JPS62288552A - 水と相溶性の還元性化合物並びにその分析用組成物及び分析方法への使用 - Google Patents

水と相溶性の還元性化合物並びにその分析用組成物及び分析方法への使用

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JPS62288552A
JPS62288552A JP62130031A JP13003187A JPS62288552A JP S62288552 A JPS62288552 A JP S62288552A JP 62130031 A JP62130031 A JP 62130031A JP 13003187 A JP13003187 A JP 13003187A JP S62288552 A JPS62288552 A JP S62288552A
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ロバート　トロコニス　ベリイ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学に関する。特に、本発明は、還元され
て検出可能な種を生成しうる水と相溶性の還元性化合物
並びに該化合物を含む分析用組成物及び要素に関する。
本発明は、更に、例えば生物学的流体中の被分析物の測
定方法に関する。
〔従来の技術〕
液体、例えば水、ミルク及び生物学的流体の化学分析は
、健康の維持及び診断にしばしば望ましいか又は必要で
ある。このような分析を容易にするため種々の組成物及
び要素が知られている。このような組成物及び要素は、
一般に、分析すべき物質（本明細書では、被分析物と示
す）を測定するための試薬組成物を含む。被分析物は、
生存生物又は非生存化学物質であってよい。試薬組成物
は、被分析物と相互反応すると、検出可能な変化（例え
ば色素形成）を生じる。
最近、生物学的流体、例えば全血、血清、血漿又は尿の
迅速かつ高度に定量的な診断又は臨床分析に有用な組成
物及び要素を開発するため、多くの研究がなされた。
例えば、感染症の迅速かつ有効な診断及び治療のために
は、その病気を引き起こしている細菌をできるだけ迅速
に検出できることが望ましい。尿路感染は、最も一般的
細菌感染症のうちでも、呼吸管の感染に次いでしばしば
起こる。実際、多くの病院において、尿路感染は、しば
しばカテーテル及び種々の外科的処置の使用により起こ
る院内感染の最も一般的な形態である。はとんどの尿路
感染は、尿道より誘導される微生物による上行性感染か
ら起こり、感知されない感染から重症の全身症状まで痙
度が変動する。このような感染は、通常、尿１−当たり
１００，０００　（１０’）以上の細菌数、顕著な細菌
尿と言われる状態と関係する。正常状態では、尿は無菌
であるが、適切に集められ、輸送された試料でｌ　ｄ当
たり微生物ｔｏｏ。
（１０’）個までは外性器からの汚染によって存在しう
る。
微生物及び還元性化合物を還元しうる他の被分析物の検
出における著しい進歩は、欧州特許出願公開第２１１．
８９８号公報に記載されている。該公報に記載されてい
る分析法は、被分析物の存在で検出可能な種を放出する
還元性化合物を利用している。
〔発明が解決しようとする問題点〕
前記公報に記載されている還元性化合物は、極めて有利
な分析法を提供するが、一般に、水溶液中への溶解度が
限られている。従って、還元性化合物の組成物を製造す
るために、水溶化界面活性剤を使用しなければならない
。
このような組成物に界面活性剤を使用することは、重大
な欠点を有する。界面活性剤は、ある種の細胞（例えば
白血球）を溶解して、該細胞の検出又は同定を困難にす
る傾向を有する。従って、還元性化合物を利用する迅速
かつ高感度な分析のため、界面活性剤の使用を回避する
方法が求められている。
〔問題点を解決するための手段〕
前記の問題点は、構造式： ％式％） 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換の芳香族又はキノン核
を表し、Ｒ１は移動可能（ｓｈｉｆｔａｂｌｅ）で、検
出可能な種を含む部分を表し、ｎはｌ又は２を表す〕を
有し、９以下のｐｕで還元されて移動可能で、検出可能
な種を放出することができ、水と相溶性にする部分を少
な（とも１個含み、更に、Ｒ１がＨで置換されている場
合には、 ＣＡＲ−→Ｈ）、１ が水中で測定して少な（とも＋１００ｍＶのＥ、７゜を
有するものである水と相溶性の還元性化合物を用いて克
服される。
特に有用な、水と相溶性の還元性化合物は、構造式：　
　　ＣＡＲ−Ｒ’ 〔式中ＣＡＲ−は を表し、 Ｒ２及びＲ４はそれぞれ独立に水素、置換若しくは非置
換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基又は
電子吸引性基を表し、 Ｒ３はＲ１、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若
しくは非置換のアリール基又は電子吸引性基を表すが、
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１個は電子吸引性
基を表すか、又はＲ３及びＲ４は一緒に、置換又は非置
換の歪のある縮合炭素同素環式環を完成するのに必要な
原子を表し、Ｒ５は炭素原子数１又は２の置換又は非置
換のアルキレン基を表し、 Ｒ６は置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは
非置換のシクロアルキル基又は置換若しくは非置換のア
リール基を表し、 Ｑはカルボニル基又はチオカルボニル基を表し、Ｆｌ？
ＡＧは、還元性化合物から放出されたときに検出可能な
種を生じる移動可能で、検出可能な種を表し、そして ｍはＯ又はｌである、但しＲ１がＩ］で置換されている
場合には、ＣＡＲ−Ｈは水中で測定して少なくとも＋１
００ｗＶのＥ、７２を有し、Ｒ’　、Ｒ”　、Ｒ３又は
Ｒ４のうち少な（とも１個は水と相溶性にする部分を少
なくとも１個含む〕を有する。
本発明は、更に、ｐＨ９以下で緩衝された、前記の水と
相溶性の還元性化合物を含む組成物を提供する。
また、被分析物の測定用の乾式分析要素は、前記の水と
相溶性の還元性化合物を含む。
本発明は、更に、 Ａ、被分析物を含むと思われる液体試料を前記の水と相
溶性の還元性化合物と接触させ、そしてＢ、被分析物の
存在の結果として放出される検出可能な種を検出する 工程を含む、被分析物の測定方法を提供する。
化学的又は生物学的に有用な部分を生成する方−法は、
ｐ！１９以下で構造式： ％式％） 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換の芳香族又はキノン核
を表し、Ｒ１は化学的又は生物学的に有用な部分を含む
部分を表し、ｎは１又は２を表す〕を有し、前記ｐＨで
還元されて化学的又は生物学的に有用な部分を放出する
ことができ、水と相溶性にする部分を少なくとも１個含
み、更に、Ｒ’がＨで置換されている場合には、 ＣＡＭ−一→Ｈ）ｎ が水中で測定して少なくとも＋１００ｍＶのＥ１／２を
有するものである水と相溶性の還元性化合物を還元する
ことを含む。
１施胆様 本発明の実施に有用な、水と相溶性の還元性化合物は、
広義には、生理学的ｐＨ（すなわち、９以下）で還元さ
れて移動可能で、検出可能な種を放出しうる、移動可能
で、検出可能な種を含む水と相溶性の有機化合物と定義
される。用語“移動可能な”とは、（１）還元性化合物
に結合しているときに第一スペクトル吸収バンドを有し
、放出されたときに第ニスベクトル吸収バンドを有する
色原体部分又は還元性化合物に結合しているときに第一
スペクトル励起及び発光バンドを有し、放出されたとき
に第ニスベクトル励起及び発光バンドを有する螢光原体
部分、（２）還元性化合物に結合しているときは不活性
であるか、遮断されているか又は接近できないが、放出
されたときは活性であるか、遮断されていないか又は接
近できる化学的又は生物学的に有用な部分、又は（３）
還元性化合物に結合しているときは活性であるか又は接
近できるが、放出されたときは不活性であるか又は接近
できない化学的又は生物学的に有用な部分と、定義され
る。
従って、検出可能な種は、還元性化合物に結合される場
合に化学的に変形され、例えば、前記の（１）について
は、還元性化合物のスペクトルバンドは、その種が放出
されたときに有するバンドからは“移動”している。必
ずというわけではないが、一般に、バンドは種が還元性
化合物の一部である場合に実質的に更に短波長側に移動
する。
すべての場合に、バンドは顕著な程度には重ならない。
一つのスペクトルバンドから他への変化は、還元性化合
物からの部分の単なる放出によるか、又は、このような
放出が放出された部分と金属イオン又は媒染剤との相互
反応を伴うか又は分析環境の変化（例えばｐＨの変化）
を伴うことによって起こりうる。環境におけるこのよう
な変化とともに、ｐＨは９以下に留まらねばならない。
また、前記のように、移動可能で、検出可能な種は、水
と相溶性の還元性化合物に結合したときに不活性である
か又は遮断されているか又は接近できないが、生理学的
ｐＨで放出されると、その後の相互反応のため生物学的
又は化学的に活性であるか又は接近できるようになる化
学的又は生物学敞に有用な部分であってもよい。放出さ
れた活性種は、それ自体で検出可能であるか、又は１個
以上のその後の化学的、物理的若しくは生物学的反応に
より検出可能な種を生成することができる。
本発明方法は、種々の化学的又は生物学的目的で、好ま
しくは生理学的ｐＨで、還元性化合物を還元する際に、
このような部分を放出する手段、例えば電子移動剤、酵
素、酵素基質、酵素禁止剤、補助因子、触媒又は反応体
を提供する。
更に、移動可能で、検出可能な種は、還元性化合物に結
合したときには１個以上のその後の化学的、物理的若し
くは生物学的反応のため活性であるか又は接近できるが
、生理学的ｐＨで放出されたときは、そのような反応に
対して不活性になるか又は接近できなくなる化学的又は
生物学的に有用な基であってよい。
本明細書に記載する還元性化合物は、水と相溶性〔無極
性有機溶剤中より、極性有機溶剤（例えば、アルコール
、アセトニトリル、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド又は
ジメチルスルホキシド）、水又は少量の１０種以上の極
性有機溶剤を含む水溶液に一層容易に溶解しうると定義
される〕である。
どの溶剤が極性であるか、無極性であるかは、当業者に
よって容易に決定されうる。この水相溶性は、化合物上
に１個以上の水と相溶性にする置換基によって与えられ
る。このような置換基は、広義には、−２，０未満の疎
水性パラメータ（Ｐ、）を有する基と定義される。この
ようなパラメータは、例えば、Ｍａｒｔｉｎ、　Ｍａｒ
ｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、、　（−ユーヨ−り
、１９７８年）　発行（７）（ｂ總剪１９工む旦」工邦
−販紅組に記載されているような所定の基に対する標準
値である。これらの部分は、水中で容易にイオン化可能
である（例えば、カルボキシ基又はスルホ基）か又は水
中でイオン化されない（例えばヨードキシ基又はグルコ
シル基）ｎ好ましい水相溶性化置換基はカルボキシ基で
ある。他の有用な置換基はヒドロキシ基、第四級アンモ
ニウム基、スルホンアミド基等を包含する。置換基は、
分子のＣＡＲ一部又はＲ１部又はその両方上に存在して
もよい。このような化合物及び水相溶性化置換基の位置
の例を下記の第１表に挙げるが、これは本発明の範囲を
限定するものではない。
詳述すれば、本発明に有用な化合物は、構造式％式％） 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換の芳香族又はキノン核
を表し、Ｒ１は下記の移動可能で、検出可能な種を含む
部分を表し、ｎはｌ又は２である〕を有する。このよう
な核の例を以下に示す。更に、Ｒ１がＨで置換されてい
る場合には、ＣＡＲ−ｆ　Ｈ）ｎは水中で測定した場合
に少なくとも＋１００ｍＶの還元電位（Ｅｌ／２）を有
する。このＥｌ／Ｚ値は、還元及び生理学的ｐＨ（９以
下）での化合物からの移動可能で、検出可能な種のその
後の放出を容易にする。このような測定は、示差パルス
ポーラログラフィ又は循環電圧測定（ｃｙｃｌｉｃ　ｖ
ｏｌｔａｍｅｔｒｙ）を使用して標準電気化学的技法に
より行う〔例えば、Ｓａｗｙｅｒ及びＲｏｂｅｒｔｓ、
　Ｊｒ、、Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌＥｌｅｃｔｒｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒ　　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ　５Ｊｏ
ｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ　、二ｊ、−ヨーク、１
９７４年、参照〕ｏ　Ｅ　ｌ／Ｚ値が水中で測定して＋
１００ｆｆＩｖ〜＋４００ｍＶであるのが好ましい。Ｅ
ｌ／２値の測定に関する詳細は、更に下記の第１表の前
に記載する。所望のＥ１／２は、ＣＡＲ−核上の適切な
電子吸引性基によって、又は核に結合した歪のある縮合
環又は両者の組み合わせによって達成される。
一実施態様においては、水と相溶性の還元性化合物を還
元して、Ｖａｎ　ｄｅ　５ａｎｄｅにより釦ＬＬ−Ｑ匹
ユニ」１↓エヱす工」且１工２２巻１９１〜２０９頁（
１９８３）及び米国特許第４，２３２．１０７号明細書
に記載されているのと同様であるが、所望のＥ、７２特
性及び１個以上の水相溶性化基を有する、キノンメチド
形成により検出可能な種を生成することができる。
別の実施態様では、有用な水と相溶性の還元性化合物は
、Ｖａｎ　ｄｅ　５ａｎｄｅの前掲文献の２０６頁に記
載されているものと同様であるが、所望のＥ、／２特性
及び１個以上の水と相溶性にする基を有するスルフィル
イミド及びスルフェニルスルホンアミドを包含する。
好ましい実施態様では、本発明の水と相溶性の還元性化
合物は、ＲＴＮＤ化合物、すなわち、生理学的ｐＨで分
子内求核置換を受−けて、求核基が化合物の少なくとも
一つの電子還元によって生成する場合に１個以上の移動
可能で、検出可能な種を放出しうる還元性化合物である
。換言すれば、このような置換は、ＲＩＮＤ化合物が１
−個以上の電子を提供する適当な還元剤（以下に更に詳
述する）によって還元される場合に起こる。写真分野で
使用される多数の同様のベンゾキノン化合物に比較した
これらのｔＮＤ化合物の卓越性は、ＲＩＮＤ化合物が高
いＥｌ／□値を有し、これにより生理学的ｐＨ（すなわ
ち、９以下）で還元及びその後の移動可能で、検出可能
な種（例えば色素）の放出を容易にする。
用語“分子内求核置換”とは、一つの分子の求核中心が
その分子の求電子中心である別の位置で反応して、求電
子中心に結合していた基又は原子を置換する反応である
。一般に、本発明に有用なｔＮＤ化合物は、求核基及び
求電子基を分子の三次元構造中に近接して併有し、それ
により分子内反応が起こり、４〜７個、好ましくは５又
は６個の原子を有する環が形成される。
特に有用な、水と相溶性のＲＩＮＤ化合物は、構造式： ％式％ Ｃ式中ＣＡＲ−は （式中ｍはＯ又は工、好ましくは１である）を表す〕を
存する化合物である。Ｒｓは、好ましくは゛　　骨格の
炭素原子数１又は２の、置換又は非置換のアルキレン基
（例えばメチレン基、エチレン基又はアルコキシメチレ
ン基）を表す。Ｒ５はメチレン基であるのが最も好まし
い。Ｑはカルボニル基又はチオカルボニル基であり、カ
ルボニル基であるのが好ましい。
Ｒ６は好ましくは炭素原子数１〜ＩＯの置換若しくは非
置換のアルキル基（例えばメチル基、エチル基、ｎ−プ
ロピル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、ヘキシル基
、デシル基又はベンジル基）、好ましくは炭素原子数４
〜１２の置換若しくは非置換のシクロアルキル基（例え
ばシクロブチル基、シクロヘキシル基又は４−メチルシ
クロヘキシル基）、又は炭素原子数６〜１２の置換若し
くは非置換のアリール基（例えばフェニル基、キシリル
基、ナフチル基、ｐ−ニトロフェニル基又はｐ−【−ブ
トキシフェニル基）である。Ｒ６は、炭素原子数１〜３
の低級アルキル基（置換又は非置換）であるのが好まし
く、メチル基であるのが最も好ましい。
ＦＲＡＧは、前記のような移動可能で、検出可能な種で
ある。これは、分子の残部と共に、第一スペクトルバン
ドを有するが、ＲＩＮＤ化合物から脱離されると、第二
スベククトルバンドを有する検出可能の種を生じる。こ
の種は、存在する還元剤の量に正比例しうる量で放出さ
れる。ＦＲＡＧの特定の組成は、所望の検出可能な種の
種類及び使用する特定の検出手段に応じて著しく変動し
うる。
移動可能で、検出可能の種は、適当な手段によって直接
検出しうる物質、及び他の物質、例えば被分析物、酵素
又は他の試薬と反応して検出可能な種を生成しうる物質
であってよい。このような種は、比色計で検出されうる
色原体（例えば染料又は顔料）及び螢光測定で検出しう
る螢光原性物Ｗ（例えば螢光性染料又はプローブ）を含
めて、放射測定手段によって検出可能なものを包含する
。
更に、検出可能な種は、燐光性種、化学発光性種、又は
当業者に公知の他の任意の検出可能な種であってよい。
特に有用な移動可能で、検出可能な種は、放出前には第
一スペクトルバンドを有し、放出後に測定すると第ニス
ベクトルバンドを有する色原体及び螢光原性物質である
。色原体の有用なものの例は、アゾ染料、アゾメチン染
料、ニトロフェノール染料、インドフェノール染料、イ
ンドアニリン染料及びトリアリールメタン染料、及びこ
の分野で公知の他のものであり、アゾ染料が好ましい。
螢光原性物質の有用なものの例は、クマリン類、４−オ
キソ−４Ｈ−ベンゾ−（ｄ、ｅ）アントラセン及びその
誘導体、フェナレノン類及びベンゾフェナレノン類、フ
ルオレセイン及びローダミンフルオレセイン染料、並び
にこの分野で公知の他のものである。フェナレノン染料
が特に有用である。
有用な燐光性種は、２′、５°−ジブロモフルオレセイ
ン及び４’、５’−ショートフルオレセインのような燐
光性物質を包含する。有用な化学発光性種はルシフェリ
ンである。
ＦＲＡＧは、ＦＲＡＧの一部である２価の単原子結合に
よる単結合によってＱに結合されている。単原子結合は
、ＦＲＡＧが色原体である場合にはオキシ基、チオ基又
はセレノ基であり、ＦＲＡＧが螢光原性物質である場合
にはオキシ基又はチオ基である。Ｑはオキシ基であるの
が最も好ましい。
前記のキノン構造中のＲＺ、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ
独立に、水素、炭素原子数１〜ｌＯの置換若しくは非置
換のアルキル基（例えばメチル基、エチル基、ヒドロキ
シメチル基、メトキシメチル基又はベンジル基）、置換
若しくは非置換の了り−ル基（例えばフェニル基、ナフ
チル基、メチルナフチル基、ｐ〜ニトロフェニル基、ｍ
−メトキシフェニル基又はフェニルスルホンアミド基）
又は一般に正のハメットシグマ値を有し、好ましくは０
．０６より大きいシグマ値を有する電子吸引性基である
。ハメットシグマ値は、例えば５ｔｅｒｉｃＥｆｆｅｃ
ｔｓ　ｉｎ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　
　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、、１
９５６年、５７０〜５７４頁及びＰｒｏ　ｒｅｓｓ　ｉ
ｎ　Ｐｈ　５ｉｃａｌ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒ　、　２巻−Ｔｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ　％　１９６４年、３３３〜３３９頁に記
載されている標準的方法によって計算される。正のハメ
ットシグマ値を存する有用な代表的電子吸引性基は、シ
アノ基、カルボキシ基、ニトロ基、ハロゲン（例えば弗
素、臭素、塩素又は沃素）、トリへロメチル基（例えば
トリフルオロメチル基又はトリクロロメチル基）、トリ
アルキルアンモニウム基、カルボニル基、カルバモイル
基、スルホニル基、スルファモイル基、エステル及び文
献に公知の他のもの、又はこれらの電子吸引性基の１個
以上で置換されたアルキル基若しくはアリール基（前記
のもの）を包含する。好ましい電子吸引性基は、ｐ−ニ
トロフェニル基、ｍ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフ
ェニル基及ヒ２．５−ジクロロフェニル基を包含する。
メタ位にメトキシ基又はアセトアミド基を有するアリー
ル基も、有用である。
前記のものより多くの炭素原子を有するＲ２、Ｒ３、Ｒ
４又はＲ６の同族体も本発明に有用であるが、このよう
に疎水性が増加したものは、炭素原子数の小さい同族体
に比べて付加的な水相溶性化置換基を必要とすることが
あることを理解しなければならない。
Ｒ３は、Ｒ１であってもよく、これによって２＝１のモ
ル比の検出可能な種分子：元のＲＩＮＤ化合物分子を生
成しうる。
また、Ｒ３及びＲ４は、−緒にキノン核に結合した置換
又は１１置換の歪のある縮合炭素同素環を完成するのに
必要な炭素原子を表すことができる。
環の歪は、還元電位を更に正側にする（Ｒｉｅｋｅら著
、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　、　Ｎｏ
　５０．４３８１〜４３８４　　（１９６９）参照〕。
例えば、このような環（単環又は双環式）は、骨格に４
〜８個の炭素原子数を有していてよく、５員の単環又は
７員若しくは８員の双環式環であるのが好ましい。
前記のＲＩＮＤ化合物において、水相溶性化部分はＲ１
、Ｒ２、Ｒ：ｌ又はＲ４のうちの１個以上の一部である
。これは、Ｒ２の一部、又は前記のＲ１の一部であるＲ
６若しくはＦＲＡＧの一部であるのが好ましい。
本発明の代表的で、好ましいＲＩＮＤ化合物を下記の構
造式に関連して下記の第１表に挙げる：第１表における
Ｅｌ／□値は、 −　ＣＨ２Ｎ−Ｃ−ＦＲＡＧ の代わりにＨ原子を有するこの構造、すなわち、のキノ
ン核について測定した。Ｅｌ／□値（入手しうる場合）
は、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド及び燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７）を含むキノンの水溶液中で測定した。
標準としては、標準カロメル電極を使用した。ＥｌＩｔ
値は標準水素電極（ＮＨＥ）に関して補正した。Ｅｌ／
□値が入手できないときは、“ＮＡ”と示す。
以下余白 本発明の水と相溶性の還元性化合物のあるものは、前記
の欧州特許出願公開第２１Ｌ８９８号公報に記載されて
いる一般的合成操作によって製造することができる。他
のもの、例えば第１表のＲＩＮＤ化合物■〜ｖ１■及び
■は、二酸化マンガンを使用するオキサジン環の開環及
びトリフルオロ酢酸を使用するｔ−ブチルエステル基の
加水分解を含む、下記の例１〜３に示したような新規操
作によって製造される。
本発明の実施に有用な他の水相溶性ＲＩＮＤ化合物は、
適切なＥ１／２値、前記の１個以上の水相溶性化基、及
び構造式：　ＣＡＲ−＋　Ｒ’）ｎを存するものを包含
する二上記の式において、（１）ＣＡＲ−は、■、２−
ナフトキノン、１，２−５１，４−若しくは９．１０−
アントラキノン、４．４′−ジフェノキノン、アズロキ
ノン、又は１．６−（１０）−アヌレノキノンの置換又
は非置換の核であり、Ｒ１はその核のオキソ基の１個か
ら炭素原子１個だけ離れて又はペリ位でその核に結合す
る。核は、Ｒ２について記載した１個以上の電子吸引性
基で置換されているが、又はＲ３及びＲ“について記載
したように１個以上の歪のある縮合環を有していてもよ
い。Ｒ１は、前記のような 又は２の整数である。
（２）　　ＣＡＲ−は、 であり、いずれも、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４について記載し
たような１個以上の電子吸引性基で置換されていてよい
。Ｒ１は、前記のような 又は２である。
（３）　　ＣＡＲ−は、構造式： ｃ式中Ｒ７は炭素原子数１〜１２の置換又は非置換のア
ルキル基（例えばメチル基、エチル基、メトキシメチル
基、イソプロピル基又はドデシル基）を表す〕の置換又
は非置換のニトロ−ベンゼノイド核であり、Ｒ１は、前
記のような ある。これらの化合物は、米国特許第４，１３９，３７
９号明細書に記載されている成る種の化合物と類似して
いる。
これらの還元性化合物はすべて、文献に公知でであるか
又は熟練した合成化学者には容易に判る技法及び出発原
料を用いて製造することができる。
本明細書に記載する水と相溶性の還元性化合物は、適当
な緩衝剤及び場合により水と混和しうる溶剤を含む水性
組成物として製造することができる。
組成物は、下記の一般的方法で製造することができ、こ
のような製造の特別の詳細については、下記の例４に記
載する。還元性化合物をその分子量に応じた濃度で、一
般的には緩衝液１−当たり１〜ｌ１００１ｌＩ、好まし
くは５〜８０ｍｇで緩衝液に溶解する。あるいは、還元
性化合物を水と混和しうる溶剤に溶解し、次いで適当な
緩衝剤と混合することができる。
緩衝液は、一般に分析を生理学的ｐＨ（以下）に維持す
る。水性組成物中の緩衝剤の濃度は、広範に変動しうる
が、一般には０．０１〜０．１モルである。代表的緩衝
剤は、燐酸塩、硼酸塩及び他の、Ｇｏｏｄらによって釘
μ洟明Ｂ１び、５巻４６７頁（１９６６）及びＡｎａｌ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０４巻３００頁（１９８０）
に報告されたものを包含する。
本明細書に記載する水と相溶性の還元性化合物は、水性
及び非水性液体、例えば生物学的流体、製造工程液、廃
水又は食品原料の分析測定（すなわち、定性又は定量的
検出）用の組成物に有用である。化合物を還元し、検出
可能な種を放出する一つの反応又は一連の反応により種
々の被分析物を測定するこへができる。被分析物は、生
存細胞（例えば細菌、白血球、酵母又は真菌）、酵素（
例えば、オキシドレダクターゼ、例えば乳酸デヒドロゲ
ナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ又はグルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、例
えばグルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ又はα
−グリセロホスフェートオキシダーゼ、トランスフェラ
ーゼ、例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ又はア
スパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ
、例えばリパーゼ、カルボキシエステラーゼ、及びその
他のＮＡＤＨＳＦＡＤＨ又はオキシダーゼに基づく分析
）、還元性化合物を還元する生存細胞以外の生物学的又
は化学的還元剤（例えばアスコルビン酸塩、システィン
、グルタチオン又はチオレドキシン）、代謝可能な物質
（例えばグルコース、乳酸、トリグリセリド又はコレス
テロール）、免疫反応体（例えば抗原、抗体又はハプテ
ン）を包含する。
酵素レドックス反応並びにフラビンアデニンジヌクレオ
チド（ＦＡＤ−ＦＡＤＨ）を基質とする反応及びニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ−ＮＡＤＨ）
を基質とする反応及び（ＮＡＤＰ−ＮＡＤＰＨ）を基質
とする反応を監視するため、組成物を使用することがで
きる。このような場合には、ＮＡＤＨＳＦＡＤＨ又はＮ
ＡＤＰＨの代わりに検出可能な種を生じる還元性化合物
を使用することができる。
本発明は、生物学的試料中の生存細胞の検出又は定量に
特に有用である。生存細胞を含むと思われる生物学的試
料（例えば食品、組織、地下水、冷却水、医薬生成物又
は下水）を、細菌、酵母又は真菌について本発明によっ
て分析することができるが、水性液体、例えばヒト及び
動物の流体（例えば尿、脳を髄液、血液及び糞便排泄物
）及びヒト又は動物組織の懸濁液中の細菌検出に特に有
用である。本発明の実施は、尿中で（希釈又は未希釈）
尿路感染の検出に特に重要である。
還元性化合物を使用して生存細胞を測定する場合、この
ような測定中での迅速な染料放出には、生存細胞が電子
移動剤（以下、ＥＴＡと言う）と相互作用するのが好ま
しい。ＥＴＡの存在は、非生存被分析物の分析測定のた
め、一層有効な染料放出を生じる。Ｅ’、　Ｔ　Ａは、
測定する物質（例えば生存細胞）と還元性化合物との間
の媒介物として作用する移動性化合物である。あるＥＴ
Ａは、所定の生物（下記の例１１参照）を測定する際に
特に良好に作用する。
−ｉに、本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物は、ＰＡＲ
ポテンシオスタット（Ｐｏ　ｔｅｎ　ｔ　ｉｏｓ　ｔａ
　ｔ）（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　、、　−’−、：Ｌ−シャーシー州プリン
ストン）を用いて示差パルスポーラログラフイー技法を
使用して水性緩衝液（ｐＨ７）中で標準水素電極に対し
て測定して、−３２０〜＋４００ｍＶの範囲のＥ１／２
を有する。一般に、ＥＴＡの電位は、測定すべき物質（
すなわち、被分析物）の電位より正側に高く、還元性化
合物の電位より低いものであるべきである。すなわち、
ＥＴＡは、被分析物より一層容易に還元され、還元性化
合物より容易には還元されないものであるべきである。
一般に、ＥＴＡ化合物は、被分析物の濃度に依存する濃
度で、好ましくはｌＸｌ０−７モル−ｌＸｌ０−’モル
の濃度で存在する。
本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物は、フェナジンメト
スルフェート、フェナジンエトスルフェート及び当業者
に公知の類似化合物を包含する。
必要に応じて、異なるＥＴＡ化合物の組み合わせを使用
することができる。
更に、低バツクグラウンドという利点を生じる、本発明
の実施に有用な、好ましいＥＴＡ化合物は、欧州特許出
願公開筒１９０．７４０号公報に記載されているもので
ある。一般に、これらの化合物は、置換ベンゾ−及びナ
フトキノンである。この種のキノン類は、例えば２．３
−ジメチル−５−ヒドロキシメチル−１，４−ベンゾキ
ノン、２．５−ジメトキシ−１，４−ベンゾキノン、２
，３．５−トリメチル−１，４−ベンゾキノン、テトラ
メチル−１，４−ベンゾキノン、２，３−ジメトキシ−
５−メチル−１，４−ベンゾキノン、２−ヒドロキシメ
チル−１，４−ナフトキノン及び２−（２−ヒドロキシ
エチル）−１，４−ナフトキノンである。
生存細胞、及び特に微生物の検出は、しばしばこれらの
細胞に対する栄養素の存在で実施されるが、その存在は
必須ではない。有用な炭素源及び場合により窒素源を含
む任意の栄養培地を使用することができる。適切な成分
及びｐＨを有する適当な栄養培地は、文献に良く知られ
ている。特に有用な栄養素は、グルコース又はトリプト
ースの単独又は組み合わせである。
本発明は、溶液又は乾式分析に適用しうる。溶液分析に
おいては、還元性化合物、及び好ましくはＥＴＡを含む
溶液を製造し、測定すべき生存細胞又は被分析物を含む
と思われる液体試験試料と接触、混合させる。還元性化
合物と混合する前にＥＴＡを試験試料と混合することも
できる。一般に、還元性化合物を適当な容器（例えば試
験管、ペトリ皿又はキュベツト）中で試験試料と混合す
る。生じる溶液を穏和に混合し、４０℃以下の温度、一
般には２０〜４０℃の温度で比較的短時間（すなわち、
３０分以下）、保温する。次いで、検出可能な種を、例
えば、色原体種のスペクトル吸収バンドにおける波長で
、又は螢光原性種の発光バンドにおける波長で（そのバ
ンドは、還元性化合物が種を放出する前に有していたバ
ンドとは異なる）測定することによって試験試料を評価
する。このような評価は、適当な検出装置を用いて行う
ことができる。
分析前に、必要に応じて、妨害物質を除去するか又は細
胞を濃縮する前処理工程を実施することもできる。
試験試料を含む多孔性吸収性物質、例えば祇ストリップ
を還元性化合物の溶液と接触させることによって溶液分
析を実施することもできる。試験試料中の被分析物は、
多孔性物質から溶液中に移動し、測定に必要な分析反応
を開始することができる。溶液分析において、存在する
水と相溶性の還元性化合物の量は、少な（ともｏ、ｏｏ
ｔミリモル濃度、好ましくは０．０１〜１．０ミリモル
濃度である。他の試薬は、当業者によって容易に決定さ
れる量で存在することができる。
また、本発明方法を乾式分析要素を用いて乾式分析法で
実施することができる。このような要素は、還元性化合
物又はこれを含む分散液の乾燥残渣を含む吸収性担体物
質、すなわち、自立性吸収性又は吸水性物質の薄いシー
ト又はストリップ、例えば口紙又はストリップであって
よい。このような要素は、試験ストリップ、診断要素、
ディツプスティック又は診断剤として公知である。
本明細書に記載する還元性化合物を乾式分析要素に使用
する場合、これを適当な吸収性担体物質中に吸収又は含
浸によって混入させるか、又は適当な吸収性担体物質上
に塗布することができる。
また、化合物を分析中に要素に混入することができる。
有用な担体物質は不溶性であり、水又は生理学的液体、
例えば尿又は血清と接触させたときに、その構造上の一
体性を維持するものである。
有用な担体物質は、紙、多孔性粒状構造体、セルロース
、多孔性ポリマーフィルム、ガラス繊維、織布及び不織
布（合成及び非合成）等から製造することができる。こ
のような要素を作製するために有用な物質及び操作は、
例えば米国特許第３、０９２．４６５号、同第３，８０
２．８４２号、同第３，９１５，６４７号、同第３，９
１７．４５３号、同第３．９３６．３５７号、同第４．
２４８．８２９号、同第４，２５５．３８４号及び同第
４．２７０，９２０号明細書によって周知である。
乾式分析は、吸収性担体物質として少なくとも１個の多
孔性拡散帯域をその上に有する支持体を含む分析要素を
用いて特に有利に実施することができる。還元性化合物
は、拡散帯域又は異なる帯域（例えば試薬帯域、記録帯
域又は親水性帯域）に存在することができる。拡散帯域
は、任意の適当な繊維性又は非繊維性物質又はその一方
若しくは両方の混合物から製造することができる。
拡散帯域は、米国特許第４．２９２．２７２号明細書に
記載されているような、適当な結合剤と混合したか又は
布に織った繊維材料を使用して、ポリマー組成物〔例え
ばプラッシュ（ｂｒｕｓｈ）ポリマー〕又は米国特許第
３．９９２．１５８号、同第４，２５８，００１号及び
同第４，４３０，４３６号明細書及び特開昭５７（１９
８２）　−１０１７６０号公報に記載されているような
粒状物質（結合接着剤を含むか又は含まない）から製造
することができる。拡散帯域は等方性に多孔性である、
すなわち、孔度が粒子、繊維、ポリマーストランド等の
間の連続空間又は孔によって生じるように帯域のどの方
向でも同一であるのが望ましい。
本発明の乾式分析要素は、還元性化合物及び特定の用途
のため所望の他の試薬を含む単一の自立性多孔性拡散帯
域であってよいが、このような帯域は適当な支持体上に
担持されているのが好ましい。このような支持体は、任
意の適当な寸法安定性で、好ましくは非多孔性で、２０
０〜９００ｎｍの波長の電磁線を透過する透明な（輻射
線透過性）フィルム又はシート物質である。特定の要素
のため選択される支持体は意図する検出方法（反射、螢
光又は透過分光分析）と認容性であり、分析に使用する
化学試薬及び液体試料に対して不活性であるべきである
。有用な支持体物質は、ポリスチレン、ポリエステル、
ポリカーボネート及びセルロースエステルを包含する。
要素は、１個より多くの帯域、例えば試薬帯域、記録帯
域又は下塗帯域を有していてよい。帯域は、一般に、相
互に液体接触〔液体、試薬及び反応生成物が隣接帯域の
重なった領域の間を通過しうろことを意味する〕してい
る。帯域は、別々に塗布された、重ねられた層であるの
が好ましいが、一つの被覆層に２以上の帯域が存在して
もよい。前記の特許の他に、例えば米国特許第４．０４
２，３３５号及び同第４，１４４，３０６号明細書及び
米国再発行特許第３０．２６７号明細書にも、適当な要
素構造及び成分が記載されている。
本発明の要素において、水と相溶性の還元性化合物の量
は、広く変動しうるが、一般に少なくとも０．０１ｇ／
ｍ、好ましくは０．０５〜０．２　ｇ　／　ｒｄの被覆
量で存在する。必須ではないが、好ましい試薬は、一般
に下記の被覆量で存在する：ＥＴＡ　：　　　一般に少
なくとも０．００１ｇ／イ、好ましくは０．０１〜Ｉｇ
／イ、 栄養素：　　一般に少なくとも０．０５ｇ／ｒｒ？、好
ましくは０．１〜２ｇ１ｒｄ（生存細胞の検出の際にの
み使用）、 緩衝剤（ｐＨ≦９）ニ一般に少なくとも０．１　ｇ　／
　ｔｒｉ、好ましくは０．５〜２ｇ／ｍ、 １以上の帯域が種々の他の所望であるが、必須ではない
成分〔文献に公知の活性剤、結合剤（一般に親水性）又
は酸化防止剤を含む〕及び特定の被分析物の分析に必要
な任意の試薬を含んでいてよい。
本発明の一実施態様では、水性液体中の微生物（例えば
、酵母、真菌又は細菌）の検出用の要素は、前記の電子
移動剤及び還元性化合物を含む。
これらの要素は、更に、生存細胞のための栄養素及び分
析中（例えば試験液体の１〜２００μｌの試料と接触さ
せる場合）、生理学的ｐｔ＋を維持する緩衝剤を含むの
が望ましい。このような要素を、試料及び要素を適当な
方法で物理的に接触させ、細菌の存在の結果として還元
性化合物から放出された検出可能な種を適当な波長で検
出することによって、例えば尿試料（例えば妨害物質を
除去するか又は細胞を濃縮するため前処理されたもの）
中の細菌を検出するため使用することができる。
本発明の別の実施態様では、要素を水性液体中の非生存
生物学的又は化学的被分析物を測定するため使用する。
被分析物が本明細書に記載した還元性化合物を直接還元
して検出可能な種を放出し得ない場合には、分析に更に
被分析物と相互作用して還元性化合物を還元する生成物
を生成する試薬を１種以上含む相互作用組成物を使用す
る。この相互作用組成物を要素中に混入するか又は分析
時に添加することができる。このような被分析物の例は
、上に記載した。検出される検出可能な種の量を、液体
試料中に存在する被分析物の量に相関させることができ
る。
本発明の要素は、更に、他の還元剤、例えばアスコルビ
ン酸塩（アスコルビン酸及び当量のアルカリ金属塩）、
システィン、グルタチオン、チオレドキシン等を測定す
るため有用である。
本発明により、分析方法に応じて異なる種々の要素を製
造することができる。任意の所望の幅の長いテープ、シ
ート、スライド又はチップを含めて種々の形で要素を形
成することができる。
本発明の分析は、手操作で又は自動的にすることができ
る。一般に、乾式要素を使用する場合、要素を供給ロー
ル、チップ包装物又は他の供給源から採取し、試験すべ
き液体試料（例えば１〜２００μｍ）と、試料が要素中
の試薬と混合するように接触させることによって被分析
物又は生存細胞を測定する。このような接触は、任意の
適当な方法で、例えば要素を試料中に浸漬するか、又は
好ましくは適当な分配手段を用いて一滴以上の試料を手
又は機械で要素にスポットすることによって達成される
。
試料を施した後、要素をコンディショニング、例えばイ
ンキュベーション、加熱等、任意の試験結果を得るのを
促進又は容易にするのに望ましい処理に付す。
被分析物又は生存細胞の検出は、水と相溶性の還元性化
合物が還元されて適当な方法で検出しうる種を放出する
場合に達成される。前記のように、検出可能な種は標準
比色又は螢光測定装置を検出操作を用いて検出されうる
、比色測定染料又は螢光染料であるのが好ましい。検出
可能な種が色原体又は螢光原性物質以外のもの、例えば
化学発光性基又は燐光性基である場合には、適当な化学
発光又は燐光検出装置を使用することができる。検出可
能な種の最大波長又は最大波長以外の波長で分光測定す
ることができる。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、　ＡＴＣ
Ｃ２５９２２）及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　、ＡＴＣＣ２５９２３）
細胞をそれぞれＢＨＩ培地中で３７℃で振盪せずに一夜
増殖させ、毎日移植した。４０ｄの細胞を遠心分離によ
って回収し、０．０５モルのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７
，８）　　１０　ｍｌ中に再懸濁した。６２０ｎｍで測
定した吸収をそれぞれ０．５及び１．０に調節した。０
．８３３　（６２０ｎｍ）の吸収は５Ｘ１０’細胞／−
に等しいことが判った。カンジダ・アルビカンス（Ｃａ
ｎｄｉｄａ　　ａｌｂｉｃａｎｓ、　ＡＴＣＣ１４０５
３）細胞をＳＡＢ肉汁中で攪拌しながら２５℃で一夜増
殖させ、遠心分離により回収し、洗浄し、ＨＥＰＥＳ緩
衝液中に再懸濁した。細胞懸濁液を１．０の光学濃度に
調節した。
記載した還元性化合物の製造において、中間体の同定及
び純度は、標準パー、キン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ）　１３７分光光度計で測定して赤外線（Ｉ
Ｒ）スペクトル〔構造に関する情報を生じるシャープ（
Ｓ）バンド又はブロード（ｂ）バンドをｃｍ−’単位で
示す〕、標準パーキン−エルマーＮＭＲ分光光度計で測
定した核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル〔化学シフトを
ブロード（ｂ）、−事項（Ｓ）、多重型（ｍ）又はブロ
ード−事項（ｂＳ）ピークでテトラメチルシランに対し
てｐｐｍ　ｉｌ−位のδ値で示す〕又はパリアン・マッ
ト（ＶａｒｉａｎＭＡＴ）７３１分光光度計で測定した
電場脱着質量分析（ＦＤＭＳ）によって測定した。最終
生成物の同定及び純度は、Ｉ　Ｒ，ＮＭＲ分光分析、Ｆ
ＤＭＳ及び元素分析によって測定した。
〔実施例〕
下記の実施例は本発明の詳細な説明するため示すもので
ある。同定されたＲＩＮＤ化合物は、上記の第１表に含
まれる還元性化合物である。
皿上：　　ＲＩＮＤ　　入　■の−１１′告前記の第１
表のＲＩＮＤ化合物ｒを製造するための中間体Ａ°〜Ｆ
°は、前記の欧州特許出願公開第２１１，８９８号公報
の例１の工程１〜６の操作により、出発原料として工程
１においてｐ−ニトロアニリンの代わりにｐ−シアノア
ニリンを使用して製造した。
工程６からのカルバモイルクロリドを下記の操作によっ
て中間体Ｇ′に変えた：カルバモイルクロリド（１５，
８ｇ、４０ミリモル）をピリジン（１５０ｍｆ）中のむ
−ブチル−５−ヒドロキシ−２−ニトロベンゾエート　
（８ｇ、３３ミリモル）及びＮ、　Ｎ−ジメチルアミノ
ピリジン（触媒量）の溶液に添加し、生じる混合物を暗
所で窒素雰囲気下に１８時間攪拌した。次いで、反応混
合物を希塩酸／氷水（２１）中に注ぎ、沈殿した黄色固
体を口過によって単離し、水で洗浄し、風乾した。
カラムクロマトグラフィー（シリカ、９７：３のジクロ
ロメタン：エーテル）により１９ｇ（収率９６％）の中
間体Ｇ°が黄色泡状体として得られた。分析により構造
を確認した：　　ＩＲ（ＫＢｒ）（ｎ　−’、２２５０
　（ｗ、　ＣＮ）、１７２５　（ｂ　Ｓ、−ＣＯ−）、
１６５０（ｓ、キノン）　、Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤＣｈ）δ
、１．２〜２．０（ｍ、双環式Ｈ）、１．５（ｓ、ｔ−
ブチル）、２．８〜３．０　（ｄ、ＮＣＨｚ）、３．２
５〜３．５（ｂｄ。
ＣＨ２−Ｎ）　、４．３〜４．５５（ｂｄ、橋頭）、７
、１５〜８．０　（ｍＳＡｒＨ）ｎ 次に、中間体Ｇ′を下記の操作によりＲＩＮＤ化合物Ｉ
に変えた。ジクロロメタン（２００ｄ）中の中間体Ｇ’
　　（１９ｇ、３１．８ミリモル）及びトリフルオロ酢
酸（７５ｄ）の溶液を暗所で窒素雰囲気下に２．２５時
間攪拌した。反応混合物を氷水中に注ぎ、層を分離させ
た。有機層を冷水で洗浄し、乾燥しく硫酸ナトリウム）
、溶剤を除去して黄色泡状体を得た。この物質を９５：
５のジクロロメタン：エーテルを用いてシリカを通して
口過して１０ｇ（収率５８％）のＲＩＮＤ化合物Ｉを得
た。Ｉ　Ｒ（ＫＢｒ）　ｃｔｍ−’、２２５０　（ｗ、
　ＣＮ）、１７３０　（ｂ　ｓ、　−Ｃｏ　　）　、１
６５０　（ｓ、キノン）、ＮＭＲ（ＣＤＣＩ、Ｉ）δ、
１．２〜２．０　（ｍ、双環式のＨ）、２．７〜３．１
　　（ｄ、ＮＣＨｚ）、３．３５〜３．３６　（ｍ、橋
頭Ｈ）　、４．３〜４．５５　（ｄ、ＣＨｚ　　Ｎ）　
、６．９〜８．０　（ｍ、ＡｒＨ）、元素分析もその構
造を確認した。
廿ＬＬ：　　　ＲＴＮＤ　　ヒ人　　ｖの　１１゛告前
記の第１表のＲＴＮＤ化合物Ｖを製造するための中間体
Ａ“〜Ｄ°は、前記の欧州特許出願公開第２１１．８９
８号公報の例１の工程１〜４の操作により、出発原料と
して工程１においてｐ−ニトロアニリンの代わりに４−
アミノ−ｔ−ブチルベンゾエートを使用して製造した。
中間体Ｄ°を下記の新規操作により中間体Ｅ。
に変えた。ジクロロメタン（１１）中の中間体Ｄ’　　
（２０ｇ、４７．４ミリモル）及び活性化した二酸化マ
ンガン（４０ｇ、４７４ミリモル）の懸濁液を２５で１
時間攪拌した。混合物をセライトパッドを通して口過し
、０液を減圧下に濃縮して所望のアミン中間体１９ｇを
得た。ＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）δ、１．１〜１．９（ｍ、
双環式環Ｈ）、１．６（ｓ、ｔ−ブチル）　、１．８５
　（ｓ、ＣＨｚＣＮ）、３．１〜３．４５（ｍ、橋頭及
びＣＨｚＮ）　、７．１及び８．１　　　（ＡＡ’ＸＸ
’、　　Ｊ＝９　　ｃｐｓ、　八ｒＨ）　　。
中間体Ｅ’を前記欧州特許出願公開第２１１，８９８号
公報の例１の工程６の操作により中間体Ｆ°に変えた。
中間体Ｆ“を同し文献の例２１の工程Ｇの操作により中
間体Ｇ′に変えた。
中間体Ｇ“を暗所で実施する下記の操作を用いてＲＩＮ
Ｄ化合物化合物比た。二塩化メチレン（１３０）ｍｆｆ
ｉ中の中間体Ｇ’（９，１ｇ、１４．４ミリモル）及び
トリフルオロ酢酸（４０Ｗｆ）の溶液を窒素下に２．５
時間攪拌した。溶剤を減圧下に除去し、残渣を最少量の
アセトンに溶解させた。アセトン溶液を氷水（４００ｍ
Ｎ）中の塩酸の希薄溶液に徐々に添加し、生じる半固体
を口過によって集め、水で洗浄し、風乾した。物質を酢
酸エチルから再結晶させると、６．３ｇのＲＩＮＤ化合
物化合物比固体として得られた。ＩＲ（ＫＢｒ）　ｃｍ
−’、１７３０　（ｂ　ｓ、　−ＣＯ−）　、１６５０
　（ｓ　、キノン−ＣＯ−）　、ＮＭＲ（ＣＤＣＩ：ｔ
）δ、１．１〜２．０　（ｍ。
双環式Ｈ）　、２．９　（ｄ、１２ｐｐｍ　、ＣＨｓＮ
）、３．３５（ｄ、９ｐｐ…、橋頭Ｈ）　、４．５　（
ｄ、１６ｐｐｍ　、　−ＣＨＩＮ）　、６．４５〜８．
６　（ｍ、フェナレノン及びＡｒ−Ｃ００Ｈ）ｎ 元素分析：　（、＋５Ｈｚ７Ｎ　Ｏｖとして、ＣＨＮ 計算値　　　７３．３　　　４．７　　　　２．４実測
値　　　７３．２　　　５．１　　　　２．２圀り別；
　　ＲＩＮＤ　ｌ１ｌＪ今　　■の、′１゛告キノン核
は、前記欧州特許出願公開第２１１，８９８号公報の例
１の工程１〜３の操作により、ｐ−ニトロアニリンの代
わりにｐ−シアノアニリンを使用して製造した、対応す
るヒドロキノンの標準酸化によって製造した。
このキノン（５，２ｇ、１８ミリモル）を臭化水素酸（
酢酸中３０％、４８ｍ）、３７％ホルマリン（１８ｄ）
及び酢酸（１４０ｄ）の混合物に添加し、生じる溶液を
５５℃で１８時間加熱した。
冷却後、反応混合物を氷水（５００ｄ）中に注ぎ、沈殿
した黄色固体を集め、エタノールから再結晶すると、融
点２０１〜２０２℃のブロモメチル中間体２．４ｇが得
られる。ＮＭＲスペクトルにより構造を確認した。
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（３６０−）中のブロモ
メチル中間体（９，２ｇ、２４ミリモル）、ｐ−アミノ
−ｔ−ブチルヘンシェード（９，２５ｇ。
４８ミリモル）及び炭酸銀（Ｉ）（６，６ｇ、２４ミリ
モル）の混合物を暗所で窒素雰囲気下に３６時間攪拌し
た。生じる混合物を希塩酸／氷水（１５００ｍｆ）中に
注ぎ、沈殿した褐色固体を口過によって集め、水で洗浄
し、デシケータ−中で減圧下に乾燥した。クロマトグラ
フィー（シリカ、７０：３０のリグロイン：酢酸エチル
）により、所望のアミン中間体を７ｇの収量で得た。質
量分析、核磁気共鳴及び赤外線分光分析で構造を［認し
た。
アミン中間体を前記の欧州特許出願公開第２１１．８９
８号公報の例１の工程６に記載の操作により対応するカ
ルバモイルクロリドに変えた。
ピリジン（７５ｍｊり中のカルバモイルクロリド（７ｇ
、１２．６ミリモル）、６−ヒドロキシフェナレノン（
２，０５ｇ、１０．４ミリモル）及びＮ。
Ｎ−ジメチルアミノピリジン（触媒量）の混合物を暗所
で窒素雰囲気下に１８時間攪拌した。混合物を希塩酸／
氷水中に注ぎ、沈殿した固体を口過によって集め、水で
洗浄し、暗所で風乾した。クロマトグラフィー（シリカ
、９８：２のジクロロメタン：アセトン）により、所望
の中間体５ｇを得た。エーテルから再結晶して淡黄色固
体を得ることによって分析用試料を作った。ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣ１，）δ、１．２〜２．０（ｍ、双環式環の−ＣＨ
ｚＣＨｚ−）　、１．６　　（ｓ、ｔ−ブチル）、３．
２１〜３．５９　（ｍ、橋頭Ｈ）　、４．９　（ｓ、−
ＣＨ２Ｎ−）　、６．６〜６．７５（ｄ、染料Ｈ）、７
．１〜８．２（ｍ、染料及びアリールＨ）、８．６〜８
．７（ｄ、染料Ｈ）　６　　Ｉ　Ｒ（ＫＢｒ）　ａｍ−
’、２２４０（ｓ、ＣＮ）　　、１７２０　　（ｂ、Ｃ
＝Ｏ）　　、１６４０　　（ｓ。
キノン）ｎ ジクロロメタン（２５ｄ）中のｔ−ブチルカルボキシフ
ェニル中間体（２ｇ、２．８ミリモル）及びトリフルオ
ロ酢酸（１０艷）の溶液を暗所で窒素雰囲気下に２時間
攪拌した。反応溶液を暗所で濃縮して溶剤を除去し、残
渣をテトラヒドロフランに溶解し、溶液を希塩酸／氷水
中に注いだ。沈殿した固体を口過によって集め、水で洗
浄し、暗所で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（シ
リカ、８９．５ジクロロメタン、１０アセトン、０．５
酢酸）により、前記の第１表のＲＩＮＤ化合物■１．４
ｇが黄色固体として得られた。ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ　−
’、２２５０　（ｗ、　ＣＮ）　、１７２０　（ｂ　５
ＳＣ＝Ｏ）、１６４５（ｓ、キノン）　、ＮＭＲ（ＣＤ
ＣＩｉ）δ、１．１５〜２．０（ｍ、双環式Ｈ）　、３
．２〜３．５　（ｄ、橋頭Ｈ）　、４．９５　（Ｓ、Ｃ
Ｈ２Ｎ）　、６．６〜８．７（ｍ、ＡｒＨ）ｎ元素分析
でも構造を確認した。
皿上：　水性維戊生夏製造 本発明の組成物を下記のようにして製造した：適切なＲ
ＩＮＤ化合物を、濃硫酸０．１％を添加して酸性にした
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２５０１ｎ１
中に溶解させ、生じた溶液を２５ｍ１の０．０５モル燐
酸カリウム緩衝液又は０．０５モルＨＥＰＥＳ緩衝液（
ｐＨ７，８）に添加した。
この例は、表面活性剤を含まない組成物を用いる本発明
の分析と、表面活性剤を含む組成物を用いた欧州特許出
願公開第２１Ｌ８９８号公報に記載の分析との比較に、
本発明の２種の水と相溶性のＲＴＮＤ化合物（前記の第
１表の■及びＸ）を使用する。
大腸菌細胞をＢＨｒ培地中で３７℃で振盪せずに一夜増
殖させた。４９ｍ１．の細胞を遠心分離によって回収し
た。生じるペレットを燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５
、μ＝０．０５）２５−中に再懸濁させ、生じた懸濁液
を遠心分離した。ペレットを洗浄し、緩衝液２５ＩＩＩ
ｌ中に再懸濁させ、既知量の懸濁液を同じ緩衝液を用い
て希釈して、６２０ｒｖで０、１の吸収を得た。
Ａ、下記の溶液から本発明の組成物を製造した：フェナ
ジンメトスルフェート（ＰＭＳ）又は２−ヒドロキシメ
チル−５，６−シメチルー１．　４−ベンゾキノン（Ｈ
ＤＭＢＱ）　　（メタノール中９．８ＸＩＯ弓モル）、
ＲＩＮＤ化合物■又はＸ（Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドＤＭＦ中１．７×１０４モル）及びグルコース溶液（
水中１０％）ｎ路長１ｃｍのキュベツト（容ｆｔ　４　
ｘｎｌ　）に細胞懸濁液０．１ｄ（最終濃度６Ｘ１０−
７細胞／ｌ１１）、燐酸塩緩衝液３．０−、グルコース
溶液５０μｌ（最終濃度８．８　Ｘ　１０−”Ｅ　）Ｌ
ｔ’４％度）及びＰＭＳ又はＨＤＭＢＱ２５μｌ（最終
濃度７．７　ｘ　１０−５モ／Ｌ／濃度）を充填した。
キュベツトを蒸発を防止するため融封し、３７℃で熱で
平衡にした。ＲＩＮＤ化合物■又はＸ１４ｄ（最終濃度
７．６Ｘ１０−’モル濃度）の添加により反応を開始さ
せた。細胞を用いないで対照溶液を製造した。
Ｂ、　　ｌ−リドン（ＴＲＩＴＯＮ）　Ｘ　−１００表
面活性剤を使用する従来技術の組成物を下記の溶液から
製造した：　　（１）ＰＭＳ又はＨＤＭＢＱ　（メタノ
ール中９．８Ｘ１０−”モル濃度）、（２）ＲＩＮＤ化
合物Ｉ又はＸ　（ＤＭＦ中７．ｌＸ１０−”モル濃度）
、（３）５０μβの溶液２＋１００μｌのトリトンＸ−
１００表面活性剤＋５ｒＲ１の燐酸塩緩衝液、（４）グ
ルコース溶液（水中１０％）及び（５）燐酸塩緩衝液中
の６Ｘ１０９細胞／−０路長ｌｅａのキュベツトに１８
８−の溶液３　（最終ＲＩＮＤ濃度７．６Ｘ１０−’モ
ル濃度）、６μβの溶液４（最終グルコース濃度８．８
Ｘ１０−’モル濃度）及び１２．５μｌの溶液５（最終
細胞濃度６ＸＩＯ−’細胞／ｍｌ）を充填した。キュベ
ツトにカバーをし、３７℃で熱で平衡にした。次に、３
μｌの溶液１　（最終ＥＴＡ濃度？、７Ｘ１０−’モル
濃度）の添加によって反応を開始させた。細胞を用いな
いで対照溶液を製造した。
４０２ｒ＋＋ｓで染料の外観を監視することによって反
応を追跡する。下記の第■表に示す結果は、３又は４回
の測定の平均値であり、本発明の組成物からの細胞応答
の増加を示す。
Ｉ　　　　　ＰＭＳ　　　　　６０　　　　１．３〃　
（対照）〃４９　　　　０．７ 〃　　　ＨＤＭＢＱ　　　　５３　　　　０．８〃（対
照）〃３１　　　　０．Ｉ Ｘ　　　　　ＰＭＳ　　　　　８３　　　　１．２〃（
対照）〃５６　　　　１．１ 〃　　　ＨＤＭＢＱ　　　　８６　　　　１．４〃　（
対照）〃６５　　　　０．７ 分析をミリリッターＨＡ９６ウエル・フィルトレイジョ
ン・プレート　（Ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ　ＩＩＡ　９６
Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｐｌａｔｅ）中で実施した。励
起５１０ｎｍ及び発光６２０ｎｍで読み取るように変形
したダイナチック・マイクロフロール・リーダー　（Ｄ
ｙｎａ　ｔｅｃｈＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ　Ｒｅａｄｅｒ
）を使用した螢光を測定した。
対照組成物を下記のようにして製造した。ＲＩＮＤ溶液
（対照ＲＩＮＤ化合物Ｌ６ｍし／ｍｌ酸性化ＤＭＦ）２
５０μｆ、ＭＪＩ−：／Ｘ−１００表面活性剤溶液５０
０μ／、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，８）２５ｄ、トリ
メチル−１，４−ベンゾキノン（ＴＭＢＱ）　　（１，
５ｍｇ／ｍｌメタノール＞５００μｌ、及びグルコース
溶液（水中１０％溶液）５００μ１０対照ＲＩＮＤ化合
物は、カルボキシ基の代わりにシアノ基を有する以外は
、第１表の化合物Ｖと同様であった。
本発明の組成物を下記のようにして製造した。
ＲＩ　ＮＤ　　Ｖ　（１６ｍｇ／ｍｌ酸性化ＤＭＦ）２
５０ｐＨ，ＨＥＰＥＳ緩衝液２５ｐｔ！、ＴＭＢＱ（１
，５ｍｇ　／　ｍｌメタノール）５ｏｏμｌ及びグルコ
ース溶液（水中１０％溶液）５００＋１゜ウェルに黄色
ブドウ球菌細胞懸濁液（最終濃度ｌＸｌ０−’細胞／ｄ
）１５０μｌを添加し、プレートを３７℃に加温し、対
照組成物及び試験組成物１５０μｌを添加することによ
って分析を二重に実施した。細胞を含まないブランク溶
液を製造した。次いで、ゼロ時及び３７℃で３０分培養
後に螢光を測定した。データを下記の第■表に示す。
これらのデータは、本発明が表面活性剤の不存在で染料
の放出を増加することを示す。
対照　’　　　　　　１５５　　　　　２７８７試験　
　　　　　１３３　　　　　＞４０００この例は、２種
の水と相溶性のＲＩＮＤ化合物及び４種の電子移動剤を
使用して本発明の組成物における細胞応答の増大を示す
。
使用したＲＩＮＤ化合物は、前記の第１表からの■及び
ＸＩであった。使用したＥＴＡは、ＥＴＡＩ、すなわち
テトラメチル−１，４−ベンゾキノン、ＥＴＡ２、すな
わち２，３．５−）ジメチル−１，４−ベンゾキノン、
ＥＴＡ３、すなわち２．３−ジメトキシ−５−メチル−
１，４−ベンゾキノン、ＥＴＡ４、すなわち２−ヒドロ
キシメチル−１，４−ナフトキノンであった。
微量滴定プレート中でそれぞれの水と相溶性のＲＩＮＤ
化合物及びそれぞれのＥ、Ｔ　Ａから溶液を製造した。
対照溶液（トリトンＸ−１００表面活性剤を含む）は下
記のものを含んでいる：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，８
）　９．３　ｙｄ、ＲＩＮＤ化合物（酸性化ＤＭＦ中の
最終濃度７．６Ｘ１０−’モル濃度）０．１μｌ、トリ
トンＸ−１００表面活性剤０．２μ１１１０％グルコー
ス溶液０．２μＮ、ＥＴＡ（メタノール中の最終濃度３
．８５Ｘ１０−Ｓモル濃度）０．２μｌ及び大腸菌細胞
（最終濃度１０７細胞／ｄＨＥＰＥｓ緩衝液）ｎトリト
ンＸ−１００表面活性剤が存在しない以外は同じ成分か
ら試験溶液を製造した。バックグラウンドを測定するた
め、細胞以外の全成分を含むブランク溶液を製造した。
次いで、ゼロ時及び３７℃で３０分培養後に螢光を測定
した。データを下記の第■表に示す。これらのデータは
、すべての試験で表面活性剤の不存在でより多くの染料
が放出されることを示す。
（以下余白） ｆｉｉ：　　１ｍＡｌ蛎寡わ１土掘 この例は、溶液分析で白血球を測定するための本発明の
使用を示す。また、これを前記の欧州特許出願公開第２
１１．８９８号公報の組成物を用いて実施した同様の分
析と比較する。
本発明の組成物を例７に記載したようにして製造した。
対照Ａ組成物は、例７の対照組成物と同様にして製造し
、対照Ｂは使用したＲＩＮＤ化合物が本発明の水と相溶
性の化合物（ＲＩＮＤＶ）である以外は対照Ａと同一で
あった。対照Ａ及びＢは、表面活性剤を含んでいた。
酸性クエン酸デキストロースｌ、５ｍｊ！を含む標準採
血管中に血液試料（８，５ｍりを集めた。管１個当たり
１．５〜２−の量でそれぞれに６％デキストラン溶液を
添加し、管内容物を倒立によって混合し、１．５時間静
置した。各管からの血漿層を１５ｍ１の滅菌遠心分離管
に移し、８．９ｇ／ｊ！のＮａＣ１を含む０．５モル燐
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）を添加した。次いで、
管及びその内容物を１０分間、１０００ｒｐｎ＋で遠心
分離し、上澄液をデカントした。生じた細胞ベレットを
細胞溶解溶液（ＩＩ！当たり塩化アンモニウム８．３ｇ
、炭酸ナトリウム１ｇ及びエチレンジアミン四酢酸ナト
リウム０．０３ｇ）１（ｌＷＩｌ中に再懸濁し、次いで
、管を５分間放置して溶液を澄明にした。管内容吻を再
び１０分間、１１０００ｒｐで遠心分離し、上澄液をデ
カントした。生じたベレットを再び、燐酸塩緩衝食塩水
中に再懸濁し、遠心分離し、上澄液をデカントし、ベレ
ットを０．５−の燐酸塩緩衝食塩水中に再懸濁した。
３０−の孔を有する市販のコールタ−・カウンター（Ｃ
ｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｒ＋Ｌｅｒ）装置を使用して、白
血球を調整後に標準的操作で数えた。数を一致させるた
め補正した。評価前に細胞を一夜凍結させ、次いで使用
前に燐酸塩緩衝食塩水中に２５倍に希釈した。
マイクロリットルプレートウェルに希釈した白血球懸濁
液（２，ｌＸ１０’細胞／　ｍｌで１５０μｌ、ＲＴＮ
Ｄ化合物組成物（１５０１り、Ｉ−リメチルベンゾキノ
ンＥＴＡ　（１，５ｍｇ／ｍｌメタノール溶液２５μｌ
）及びグルコース（１０％ｗ　／　ｖ溶液２５μｌ）を
添加した。プレートを３７℃で静置し、放出された染料
をキセノンアーク灯源を装着した市販の螢光計を使用し
て螢光（発光６２０ｎｍ、励起５４０ｎｍ）を測定する
ことにより評価した。
各試験を３回繰り返した。
下記の第７表に示した分析結果は、白血球が表面活性剤
を欠いた組成物中に水と相溶性のＲＩＮＤ化合物を使用
した場合だけ検出できることを示す。
対照Ａ　　　　　　　−２２ 対照Ｂ　　　　　　　　−８ 例９　　　　　　　５２ この例は、前記の第１表のＲＩＮＤ化合物■を含む乾式
要素を使用して、２種の細菌、すなわち大腸菌及び黄色
ブドウ球菌並びに酵母、すなわちカンジダ・アルビカン
スの測定を示す。
ファツトマン（１４１１ａｔｍａｎ）の３鶴のクロマト
グラフィーペーパーのストリップを下記の溶液中に浸漬
した：メタノール７−１ＲＩＮＤ溶液（ＲＩ　ＮＤＶＩ
、０．１％硫酸を含むＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中
０．０２８モル濃度）１１ｎ１、ＥＴＡ溶液（２，３−
ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン、０．
０１モル濃度メタノール）１−及びグルコース溶液（水
中１０％溶液）１−０次いで、ストリップを暗所で２５
℃で１時間乾燥させた。
標準紙パンチを使用して乾燥したストリップからディス
ク〔直径約１／４インチ（０，６ＣＪ））を切断し、デ
ィスクをコーニング・セル・ウエルス（Ｃｏｒｎｉｎｇ
　Ｃｅ１ｌ　Ｗｅｌｔｓ　、商標）に入れた。
対照（緩衝剤だけを含む）及び試験細胞懸濁液（大腸菌
、〜５Ｘ１０’細胞／−１黄色ブドウ球菌、〜５Ｘ１０
ａ細胞／ｄ及びカンジダ・アルビカンス、〜５×１０６
細胞／　ｗｒｌ　）の試料ＬＯｐｌのスポットをペーパ
ーストリップ上に落とし、ゼロ時及びグイナテソク・マ
イクロフロール・リーダーを使用して３７℃で３０分培
養後に螢光（励起５４０ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を測定
した。結果を３０分後の相対類光度の変化として下記の
第■表に示す。２回の読みの平均値を挙げる。本発明を
乾式要素を用いて微生物を測定するため使用しうろこと
は明らかである。
対照　　　　　　　　　　　　２７８ 大腸菌　　　　　　　　　２６８９ 黄色ブドウ球菌　　　　　２５７０ カンジダ・アルビカンス　２０５４ この例は、数種の微生物を測定するための本発明の還元
性化合物（前記の第１表のＲＴＮＤＩ）の使用を説明す
るものである。すべての細胞を前記のように、振盪せず
に３７℃で増殖させたが、ミクロコツカス・ルテウス（
Ｍ　１ｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）及び枯草菌（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）は３０℃で増
殖させ、緑膿Ｗ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ赳且［ＬＬ
９ユ）は振盪せずに増殖させた。
前記の例５及び６に記載したように分析を実施した。２
種の異なるＥ　Ｔ　Ａ　、　Ｐ　Ｍ　Ｓ及びＨＤＭＢＱ
（両方とも前記の例５及び６に記載した）を使用した。
得られた結果を下記の第■表に示す。
（以下余白） ′　え。
ミクロコツカス・ルテウス（Ｍ　１ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｌｕｔｅｕｓ、　ＡＴＣＣ４６９８） プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌ　ａ
ｒｉｓＡＴＣＣ１３３１５ 緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓ
ａＳＡＴＣＣセレイシア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ１１１ａｒＣｅＳＣｅｎＳ％＾ＴＣＣ８１００）
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａ　ｈ　Ｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕ
ｒｅｕｓ八ＴＣＣへ２５９２３） ストレプトコッカス・フエカーリス （Ｓｔｒｅ吐匹匹９ｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ、　ＡＴＣＣ
３３１８６）サルモネラ・チフイムリウム（Ｓａ１ｍｏ
ｎｅｌｌａ勺１垣！証１リエ、ＡＴＣＣ１４０２８）肺
炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｎ＋ｏｎｉａ
ｅ　、、ＡＴＣＣ茅−昌し一表 最終濃度　　　　　　　　　　　１０分後に放出」風１
ｉＭ剪）　　　　　ＥＴＡ　　　　嘉ム亙染且Ｘ−１，
７Ｘ１０’　　　ＨＤＭＢＱ　　　　　９９ＰＭＳ　　
　　　　　　　７９ １．５Ｘ１０７　　ＨＤＭＢＱ　　　　　６２ＰＭＳ　
　　　　　　　　５　９ ９．８　Ｘ　１０’　　　）（ＤＭＢＱ　　　　　６８
？ＭＳ　　　　　　　　　６７ ３．５　Ｘ　Ｉ　Ｏ７ＨＤＭＢＱ　　　　　６８？ＭＳ
　　　　　　　　　　　３ ２．２ＸＩＯ’　　　ＨＤＭＢＱ　　　　　１２ＰＭＳ
　　　　　　　　　２　１ ？、６Ｘ１０７　　ＨＤＭＢＱ　　　　　６１ＰＭＳ　
　　　　　　　　５０ ＩＸＩＯ’　　　ＨＤＭＢＱ　　　　　４１ＰＭＳ　　
　　　　　　　２０ １．４Ｘ１０ＩＩ　　ＨＤＭＢＱ　　　　　４１ＰＭＳ
　　　　　　　　　５４ ９．８Ｘ１０７　　ＨＤＭＢＱ　　　　　３７ＰＭＳ　
　　　　　　　　５９ 〔発明の効果〕 本発明は、生理学的ｐＨ（すなわち９以下）体中の被分
析物、例えば酵素、代謝産物又番ｊ細胞（例えば細菌、
酵母、真菌又は白血球）速かつ高度に定量的に測定する
際に還元性什を使用する手段を提供する。これらの還元
ｆＩ物は、表面活性剤を使用することなく被覆旭又は溶
液分析組成物中に溶解することができ従って、表面活性
剤の使用に伴って遭遇する点（細胞に対する不利な影響
）は回避されるに、表面活性剤の不存在で分析の感度が
改善ることが以外にも判明した。本発明は、更に出可能
な種に変えることのできる化学的又は学的に有用な基を
放出する手段を提供する。
らの利点は、還元性化合物に水と相溶性にすを組み入れ
ることによって達成された。
以下余「

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、構造式： ＣＡＲ−（Ｒ＾１）＿ｎ 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換の芳香族又はキノン核
    を表し、Ｒ＾１は移動可能で、検出可能な種を含む部分
    を表し、ｎは１又は２を表す〕を有し、９以下のｐＨで
    還元されて移動可能で、検出可能な種を放出することが
    でき、水と相溶性にする部分を少なくとも１個含み、更
    に、Ｒ＾１がＨで置換されている場合には、 ＣＡＲ−（Ｈ）＿ｎ が水中で測定して少なくとも＋１００ｍＶのＥ＿１＿／
    ＿２を有するものである水と相溶性の還元性化合物。 ２、９以下のｐＨで緩衝され、構造式： ＣＡＲ−（Ｒ＾１）＿ｎ 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換の芳香族又はキノン核
    を表し、Ｒ＾１は移動可能で、検出可能な種を含む部分
    を表し、ｎは１又は２を表す〕を有し、９以下のｐＨで
    還元されて移動可能で、検出可能な種を放出することが
    でき、水と相溶性にする部分を少なくとも１個含み、更
    に、Ｒ＾１がＨで置換されている場合には、 ＣＡＲ−（Ｈ）＿ｎ が水中で測定して少なくとも＋１００ｍＶのＥ＿１＿／
    ＿２を有するものである水と相溶性の還元性化合物を含
    む組成物。 ３、構造式： ＣＡＲ−（Ｒ＾１）＿ｎ 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換の芳香族又はキノン核
    を表し、Ｒ＾１は移動可能で、検出可能な種を含む部分
    を表し、ｎは１又は２を表す〕を有し、９以下のｐＨで
    還元されて移動可能で、検出可能な種を放出することが
    でき、水と相溶性にする部分を少なくとも１個含み、更
    に、Ｒ＾１がＨで置換されている場合には、 ＣＡＲ−（Ｈ）＿ｎ が水中で測定して少なくとも＋１００ｍＶのＥ＿１＿／
    ＿２を有するものである水と相溶性の還元性化合物を含
    む、被分析物の測定用の乾式分析要素。 ４、Ａ、被分析物を含むと思われる液体試料を構造式： ＣＡＲ−（Ｒ＾１）＿ｎ 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換の芳香族又はキノン核
    を表し、Ｒ＾１は移動可能で、検出可能な種を含む部分
    を表し、ｎは１又は２を表す〕を有し、９以下のｐＨで
    還元されて移動可能で、検出可能な種を放出することが
    でき、水と相溶性にする部分を少なくとも１個含み、更
    に、Ｒ＾１がＨで置換されている場合には、 ＣＡＲ−（Ｈ）＿ｎ が水中で測定して少なくとも＋１００ｍＶのＥ＿１＿／
    ＿２を有するものである水と相溶性の還元性化合物と接
    触させ、そして Ｂ、被分析物の存在の結果として放出された検出可能な
    種を検出する 工程を含む被分析物の測定方法。 ５、ｐＨ９以下で構造式： ＣＡＲ−（Ｒ＾１）＿ｎ 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換の芳香族又はキノン核
    を表し、Ｒ＾１は化学的又は生物学的に有用な部分を含
    む部分を表し、ｎは１又は２を表す〕を有し、前記ｐＨ
    で還元されて化学的又は生物学的に有用な部分を放出す
    ることができ、水と相溶性にする部分を少なくとも１個
    含み、更に、Ｒ＾１がＨで置換されている場合には、 ＣＡＲ−（Ｈ）＿ｎ が水中で測定して少なくとも＋１００ｍＶのＥ＿１＿／
    ＿２を有するものである水と相溶性の還元性化合物を還
    元することを含む、化学的又は生物学的に有用な部分を
    生成する方法。
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