ　Ｉ　−５
ｅｐｈａｒｏｓｅを用いる最初のクロマトグラフィース
テップで行った他の汚染性タンパク質のより効果的な除
去の直接的結果である。
精製処理の最初のクロマトグラフィーステップとして、
ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いる疎水性相互
作用クロマトグラフィー（ＨＴＣ）を使用したことが、
総括性収率（総単位）及び比活性（単位／ｍｇ＞の主要
改善要因であることが判明した。ＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒ
ｙｌｌｔによるイオン交換クロマＩ・グラフィーの後で
は４．２ｘ　１０’単位／■の比活性が得られ、ｐｈｅ
ｎｙｉＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーでは比活
性１．０７ｘ１０６単位／１ｎｇのＴＧＩが得られた。
このステップでｐｌ＋ｅｎｙｌ−Ｓｅｐｌ＋ａｒｏｓｅ
クロマトグラフィーを行うことによって該方法の精製操
作はほぼ２０倍になった。
しかしなから、ｐｌ＋ｅｎｙ　ｌ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ
クロマトグラフィーによって得られたＴｅｌ含有タンパ
ク質は、ｃトＴｒｉｓａｃｒｙｌ”クロマトグラフィー
から誘導したＴＧＩ含有物質の２６倍の比活性を示した
。
Ｔｅｌ含有タンパク質の総酸￥−（阻害単位）及び比活
性を増大させて、タンパク質を均質状態まで精製するの
に必要なステップ回数だＣフ処理するために適切な生物
学的活性物質が存在することになるように実験を工夫し
た。「改変方法」における血液の除去、及び「変形方法
」におけるｐｈｅｎｙ　ｌ　−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅク
ロマトグラフイーの使用は、この目的を達成する上での
大きな要因であった。精製処理にｐｈｅｎｙｌ−３ｅｐ
ｈａｒｏｓｅクロマトグラフイーを導入すると比活性の
より大きい（１〜２ｘ１０６単位／１．１ｇ＞物質が得
られ、そのため最少量の出発材料（湿潤組織重量）を均
質性への最終精製に向けてより少ないステップ数で更に
精製することが可能になった。
ｐｈｅｎｙ　ｌ−５ｅｐｂａｒｏｓｅクロマＩ・グラフ
ィーの後では、１．５Ｍ酢酸アンモニウム、３７％エチ
レングリコールて溶離するＴＧＩ活性ピークが１つ得ら
れた（第１３図）。これはまた、最初の方法に比較して
、ＣトＴｒｉｓａｃｒｙｌＲを用いる「改変方法」での
ＴＧＩ分離を改善させる大きな要因であった。
「変形方法」によってＴＧＩの精製にもたらされる別の
改良点は、最初の方法及び改変方法で使用した直線勾配
（第１２図）ではなく　、Ｃ１８ＲＰＨＨＰＬＣからア
セＩ−ニトリルにより段階的に溶離する方法（第１４図
へ及び第１４図Ｂ）を使用することにあった。この方式
でカラムの溶離を行うと、主要活性ピークから約９０％
の生物学的不活性汚染物質を分離することができる。最
も重要なことは、ｐｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅクロ
マトグラフィーを用いると、各カラム毎に１．０ｍｇを
使用する最高３つ最低２つのＲＰＨＨＰＬＣＣ１８及び
分析カラムに試料全体を適用するのに十分な、より少な
いタンパク質が湿潤重量２００〜４００ｇの腰帯から得
られることである。
Ｃ１８でのＲＰ　ＨＨＰ　Ｌ　Ｃによって精製度のより
高い生物学的活性タンパク質をより大量に得る可能性は
、ｐｈｅｎｙ　ｌ−５ｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフ
イーからの高比活性の腫瘍成長阻害活性の分離に関連し
ている。
ＣＭ−ＴｒｉｓａｃｒｙｌＲによるクロマトグラフィー
（改変方法）の後では、生物学的活性フラクション全体
の２０％をＲＰＨＩＩＰＬＣ（Ｃ１８）にかけることが
てきるに過ぎないが、ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅクロマトグラフィーからのプールした生物学的活性フ
ラクションは通常全体の５０％を一度に０１８カラムに
適用できる。これら個々の比較実験では、出発材料がＣ
Ｍ−Ｔｒｉｓ−ａｃｒｙｌ’使用クロマトグラフィーの
場合で９．９ｍｇ、ｐｈｅｎｙ　ト５ｅｐｂａｒｏｓｅ
クロマトグラ・フィーの場合で４２ｍｇであった。従っ
て同量の出発材料をＣＭ−Ｔｒｉｓ−ａｃｒｙ　Ｉ　’
に使用していれば、次のＣ１８ステップには総試料の４
．７％しか使用できなかったことになる。
Ｃ１８カラムにはより大量の阻害活性を適用できるため
、同程度の阻害活性を得るために１／１００（０，５ｍ
１に対して０．００５ｍ１＞の試料を使用した。この方
法のこの時点では、最も大きい生物学的活性をもつフラ
クションが銀染色法を用いる５ＯＳ−ＰＡ［；Ｅにより
６つの主要タンパク質バンドに分解された。
ＣＩ８カラムでのＩＩＰＬｃの後では、タンパク質濃度
は、得られるタンパク質量が標準的方法の分解能（ＯＤ
２８ｏ又はＬｏｕ＋ｒｙ）を下回るため測定できなかっ
た。
従って、タンパク質濃度は２０１Ｉｇ／ｌｏＩ未満であ
ると想定された。ＴＧＩを更に精製するために、活性フ
ラクションをプールして凍結乾燥し、ＲＰＩＩＬＣＣＮ
カラムに適用した。溶媒中０．６％／分の増加率で２−
プロパノール勾配を用いると、活性は大部分のタンパク
質の右側に移動した（第１６図）。種々の活性フラクシ
ョンをヨウ素化し、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した
。レーン２に示されている最大の生物学的活性をもつフ
ラクション（第１６図、フラクション５９〜６５）は同
位体で標識された２つのバンドを含んでいた。１つは２
５ＫＤａのバンド、１つは３０ＫＤａのバンドである。
また、レーン３のフラクション６６〜６８には２５ＫＤ
ａの均質バンドが含まれていた。レーン７のフラクショ
ン＃５８は活性であるが、少なくとも５つのバンドを含
む。フラクション＃５６は主要タンパク質ピークであり
生物学的に活性ではな（，２６ＫＤａバンドを除いてフ
ラクション５８の総てのタンパク質バンドを含んていた
く第１７図、レーン１）。
第１７図に示したゲルから３つの主要中結論が得られる
。１つは、２６ＫＤａタシパク質が生物学的活性物質を
含むフラクションに常に存在しており、生物学的に活性
てはないフラクションには絶対に存在していないことで
ある。２つ目の結論は、ＴＧＩが、第１５８図及び第１
７図に示したように、Ｍｒ２５ＫＤａタンパク質として
５ＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動するという点で、血小板及
び他の組織から誘導したＴＧＦ−βと称するタンパク質
に対して同様の性質の活性を示すということである。３
つ目は、第１７図レーン２に示した最大の生物学的活性
（２，０６８単位）をもつ活性フラクションが、２５６
単位の阻害活性をもつレーン７に見られるＴＧＦ−βの
２５ＫＤａバンドの出現に比肩する強さくヨウ素化タン
パク質）をもちないことである。これは比活性の量の違
いを意味する。
アセトニトリル 勾配で溶離させると、２つの活性ピークが得られた。１
つは２７％で溶離し、１つは２８〜３０％で溶離する（
第１４Δ図及び第１４Ｂ図）。個々のフラクションを第
１４八図及び第１４Ｂ図に示すように類似のプロフィル
をもつカラムからの２つの別個のプール、即ちプール■
（２７％）及びプールＩｌ（２８％）にまとめた後、こ
れらのプールを第１６図に示す勾配より浅い勾配（０．
６％／分に対して０．３７％／分）を用いるＲＰＩＩＰ
ＬＣ　ＣＮカラムに適用した。プール■は４０〜４１％
２−プロパノールで溶離しく第１８図）、プールＩＩは
４４％２−プロパノールで溶離した（第１８図）。ここ
で重要なこととして、予想通りに、Ｃ１８カラムから溶
離するより疎水性のタンパク質（プールＩＩ）はＣＮカ
ラムからより疎水的に溶離し続けた。このように、タン
パク質精製の「改変方法」を使用すると２つの別個の成
長阻害活性ピークが得られた。第１活性ピーク即ちプー
ルＩはプールＩＩより８２％多い阻害単位を含む。
血小板から誘導したＴＧＦ−βと称する精製タンパク質
は我々の阻害活性分析では生１勿学的に活性であったが
、活性が一貫してプール■の１７１０〜１／１００であ
る。プール■でもプールＩＩてＴＧＦ−βでも活性はＭ
ｒ２６ＫＤａのタンパク質バンドの存在に呼応するため
（第１５図及び第１７図）、これらのタンパク質は総て
互いに類似しているか又は同し成長阻害及び／又は成長
緩和活性タンパク質グループに属すると考えられる。あ
るいは、ＣＮ１８及びＣＮ樹脂てのこれらタンパク質の
溶離状態が異なることから、またＴＧＩの比活性がより
大きいことから、ＴＧＩはＴＧＦ−βとは全く異なるも
のであり得る（ＴＧＦ−βプロフィルの側面図は図示せ
ず）。更に進んだ生化学的特徴分析（アミノ酸配列）を
行えばこの問題の回答が得られるであろう。結論として
、ＴＧＩはこの検査で比較のために使用した血小板から
誘導したＴＧＦ−βより優れており（阻害活性）且つそ
れとは異なる（溶離位置）ものであると考えられる。
Δ４３１のならし培地は２つのタイプの成長阻害活性を
含んでいた。１つのＴＧＩは約２５％アセトニトリルで
溶離し、＾５４９及びＣＣＬ　６４ミンク細胞を両方共
阻害する。このＴＧＩの阻害の選択性は、ヒト腋帯抽出
物てＴＧＩ−１及びＴＧＩ−２に関して観察されるもの
に類似している。３０〜３６％アセトニトリルて溶離す
る第２ＴＧＩはミンク細胞よりΔ５４９細胞に対して大
きな特異性を示す。
本出願人等はここて、幾つかの共通の特徴をもつ別個の
エンティティからなるグループについて検討する。各グ
ループメンバーはジスルフィド結合により結合した分子
Ｆ１２６，０００タルＩ・ンのポリペブチ１〜ダイマー
であり、単層培養でミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）及
びヒト細胞系（Ａ５４９）に対して腫瘍成長阻害活性を
示す。
このグループは新しい別個のファクター、ＴＧＴ−１及
びＴＧＩ−２と、既に開示されたファクターＴＩＦ−１
及びＴＧＦ−βとを含む。現時点てはＴＩＦ−１及びＴ
ＧＦ−βはＴＧｉｌともＴＧＩ−２とも異なる同一ポリ
ペプチドであると考えられる。ＴＧＩＩ及びＴＧＩ−２
は別個のものであり、いずれもＴＣ，Ｆ−βと同一では
あり得ない。
ＴＧＩ−１及びＴＧＩ２は各々ＴＧＦ−βより大きい比
括性を有する。ＴＧＩ−１もＴＧＩ２も２−プロパノー
ルを用いるＣＮカラムでの高圧液体クロマ１−グラフィ
ーてＴＧＦ−βとは異なる溶離状態を示す。更に、ＴＧ
ＩＩ及びＴＧＩ−２は２−プロパノールを用いるＣＮで
の高圧液体クロマトグラフィーで互いに異なる溶離状態
を示す。
２つの別個のファクター、即ちＣＭ−１及びピト腫瘍細
胞系（Ａ５４９）のならし培地がち誘導したポリペプチ
ドも開示されている。これらは双方共、ヒト腫瘍細胞系
（Ａ５４９）の成長を実質的に阻害する！ｔ８性を有す
るが、樹立したミンクの肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成
長は阻害しないため、ＣＭ−１は＾４３１細胞のならし
培地から誘導したＴＧＩと同してあり得ると考えられる
。また、ＣＭ−１は先行特許のＴＩＦ−２に類似したも
のであり得るとも考えられる。
７４−　シリーズ ｉ　　　−−’−をもつタンパク　をコード−るＴＧＦ
−β１　ｃＤＮＡの配列は既に知られている（Ｄｅｒｙ
ｎｃｋ　、　Ｒ、他、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１６．７０
１−７０５）。この配列に基づいて我々は２５ｍｅｒオ
リゴヌクレオチ１〜プローブ（ＴＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧ
ＧＣＴＣＧＧＣＧＧＴＧＣＣＧ　）を合成し、これを使
用して市販のラムターｇｔｌｌヒト胎盤ライブラリー（
Ｃ１ｏｎｅｔｃｈＲ）からＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡを分
離した。これらの実験及び下記の実験では、標準的分子
生物学技術を使用した（例えばＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、
他（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、
ａ　１ａｂｏｒａＬｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ。
Ｃｏ１ｃｌ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、に記
載の方法）。制限地図（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｍａ
ｐ）の作成及び部分的配列分析によると、このクローン
は３９０アミノ酸ＴＧＦ−β１前駆体に関しては完全な
コーディング配列を含むが、５”及び３゛先端から幾つ
かの未翻訳配列が欠失していた（５′先端から４３９ｂ
ｐ、３′先端から約２００ｂｐ）。
ＴＧＦ−１のバクテリア発エ ＴＧＦ−β１遺伝子のセグメントを２つの関連した誘導
可能発現ベクター即ちｐＡＴＨＩＩ（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ
他（１９８４）Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４９：１３２４４１
）及びｐＫＳ−１（ｐＡＴＨＩＩの誘導体）を用いてｔ
ｒｐＥ：　：ＴＧＦ−β融合タンパク質として大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ）中に発現させた。ｐＡＴＨＩＩ：：ＴＧ
Ｆ−β１構造は、Ｂａｌ　１ｓａｌ　Ｉ断片をｐＡＴＨ
ＩＩの多重クローニング部位内にクローニングすること
によって形成した。Ｂａｌ　ｌ−５ａｌ　Ｉ断片はＴＧ
Ｆ−β１アミノ酸残基２４９−３９１をコードする。ｒ
＋Ｋｓ−１：　：　ＴＧＦ−β１構造は、Ｎａｅ　ｌ−
５ａｌ　Ｉ断片をｐＫＳ−１の多重クローニング部位に
クローニングすることによって形成した。Ｎａｅ　ｌ−
３ａｌ　Ｉ断片はＴＧＦ−βのアミノ酸残基２５−３９
１をコードする（第２３図）。
発現プラスミドを含むバクテリア（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＲ
Ｉ）を、５０１１Ｈ／ｍｌアンピシリン及び２ｏｎｇ／
ｍｌ　ｌ・リプ）・ファンを補足したＭ９培地（１リッ
トル中、１０ｇのＮａ２１１ＰＯ＋及び１Ｉ２０．３ｇ
のＫＨ２ＰＯ，，０，５ｇのＮａＣｌ、１ｇのＮＨ，Ｃ
Ｉ、５ｇのカサミノ（ｃａｓａｍｉｎｏ）酸、１ａｌの
ＭＨ３Ｏ＜、０．２ｍｌの０．５ＭＣａＣｌ２．５ｍｌ
の４０％グルコース、１０ｍ１の１ｍｇ／ＷチアミンＢ
、）１ｍｌ中で一晩増殖した。この−晩の培養物の１７
２ｍ１をアンピシリンを補足したＭ９培地５ｍｌで希釈
し、空気の流通をよくして３０℃で１時間培養した。２
ｍｇ／ｍ　ｌインドールアシル酸（■＾Δ）１２．５１
１１を加えることによりタンパク質をの発現を誘発し、
更に３０℃で２時間増殖した。１ｍｌを遠心分離にかけ
（上澄みは可溶性フラクションである）ペレットを１０
０．ＩＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭ　）リス−１１ｃＩ、ｐ
■７．５．０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．３ＭＮａＣｌ）
に再懸濁させた。その後下記のものを加えたニ ー１０μｍの１０ｍビ／１ｎ１リソチーム、氷上で１５
分。
＝２１ＩＩの１０％ＮＰ−４０、氷上で１０分。
−１ｓｏｐ＋の１．５Ｍ９ＮａＣｌ，１２ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２及び０．４．Ｉの１．９ｍｇ／ｍｌ　ＤＮａｓｅ、
氷上で１時間。
次いてマイクロフユージュ内で５分間回転させることに
より不溶性フラクションを集めた。ペレットを１１００
ｐｌＴＥＮ街液で２回洗浄し、最後に５．１の０．０Ｉ
Ｍリン酸Ｎａ、　ｐｔ１７．２．１％β−メルカプトエ
タノール、１％ＳＤＳ、６Ｍ尿素に溶解し、３７℃で３
０分インキュベートした。
標準５ＯＳ−ＰＡＧＥ及びＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕ
ｅ染色の後では、構成した発現プラスミドは予想した分
子量（５３ｋｄ及び４５ｋｄ）の融合タンパク質を産生
ずることが判明した。ウェスタンプロット（Ｗｅｓｔｅ
ｒｎ　Ｂｌｏｔ）のタンパク質（Ｔｏｕ＋ｂｉｎ他、　
（１９７９）Ｐｏｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ
。
７６：４３５０−４３５４）を両方共市販の抗ＴＧＦ−
βポリクローナル抗血清（Ｒａｎｄ　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ　Ｉｎｃ、）と反応させた。
ＴＧＦ−βＩとのホモロジーで配列を同定すべく、ＴＧ
Ｆ−β１ｃＤＮΔ配列の成熟形態の大部分を含むＰｖｕ
ＩＩ−Ｐｖｕ　ＩＩプローブを３２Ｐ標識し、これを用
いて標準的方法によりＥｃｏ　Ｒ１，Ｈｉｎｄ　ＩＩＴ
又は５ｓｔｌｌｌで消化した合削ヒトＤＮＡのサザンブ
ロッｌ□　（ＳＯｕＬｈｅｒｎＢｌｏｔ）（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ　　、（１９７５）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９８
：５０３−５１７＞をスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎ　
ｉＢ）処理した。各消化物（ｄｉｇｅｓｔ）毎に２つの
バンドが低緊縮洗浄（Ｉｏｕ＋ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　
ｕ＋ａｓｈ）（２，５ｘ　５ＳＣ５６５℃）で存在した
（第２４図）。洗浄緊縮性を増加させると（０，０１ｘ
　ＳＳＳ、６５℃）各消化物毎に１つのハイブリダイジ
ングバンドが残るにすぎないく第２４図）。強くハイブ
リダイズするバンドはＴＧＦ−βのようであり、弱くハ
イブリダイズするバンドは腫瘍成長阻害活性をもつタン
パク質をやはりコードする関連遺伝子である。
この腫瘍成長阻害活性のあるタンパク質をコードするヌ
クレオチド配列及びそのアミノ酸配列を第２９図に示し
た。
ＴＧＦ−βＩとのホモロジーで腫瘍成長阻害活性をもつ
タンパク質をコートする遺伝子を分離するためには、Ｔ
ＧＦ−β１クローンからのＰｖｕ　ＩＴ−Ｐｖｕ　ＩＴ
プローブを使用して慢性骨髄性白血病細胞系（Ｋ５６２
）のＤＮ八から構成したヒトファージライブラリーをス
クリーニング処理した。ＴＧＦ−βＩと腫瘍成長阻害活
性をもつタンパク質をコードする関連遺伝子とに対応す
る２つのゲノム遺伝子座をクローニング処理し、ファー
ジのｐＵＣサブクローンの地図を制限酵素分析によって
作成したく第２５図及び第２６図）。
Ｋ５６２ライブラリーの構成、スクリーニング及び組換
えクローンの分離は本質的に、Ｇｅｎｅ　１３（１９８
１）：２２７−２３７に記載のＧｒｏｓｖｅｌｄ他の方
法に従って実施した。
ＴＧＦ−β１に関連し且つ腫瘍成長阻害活性をもつタン
パク質をコードする配列を含むファージＤＮ＾クローン
をＳａｕ　３＾で切断し、制限フラクションをＭ２Ｓに
クローニングした。組換えプラークをＴＧＦ−β１のＳ
ｍａ　Ｉ−Ｐｖｕ　ＩＩプローブでスクリーニング処理
した。６つのハイブリダイジングゲノムクローンをＰｒ
ｏｃ、Ｎｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ　、７４（１９７７）
　＋５４６３−５４６７に記載のＳａｎｇｅｒ他の方法
で配列したところ、約１３ｏｂｐの領域がＴＧＦ−β１
ｃＤＮＡ４こ類似していることが判明した（第２７図）
。ＴＧＦ−β１のアミノ酸配列と、これらの実験でクロ
ーニングした関連遺伝子とを比較すると、８２％の類似
度を示した。
腫瘍成長阻害活性をもつ一タンパク質をコードするＴＧ
Ｆ−β１遺伝子の繰り返しのない（ｒｅｐｅａｔ　ｆｒ
ｅｅ）プローブを得るために、この遺伝子のＢａｍ　Ｈ
Ｉ−Ｂａｍ旧サブクローンからの種々の制限断片をＴＧ
Ｆ−β１ｃＤＮ＾及び完全ヒトＤＮＡとハイブリダイズ
した。腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質をコードする
遺伝子のＢａｍ　Ｈｌ−Ｔａｑｌ断片はＴＧＦ−β１ｃ
ＤＮ八に特異的にハイブリダイズすることが判明した。
腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質をコードする遺伝子
における前記断片の位置を第２８図に示した。
腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質をコードする配列の
［ｌａｍ　Ｈｌ−Ｔａｑ　Ｉユニークプローブを用いて
ラムダ−ＨｔＩＩヒト胎盤ｃＤＮ＾ライブラリー（Ｃｌ
ｏｎｅ−Ｌｅｃｈ’）をスクリーニング処理した。２つ
の強くハイブリダイズするクローンと４つの弱くハイブ
リダイズするクローンとが分離された。ＤＮＡ配列分析
によると、弱くハイブリダイズするクローンはＴＧＦ−
β１に対応することが判明した（第２９図）。強くハイ
ブリダイズするクローンを１つ分離し、１．７ｋｂＥｃ
ｏＲＩインサートをｐＵｃ８にザブクローニング処理し
た。このクローンの制限地図を第３０図に示す。
このクローンの制限断片を５ａｎｅｅｒ他の方法により
Ｍ１３にサブクローニングし且つ配列した。この遺伝子
の想定アミノ酸配列はＴＧＦ−βＩ、ＴＧＦ−β２、グ
リオブラストマＴ−細胞抑圧フアクタ（に−ＴＳＦ）、
インヒビン／アクチビン、Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ　Ｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｖｅＳｕｂｓｔａｎｃｅ（旧Ｓ）及びＤｒｏ
ｓｏｐｌ＋　ｉ　Ｉａのデカペンタプレシック転写複合
体を含む遺伝子グループ（Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ、　（
１９８７）Ｃｅｌｌ　４９，４３７−４３８）と極めて
類似しており、６つのシスティン残基が全体を通して保
持される。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２との比較を第
３１図に示した。腫瘍成長阻害活性をもつタンパり質を
コードするｃＤＮ＾ＤＮＡ第２９図）は腫瘍成長阻害活
性をもつタンパク質をコードするゲノムＤＮΔ（第２７
図）からの配列に対応していた。
腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質をコードする遺伝子
の配列を含む１７ｋｂゲノムＤＮ＾断片をクローニング
した（第２６図参照）。腫瘍成長阻害活性をもつタンパ
ク質をコードするＩ、７ｋｂｃＤＮ＾クローンの５°部
分及び３“部分を腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質の
ゲノム遺伝子座とハイブリダイズすると、１．７ｋｂｃ
ＤＮ＾配列はゲノムクローン内に完全に含まれているこ
とが判明した。腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質の全
長におよぶメツセージは３．５ｋｂであるため、５“及
び３′フランキング（ｆｌａｎｋ−ｉＢ）配列を分離す
れば完全な遺伝子が得られ得る。
これはゲノムファージ及びコスミドライブラリーを、腫
瘍成長阻害活性をもつタンパク質をコードする遺伝子独
自のプローブでスクリーニングすることによって実施し
た。
ＴＧＦ−β１では配列Ｒ−Ｒ（第３１図の位置−１及び
−２）は成熟タンパク質を産生ずるタンパク質分解分割
（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｃｌｅａｖａｇｅ）部位を
表す。腫瘍成長阻害活性をもつ関連タンパク質では配列
Ｒ−に−に−Ｒは対応分割部位を表すと思われる。
予想される分割部位の末端となるＮ領域では、ＴＧＦ−
β１及び腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質をコードす
る関連遺伝子が７％の類似率しか示さない。しかしなか
ら、これらのタンパク質はいずれもフィブロネクチンレ
セプタにより認識されると思われるこの領域に配列Ｒ−
Ｇ−Ｄ−Ｌを有する。
どの細胞系タイプが腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質
をコードする関連遺伝子を発現するかを調べるために、
５′末端Ｅｃｏ　ＲＩ−ＢｇＩ　ＩＩプローブを用いて
ノザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーションを
実施した（第３２図）。その結果、約３．５ｋｂのｍＲ
Ｎ八が＾６７３（横絞筋肉腫）、＾４９８（腎臓癌腫）
に現れ、弱くハイブリダイズする信号が＾５４９（肺ア
デノ癌腫）に現れた。
次いて、腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質をコードす
る関連遺伝子の３′領域（予想されるタンパク質分解分
割部位の下流に対応する）からのゲノムプローブを用い
て同じノザンブロッ１〜をスクリーニング処理した。Ｔ
ＧＦ−β１（２，５ｋｂ）に対応するΔ６７３及びΔ４
９８の双方と、腫瘍成長阻害活性をもつ関連タンパク質
（３，５ｋ）と、別の関連遺伝子（４，２ｋ＞とに３つ
の強いハイブリダイゼーション信号が観察された（第３
３図）。これらの結果は、このプローブが腫瘍成長阻害
活性をもつタンパクと相同の配列と交差反応することが
予想されるという事実に呼応している。
次いでＰｓｔ　ｌ−Ｂａ１　Ｉ　ＴＧＦ−β１プローブ
を用いて＾６７３、Δ５４９及びＡ４９８細胞系のノザ
ンプロット分析を行った。このプローブはＴＧＦ−β１
に対して大きな特異性を示すはずである。というのも、
このプローブはタンパク質分解分割部位、即ちＴＧＦ−
β１がこの遺伝子グループの他のメンバーに対して相同
性（ホモロジー）を殆ど示さない領域のＮ末端配列に対
応する配列を含むからである。ＴＧＦ−β１の既知の大
きさ２．５ｋｂから予想されるように、これら３つの細
胞系の総てにおいて２．５ｋｂ　ｍＲＮΔパン１〜への
強いハイブリダイゼーションが観察された。
弱くハイブリダイズするハントも４．２ｋｂ及び３．５
ｋｂで幾つか観察された（第３４図）。
次いで、ＴＧＦ−β１前駆体の完全コーティング配列を
含むＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡを用いて、八６７３、八５
４９及びへ４９８細胞系のノザンプロット分析をスクリ
ーニングした。このプローブはＴＧＦ−β１の相同配列
との間に交差ハイブリダイゼーション（ｃｒｏｓｓ　ｈ
ｙｂｒ・１−ｄｉｚａｔｉｏｎ）を生じると予想される
。予想通り、ＴＧＦ−β１に対応する２、５ｋｂ　ｍＲ
Ｎ＾バンドと、ＴＧＦ−β２に対応すると思われる４、
２ｋｂ　ｍＲＮ八パへＩ・とに強いハイブリダイゼーシ
ョンが見られたく第３５図）。
ヒト用事及びＡ６７３細胞系からのＩｌｌ　ＲＮへのノ
ザンブロット分析も腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質
をコードする関連遺伝子のＥｃｏ　ＲＩ−ｋｌ　ＩＩ　
ｃＤＮＡをプローブとして用いてスクリーニングした（
第３６図）。この図は、各レーンの正常ｍＲＮΔレベル
に対するコンｌ−ロールとして作用するアクチンプロー
ブに関する結果を含んでいる。アクチンｍＲＮへレベル
に標準化すると、コートはこれまでに検査してきた総て
の細胞タイプの腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質をコ
ードする遺伝子の最高レベルのｍＲＮ八を発現する（第
３６図）。
Ｅｃｏ　Ｒ１によって消（ヒし且つ低緊縮洗浄（２，５
ｘＳＳＣ１６５°Ｃ）及び高緊縮洗浄（０，３ｘＳＳＣ
５６５℃）でのプローブとして腫瘍成長阻害活性をもつ
タンパク質をコードするＴＧＦ−β１関連遺伝子のＳ＋
ｎａ　Ｉ−＾νａｒｃＤＮ八でハイブリダイスした種々
の腫瘍ＤＮＡに関してサザンブロッ１〜分析を行った。
前記プローブは低緊縮洗浄条件下てのみ観察される２つ
のバンド（３ｋｂ及び１２ｋｂ）とハイブリダイズする
ことから、このサザンプロットは、腫瘍成長阻害活性を
もつタンパク質をコードする遺伝子に関連した別の遺伝
子座の存在を示唆する。
腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質をコードする遺伝子
の全長に及ぶｃＤＮ＾クローンを得るために、ヒト繊維
芽細胞のＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　ｃＤＮＡライブラ
リープロットを腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質をコ
ートする遺伝子の１．７ｋｌ〕ｃＤＮＡクローンの５’
　Ｅｃ。
Ｒ１−１ｆｆ　ＩＩプローブてスクリーニングした。３
．２ｋｂのハイブリダイゼーションハンドは中庸洗浄緊
縮性０．３ｘＳＳＣ１６５℃で観察できる。
ｄ遺伝子の小領域に融合した腫瘍成長阻害活性をもつタ
ンパク質のＣ末端１５０アミノ酸を含むキメラバクテリ
アタンパク質を構成した。この種の融合タンパク質は、
成熟形態の腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質のアミノ
酸９番〜２８番から誘導されるペプチドに対して産生さ
れた抗体により認識されることが判明した。前記抗体は
ｔｒｐ：：腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質の融合タ
ンパク質をｔｒｐ：ＴＧＦ−β１の融合タンパク質より
遥かに良く認識し、前記ペプチドは前記抗体の結合に関
して腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質と特異的に競争
する。
腫瘍成長阻害活性をもつＴＧＦ−β１関連タンパク質を
コートするＤＮＡ配列をｐＳＫベクターにクローニング
処理した。このベクターは誘導可能ｔｒｐプロモーター
と多重クローニング部位とを含むｐ　Ａ　Ｔ　＋＋ＩＩ
誘導体である。その結合得られる構造体はｍ（ト）遺伝
子の最初の２２個のアミノ酸、腫瘍成長阻害活性をもつ
タンパク質のＣ末端１５０アミノ酸を含むキメラタンパ
ク質を産生する。これらのクローンを含む形質転換細胞
を最初に制限エンドヌクレアーゼ分析によってスクリー
ニングし、最後にキメラタンパク質の産生に関してＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動によりスクリーニン
グした。３つのクローン、ｐ１１６、ｐ１３４及びｐ１
３５のタンパク質生成物を第３７図に示す。これらの細
胞を初期対数期に到達するまで所定培地で増殖させ、次
いてｔｒｐＥ誘導因子インドールアクリル酸（ＩＡＡ）
の存在下または非存在下で３時間インキュベートした。
次いてこれらの細胞を集め、溶解処理し、そのタンパク
質を１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳
動にかけた。第３７図はＣｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ
で染色したこのようなゲルの写真を示している。この写
真から明らかなように、溶解物ｐ１１６及びｐ１３５は
約１９，０００ダルトンのタンパク質を産生する。その
相対数度（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ）は
ＩＡＡの存在下で増加する。これに対し、ｐ１３４はこ
のタンパク貫挿を産生しない。制限分析によれば、ｐ１
１６及びｐ１３５はいずれも、分子量１９，５００ダル
トンの融合タンパク質を産生するはずのオリエンテーシ
ョンでクローニング処理した腫瘍成長阻害活性をもつタ
ンパり質の配列を有するプラスミドを含む。ｐ１３４プ
ラスミドは前記と反対のオリエンテーションの腫瘍成長
阻害活性をもつタンパク質の反対を有することが判明し
た。
ｔｒｐ：：腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質の融合タ
ンパク質を使用して、腫瘍成長阻害活性をもつタンパク
質の一部分に相同するペプチドを抗体として使用する抗
体の特異性を調べた。腫瘍成長阻害活性をもつ成熟タン
パク質の残基９から２８に対応するポリペプチドを合成
した。但し、この配列の残基９即ちアルギニンに代えて
セリンを使用した。前記ペプチドをＲＰ　１１　Ｐ　Ｌ
　Ｃによって精製し、ウサギのイムノゲンとして使用す
べ（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔヘモシアニンに結合し
た。
最初の注射（５００ｕｇ）から３３日後に、１１００ｎ
／井戸のペプチドを使用する標準ＥＬＩＳＡによって抗
血清をスクリーニングした。１匹のウサギは抗体の１：
２５希釈度で１．０００単位の信号を示した。このウサ
ギの最初の採血から１０日後に、結合抗原２５０ｍｇを
ブースターとして注射した。最初の採血から２０日後の
採血では、ペプチド抗原に対する抗体反応が２０倍に増
加していた。最初の採血から４０日後の採血（３回目の
採血）では抗血清の１：８０００の希釈度で１．０００
単位の信号が見られた。これは、抗体力価が２回目の採
血の１６倍に増加したことを意味する。
この抗体はまた、ＴＣＰ−β１配列から誘導した相同ペ
プチドと殆ど交差反応していなかった。このＴＧＦ−β
１誘導ペプチドは成熟ＴＧＦ−β１タンパク質のアミノ
酸４番〜１９番を含んていた。１１の共通アミノ酸のう
ち残基９〜１９．７を、腫瘍成長阻害活性のあるタンパ
ク質とＴＧＦ−βＩとの間に保持した。
抗体を認識するペプチドが腫瘍成長阻害活性をもつタン
パク質を認識できるか否かを調べるために、前記抗体を
、腫瘍成長阻害活性のあるタンパク質とＴＧＦ−βＩと
の融合に対するウェスタンプロット分析で使用した。第
３８図に示したように、前記抗ペプチド抗体は腫瘍成長
阻害活性をもつタンパク質の融合タンパク質とは強く反
応したが、ｔｒｐ　：、ＴＧＦ−β１融合タンパク質に
対しては弱い反応しか生じなかった。これら２つの融合
タンパク質はいずれも、市販の抗ＴＧＦ−β１抗体（Ｒ
ａｎｄ　Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）によって認識される（第
３８図）。
第３８図から明らかなように、腫瘍成長阻害活性をもつ
タンパク質を認識する前記抗ペプチド抗体はバクテリア
タンパク質に対する高レベルのバックグラウンド反応性
も有する。この交差反応を低下させるために、我々は元
のペプチドを抗原として含むＣＮＢｒ−５ｅｈａｒｏｓ
ｅカラムで前記抗体を精製した。この抗体は腫瘍成長阻
害活性をもつタンパク質のペプチドに対する大きな力価
を保持し、且つ相同ペプチドＴＧＦ−β１に対しては小
さい交差反応性を維持した（データ示さず）。次いて、
この精製したペプチド抗体をウェスタンプロット分析に
かけてＴＧＦ−βＩとの交差反応性を調べた。結果を第
３９図に示す。この精製抗体は、腫瘍成長阻害活性をも
つタンパク質の融合タンパク質（レーン２）及び分子量
のより大きいタンパク貫挿とは極めて強く反応するが、
他のバクテリアタンパク質に対するハイブリダイゼーシ
ョンは未精製抗体に比べて大きく低下することが判明し
た（第３８図）。前記精製抗体は、ＴＧＦ−β１融合タ
ンパク質（レーン１）又は市販の精製ＴＧＦ−β１（Ｒ
ａｎｄ　Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）に対しては反応性を殆ど
示さない（レーン３及び６）。精製抗体を３００倍過剰
なモルのペプチドと共に予めインキュベートして競争実
験を繰り返えした。抗体を過剰旦のペプチドと共に室温
で６０分インキュベートしておくと、ハイブリダイゼー
ションは腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質の融合タン
パクに対しては著しく低下するが（レーン４）、ＴＧＦ
−β１融合タンパク質に対して示される微量バックグラ
ウンド反応性又は他のバクテリアタンパク質（レーン４
）に対しては低下しなかった。従って、前記抗ペプチド
抗体は腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質の配列を含む
タンパク質を特異的に認識する。
ヒト組換えＴＧＦ−β１をザルＣＯＳ細胞内に発現させ
た。ｐＳＶＬＰ真核細胞発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）を用いて、ＴＧＦ−β１　ｃＤＮ＾の完全前駆体
をコードする配列を、ＳＶ４０プロモーターから下流に
クローニングした。この構造体を、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　
５２（１９７３）４５６−４６７に記載のＧｒａｈａｍ
及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂの標準的リン酸カルシウム沈
澱法を用いてＣＯ３細胞にトランスフェクション処理し
た。トラン−スフェクション後、約４ｘ１０６個の細胞
を無血清培地で２日間増殖させた。
次いで、このならし培地を回収し、酸性化して、生物学
的活性を調べた。ＴＧＦ−β１のならし培地は単層被検
ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）の成長を５９％阻害し
たのに対し、ｐＳＶＬベクターのみでトランスフェクシ
ョン処理したＣＯ８細胞からのならし培地はＣＣＬ６４
細胞の成長を３２％しか阻害しなかった。
腫瘍成長阻害活性を持つタンパク質をコードする配列の
全長クローンを発現分析て使用すべく得ることは現時点
では不可能であるため、ＴＧＦ−β１前駆体の３′配列
を腫瘍成長阻害活性のあるタンパク質をコードする配列
で置換することにより、キメラＴＧＦ−β１：：腫瘍成
長阻害活性をもつタンパク質の融合構造体を合成した。
これら２つのタンパク質の間に相同性を与え且つこのよ
うな構造体をＣＯ５細胞内にトランスフェクション処理
する時にそのシスティン残基の位置を維持すれば、新し
い融合タンパク質を腫瘍成長阻害活性をもつ生物学的に
活性の成熟したタンパク質に処理し得る。Ｓ■プロモー
ター又はマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）の長い末端反
復の調節配列の下でクローニングしたｔｒｐＥ：：腫瘍
成長阻害活性をもつタンパク質をコードする遺伝子の融
合を含む付加的構造体を形成した。これは過渡的トラン
スフェクション実験で生物学的活性に付いて検査し得る
。
）４−　シリーズから′すられるＬｊ 第４実験シリーズではＴＧＦ−β１をクローニング処理
し、これを用いて腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質を
コードする関連遺伝子を分離した。
ＴＧ■−１又はＴＧ１２のいずれが、ＴＣＰ−β１に関
連し且つ腫瘍成長阻害活性をもつタンパク質に対応する
かはまだ不明であるが、当業者には、このような対応が
、その性格な性質は不明であっても確かに存在すること
は理解されよう。
（以下余白）
【図面の簡単な説明】
第１図は２３℃のゲル濾過クロマトグラフィを示す。溶
離パターンは、ヒト用事からの酸性化エタノール粗抽出
物の２３℃におけるゲル濾過クロマＩ・グラフィである
。Ｂｌｏ−Ｇｅ１＠Ｐ１０を含む１４Ｘ　１００ｃｍカ
ラム（八ｍ１ｃｏｎ；　＃８６０１２）に、１．０Ｍの
酢酸１５０ａＬ！中の２ｇの酸性化エタノール抽出物を
加え、７１１７分の流量で溶離させた。Ｃ型収集ラック
（ＬＫＢ）を備える５ｕｐｅｒＲａｃ＠（ＬＫＢ　２２
１１）で１βのフラクションを収集した。各フラクショ
ン（１１／フラクシヨン）の１１１のアリコートを１２
Ｘ７５ｍｍ無菌スナップトップ管（Ｆａｌｃｏｎ　２０
５８）に移した。材料と方法の項に記載したようにＴＧ
Ｉ活性を決定した。Δ５４９ヒト肺癌細胞の阻害率は三
角、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）Ｍ胞の阻害率は丸で示す
。２８０ｎｍの吸光度（−）は、１．０＾ＵＦのフルス
ケール吸光度範囲を有するＬｌｖｉｃｏｒｄ　Ｓ’（Ｌ
ＫＢ２１３８）及びＩ　Ｉ！１ｍ　７分のチャート速度
を有するシングルチャネルチャー１−レコーダー（ＬＫ
Ｂ　２２１０）により検出した。 第２図は、４℃のゲル濾過クロマトグラフィを示す。溶
離パターンは、ヒト膀帯からの酸性化エタノール粗抽出
物の４℃におけるゲル沢過クロマＩ・グラフィである。 Ｂｌｏ−Ｇｅ１＠Ｐ１０を含む１４Ｘ　１００ｃｎ＋カ
ラム（八ｍ１ｃｏｎ；　＃８６０１２）に、１．０Ｍの
酢酸１５０ｘＮ中の２ｇの酸性化エタノール抽出物を加
え、７１１７分の流量で溶離させた。Ｃ型収集ラック（
ＬＫＢ）を備える５ｕｐｅｒＲａｃ＠（ＬＫＢ　２２１
１）でＩＮ’のフラクションを収集した。各フラクショ
ン（１１／フラクシヨン）の１１１１のアリコートを１
２Ｘ７５ｍｍ無菌スナップトップ管（Ｆａｌｃｏｎ　１
０５８）に移した。材料と方法の項に記載したように腫
瘍成長阻害活性を決定した。＾５４９ヒト肺癌細胞の阻
害率は、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻害率は○で
示す。２８０ｎ…の吸光度（−）は、１，０ＡＵＦのフ
ルスケール吸光度範囲を有するＵｖｉｃｏｒｄＳ＠（Ｌ
ＫＢ　２１３８）及び１ｍｍ／分のチャート速度を有す
るシングルチャネルチャートレコーダー（ＬＫＢ　２２
１０）により検出した。 第３図は、４℃のゲル沢過りロマトグラフィからのフラ
クションによる細胞成長阻害及び清浄ヒト細胞刺激を示
す。酸性化エタノール粗抽出物の４℃におけるゲル沢過
クロマトグラフィの溶離パターンを１．０Ｍの酢酸１５
０ＩＩＮに溶解させ、Ｂｌｏ−Ｇｅ１’ＰＩＯを含む１
４ｘ　１００ｃｍカラム（＾ｍ１ｃｏｎ；　＃８６０１
２）に、加え、７１１／分の流量で溶離させた。Ｃ型収
集ラック（ＬＫＩＩ）を備える５ｕｐｅｒＲａｃ’（Ｌ
ＫＢ　２２１１）で１１のフラクションを収集した。各
フラクション（１１／フラクシヨン）のＩＲｌのアリコ
ートを１２Ｘ７５ｍｍ無菌スナップトップ管（Ｆａｌｃ
ｏｎ　２０５８）に移した。材料と方法の項に記載した
ように腫瘍成長阻害活性を決定した。＾５４９ヒト肺癌
細胞の阻害率は、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻害
率は○で示す。正常ヒト包皮線維芽細胞の刺激率は口で
示す。２８０ｎｍの吸光度（＝）は、１．０八〇Ｆのフ
ルスケール吸光度範囲を有するＵｖｉｃｏｒｄ　Ｓ＠（
ＬＫＢ　２１３Ｂ）及び１ｍｍ／分のヂャート速度を有
するシングルチャネルチャートレコーダー（ＬＫＢ　２
２１０）により検出した。 第４図は、ゲル濾過クローマドグラフィからの活性フラ
クションの逆相高性能液体クロマＩ・グラフィ（ＩＩＰ
Ｌｃ）を示す。ヒト両帯からの酸性化エタノール抽出物
をＢｌｏ−Ｇｅ１ｆＤＰＩＯてゲル濾過クロマ１ヘグラ
フイして得たフラクション４（６５，８ｘｙタンパク質
）を凍結乾燥し、０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＥ
Ａ）１０Ｍ１に再懸濁させた。フラクション４は、２８
０ｎｍの吸光度の最大ピーク（第２図）に続く最初のフ
ラクションであった。試料をＢｅｃｋｍａｎチーフルト
ップ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＴＪ−６）で３０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離し、不溶性物質を除去した。２
ｘｌの試料ループを備える一ａｔｅｒｃｒ）ＵＳＫ型注
射器を使用して上清を３回に分けて注入した。次に試料
をμＢＯＮＤΔＰＫ’Ｃ１８カラム（０，７８Ｘ３０ｃ
ｍ）（Ｗａｔｅｒｓ　＃８４１７６）に充填した。流量
は２１１７分とし、２．０ΔＵＦＳの感度のＷａｔｅｒ
ｓ紫外線検出器（Ｗａｔｅｒｓ　Ｍｏｄｅｌ　４８１）
を使用して２０６ｎｍの流出物（＝）を監視した。溶離
は、まず０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＥＡ）を含
むアセトニトリルの濃度を０〜２５％に増加する線状３
０分勾配を使用し、次に００５％のＴＥＡを含む２５〜
４５％のアセＩ・二Ｉ〜リルの線状２４０分勾配を使用
し、更に０．０５％のＴＥＡを含む４５〜１００％のア
セトニトリルの線状３０分勾配を使用して行った。５ｕ
ｐｅｒＲａｃ’（ＬＫＢ　２２１１）を使用して１２ｚ
ｆのフラクションを収集した。１．ＯＭの酢酸５０μβ
及び５０ｐｇのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ　八６
００３）を収容する１２Ｘ７５＋ｎｍポリスチレン管（
Ｆａｌｃｏｎ　２０５８）に各フラクションのＩｌｌの
アリコートを移し、材料と方法の項に記載したように腫
瘍成長阻害活性をアッセイした。へ５４９ヒト肺癌細胞
の阻害率は、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）の阻害率は○で
示す。溶媒の勾配は（−−−）で示す。 第５図は１（ＰＬＣ（ＴＧＩ−１＞からプールしたＴＧ
Ｉ活性のＨＰＬＣ再クロマ１ヘグラフィを示す。ＨＰＬ
Ｃクロマ１〜グラフィ（第４図）により２８〜３４％の
アセトニトリルで溶離する腫瘍成長阻害活性（１，５Ｂ
）のプールしたフラクション（フラクション１３〜２２
）を凍結乾燥し、０．０５％の１−リフルオロ酢酸（Ｔ
ＥＡ）２′Ｒ１に再懸濁させた。試料をＢ　ｅ　ｃ　ｋ
　ｍ　ａ　ｎテーブルトップ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ　
ＴＪ−６）で３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、不
溶性物質を除去した。２ｘｌの試料ループを備えるＷａ
ｔｅｒのＵ６に注射器を使用して上清を２回に分けて注
入した。試料をμＢＯＮＤＡＰ八に’Ｃ１８カラム（０
，３９Ｘ　３０ｃｍ）　（Ｗａｔｅｒｓ　＃２７３２４
）に充填した。流量は１１１７分とし、２．０ΔＩＪＦ
ｓの感度のＷａｔｅｒｓ紫外線検出器（Ｗａｔｅｒｓ　
Ｍｏｄｅｌ　４８１）を使用−して２０６ｎｍの流出物
（−）を監視した。溶離は、まず０．０５％のＴＥＡを
含む２−プロパノールの濃度を０〜１５％に増加する線
状２０分勾配を使用し、次に０．０５％のＴＥＡを含む
１５〜３５％の２−プロパノールの線状１２０分勾配を
使用して実施した。５ｕｐｅｒＲａｃｔＤ（ＬＫＢ　２
２１１）を使用して４ＩＩＩ６のフラクションを収集し
た。１．０Ｍの酢酸５０μρ及び５０１Ｉｇのウシ血清
アルブミン（ＳｉｇｍａΔ−６００３）を収容するＬ２
Ｘ７５ｍｍのポリスチレン管（Ｆａｌｃｏｎ　２０５８
）に各フラクションの１１のアリコートを移し、材料と
方法の項に記載したように腫瘍成長阻害活性をアッセイ
した。Δ５４９ヒｌ〜肺癌細胞の阻害率は、ミンク肺（
ＣＣＬ　６４）細胞の阻害率は○で示す。溶媒勾配は（
−−−−−）で示す。 第６図は、ＨＰＬＣ（ＴＧＩ−１，）からプールした活
性の逆相ＨＰＬＣ再クロマトグラフィを示す。ＩＩＰＬ
ｃクロマトグラフィ（第４図）により３５〜３９％のア
セトニトリルで溶離する腫瘍成長阻害活性（０，８′Ｒ
ｇ）のプールしたフラクション（フラクション２５〜３
１）を凍結乾燥し、０．０５％のトリフルオロ酢酸（Ｔ
ＥＡ）２Ｉ１１に再懸濁させた。試料をＢｅｃｋｍａｎ
テーブルトップ遠心器（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＴＪ−６）で
３００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離し、不溶性物質を除
去した。２ｚｌの試料ループを備えるＷａｔｅｒのＵ６
に注射器を使用して上清を２回に分けて注入した。試料
をμＢＯＮＤＡＰＡＫ■Ｃ１８カラム（０，３９Ｘ　３
０ｃｍ）　（Ｗａｔｅｒｓ　＃２７３２４）に充填した
。流量は１Ｎ１／分とし、２，０Δ肝Ｓの感度のＷａｔ
ｅｒｓ紫外線検出器（Ｗａｔｅｒｓ　Ｍｏｄｅｌ　４８
１）を使用して２０６ｎｍの流出物（−）を監視しな。 溶離は、まず０．０５％のＴＦ＾を含む２−プロパノー
ルの濃度を０〜１５％に増加する線状２０分勾配を使用
し、次に０．０５％のＴＦ八を含む１５〜３５％の２−
プロパノールの線状１２０分勾配を使用して実施した。 ５ｕｐｅｒＲａｃ’（Ｉ、Ｋｌｌ　２２１１）を使用し
て４１のフラクションを収集した。１．叶の酢酸５０．
Ｎ及び５０１ｇのウシ血清アルフミン（ＳｉｇｍａΔ−
６００３）を収容する１２×７５ｍｍのポリスチレン管
（Ｆａｌｃｏｎ　２０５８）に各フラクションの１１の
アリコートを移し、材料と方法の項に記載したように腫
瘍成長阻害活性をアッセイした。＾５４９ヒト肺癌細胞
の阻害率は、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻害率は
Ｏて示す。溶媒勾配は（−−−−）て示す。 第７図は、ヒト珀帯抽出物のカチオン交換クロマトグラ
フィを示す。１．０ＭのＮａｐ！を含む０．ＩＮのｐｌ
＋４．０ノＮｌ’酸アンモニウム１当量４．：　ＣＭ−
ＴＲＩＳＡＣＲＹ−を再懸濁さぜな。樹脂を３時間平衡
化させ、４℃で抽気した。２０ｚβの樹脂を１．６Ｘ４
０ｃｍカラム（Ｐｈａｒｍａ−ｃｉａ；　＃１９−０３
６２−０１）に充填し、１．叶のｐＨ４，０の酢酸アン
モニウム、次に０．０１Ｍの酢酸アンモニウム２倍カラ
ム当量て洗った。流出物が平衡化緩衝液（ｐＨ４，０の
０．０１Ｍ酢酸アンモニウム）の導電率及びｐＨと合致
するまてカラムを洗った。１ｇのヒト用事酸性化エタノ
ール抽出物を１．０Ｍの酢酸５０ａＮに再懸濁させ、ｐ
Ｈ及び導電率が平衡緩衝液のｐＨ及び導電率と合致する
まで４℃のカラム平衡緩衝液で透析した。 透析した酸性化エタノール抽出物を１１７分の流量で４
℃でカラムに加え、１．０＾肛Ｓの感度を有するＵｖｉ
ｃｏｒｄ＠５（ＬＫＢ　２１３８）により監視しなから
、吸光度（−）、Δ２８０が最低点に達するまてカラム
を平衡Ｍ＠液で洗った。次に、勾配混合器（Ｐｈａｒｍ
ａｃ　ｉａＧＭ−１，＃１９−０４９５−０１）を使用
して０．０１〜１．０ＭのｐＨ４，０の酢酸アンモニウ
ムの上昇モル直線勾配２００ｚＮを加えた。勾配の終わ
りに、更に１．ＯＨのｐＨ４，０の酢酸アンモニウム３
０１１ｎをカラムに通した。５ｕｐｅｒ−ＲａｃｌＩ′
フラクションコレクター（ＬＫＢ　２２１１）中の１２
×１．００　ｍ　ｍポリスチレン管（Ｃｏｌｕｍｂｉａ
　ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＢ−２５６４）で２ｘｌのフ
ラクションを収集した。１．０Ｍの酢酸５０１ＩＮ及び
５０１４ｇのウシ血清アルブミン（ＳｉＩ？ｍａ八６０
０３へを収容する１２Ｘ７Ｓｍｍ管（Ｆａｌｃｏｎ　２
０５８）に各フラクションからの１屑ｐのアリコートを
移し、凍結乾燥し、材料と方法の項に記載したように腫
瘍成長阻害活性をアッセイした。Δ５４９ヒト肺癌細胞
の阻害率は、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）の阻害率は○で
示す。塩勾配は（−一一）て示す。 第８図は、カチオン交換クロマトグラフィからプールし
たフラクションの再クロマトグラフィを示す。第９図の
項に記載するようにＣＭ−ＴＲＩＳ八へＲＹＬ’を調製
した。ＣＭＩＴＩ及びＣＭＩＶを含むフラクションから
の材料をプールし、凍結乾燥し、０．１Ｍ酢酸５０Ｍ１
に再懸濁さぜ、ｐＨ及び導電率が平衡Ｍ街液と合致する
まて４℃のカラム平衡緩衝液で透析した。試料を４℃で
１１１７分の流量でカラムに加え、カラムを１２０１１
ノ平衡緩衝液で洗ツタ。吸光度（２８０ｎ＋ｎ）（）は
１．ＯへＵＰＳの感度を有するＵｖｉｃｏｒｄ　５（Ｌ
ＫＩＩ　２１３８＞により監視した。勾配混合器（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ；　ＧＭ−１゜＃１９−０４９５−０１
）を使用して、０．０１〜１．０ＭノｐＨ４，０ノ酢酸
アンモニウムの上昇モル直線勾配置００ｚＮを加えた。 勾配の終わりに、更に１　、ＯＮのｐＨ４，０の酢酸ア
ンモニウム３０１１をカラムに通した。５ｕｐｅｒＲａ
ｃ１′フラクシヨンコレクター（ＬＫＢ　２２１１）中
ノ１２Ｘ１．００ｍｍポリスチレン管（Ｃｏｌｕｍｂｉ
ａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　１１２５６４）で２ｔ１
のフラクションを収集した。５０ＩＩＮの１．０Ｍ酢酸
及び５０μｇのウシ血清アルブミン（ＳｉｇｍａΔ６０
０３）を収容する１２Ｘ７Ｓｍｍ管（Ｆａｌｃｏｎ　２
０５８）に各フラクションからの１肩！のアリコーＩ・
を移し、凍結乾燥し、材料と方法の項に記載したように
腫瘍成長阻害活性をアッセイしな。へ５４９ヒト肺癌細
胞の阻害率は、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻害率
は○で示す。塩勾配は（−−−）て示す。 第９図は、４℃のカチオン交換クロマトグラフィによる
ＴＧＩの分画化を示す。第２実験シリーズの項に記載し
たように調製したＩ、６５肩ｇのタンパク質抽出物を２
０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐｌ（４，５）で十分に透
析し、２０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ４，５）中で
予メ平衡化Ｌ　タＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ’＜７）　
５ｘｎ（Ｉ　Ｘ　６．３ＣＭ）カラムに加え、１．８５
ｚＮのフラクション（１２ｘ　１００ｍｍポリスチレン
管）を収集した。試料添加後、１ｃｍの光路の石英キュ
ベツトを使用するＢａｕｓｃｈ　＆　Ｌｏｍｂ１００１
型分光光度計て決定した２８０ｎｍの吸光度（−）が基
線の値（０，００３未満）に戻るまで２０ｍＭのｐＨ４
，５の酢酸アンモニウムでカラムを洗った。線状塩勾配
（２０ｍＭのｐＨ４，５の酢酸アンモニウムの０〜１．
ＯＮのＮａＣｌ　）を加え、１．６５ｘ１のフラクショ
ンの２８０ｎｍの吸光度を上記のように決定した。１．
ＯＭの酢酸５０．ｆ及び５０−ｇのウシ血清アルブミン
（Ｓｉｇｍａ＾６００３）を収容するｌＯ１０Ｘ７ｓ管
に支持したフラクションの１０．Ｎのアリコートを移し
、凍結乾燥し、材料と方法の項に記載したように＾５４
９ヒト肺癌細胞に対する阻害活性（−−−）をアッセイ
した。ＮａＣｌ勾配（−一−）は、ｌＩ２０に１００倍
に希釈した適当な試料の導電率（ＹＳＩ　Ｍｏｄｅｌ　
３２コンダクタンスメーター）を測定することにより決
定した。 第１０図は、４℃のアニオン交換クロマトグラフィによ
るＴＧＩの分画化を示す。第２実験シリーズの項に記載
したように調製したｌ　、６５１１１？のタンパク質抽
出物を２０＋ｎＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）で
十分に透析し、３０００ｘＦＩで１５分間遠心分離によ
り清澄化した。まず１．ＯＮのＮａＣＩを含む２０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）中に３時間、第二に
０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０＞中に１時
間、樹脂を懸濁させることにより、ＤＥＡＥ−ＴＲＩＳ
ＡＢＲＹＬ”を調製した。沈降した樹脂をＢｕｃｈｎｅ
ｒ漏斗で１０００ａｌｌのＩ２０で洗い、最後に２０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−１１ｃＩ（ｐＨ８，０）に再懸濁させ、
抽気し、５ｗｌカラム（ＩＸ６．３ｃｍ）に注入し、２
０ｍＭのＴｒｉｓ、　ＨＣＩ（ｐｉ（８，０）で樹脂を
平衡化した。清澄化した試料をカラムに加え、２８０ｎ
ｍの吸光度（−）、ミンク肺細胞に対する阻害活性（○
−○）、及びＮａＣｌ勾配＜−−−＞を第９図及び材料
と方法の項に記載したように決定した。２０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）中の線状ＮａＣｌ勾配はＯ
〜１．０ＭのＮａＣｌとした。 第１１図は、４℃のカチオン交換クロマトグラフィによ
るＴＧＩの分画化を示す。最終平衡緩衝液を２０１のｐ
ｌ＋４．５の酢酸アンモニウムとした以外は、第７図の
項に記載したようにＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬυを調製
した。上記のように調製したタンパク質抽出物（９，Ｏ
ｚｇ）を２０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ４，５）で
十分に透析し、２０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ４，
５）中のＣＭ−ＴＲＴＳＡＣＲＹＬ’の１５ｘ＆（Ｌ５
ｘ　８．５ｃｍ）カラムに古註えた。２８０ｎｍの吸光
度（−）及びへ５４９ヒト肺癌細胞に対する阻害活性（
−〇−−〇−一）を第７図の項に記載したように決定し
た。線状Ｏ〜１．ＯＭ　ＮａＣｌ勾配の容量は１５０ｚ
ｆｆとした。各フラクションの容量は３，７肩ｐとした
。 第１２図は、カチオン交換クロマトグラフィからの活性
フラクションの逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰ
ＬＣ）を示す。第１１図の項に記載したようにヒト稍帯
をＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ＠でカチオン交換クロマト
グラフィして得たフラクション５９〜７８をプールし、
凍結乾燥し、０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
１０＋ｊ！に再懸濁させた。２４０μｇのタンパク質を
含む透析材料の２０％の全体を、２ｘ（ｌの試料ループ
を備えるＷａｔｅｒの０６に注射器で３回に分けて注入
した。次に試料をμＢＯＮＤＡＰＡＫ＠Ｃ１８カラム（
０，３９ｘ３０ｃｍ＞（Ｗａｔｅｒｓ　２７３２４）に
加えた。流量は１ｘｌ１分とし、流出物は０．５＾ＵＦ
Ｓの感度のＷａｔｅｒｓ紫外線検出器（Ｗａｔｅｒｓ　
Ｍｏｄｅｌ　４８１）で２０６ｎｍ（）で監視した。溶
離は、まず０．０５％のＴＦＡを含むアセトニトリルの
濃度を０〜２５％に増加する線状５分勾配を使用し、次
に０．０５％のＴＦＡを含む２５〜４５％のアセトニト
リルの線状１５分勾配を使用し、次に０．０５％のＴＦ
Ａを含む４５〜８０％のアセトニトリルの線状１５分勾
配を使用し、次に０．０５％のＴＦＡを含む８０〜１０
０％のアセトニトリルの線状５分勾配を使用して実施し
た。 ５ｕｐｅｒＲａｃ＠（ＬＫＢ　２２１１）を使用してｌ
ｉ＋ｆのフラクションを収集した。１．０Ｍ＋７）　酢
ｒｌｉ　５０１Ｊ（ｌ及び５０１１１？ノウシ血清アル
ブミン（Ｓｉｇｍａ　Ａ０２８１）を収容する１２Ｒ７
５ｍ’＋ｎポリスチレン管（Ｆａｌｃｏｎ　２０５８）
に一つおきのフラクションの５００νｐのアリコートを
移し、材料と方法の項に記載したように腫瘍成長阻害活
性をアッセイした。＾５４９ヒト肺癌細胞の阻害率を、
ミンク肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻害率を○で示す。溶
媒勾配は（−−−）で示す。 第１３図は、疎水性相互作用クロマトグラフィフェニル
−セファロースを示す。フェニル−セファロース（ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）を４．０Ｍのｐｌ＋４．５の酢酸アン
モニウムで平衡化させ、１５Ｒ１の樹脂をｌ　、５　Ｘ
　２０ｃｍカラム（Ｐｂａｒｍａｃｉａ）に注入した。 ３６．ＯｚＮのエーテルエタノールから沈降したＴＧＩ
３１Ｊ！ＩＦを４．ＯＭの酢酸アンモニウム中の５ｐｅ
ｃｔｏｐｏｒ’３（分子量カットオフ３５００）で透析
により平衡化し、１．０ｙ（１／分の流量でカラムに加
えた。０Ｄ２８ｏの吸光度がゼロに達した後、４．０Ｍ
〜０．０４Ｍの下降濃度の酢酸アンモニウム（−−−）
及び０〜５０％（−−−）の上昇濃度のエチレングリコ
ール（Ｍａｌ　ｌ　１ｎｋｒｏｄＬ）を含むｐＨ４，５
の勾配をフローアダプター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＣ
１６）を介して加えた。勾配の全容量は１５０ｚｆとし
、１．９＋ｖＮのフラクションをＲｅｄｉｒａｃ＠フラ
クションコレクター（ＬＫＢ）により収集した。１．Ｏ
Ｎの酢酸中の５０目のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ
＾０２８１）を含む無菌プラスチツク１２Ｘ７５ｍｍス
ナップトップ管（Ｆａｌｃｏｎ）に、一つおきのフラク
ション３０９１を移した。ＣＣＬ　６４ミンク肺細胞及
びへ５４９細胞の双方について最初の手順で記載したよ
うに腫瘍成長阻害活性を決定した。活性プロフィルは類
似しているので、へ５４９細胞に対する活性は示さない
。腫瘍成長阻害活性は阻害率％としてプロツトシ、・で
示した。成長阻害活性のピークは１．１８Ｍの酢酸アン
モニウム、４２％のエチレングリコールで溶離した。タ
ンパク質濃度は２８０ｎｍの吸−１９！３− 光度として示し、分光光度計（Ｉｌａｕｓｈ　＆　Ｌｏ
ｍｂ。 ５ｐｅｃｔｒｏｎｉｃ＠１００１）を使用して決定した
。 生物学的に活性なフラクション９０〜１００をプールし
、０．１Ｍの酢酸で透析した。プールしたフラクション
のタンパク質濃度は０Ｄ２８゜の吸光度により決定した
。回収したタンパク質は１．４ｙｇＣ第７図参照）であ
った。加えた阻害単位の址は３０．９ａ＋ＦＩ中に１．
５８Ｘ　１０’、回収した量はＬ４ｘｇ中に１．５ｘｌ
ｏ６であった。 第１４八図は、逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＩＩＰ
ＬＣ）　（μＢｏｎｄｐａｋ＠Ｃｌ８）を示す。用事組
織（剥離した）の基質成分から誘導し且つフェニル−セ
ファロースクロマトグラフィからプールした生物学的に
活性なフラクションから得たＩＢの凍結乾燥ＴＧＩを、
１０％のアセトニトリルを含む０．０５％のトリフルオ
ロ酢酸（ＴＦ＾）２．Ｏｚｌに希釈した。この段階でＲ
ＰＨＰＬＣに使用したタンパク質の量は、フェニル−セ
ファロースを使用するクロマトグラフィ後に得られた生
物学的に活性なタンパク質の全体の５０％を示す。 タンパク質溶液を２分間音波処理（Ｂｒａａｎｃｏｎ　
Ｂ−２２０ソニケーター）し、５分間３０００ｒｐｍで
遠心分離（ｌｌｌｅｃ−ｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　ＴＪ６
）により粒状物質を除去した後、μＢＯＮＤＰ八に＠Ｃ
１８カラム（０，３９ｘ　３０ｃｍ）に注入した。 段階的勾配を使用して１．Ｏｚｌ１分の流量でタンパク
質を溶離させた。アセトニトリルの濃度をまず１５分間
に２５％まで増加し、２５％で１０分間溶離を続けた。 次に濃度を２分間に２７％まで増加し、２７％で１０分
間溶離を続けた。次に濃度を２分間に２８％まで増加し
、２８％を１０分間維持し、最後に濃度を１０分間に１
００％まで増加した。フラクションをシリコンガラス管
に収集した。溶媒勾配を（−−−）で示す。タンパク質
の吸光度は２１０ｎｍで監視した（−）。 各フラクション容量は１．０ｙｘ（ｌであった。ＲＰ　
１１　Ｐ　Ｌ　Ｃに使用した装置は第１２図の項で記載
した通りである。 一つおきの管からの５１１１のアリコートを取り出し、
上述のようにＣＣＬ　６４及び八５４９に対する腫瘍成
長阻害活性をアッセイしな。ＣＣＬ　６４細胞系に対す
る活性は・て示す。フラクショ４７〜５１を別々にプー
ルし、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（矢印で示す）−により電気泳
動さぜた。 ３５００００阻害単位をこのクロマ）・り′ラフィ手順
で使用した処、プールしたフラクションで回収した単位
は、フラクション３９〜５８て１５００００、フラクシ
ョン５９〜７１で１．４８５０（合計１６４８５０）で
あった。成長阻害活性は２７％及び２８−３０％のアセ
トニトリル離した。 第１４Ｂ図は逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＩＩＰＬ
Ｃ）（μＢＯＮＤＡＰＡＫ’Ｃ１８）を示す。剥落した
ヒＩー用帯組織の基質成分から誘導し且つフェニルーセ
ファロースクロマトクラフィからプールした生物学的に
活性なフラクションから得な３４５１１１？の凍結乾＋
ＭＴＧＩを、０、０５％Ｉ・リフルオロ酢酸（ＴＦΔ）
及び１０％のアセ１−ニトリル２．（ｈｒ１２に希釈し
た。この試料は、フェニル−セファロースからプールし
た生物学的に活性なフラクションの全体の３０％を示し
た。カラムに加えた阻害単位数は３１２５０００であっ
た。回収した単位は、フラクション４６〜５０で６２５
００、フラクション５１〜５５て５００００単位、フラ
クション５６〜７２て９００００単位（合計２０２５０
０単位回収）てあった。 第１５図は、ドテシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ドスラブゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。 ２つの同様のクロマ１〜クラフィ手順を使用してμＢＯ
ＮＤＰＡＫυＣ１８によるクロマトグラフィから得た生
物学的に活性なタンパク質（第１４図Δ中の矢印）の凍
結乾燥プールをプールし、ゲル電気泳動に備えた。０，
１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　、ｐＨ６、８（Ｓｉｇｍａ）
、１５％のグリセロール（Ｋｏｄａｋ）及び２％のドデ
シル硫酸すトリウム（ＳＤＳ）を含む１００．１の試料
Ｍ街液に希釈した。 試料を２分間沸騰させ、（シリコン）ガラスに付着して
いるタンパク質を除去し、１０％のβ−メルカプトエタ
ノール（［ｌｉｏＲａｄＭ′）を含む試料Ｍｔｉｆ液５
０μ！に５０−を移し、ジスルフィド結合を還元させた
。 これらの試料を２分間沸騰させ、非還元及び還元試料の
両方を２個の別々の幅１　、５ｍｍのスラブゲルに加え
（レーン２て示す）、ゲル当たり３０ｍへの一定電流（
Ｉｌｏｅｆｆｅｒ電源ＰＳ　１２００　ＤＣ）で４．５
時間縦型電気泳動セル（旧ｏＲａｄ，　Ｍｏｃｌｅｌ　
１５５）内で１０〜２０％のアクリルアミド勾配て電気
泳動させた。５％のβーメルカフＮ〜エタノールで還元
したもの及び還元しないものの両方の分子量標準（Ｐｂ
ａｒｍａｃｉａ）を夫々対応する分子量で示した。分子
量は、ホスポリラーゼ八が９６ｋＤａ、ウシ血清アルブ
ミンか６８ｋＤａ、オボアルフミンか４３ｋＤａ、カル
ボニックアンヒドラーゼが３０ｋＤａ、大豆１〜リプシ
ンインヒビターが２１ｋＤａ、及びリゾチームが１４．
４ｋＤａであった。Ｂｒｕｃｅ　Ｍａｇｕｎ博士から入
手した精製血小板から誘導したＴＧＦ−β５０ｎｇを試
料緩衝液に希釈し、非還元条件（ａ）及び還元条件（ｂ
）て電気泳動させた（レーン１）。５，７％の酢酸、４
７％のメタノール中の０．１２５％のクーマシープルー
Ｒ−２５０（ＢｉｏＲａｄ）で１０分間ゲルを染色しく
ゲルにタンパク質を固定するため）、クーマシーブルー
を含まない同一の溶液で一晩脱染色した。 Ｍｅｒｒ　ｉ　Ｉにより記載されているような銀染色法
＜ＢｉｏＲａｄ銀染色キット＃１６１−０４４３）によ
りゲルを再染色した処、レーン１　（ＴにＦ−β）は約
１０００〜１５００（５０ＩＩ　ｇ　）単位の成長阻害
活性を含んでおり、レーン２は約８０００〜２００００
単位の成長阻害活性を含んでいた。 第１６図は、２つの別々のクロマトグラフィ工程から結
合した従来のｌ（ＰＬＣ手順（１４図Ｂ）からの活性フ
ラクションの逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＩＩＰＬ
ｃ）（μＢＯＮＤＡＰＡＫｆＤＣＮ）を示す。各管（シ
リコンカラス１３ｘ　１００ｍｍ管）からの凍結乾燥材
料を、１０％のプロパツールを含む０．１％のトリフル
オロｉｌｉ＄：酸（ＴＦ八）４．Ｏｚβに懸濁させ、２
分間音波処理し、１，０肩ｐ／分てμＢＯＮＤＡＰ八に
’ＣＮカラム（０　、３９　Ｘ　３０ｃｍ）に注入した
。タンパク質の溶離は、０．０５％のＴＦΔを含む２−
プロパノールの濃度を１０分間で１０％から２０％に増
加し、次に濃度を５０分間で２０％から５０％に増加し
く０，６％／分）、最後に濃度を２０分間で１００％ま
で増加することにより実施した。溶媒勾配は（−−一）
で示す。溶離したタンパク質の吸光度は２１０ｎｍて監
視したく−）。ＲＩ’　＋１　Ｐ　Ｌ　Ｃに使用した装
置は第１２図の項に記載した通りである。各フラクショ
〉・容量は１．Ｏ肩ρとし、次に２００−のアリコー１
〜を一つおきの管から取り出して生物学的活性をアッセ
イした（・）。 阻害活性は約４０〜４５％の２−プロパノールのカラム
から溶離した。１２０００単位の活性をこのカラムに加
えた。次のフラクションを凍結乾燥し、ヨウ素化し、５
ＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動させたく第１７図）。 これらのフラクションに含まれる総単位数は、フラクシ
ョン１１５６（Ｏ単位）、＃５８（４８８単位）、＃５
９〜６５（１１，７５０単位）、及び＃６６〜６Ｂ（１
８５単位）であった。 第１７図はＳＤＳポリアクリルアミドスラブゲル電気泳
動及びオートラジオグラフィを示す。第１６図の項で説
明したμＢＯＮＤＡＰＡＫＩＩＩＣＮカラム上のクロマ
１へグラフィから得た各活性又は非活性フラクションか
らの凍結乾燥試料を、明細書中に記載したようにヨウ素
化した。第１５図に関して記載したように試料を非還元
及び還元試料緩衝液に溶解させ、５ヘ−２０％のアクリ
ルアミド勾配を使用して電気泳動させ、タンパク質バン
ドを分解させると共に非放射性ヨウ素を除去した。ゲル
を染色し、放射性標識が脱染色溶液から消えるまで脱染
色した。ゲル乾燥器（ｌｌｏｅｆｆｅｒ）を使用してゲ
ルを乾燥し、ＸＡＲ型フィルム（Ｋｏｄａｋ）を使用し
て１週間オートラジオグラフィにか（つな。非放射性標
準も電気泳動させ、ゲルの左側に示した。このゲルに加
えた阻害単位の計算値は、第１６図からフラクション＃
５８（１８９単位）、レーン１．　＃５９〜６５（２０
６８単位）、レーン２゜＃６６〜６８（４６単位）、レ
ーン３．　＃５６（Ｏ単位）、レーン４、第１８図のク
ロマトグラムに示したようなμＢＯＮＤＡＰ八Ｋ”ＣＮ
カへム上のクロマトグラフィによる剥離し１へ制器の活
性フラクション（４０８単位）ル−ン５．同−基質／血
管調製物からの不活性フラクション、レーン６；　Ｂｒ
ｕｃｅ　Ｍａｇｕｎにより精製した血小板から誘導した
ＴＧＦ−β（２５６単位、約０．４ｎｇ）　。 レーン７であった。 第１８図は逆相高圧液体クロマｌ−グラフィ（ＨＰＬＣ
）＜１３　ＢＯＮＤＡＰＡＫ’ＣＮ）　ヲ示ｔ　。非剥
１１［帯の従来）ＩＩＰＬＣ手順（第１４図Δ及びＢと
類似）から得、μＢＯＮＤＡＰΔに０Ｃ１８カラムから
２７％のアセトニトリル（プール■）て溶離した活性フ
ラクションをプールし、シリコンガラス管（１６ｘ　１
００ｍｍ）中にＬＯ＊１容量まて凍結乾燥し、最終濃度
がトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％及び２−プロパ
ノール２０％となるまで希釈した。試料を２分間音波処
理し、ｌＲ１７分でμＢＯＮＤＡＰＡＫｆＤＣＮカラム
（０，３９ｘ　３０ｃ＋ｎ）に注入した。タンパク質の
溶離は、０．１％のＴＦＡを含む２−プロパノールの濃
度を５分間で２０％から３５％に増加し、次に５０分間
で３５％から５０％に増加しく０．３７５％／分）、次
に５分間て５０％から１００％に増加した。溶媒勾配は
（−−−）で示す。１０ｐ１のアリコートを各り、０ｔ
ｘ１！の試料から取り出し、生物学的活性を試験した（
・）。ＲＰ　ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃに使用した装置は第１４
図の項に記載した通っである。活性フラクションは３９
〜４３％で溶離し、４０〜４１％の溶離で活性ピークを
示した。カラムに加えた阻害単位計算値は３７０００で
あった。タンパク質濃度は決定することができなかった
。２１０ｎｍの吸光度は・て示す。 第１９図は逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）
（／ｌ　ＢＯＮＤＡＰＡＫ’ＣＮ）を示す。従来（７）
ＩＩＰＬｃ手順で得（第１８図と同一のクロマトグラフ
ィ工程から誘導）、２８〜３０％のアセトニトリル（プ
ール■）でＣ１８樹脂から溶離した活性フラクションを
プールし、第１８図の項て記載したようにβＢＯＮＤＡ
ｒ’ＡＫｆＤＣＮカラムに加えた。勾配溶離及び装置は
第１８図の項て記載した通りである。１００１Ｎのアリ
コートを一つおきの管から取り出し、生物学的活性を試
験した（・）。 生物学的活性は４４％から４６％で溶離し、４４％で活
性ピークを示した。カラムに加えた成長阻害単位の数は
２１０００であった。タンパク質濃度は決定することが
できなかった。 第２０図は逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＩＩＰＬＣ
）（μＢＯＮＤＡＰＡＫ’ＣＮ）を示す。第１８図（プ
ール■）及び第１９図（プール■）からの生物学的活性
を反映する溶離プロフィル（ピークのみ）を比較のため
に別のクロマトグラムに描いた。プールＩは４０〜４１
％で溶離し、プール■は４４％で溶離した。 第２１図はへ４３１条件付は培地の逆相肝ＬＣを示す。 ４Ｘ１０８の＾４３１細胞（１１ｏ１１１）からの凍結
乾燥条件材は培地を明細書中に記載したように処理し、
腫瘍細胞条件付は培地から誘導した腫瘍成長阻害活性に
体するＤＴＴの効果を試験した。Δ４３１細胞からの凍
結乾燥条件材は培゛地を５′１１の４ｚＮのＨＣＩに再
懸濁させ、４℃て３５０００ｒｐ＋ｎで１５分間遠心分
離（ＲＣ５Ｂ−Ｓｏｒｖａｌｌ＠Ｓ＾６００ローター）
して不溶性物質を除去した。上清を１．５ｚＮのマイク
ロフユージ管に移し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ＠マイクロフ
ユージで４℃で１５分間遠心分離した。タンパク質濃度
は２８０ｎｍの吸光度により決定した。６８０同のタン
パク質を含む０．２ｘｆｌのアリコー１〜を０．ＩＭの
重炭酸アンモニウム１．８ｚＮに加えた。試料を室温で
２時間インキュベー１−　Ｌ、凍結乾燥し、０．０５％
の１−リドフルオロ酢酸２１に再懸濁させた。材料（２
，０ｚＮ）を１．Ｏ＊１’／分で逆相半分雌用μＢＯＮ
ＤＡＰＡＫ’Ｃ１８カラムに注入し、５０分Ｏ〜５０％
の直線勾配の出発点で２．０ｘ１のフラクションを収集
した。各フラクションからの１．ｏｚｌの勾配のアリコ
ーＩ・について、ミンク細胞系（ＣＣＬ　６４）（−・
−・−・−）及びヒト腫瘍細胞系（Ａ５４９）　（−ム
ームーム−）に対する腫瘍成長阻害活性を上述のように
アッセイした。２０６ｎｍの吸光度は実線により示す。 第２２図はＤＴＴで処理したΔ４３１条件付は培地の逆
相１（ＰＬＣを示す。４Ｘ　１０８のΔ４３１＃Ｉ胞（
１１０ｚ１）からの凍結乾燥条件材は培地を上述のよう
に処理し、腫瘍細胞条件付は培地中の腫瘍成長阻害活性
に対するＤＴＴの効果を試験した。＾４３１細胞からの
凍結乾燥条件材は培地を４ｚＮのＨＣｌ　５ｘｌに再懸
濁させ、４℃で３５００ＩｔＰＭで１５分間遠心分離（
ＲＣ５Ｂ−Ｓｏｒｖａｌ　Ｉ’Ｓ＾６００ローター）し
て不溶性物質を除去した。上清を１．５ｉのマイクロフ
ユージ管に移し、Ｅｐｐｅｒｄｏｒｆ　＠マイクロフユ
ージで４℃で１５分間遠心分離した。 タンパク質濃度は２８０ｎｍの吸光度により決定した。 ６８０μｇのタンパク質を含む０．２ｚｌのアリコート
を、最終濃度６５ｍＭのＤＴＴを含む０．１Ｍの重炭酸
アンモニウム１．８Ｉｌｊ！に加えた。試料を室温で２
時間インキュベートし、凍結乾燥し、０．０５％のトリ
フルオロ酢酸２ｖｆに再懸濁させた。材料（１，ＯＲ／
）を逆相半分前用μＢＯＮＤＡＰへに＠Ｃ１８カラムニ
注入シ、２．Ｏａｊ！ノア　ラクションを直線勾配の初
めに収集し、ミンク肺細胞系（ＣＣＬ　６４）（−ムー
ムーム−）及びヒト腫瘍細胞系（＾５４９）（−・−・
−・−）に対する成長阻害活性をアッセイした。２０６
ｎｍの吸光度は実線で示す。 第２３図は、細菌中でＴＧＦ−β１ポリペプチドを産生
させるためにｐＡＴＩ＋　１１及びｌｌ５Ｋ−１発現ベ
クターを使用するＬｒｐＥ：：Ｔ［；Ｆ−β１プラスミ
ド構造物を概略的に示す。 第２４図は、Ｐｖｕ　Ｕ　−Ｐｖｕ　ＩＩ　ＴＧＦ−β
１ｃＤＮ八プローブとハイブリダイズしたヒト腫瘍ＤＮ
Ａのザザンプロット分析を示す。ＳＣＣは０．１５Ｍの
塩化ナトリウム及び０．１５Ｍのクエン酸ナトリウムか
ら構成される標準食塩−クエン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞
である。 第２５図は、高ストリンジエンシー洗浄でＴＧＦ−β１
ｃＤＮ＾プローブとハイブリダイズしたファージサブク
ローンの制限地図を示す。クローンはＴＧＦ−β１ゲノ
ム遺伝子座に対応する。ファージクローンのＳａｌ　Ｉ
　−５ａｌ　ＩフラグメントをｐＵｃにサブクローニン
グした。制限酵素部位の略号は、Ｓ−５ａｌ　Ｉ　；に
−Ｋｐｎ　■；　Ｅ−ＥｃｏＲｌ　；　Ｈ−Ｈｉｎｄｌ
ｌ［；　Ｂ−ＢａｍＨＩ　；　Ｂｇ−Ｂｇｌ　ＩＩであ
る。 第２６図は、低ストリンジエンシー条件下のみにＴＧＦ
−β１ｃＤＮ＾プローブとハイブリダイズしたファージ
サブクローンの制限地図を示す。 第２７図は、ＴＧＦ−β１及び腫瘍阻害活性を有するタ
ンパク質をコードする関連遺伝しのヌクレオチド配列及
び予測されるアミノ酸配列の比較を示す。 同一のアミノ酸を線で囲んだ。（Ａ）は腫瘍成長阻害活
性を有するタンパク質をコードする遺伝子に対応する。 第２８図は、ｐＵＣにサブクローニンクした腫瘍成長阻
害活性を有するタンパク質を＝１−ドする関連遺伝子の
ＢａｍＨＩフラグメントの制限地図を示す。 反復遊部フラグメンｌ−（Ｂａｍｌｌ　Ｉ　−Ｔａｑ　
Ｉ　）の位置を太線で示した。 第２９図は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコ
ードするＩ、７ｋｂのｃＤＮΔの部分ヌクレオチド配列
及び対応するアミノ酸配列を示す。 第３０図は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコ
ードするＴＧＦ−β１関連遺伝子の１．７ｋｂのＥｃｏ
ＲＩサブクローンの制限地図を示す。 第３１図は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子及びＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２のヌ
クレオチド及び予測されるアミノ酸配列の比較を示す。 （Ａ）は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子に対応する。 第３２図は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子のＥｃｏＲＩ　−ＢｇＩ　ＩＩ　＋、７
ｋｂｃＤＮΔフラグメンＩ・をプローブとして使用した
Ａ６７３、Ａ３４９及びへ４９８細胞系のノーザンプロ
ット分析を示す。 第３３図は、ＴＧＦ−β１に関連し且つ腫瘍阻害活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子のゲノム配列から
のＰｖｕ　（１−Ｔａｑ　ｌプローブを使用したＡ６７
３、Ａ５４９及びΔ４９８細胞系のノーザンフロッＩ〜
分析を示す。 第３４図はＰｓｔ　Ｉ　−Ｂａｌ　Ｉ　ＴＧＦ−β１プ
ローブを使用したＡ６７３、Ａ５４９及び＾４９８細胞
系のノーザンブロッ１へ分析を示す。 第３５図は、ＴＧＦ−β１前駆体の完全コープインク配
列を含むＴＧＦ−β１ｃＤＮ八をプローブとして使用し
−２１，５− たＡ６７３、Ａ５４９及びΔ４９８細胞系のノーザンブ
ロッ１〜分析を示す。 第３６図は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコ
ーディングする遺伝子のＥｃｏＲＩ　−ＢＦｌｌ　Ｈｃ
ＤＮＡフラグメンＩ・をプローブとして使用した腰帯か
らのｍＲＮΔ及び＾６７３細胞系のノーザンプロット分
析を示す。 第３７図は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる３つの溶解物の融合タンパク質である腫瘍成長阻害
活性を有する屓■Ｅ　：　：タンパク質の産生を示す。 （＾）は腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子に対応する。 第３８図は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質の融
合タンパク質を認識する抗体のウェスタンフロラ）・分
析を示す。（Ａ）は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパ
ク質の最後の１５０個のアミノ酸に対応するポリペプチ
ド配列を示す。 第３９図は、１２．５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミト
ゲル上で分離した全細胞細菌溶解物即ちｔｒｐＥ：：Ｔ
ＧＦ−β１融合タンパク質（レーン１及び４）、ｔｒｐ
Ｅ：：（八）融合タンパク質（レーン２及び５）、並び
にＴＧＦ−β１タンパク質（Ｒ＆　Ｄ　５ｙｓｔｅ＋ｎ
ｓから購入）（レーン３及び６）を示す。タンパク質を
電気泳動によりニトロセルロースフィルター（１μｍ孔
径）に移し、３００倍モル過剰の抗原性ペプチドの不在
下（レーン１．２及び３）又は存在下（レーン４．５及
び６）でアフィニティ精製抗ペプチド抗体１００μｇと
共にインキュへ一トシた。 ヒツジ抗つザキ抗体（Ｐｒｏ…ｃ４ａ）に結合したアル
カリフォスファターゼを使用して、製造業名の指示に従
って抗体を検出した。 ＦＩＧ、４４Ａ。 ＡＢＳＯＲＢＡＮＣＥ（２（Ｏｎｍ） ０．８　　０．６　　０４　　０．２ ＦＩＧ、１４Ｂ。 ＡＢＳＯＲＢＡＮＣＥ（２（Ｏｎｍ） ０．８　０６　０ＡＱ、２ ＦＩＧ、１９゜ ＡＢＳＯＲＢＡＮＣＥ（２１０ｎｍ） ＰＥＲＣＥＮＴ　ＩＮＨＩＢＩＴＩＯＮＰＥＲＣＥＮＴ
２−ＰＲＯＰＡＮＯＬ ＦＩＧ、２０ ＰＥＲＣＥＮＴ　ＩＮＨＩＢＩＴＩＯＮＢ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　［（ＴｑＴｑ　　　　Ａ 区ｍ ＠）　　　　　−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−ｆ’ｌ）　　　　　−−−−−−−−−−−−−
−−−−−＝８０ ｆｌ）　　　　　　ＣＴＲ０１”ＩＲＦＩＴＣ日ＧＣＲ
ＴＴ　　Ｃ１１ＣＴＧＴＬｅｕ　　Ｇｌｕ　　ｌ　ｌｅ
　　Ｓｅｒ　　ｌ　Ｉｅ　　Ｈｉｓ　　Ｃ１，ｌ；１Ｒ
）　　　　　　日ＲＣＲＴＴ　　Ｃｎｃ　　Ｃ１ＦＩＧ
ＧＴ１３　　ＦＩＴＧ　　Ｌｉ１ＩｌＩＲｓｎ　　ｌ　
ｌａ　　Ｈｉｓ　　ＧＩＬＩ　　リａ：　　Ｎｅｔ、Ｇ
ｌｕｆｌ）ＣＧＴＧＧＲＧＲＴＣＴＧ（３ＧＧＣＩＸｉ
ＣＣＴＣ１”ｌｒｇ　６１１．Ｊ　Ｒｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇ
ＩＩＪ日ｒｇ　Ｌｅｕ旧〉　　　　　日Ｔ（３日ＴＧ　
　日ＴＴ　　ＣＣＣＣＣｆ１　　ＣＲＣＣＧＧｌｌｅｔ
　　Ｎｅｔ　　ｌ　ｌｅ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｈｉ
ｓ　　日ｒ＋］Ｆｉｇ、２９　　（その１） −１１０・−１０１ ３ｅｒ　ＯｌすＧＩＩＪ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　日
ｒｇ　Ｒｒｇ　０１１−＋　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　
ＧＩＩＪ″ｒ’ｏ　　Ｃ１：＋５　　ＨＩ３　Ｔｈｒ　
　Ｐｈｅ　　ＧＩｎ　Ｐｒｏ　　日ｓｎ　　ＧＩＬＪ　
　Ｆｌｓｐ　　ｌ　ｌｅ　　Ｌｅｕ　　ＧＩＬＩＦｉｇ
−，２０（＋ く日）　　　　　　ＧＣＴ　　ＴＴＧ　　ＧＩＴＨ日Ｃ
Ｃ日ｎＴ　　ＴｎＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣｆＴ＋ｃ　　Ｔ
ＴＧＲｌａ　　Ｌｅｕ　　日ｓｐ　　Ｔｈｒ　　日ｓｎ
　　Ｔ１７　　ＣＩ、Ｉｓ　　Ｐｈｅ　　自ｒｇ　　＋
１．ｐｎ　　Ｌｅ＋、＋２＋−；’：’ （日）　　　　　ＴｎＣＦＩＴＴ　　ＧＩ”ＣＴＴＣｃ
、日　ＣＦＩＧ　　ＧＡｌＴ　　ＣＴＧ　　ＧＧＣＴＧ
Ｇ　　ＥｌｌｃＴすｒ　　ｌ　Ｉｅ　　Ｆｌｓｐ　　Ｐ
ｈｅ　　ｎｒｇ　　Ｇｌｎ　　日ｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｇ
ＩＩＪ　　Ｔｌ−ｐ　　ＬＩＪｓ（Ｒ）　　　　　ＧＣ
Ｃｎｌ”ＩＣＴＴＣＴＧＣＴＣ＋１ＧＣＣＣＣＴ　　Ｔ
ＧＣＣＣｎ　ＴｎＣＣＴＣ日ｌａ　　Ｒｓｎ　　Ｐｈｅ
　　ＣＩＪ５　　Ｓｓｒ　　０ＩＩＪ　　ＰＩ−ＯＣ１
，Ｊｓ　　Ｐｒｏ　　ＴＩＪｒ　Ｌｅｕ（ｎ）　　　　
　　Ｇ１’ＯＣＴ１３　０Ｇ１１　ＣＴＩコ　Ｔｌ−Ｉ
ＣｌｌｌＩｃ　　１１ｃＴ　　ＣＴＧ　　ｆｌ「ｌｃ　
　ＣＣＴ　　Ｇ１−１１１Ｕａｌ　　Ｌｅｕ　　ＧＩＬ
Ｊ　　Ｌｅｕ　　Ｔｇｒ　　ｎ；ｎ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅ
ｌ、口１５ｎ　　Ｐｒｏ　　ＧＩＬＩ８１電＝）０ （ＩＩ）　　　　　　ＣＲＧ　　ＧｎＣＣＴ１３　　Ｇ
ＲＣ；　　ＣＣＣＣＴＩ：ｉ　　１１ｃｃ　　＋］ＴＣ
ＣＴＧ　　ＴｎＣＴＩＩＴＧｌｎ　　ｌ］ｓｐ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　し＝ｕ　　Ｔｌｍ−Ｉ　ｌ
ｅ　　Ｌｅｕ　　Ｔすｒ　　Ｔｇ１１〕１ｌｌＩ〕 ＜Ｒ）　　　　　　ＣＴＣＴＣＣｎＦｃ　　ＲＴ＋３　
０ＴＣＧＴＧ　　ｌ’ｈｌｃｉ　　ＴＣＴ　　Ｔ（３Ｔ
　　Ｆｌ自ＲＴＧＴＬｅｌ−＋　　ＳＬ：！ｒ　Ｆ１５
ｎ　　ＩＩＧ　Ｌ　　リｑ１　リａｔ　　ＬＬＪ５　１
＋ｅｌ−ＣＩＪ５　　ＬＩＪ５　　ｌＺＩＪ５Ｆｉｇ−
３０ ０１”ＩＧ　　Ｇ＋ＩＧ　　ｆｌｎｃ　　ＴＧに　１６
丁　ＧＴＧ　　ＣＧＣＣＣＣＣＴＣＧｌｕ　　Ｇｌ＋、
＋　　Ｆｌｓｎ　　ＣＩＪＥ　　ｌユリ５　り曙＋Ｉｌ
　　ｌｌｒｇ　　Ｐｒｏ　　ＬｅｕＴＧ６　（３ＴＣＣ
ＲＴ　　Ｇ＋ｕ”ｔ　　Ｃ：ＣＴ　　ＦＩＩＩＧ　　Ｇ
ＧＣ，ＴＲＣＴＦＩＴＴｒｐ　　１Ｊａｌ　　１（ｉ＝
　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　ＬＩＪ、；　　ＧＩＩＪ　　
Ｔｌ７ｒ　　ＴすｒＣＧＣ＋ＩＧＴ　　ＧＣ＋〕　ＧＦ
ｉＣＲＣＩ］　＋ＩＣＣＣＦＩＣＩＩＧＣＲＣＧＦｌｒ
ｇＳｅｒＲ１ａＲｉｐＴｈｒＴｔｙト＋１ｓＳｅｒＴｌ
−＋ｒ８（］ ＧＣｎＴＣＴＧＣＣＴＧ１３Ｃ’ＣＴＴＧＣＴｌコＣＧ
ＴＬｉｃｃｃＲ１ａ　　Ｓｅｒ　Ｒｌａ　　Ｔｒｐ　　
Ｐｒｏ　　ＣＩＪ５　　ＣＩ、＋５　　リＱＩｐＴ−１
：１すｑｌ　　Ｇｌ＋、）ｌｌｒｇ　　Ｔｌ）ｒ　Ｐｒ
ｏ　　ＬＩＪｓ　　ＩＪｃＩＩ　　Ｇｌｕ　　Ｉ：ｉｌ
＋’■ＦＩＧ、３２゜ ＜＜＜ ＦＩＧ、３３゜ ｂ −４，５ −４，２ −３，５ −２，］α−ｏｃｔｉｎ ＦＩＧ、３５゜ クク＜ Ｉ、′ｌ開鳩′１Ｇ３−２５８４！１７　（７２）ＦＩ
Ｇ、３６゜ ｃｏｒｄ　Ａ６７３ ［下＝１１］ 手続補正書（鹿） 昭和６３年４月２１日

Claims (115)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）夫々約２６０００ドルトンの見掛けの分子量を有
    しており、各々が約１３０００ドルトンの見掛けの分子
    量を有しており且つジスルフィド結合により相互に結合
    された２つのポリペプチドから構成される二量体である
    複数のタンパク質を含むヒト組織から誘導された酸性化
    エタノール抽出物であって、抽出物の各々がヒト腫瘍細
    胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の成長を阻害
    し且つ正常なヒト包皮線維芽細胞の成長を刺激する特性
    を有しており、ヒト腫瘍細胞成長に対する阻害活性は、
    酸性化エタノール抽出物の温度を約３分間約１００℃に
    上げた場合、あるいは酸性化エタノール抽出物が酢酸中
    に約１．０モルとなるまで酢酸を加えた場合に破壊され
    ず、阻害活性は酸性化エタノール抽出物が約２３℃でな
    く約４℃で調製される場合に強化される前記酸性化エタ
    ノール抽出物。
  2. （２）ヒト組織が臍帯である特許請求の範囲第１項に記
    載の酸性化エタノール抽出物。
  3. （３）ヒト組織が胎盤である特許請求の範囲第１項に記
    載の酸性化エタノール抽出物。
  4. （４）約２６０００ドルトンの見掛けの分子量を有して
    おり、各々が約１３０００ドルトンの見掛けの分子量を
    有しており且つジスルフィド結合により相互に結合され
    た２つのポリペプチドから構成される二量体である少な
    くとも２つの酸性タンパク質を含む、実質的に全血液及
    び全細胞外可溶性成分を除去するように処理したヒト臍
    帯から誘導された酸性化エタノール抽出物であって、タ
    ンパク質の各々がヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系
    （ＣＣＬ６４）の成長を阻害し且つ正常なヒト包皮線維
    芽細胞の成長を刺激する特性を有しており、ヒト腫瘍細
    胞成長に対する阻害活性は、酸性化エタノール抽出物の
    温度を約３分間約１００℃に上げた場合、あるいは酸性
    化エタノール抽出物が酢酸中に約１．０モルとなるまで
    酢酸を加えた場合に破壊されない前記酸性化エタノール
    抽出物。
  5. （５）ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６
    ４）の成長を阻害し且つ正常なヒト包皮線維芽細胞の成
    長を阻害しない特性を有しており、約２６０００ドルト
    ンの見掛けの分子量を有しており、各々約１３０００ド
    ルトンの見掛けの分子量を有しており且つ非還元条件下
    でジスルフィド結合により相互に結合された２つのポリ
    ペプチドから構成される二量体である組織誘導型成長阻
    害剤１（ＴＧＩ−１）と呼称されるタンパク質。
  6. （６）タンパク質が、エーテル−エタノール調製後、直
    線勾配を使用するヒト組織の酸性化エタノール抽出物の
    フェニル−セファロースを用いた疎水性相互作用クロマ
    トグラフィで約１．５Ｍの酢酸アンモニウム及び約３１
    ％のエチレングリコールで定義される活性として回収可
    能である特許請求の範囲第５項に記載の組成物。
  7. （７）タンパク質が、０．０５％のトリフルオロ酢酸を
    含むアセトニトリルの分離勾配を使用するヒト組織の酸
    性化エタノール抽出物の高性能液体クロマトグラフィで
    定義される活性として回収可能であり、０．０５％のト
    リフルオロ酢酸を含む２−プロパノールの分離勾配を使
    用するヒト組織の該酸性化エタノール抽出物の高性能液
    体クロマトグラフィで定義される活性として回収可能で
    ある特許請求の範囲第５項に記載の組成物。
  8. （８）酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマトグ
    ラフィが、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含むＣ１８
    カラム上でアセトニトリルの直線勾配を使用して約２７
    ％のアセトニトリルで実施される特許請求の範囲第７項
    に記載の組成物。
  9. （９）酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマトグ
    ラフィが、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含むＣＮカ
    ラム上で２−プロパノールの直線勾配を使用して約４０
    〜４１％の２−プロパノールで実施される特許請求の範
    囲第７項に記載の組成物。
  10. （１０）ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ
    ６４）の成長を阻害し且つ正常ヒト包皮線維芽細胞の成
    長を阻害しない特性を有しており、約２６０００ドルト
    ンの見掛けの分子量を有する少なくとも２つのポリペプ
    チドを含む組織誘導型成長阻害剤（ＴＧＩ）と呼称され
    る組成物であって、該組成物がａ）直線ＮａＣｌ勾配に
    より約０．６〜０．７ＭのＮａＣｌで溶離されるときカ
    チオン交換から定義される活性の単一ピークとして分解
    され、ｂ）０．０５％のトリフルオロ酢酸を含むアセト
    ニトリルの直線勾配を使用する特許請求の範囲第４項に
    記載の酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマトグ
    ラフィで約２８〜３４％のアセトニトリルで定義される
    活性として回収可能であり、ｃ）３１％エチレングリコ
    ールを含む約１．５Ｍ酢酸アンモニウムに於いて直線分
    離勾配を使用する酸性化エタノール抽出物のフェニル−
    セファロースから定義される活性として回収可能である
    組成物。
  11. （１１）ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ
    ６４）の成長を阻害し且つ正常ヒト包皮線維芽細胞の成
    長を阻害しない特性を有しており、約２６０００ドルト
    ンの見掛けの分子量を有しており、夫々約１３０００ド
    ルトンの見掛けの分子量を有しており且つ非還元条件下
    でジスルフィド結合により相互に結合された２つのポリ
    ペプチドの二量体である組織誘導型成長阻害剤２（ＴＧ
    Ｉ−２）と呼称されるタンパク質。
  12. （１２）タンパク質が、エーテル−エタノール調製後、
    直線勾配を使用するヒト組織の酸性化エタノール抽出物
    のフェニル−セファロースを用いた疎水性相互作用クロ
    マトグラフィで約１．５Ｍの酢酸アンモニウム及び約３
    １％のエチレングリコールで定義される活性として回収
    可能である特許請求の範囲第１１項に記載の組成物。
  13. （１３）タンパク質が、０．０５％のトリフルオロ酢酸
    を含むアセトニトリルの分離勾配を使用するヒト組織の
    酸性化エタノール抽出物の高性能クロマトグラフィで定
    義される活性として回収可能であり、０．０５％のトリ
    フルオロ酢酸を含む２−プロパノールの分離勾配を使用
    するヒト組織の該酸性化エタノール抽出物の高性能液体
    クロマトグラフィで定義される活性として回収可能であ
    る特許請求の範囲第１２項に記載の組成物。
  14. （１４）酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマト
    グラフィが、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含むＣ１
    ８カラム上でアセトニトリルの直線勾配を使用して約２
    ８〜３０％のアセトニトリルで実施される特許請求の範
    囲第１３項に記載の組成物。
  15. （１５）酸性化エタノール抽出物の高性能液体クロマト
    グラフィが、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含むＣＮ
    カラム上で２−プロパノールの段階状勾配を使用して約
    ４４％の２−プロパノールで実施される特許請求の範囲
    第１３項に記載の組成物。
  16. （１６）ヒト腫瘍細胞の成長を阻害し且つ樹立ミンク肺
    細胞系（ＣＣＬ６４）の成長を阻害しない特性を有して
    おり、ヒト組織の酸性化エタノール抽出物のカチオン交
    換クロマトグラフィにより回収可能であるＣＭ−Ｉと呼
    称されるタンパク質
  17. （１７）約３００００ドルトン未満の見掛けの分子量を
    有しており、実質的にヒト腫瘍細胞系（Ａ５４９）の成
    長を阻害し且つ樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の成
    長を阻害しない特性を有しており、０．１Ｍ重炭酸アン
    モニウム中の６５ｍＭジチオトレイトールによるジスル
    フィド結合の還元に対して非感受性である該特性を室温
    で２時間維持するＡ４３１細胞の条件付け培地から回収
    可能なタンパク質。
  18. （１８）ａ）見掛けの分子量が約２６０００ドルトンで
    あり、 ｂ）約１３０００ドルトンの見掛けの分子量を有してお
    り且つジスルフィド結合により結合 される２つのポリペプチドから構成される 二量体であり、 ｃ）ヒト腫瘍細胞系（Ａ５４９）及び樹立ミンク肺細胞
    系（ＣＣＬ６４）の腫瘍成長阻害活性を示し、ｄ）１．
    ０Ｍ酢酸及び０．１％トリフルオロ酢酸の酸中に可溶性
    であり、 ｅ）約１００℃までの熱に安定であり、 ｆ）３９％までのアセトニトリル及び４９％までの２−
    プロパノールに安定である 特徴を有するタンパク質。
  19. （１９）ＴＧＩ−１と呼称される特許請求の範囲第１８
    項に記載のタンパク質。
  20. （２０）ＴＧＩ−２と呼称される特許請求の範囲第１８
    項に記載のタンパク質。
  21. （２１）１位のアラニンから開始して１１２位のセリン
    で終止する第２９図に示す１１２個のアミノ酸を含有す
    る腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質。
  22. （２２）特許請求の範囲第２１項に記載の精製タンパク
    質。
  23. （２３）１１２個のアミノ酸を有する特許請求の範囲第
    ２２項に記載のタンパク質。
  24. （２４）−９３位のセリンから開始して１１２位のセリ
    ンで終止する第２９図に示す２０５個のアミノ酸から構
    成される特許請求の範囲第２１項に記載のタンパク質。
  25. （２５）特許請求の範囲第２１項に記載のタンパク質を
    コードする核酸分子。
  26. （２６）特許請求の範囲第２３項に記載のタンパク質を
    コードする核酸分子。
  27. （２７）特許請求の範囲第２４項に記載のタンパク質を
    コードする核酸分子。
  28. （２８）第２９図に示す特許請求の範囲第２５項に記載
    のｃＤＮΛ。
  29. （２９）１位のコドンのグアニンから開始して１１２位
    のコドンのシトシンで終止する第２９図に示す特許請求
    の範囲第２６項に記載のｃＤＮＡ。
  30. （３０）−９３位のコドンのチミンから開始して１１２
    位のコドンのシトシンで終止する第２９図に示す特許請
    求の範囲第２７項に記載のｃＤＮＡ。
  31. （３１）特許請求の範囲第２５項に記載の核酸分子を含
    むプラスミド。
  32. （３２）適当な宿主細胞中に特許請求の範囲第３１項に
    記載のプラスミドを含む宿主ベクターシステム。
  33. （３３）適当な宿主細胞が細菌細胞である特許請求の範
    囲第３２項に記載の宿主ベクターシステム。
  34. （３４）適当な宿主細胞が真核細胞である特許請求の範
    囲第３２項に記載の宿主ベクターシステム。
  35. （３５）特許請求の範囲第３２項に記載の宿主ベクター
    システムを増殖させて宿主中にタンパク質を産生させ、
    こうして産生されたタンパク質を回収することから成る
    タンパク質の産生方法。
  36. （３６）９位のアルギニンから開始して２８位のロイシ
    ンで終止する第２９図に示す２０個のアミノ酸を含む特
    許請求の範囲第２１項に記載のタンパク質から誘導され
    たポリペプチド。
  37. （３７）特許請求の範囲第２１項に記載のタンパク質に
    含まれるエピトープに特異的に結合する抗体。
  38. （３８）特許請求の範囲第３７項に記載のモノクローナ
    ル抗体。
  39. （３９）特許請求の範囲第３６項に記載のポリペプチド
    に含まれるエピトープに特異的に結合する抗体。
  40. （４０）特許請求の範囲第３９項に記載のモノクローナ
    ル抗体。
  41. （４１）ヒト被験体からの試料を適当な条件下で特許請
    求の範囲第３７項に記載の抗体と接触させて該抗体とタ
    ンパク質に含まれるエピトープとの複合体を形成させ、
    こうして形成された複合体を検出し、これにより腫瘍を
    診断することから成る腫瘍の診断方法。
  42. （４２）特許請求の範囲第３７項に記載の抗体及び医薬
    上許容可能なキャリアを含有する医薬組成物。
  43. （４３）有効な腫瘍治療量の特許請求の範囲第４２項に
    記載の組成物を被験体に投与することから成る腫瘍の治
    療方法。
  44. （４４）有効な増殖型障害治療量の特許請求の範囲第４
    ２項に記載の組成物を被験体に投与することから成る増
    殖型障害の治療方法。
  45. （４５）有効量の特許請求の範囲第１項に記載の酸性化
    エタノール抽出物又は生物学的に活性なそのフラグメン
    ト、及び適当な医薬キャリアを含有する医薬組成物。
  46. （４６）有効量の特許請求の範囲第４項に記載の酸性化
    エタノール抽出物又は生物学的に活性なそのフラグメン
    ト、及び適当な医薬キャリアを含有する医薬組成物。
  47. （４７）有効量の特許請求の範囲第５項に記載のタンパ
    ク質又は生物学的に活性なそのフラグメント、及び適当
    な医薬キャリアを含有する医薬組成物。
  48. （４８）有効量の特許請求の範囲第１０項に記載の組成
    物又は生物学的に活性なそのフラグメント、及び適当な
    医薬キャリアを含有する医薬組成物。
  49. （４９）有効量の特許請求の範囲第１１項に記載のタン
    パク質又は生物学的に活性なそのフラグメント、及び適
    当な医薬キャリアを含有する医薬組成物。
  50. （５０）有効量の特許請求の範囲第１６項に記載のタン
    パク質又は生物学的に活性なそのフラグメント、及び適
    当な医薬キャリアを含有する医薬組成物。
  51. （５１）有効量の特許請求の範囲第１７項に記載のタン
    パク質又は生物学的に活性なそのフラグメント、及び適
    当な医薬キャリアを含有する医薬組成物。
  52. （５２）有効量の特許請求の範囲第１８項に記載のタン
    パク質又は生物学的に活性なそのフラグメント、及び適
    当な医薬キャリアを含有する医薬組成物。
  53. （５３）有効量の特許請求の範囲第２１項に記載のタン
    パク質又は生物学的に活性なそのフラグメント、及び適
    当な医薬キャリアを含有する医薬組成物。
  54. （５４）ヒト腫瘍細胞を有効な腫瘍成長阻害量の特許請
    求の範囲第４５項に記載の組成物と接触させることから
    成るヒト腫瘍細胞の成長の阻害方法。
  55. （５５）ヒト腫瘍細胞を有効な腫瘍成長阻害量の特許請
    求の範囲第４６項に記載の組成物と接触させることから
    成るヒト腫瘍細胞の成長の阻害方法。
  56. （５６）ヒト腫瘍細胞を有効な腫瘍成長阻害量の特許請
    求の範囲第４７項に記載の組成物と接触させることから
    成るヒト腫瘍細胞の成長の阻害方法。
  57. （５７）ヒト腫瘍細胞を有効な腫瘍成長阻害量の特許請
    求の範囲第４８項に記載の組成物と接触させることから
    成るヒト腫瘍細胞の成長の阻害方法。
  58. （５８）ヒト腫瘍細胞を有効な腫瘍成長阻害量の特許請
    求の範囲第４９項に記載の組成物と接触させることから
    成るヒト腫瘍細胞の成長の阻害方法。
  59. （５９）ヒト腫瘍細胞を有効な腫瘍成長阻害量の特許請
    求の範囲第５０項に記載の組成物と接触させることから
    成るヒト腫瘍細胞の成長の阻害方法。
  60. （６０）ヒト腫瘍細胞を有効な腫瘍成長阻害量の特許請
    求の範囲第５１項に記載の組成物と接触させることから
    成るヒト腫瘍細胞の成長の阻害方法。
  61. （６１）ヒト腫瘍細胞を有効な腫瘍成長阻害量の特許請
    求の範囲第５２項に記載の組成物と接触させることから
    成るヒト腫瘍細胞の成長の阻害方法。
  62. （６２）ヒト腫瘍細胞を有効な腫瘍成長阻害量の特許請
    求の範囲第５３項に記載の組成物と接触させることから
    成るヒト腫瘍細胞の成長の阻害方法。
  63. （６３）増殖型障害を治療するのに有効な量の特許請求
    の範囲第５３項に記載の組成物を被験体に投与すること
    から成る被験体の増殖型障害の治療方法。
  64. （６４）熱傷又は創傷を特許請求の範囲第４６項に記載
    の医薬組成物と接触させることから成る熱傷治療又は創
    傷癒合方法。
  65. （６５）熱傷又は創傷を特許請求の範囲第４７項に記載
    の医薬組成物と接触させることから成る熱傷治療又は創
    傷癒合方法。
  66. （６６）熱傷又は創傷を特許請求の範囲第４８項に記載
    の医薬組成物と接触させることから成る熱傷治療又は創
    傷癒合方法。
  67. （６７）熱傷又は創傷を特許請求の範囲第４９項に記載
    の医薬組成物と接触させることから成る熱傷治療又は創
    傷癒合方法。
  68. （６８）熱傷又は創傷を特許請求の範囲第５０項に記載
    の医薬組成物と接触させることから成る熱傷治療又は創
    傷癒合方法。
  69. （６９）熱傷又は創傷を特許請求の範囲第５１項に記載
    の医薬組成物と接触させることから成る熱傷治療又は創
    傷癒合方法。
  70. （７０）熱傷又は創傷を特許請求の範囲第５２項に記載
    の医薬組成物と接触させることから成る熱傷治療又は創
    傷癒合方法。
  71. （７１）熱傷又は創傷を特許請求の範囲第５３項に記載
    の医薬組成物と接触させることから成る熱傷治療又は創
    傷癒合方法。
  72. （７２）夫々約３００００ドルトン未満の分子量を有し
    ており、ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ
    ６４）の成長を阻害し且つ正常なヒト包皮線維芽細胞の
    成長を刺激する特性を有する複数のタンパク質を含む酸
    性化エタノール抽出物をヒト組織から調製する方法であ
    って、 ａ、タンパク質を可溶化するように組織を処理し、組織
    から誘導された可溶化タンパク質を除去し、ｂ、可溶化
    タンパク質を回収し、 ｃ、可溶化組織から約３００００ドルトン未満の見掛け
    の分子量を有するタンパク質を分離回収し、ｄ、分離回
    収したタンパク質をアッセイし、ヒト腫瘍細胞の成長を
    阻害するか又は樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の成
    長を阻害するか又は正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を強
    化するタンパク質を同定し、 ｅ、こうして同定されたタンパク質を含む酸性化エタノ
    ール抽出物を回収する 段階を適当な条件下に実施する方法。
  73. （７３）約２６０００ドルトンの分子量を有しており、
    ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の
    成長を阻害し且つ正常なヒト包皮線維芽細胞の成長を刺
    激する特性を有する少なくとも２つのタンパク質から成
    る組織誘導型成長阻害剤（ＴＧＩ）を含む酸性化エタノ
    ール抽出物をヒト臍帯から調製する方法であって、 ａ、臍帯組織から静脈及び動脈を除去し、全痕跡量の血
    液を除去するように組織を洗浄し、 ｂ、可溶化タンパク質を生成するように組織を処理し、
    組織から誘導された可溶性汚染タンパク質を除去し、 ｃ、酸性可溶化タンパク質を回収し、 ｄ、約２６０００ドルトンの分子量を有するＴＧＩを可
    溶化タンパク質から分離回収し、 ｅ、分離回収されたＴＧＩをアッセイし、ヒト腫瘍細胞
    の成長を阻害し、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の
    成長を阻害し、正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を強化す
    る活性を同定し、 ｆ、こうして同定されたＴＧＩを含む酸性化エタノール
    抽出物を回収する 段階を適当な条件下に実施する方法。
  74. （７４）約２６０００ドルトンの分子量を有しており、
    ヒト腫瘍細胞及び樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の
    成長を阻害し且つ正常なヒト包皮線維芽細胞の成長を刺
    激する特性を有する組織誘導型成長阻害剤１（ＴＧＩ−
    １）及び組織誘導型腫瘍成長阻害剤２（ＴＧＩ−２）を
    含む酸性化エタノール抽出物をヒト臍帯から調製する方
    法であって、 ａ、洗浄により血液成分を除去し、 ｂ、可溶化タンパク質を生成するように組織を処理し、
    組織から誘導された可溶性汚染タンパク質を除去し、 ｃ、酸性可溶化タンパク質を回収し、 ｄ、約２６０００ドルトンの分子量を有するＴＧＩ−１
    及びＴＧＩ−２を可溶化タンパク質から分離回収し、ｅ
    、分離回収されたＴＧＩをアッセイし、ヒト腫瘍細胞の
    成長を阻害し、樹立ミンク肺細胞系 （ＣＣＬ６４）の成長を阻害し、正常ヒト包皮線維芽細
    胞の成長を強化する活性を同定し、 ｆ、こうして同定されたＴＧＩを含む酸性化エタノール
    抽出物を回収する 段階を適当な条件下に実施する方法。
  75. （７５）組織を処理する段階（ａ）が、均質化組織を形
    成するのに適当な時間組織を均質化させ、約４℃のエタ
    ノールを含む適当な酸性抽出緩衝液に均質化組織を懸濁
    させ、可溶化タンパク質を生成するのに適当な時間約４
    ℃で均質化組織を撹拌することから成る特許請求の範囲
    第７２項に記載の方法。
  76. （７６）可溶化タンパク質からタンパク質を分離回収す
    る段階（ｃ）が、タンパク質の分子ふるいクロマトグラ
    フィから成る特許請求の範囲第７２項に記載の方法。
  77. （７７）タンパク質をアッセイする段階（ｄ）が、ヒト
    腫瘍細胞、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）又は正常
    ヒト包皮線維芽細胞を適当な条件下で適当な時間夫々タ
    ンパク質と接触させ、ヒト腫瘍細胞の成長を阻害するか
    、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の成長を阻害する
    か、あるいは正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を強化する
    タンパク質を同定することから成る特許請求の範囲第７
    ２項に記載の方法。
  78. （７８）組織を処理する段階（ｂ）が、約４℃の適当な
    緩衝液に組織を懸濁させ、可溶性タンパク質を生成する
    に適当な時間組織を均質化することから成る特許請求の
    範囲第７３項に記載の方法。
  79. （７９）組織を処理する段階（ｃ）が、酸性可溶性タン
    パク質を抽出するべく、均質化し洗浄した組織を適当な
    時間酸性化エタノールに懸濁させることから成る特許請
    求の範囲第７３項に記載の方法。
  80. （８０）ＴＧＩ−１及びＴＧＩ−２をアッセイする段階
    （ｅ）が、ヒト腫瘍細胞、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ
    ６４）又は正常ヒト包皮線維芽細胞を適当な条件下で適
    当な時間夫々ＴＧＩと接触させ、ヒト腫瘍細胞の成長を
    阻害するか、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の成長
    を阻害するか、あるいは正常ヒト包皮線維芽細胞の成長
    を強化する活性を同定することから成る特許請求の範囲
    第７３項に記載の方法。
  81. （８１）段階（ｂ）が、組織を適当な緩衝液に懸濁させ
    、均質化組織を形成するに適当な時間組織を約４℃で均
    質化させることから成る特許請求の範囲第７４項に記載
    の方法。
  82. （８２）段階（ｃ）が、洗浄した組織を適当な時間約４
    ℃のエタノールを含有する適当な酸性抽出緩衝液に懸濁
    させることから成る特許請求の範囲第７４項に記載の方
    法。
  83. （８３）可溶化タンパク質からポリペプチドを分離回収
    する段階（ｄ）が、フェニル−セファロースを使用する
    疎水性相互作用クロマトグラフィから成る特許請求の範
    囲第７４項に記載の方法。
  84. （８４）ＴＧＩをアッセイする段階（ｅ）が、ヒト腫瘍
    細胞、樹立ミンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）又は正常ヒト
    包皮線維芽細胞を適当な条件下で適当な時間ＴＧＩと夫
    々接触させ、ヒト腫瘍細胞の成長を阻害するか、樹立ミ
    ンク肺細胞系（ＣＣＬ６４）の成長を阻害するか、ある
    いは正常ヒト包皮線維芽細胞の成長を強化する活性を同
    定することから成る特許請求の範囲第７４項に記載の方
    法。
  85. （８５）組織誘導型成長阻害剤１（ＴＧＩ−１）と呼称
    されるタンパク質の調製方法であって、まず特許請求の
    範囲第７４項に記載の方法に従って酸性化エタノール抽
    出物を調製し、次に酸性化エタノール抽出物の高性能液
    体クロマトグラフィにより定義される活性として酸性化
    エタノール抽出物からＴＧＩ−１を回収することから成
    る方法。
  86. （８６）高性能液体クロマトグラフィによる回収に先立
    ち、フェニル−セファロースを使用する疎水性相互作用
    クロマトグラフィによりエタノール抽出物を精製する特
    許請求の範囲第８５項に記載の方法。
  87. （８７）０．０５％のトリフルオロ酢酸を含むＣ１８カ
    ラムでアセトニトリルの分離勾配を使用して約２７％の
    アセトニトリルでエタノール抽出物の高性能液体クロマ
    トグラフィを実施する特許請求の範囲第８５項に記載の
    方法。
  88. （８８）０．０５％トリフルオロ酢酸を含むＣＮカラム
    で２−プロパノールの分離勾配を使用して約４０〜４１
    ％の２−プロパノールで酸性化エタノール抽出物の高性
    能液体クロマトグラフィを実施する特許請求の範囲第８
    ５項に記載の方法。
  89. （８９）組織誘導型成長阻害剤（ＴＧＩ）と呼称される
    少なくとも２つのタンパク質から成る組成物の調製方法
    であって、まず特許請求の範囲第７３項に記載の方法に
    従って酸性化エタノール抽出物を調製し、次にｉ）０．
    ０５％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線
    勾配を使用する酸性化エタノール抽出物の高性能液体ク
    ロマトグラフィで約２８〜３４％のアセトニトリルで定
    義される活性として、又はｉｉ）直線ＮａＣｌ勾配によ
    り約０．６〜０．７ＭのＮａＣｌで溶離するときカチオ
    ン交換樹脂からの単一活性ピークとして、酸性化エタノ
    ール抽出物からＴＧＩを回収することから成る方法。
  90. （９０）組織誘導型成長阻害剤−２（ＴＧＩ−２）と呼
    称される組成物の調製方法であって、まず特許請求の範
    囲第７４項に記載の方法に従って酸性化エタノール抽出
    物を調製し、次に酸性化エタノール抽出物の高性能液体
    クロマトグラフィにより定義される活性として酸性化エ
    タノール抽出物からＴＧＩ−２を回収することから成る
    方法。
  91. （９１）高性能液体クロマトグラフィによる回収に先立
    ち、フェニル−セファロースを使用する疎水性相互作用
    クロマトグラフィによりエタノール抽出物を精製する特
    許請求の範囲第９０項に記載の方法。
  92. （９２）アセトニトリルの分離勾配及び０．０５％トリ
    フルオロ酢酸を含むＣ１８カラムを使用して約２８％の
    アセトニトリルでエタノール抽出物の高性能液体クロマ
    トグラフィを実施する特許請求の範囲第９０項に記載の
    方法。
  93. （９３）０．０５％トリフルオロ酢酸を含むＣＮカラム
    で２−プロパノールの分離勾配を使用して約４４％の２
    −プロパノールで酸性化エタノール抽出物の高性能液体
    クロマトグラフィを実施する特許請求の範囲第９０項に
    記載の方法。
  94. （９４）ＣＭ− I と呼称されるポリペプチドの調製方
    法であって、まず特許請求の範囲第７２項に記載の方法
    に従って酸性化エタノール抽出物を調製し、次にカチオ
    ン交換クロマトグラフィにより酸性化エタノール抽出物
    からポリペプチドを回収することから成る方法。
  95. （９５）特許請求の範囲第７２項に記載の方法により調
    製された酸性化エタノール抽出物。
  96. （９６）特許請求の範囲第７３項に記載の方法により調
    製された酸性化エタノール抽出物。
  97. （９７）特許請求の範囲第７４項に記載の方法により調
    製された酸性化エタノール抽出物。
  98. （９８）特許請求の範囲第８５項に記載の方法により調
    整されたＴＧＩ−１。
  99. （９９）特許請求の範囲第８９項に記載の方法により調
    製されたＴＧＩ。
  100. （１００）特許請求の範囲第９０項に記載の方法により
    調製されたＴＧＩ−２。
  101. （１０１）特許請求の範囲第９４項に記載の方法により
    調製されたＣＭ− I 。
  102. （１０２）被験体からの試料中に存在しているＴＧＩ−
    １の量を定量し、こうして定量した量を正常な被験体か
    らの試料中に存在している量と比較し、量の顕著な差の
    存在により腫瘍の存在を指示することから成る腫瘍の存
    在の検出方法。
  103. （１０３）被験体からの試料中に存在しているＴＧＩの
    量を定量し、こうして定量した量を正常な被験体からの
    試料中に存在している量と比較し、量の顕著な差の存在
    により腫瘍の存在を指示することから成る腫瘍の存在の
    検出方法。
  104. （１０４）被験体からの試料中に存在しているＴＧＩ−
    ２の量を定量し、こうして定量した量を正常な被験体か
    らの試料中に存在している量と比較し、量の顕著な差の
    存在により腫瘍の存在を指示することから成る腫瘍の存
    在の検出方法。
  105. （１０５）被験体からの試料中に存在している特許請求
    の範囲第２１項に記載のタンパク質の量を定量し、こう
    して定量した量を正常な被験体からの試料中に存在して
    いる量と比較し、量の顕著な差の存在により腫瘍の存在
    を指示することから成る腫瘍の存在の検出方法。
  106. （１０６）被験体からの試料中に存在しているＣＭ−
    I と呼称されるタンパク質の量を定量し、こうして定量
    した量を正常な被験体からの試料中に存在している量と
    比較し、量の顕著な差の存在により腫瘍の存在を指示す
    ることから成る腫瘍の存在の検出方法。
  107. （１０７）被験体からの試料中に存在しているＡ４３１
    細胞の条件付け培地から回収可能なタンパク質の量を定
    量し、こうして定量した量を正常な被験体からの試料中
    に存在している量と比較し、量の顕著な差の存在により
    腫瘍の存在を指示することから成る腫瘍の存在の検出方
    法。
  108. （１０８）被験体からの試料中に存在しているＴＧＩ−
    １及び形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）の量を別々に
    定量し、試料中に存在しているＴＧＩ−１の量とＴＧＦ
    −αの量との比を決定し、正常被験体からの試料におけ
    る比較比を決定し、被験体における比を正常被験体にお
    ける比と比較し、比の顕著な相違により腫瘍の存在を指
    示することから成る腫瘍の存在の検出方法。
  109. （１０９）被験体からの試料中に存在しているＴＧＩ及
    び形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）の量を別々に定量
    し、試料中に存在しているＴＧＩの量とＴＧＦ−αの量
    との比を決定し、正常被験体からの試料における比較比
    を決定し、被験体における比を正常被験体における比と
    比較し、比の顕著な相違により腫瘍の存在を指示するこ
    とから成る腫瘍の存在の検出方法。
  110. （１１０）被験体からの試料中に存在しているＴＧＩ−
    ２及び形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）の量を別々に
    定量し、試料中に存在しているＴＣＩ−２の量とＴＧＦ
    −αの量との比を決定し、正常被験体からの試料におけ
    る比較比を決定し、被験体における比を正常被験体にお
    ける比と比較し、比の顕著な相違により腫瘍の存在を指
    示することから成る腫瘍の存在の検出方法。
  111. （１１１）被験体からの試料中に存在している特許請求
    の範囲第２１項に記載のタンパク質及び形質転換成長因
    子α（ＴＧＦ−α）の量を別々に定量し、試料中に存在
    している特許請求の範囲第２１項に記載のタンパク質の
    量とＴＧＦ−αの量との比を決定し、正常被験体からの
    試料における比較比を決定し、被験体における比を正常
    被験体における比と比較し、比の顕著な相違により腫瘍
    の存在を指示することから成る腫瘍の存在の検出方法。
  112. （１１２）被験体からの試料中に存在しているＣＭ−
    I 及び形質転換成長因子（ＴＧＦ−α）の量を別々に定
    量し、試料中に存在しているＣＭ− I の量とＴＧＦ−
    αの量との比を決定し、正常被験体からの試料における
    比較比を決定し、被験体における比を正常被験体におけ
    る比と比較し、比の顕著な相違により腫瘍の存在を指示
    することから成る腫瘍の存在の検出方法。
  113. （１１３）被験体からの試料中に存在しているＡ４３１
    細胞の条件付け培地から回収可能なポリペプチド及び形
    質転換成長因子（ＴＧＦ−α）の量を別々に定量し、試
    料中に存在しているＡ４３１細胞の条件付け培地から回
    収可能なポリペプチドの量とＴＧＦ−αの量との比を決
    定し、正常被験体からの試料における比較比を決定し、
    被験体における比を正常被験体における比と比較し、比
    の顕著な相違により腫瘍の存在を指示することから成る
    腫瘍の存在の検出方法。
  114. （１１４）腫瘍を有する被験体からの試料について該試
    料中におけるＴＧＩ−１、ＴＧＩ、ＴＧＩ−２、特許請
    求の範囲第２１項に記載のタンパク質、ＣＭ− I 、又
    はＡ４３１細胞の条件付け培地から回収可能なポリペプ
    チドの１種以上の存在を決定し、その特異的組み合わせ
    の有無により特定の腫瘍型を指示することから成る腫瘍
    の分類方法。
  115. （１１５）腫瘍を有する被験体からの試料について該試
    料中に存在しているＴＧＩ−１、ＴＧＩ、ＴＧＩ−２、
    特許請求の範囲第２１項に記載のタンパク質、ＣＭ−
    I 、又はＡ４３１細胞の条件付け培地から回収可能なポ
    リペプチドの各々の量を定量し、その特異的量又は相対
    量の存在により特定の腫瘍型を指示することから成る腫
    瘍の分類方法。
JP62265201A 1986-10-20 1987-10-20 組織から誘導された腫瘍成長阻害剤、その調製方法及び使用 Pending JPS63258497A (ja)

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