JPS6229975A - 粗ｔＰＡの精製法 - Google Patents
粗ｔＰＡの精製法Info
- Publication number
- JPS6229975A JPS6229975A JP60168601A JP16860185A JPS6229975A JP S6229975 A JPS6229975 A JP S6229975A JP 60168601 A JP60168601 A JP 60168601A JP 16860185 A JP16860185 A JP 16860185A JP S6229975 A JPS6229975 A JP S6229975A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tpa
- inhibitor
- affinity reagent
- erythrina
- column
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は５組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔＰ
Ａ）の精製法に関する。
Ａ）の精製法に関する。
さらに詳しくは、粗製のｔＰＡを特定のｔＰＡ 阻害剤
を用いて、 ｔＰＡを分離精製して得る方法に関する
。
を用いて、 ｔＰＡを分離精製して得る方法に関する
。
組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔＰＡ、）とは
、高等動物の組織で産生されるものであって、フィブリ
ンに特有な分解酵素であるプラスミンの前駆物質である
プラスミノーゲンを賦活化させる一種の蛋白質であり、
ウロキナーゼと多くの点で類似し文具なっている物質で
ある。そしてこのものは血栓溶解剤としての用途が大き
く見込まれるのでその製造方法に関して現今各所で研究
が進められている。
、高等動物の組織で産生されるものであって、フィブリ
ンに特有な分解酵素であるプラスミンの前駆物質である
プラスミノーゲンを賦活化させる一種の蛋白質であり、
ウロキナーゼと多くの点で類似し文具なっている物質で
ある。そしてこのものは血栓溶解剤としての用途が大き
く見込まれるのでその製造方法に関して現今各所で研究
が進められている。
ｔＰＡを得る方法としては腎細胞培養物から分離して取
得することが嘗て行われていたが大量の取得には適して
いないので、今日では更に大量に分泌する特定の細胞を
培養し分離する研究が行われている。
得することが嘗て行われていたが大量の取得には適して
いないので、今日では更に大量に分泌する特定の細胞を
培養し分離する研究が行われている。
本発明もその流れの一環として行われたものであって、
牛胎児血清添加培養に基（特定の挟雑物を特定のｔＰＡ
阻害剤を用いることによって除去することを要点とする
ものである。
牛胎児血清添加培養に基（特定の挟雑物を特定のｔＰＡ
阻害剤を用いることによって除去することを要点とする
ものである。
本発明は、特許請求の範囲で特定したように［エリスリ
ナラティシマ及び他のエリスリナ種の種子中に生成し、
かつトリプシン、プラスミン及び＋ＰＡの阻害剤である
が、ウロキナーゼには作用しない型の固定化クニノツ型
阻害剤」を使用する。
ナラティシマ及び他のエリスリナ種の種子中に生成し、
かつトリプシン、プラスミン及び＋ＰＡの阻害剤である
が、ウロキナーゼには作用しない型の固定化クニノツ型
阻害剤」を使用する。
この阻害剤を粗製のｔＰＡの精製に使用することそれ自
体は、しかし、特開昭５９−１．１８７１７号・ に
おいてすでに公知でしかない。
体は、しかし、特開昭５９−１．１８７１７号・ に
おいてすでに公知でしかない。
即ち、この先行技術においては、ヒトメラノーマ細胞を
１０％熱不活性（５６℃、３０分間）胎児牛血清（Ｆｅ
２）を含むＲ，ＰＭＩ （’Ｒ，ｏｓｓｗｅｌ ｌ Ｐ
ａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌ Ｔｎｓｔｉｔｕｔｅ ）培地
１６４０組織培養培培養性着単一層として成長させ、培
養物を一度洗い、血清を含まない媒体で被覆し、２４時
間後。
１０％熱不活性（５６℃、３０分間）胎児牛血清（Ｆｅ
２）を含むＲ，ＰＭＩ （’Ｒ，ｏｓｓｗｅｌ ｌ Ｐ
ａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌ Ｔｎｓｔｉｔｕｔｅ ）培地
１６４０組織培養培培養性着単一層として成長させ、培
養物を一度洗い、血清を含まない媒体で被覆し、２４時
間後。
媒体を集め収穫液をエリスリナラティシマ及び他のエリ
スリナ種の種子中に生成しかつトリプシン。
スリナ種の種子中に生成しかつトリプシン。
プラスミン及びｔＰＡの阻害剤であるが、ウロキナーゼ
には作用しない型の固定化クニッツ型阻害剤を含んでな
る親和試薬に適用している。
には作用しない型の固定化クニッツ型阻害剤を含んでな
る親和試薬に適用している。
この方法では、 ｔＰＡ産生細胞の育成段階ではＦｅ
２を使用するが、 ｔＰＡを分泌させる段階では細胞
を−は洗浄してＦｅ２を除去して行なっているので、本
発明で問題とした特有の挟雑物の問題がなかった。
２を使用するが、 ｔＰＡを分泌させる段階では細胞
を−は洗浄してＦｅ２を除去して行なっているので、本
発明で問題とした特有の挟雑物の問題がなかった。
この点で本発明は、この先行技術と構成が類似している
けれど、先行技術では存在しなかった新たな技術的課題
を解決しているものであって、その故にそれに基いては
容易にはなし得ないものである。
けれど、先行技術では存在しなかった新たな技術的課題
を解決しているものであって、その故にそれに基いては
容易にはなし得ないものである。
本発明者らは、Ｉ＞Ｃ８１０係を含むＲ，ＰＭＴＩ６４
０培養培地を用いたメラノーマ細胞培養液中に含まれる
ｔＰＡの様態を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動後
のザイモグラフィーで調べ、胎児牛血清無添加の場合の
培養液と比較した。
０培養培地を用いたメラノーマ細胞培養液中に含まれる
ｔＰＡの様態を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動後
のザイモグラフィーで調べ、胎児牛血清無添加の場合の
培養液と比較した。
それによると、血清添加培養培地中には分子量７万ダル
トンｔＰＡ以外に抗ヒ）ｔＰＡ抗体に反応する分子量１
１万±２万ダルトンのバンドが確認される。このバンド
は血清無添加の培養培地でもわずかに観察される事があ
るが血清添加培養培地中ではその量が相当に増加する。
トンｔＰＡ以外に抗ヒ）ｔＰＡ抗体に反応する分子量１
１万±２万ダルトンのバンドが確認される。このバンド
は血清無添加の培養培地でもわずかに観察される事があ
るが血清添加培養培地中ではその量が相当に増加する。
この現象はメラノーマ細胞の培養のみならず。
ヒト正常組織由来細胞及び遺伝子組換え技法を用いヒト
ｔＰＡ遺伝子を組み込んだ細胞の培養でも見られる。す
なわちこのものはｔＰＡと培養培地中に存在するＦｅ２
の存在に基く結合蛋白の複合体と考えられる。このもの
は異種蛋白とｔＰＡの複合体であるので精製ｔＰＡ標品
中にこれが混入すると患者に免疫原となると思われる。
ｔＰＡ遺伝子を組み込んだ細胞の培養でも見られる。す
なわちこのものはｔＰＡと培養培地中に存在するＦｅ２
の存在に基く結合蛋白の複合体と考えられる。このもの
は異種蛋白とｔＰＡの複合体であるので精製ｔＰＡ標品
中にこれが混入すると患者に免疫原となると思われる。
このｔＰＡ複合体は水溶液中に存在しても固定化された
阻害剤には吸着されないのでｔＰＡがこのｔＰＡ複合体
により汚染されている場合にも本発明の方法によれば親
和試薬を使用でき、このｔＰＡ複合体は非吸着不純物と
ともに除かれる。
阻害剤には吸着されないのでｔＰＡがこのｔＰＡ複合体
により汚染されている場合にも本発明の方法によれば親
和試薬を使用でき、このｔＰＡ複合体は非吸着不純物と
ともに除かれる。
本発明のもう１つの要旨は、遺伝子組換え技法を用いｔ
ＰＡ遺伝子を組み込んだ細胞を培養し、ｔＰＡを生産さ
せる際に懸念されるその宿主細胞由来のｔＰＡ汚染物の
問題も解決されることである。
ＰＡ遺伝子を組み込んだ細胞を培養し、ｔＰＡを生産さ
せる際に懸念されるその宿主細胞由来のｔＰＡ汚染物の
問題も解決されることである。
すなわち宿主細胞としてヒト以外の細胞を選んだ場合そ
の細胞が固有にｔＰＡを生成している場合。
の細胞が固有にｔＰＡを生成している場合。
その固有のｔＰＡが患者に免疫反応を誘引することが考
えられる。
えられる。
驚くべき事に、本発明に用いる特定の阻害剤を含んでな
る親和試薬はヒト細胞由来ｔＰＡと宿主細胞由来ｔＰＡ
を本発明者らが考案した方法により分離回収できるので
ある。
る親和試薬はヒト細胞由来ｔＰＡと宿主細胞由来ｔＰＡ
を本発明者らが考案した方法により分離回収できるので
ある。
この点も、前記の先行技術においては存在しなかった問
題点であった。即ち、先行技術においては単にメラノー
マ細胞から分泌されるｔＰＡ−を取扱っていたからであ
る。
題点であった。即ち、先行技術においては単にメラノー
マ細胞から分泌されるｔＰＡ−を取扱っていたからであ
る。
即ち組換え体ｔＰＡ及び宿主細胞由来ｔＰＡを含む水性
媒体を親和試薬層へ通過させる際約０．５〜３．０モル
／ｌ（例えば１．０〜２．０モル／１．好ましくは１．
５モル／ｌ）の食塩水溶液を用いて行なう。この場合中
性付近のｐ Ｈが好ましく、安定化量の適当な界面活性
剤（例えば０．１チのＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎｘ
−１００）を存在させる。この条件で組換え体ｔＰＡは
親和試薬層に吸着されるが。
媒体を親和試薬層へ通過させる際約０．５〜３．０モル
／ｌ（例えば１．０〜２．０モル／１．好ましくは１．
５モル／ｌ）の食塩水溶液を用いて行なう。この場合中
性付近のｐ Ｈが好ましく、安定化量の適当な界面活性
剤（例えば０．１チのＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎｘ
−１００）を存在させる。この条件で組換え体ｔＰＡは
親和試薬層に吸着されるが。
宿主細胞由来ｔＰＡは吸着されない。
ｒＰＡの脱着は公知の方法（特開昭５９−１１８７１７
号公報）が使用できる。
号公報）が使用できる。
以上１本発明はエリスリナラティ７７及び他のエリスリ
ナ種の種子中に生成し、かつトリプシン。
ナ種の種子中に生成し、かつトリプシン。
プラスミン及びｔ’ＰＡの阻害剤であるが、ウロキナー
ゼに作用１〜ない型の固定化クニッツ型阻害剤を含んで
なる親和試薬の粗製ｔＰＡの精製法への応用でル）るが
、この新しい技術、によって２つの不純物質。
ゼに作用１〜ない型の固定化クニッツ型阻害剤を含んで
なる親和試薬の粗製ｔＰＡの精製法への応用でル）るが
、この新しい技術、によって２つの不純物質。
２、
りまり抗ヒ１−ｔｐＡ抗体と反応し、１１万」−１万ダ
ルトンの分子量をもつ物質と遺伝子組換え技法を用い＋
ＰＡを生成させる際に問題となる宿主細胞由来ｉ Ｉ’
Ａの分離、除去が可能となった。
ルトンの分子量をもつ物質と遺伝子組換え技法を用い＋
ＰＡを生成させる際に問題となる宿主細胞由来ｉ Ｉ’
Ａの分離、除去が可能となった。
抗ヒ）ｔＰＡ抗体に反応し、１１万士千万の分子量をも
つ物質はもちろん固定化抗ヒ）ｔＰＡ抗体を含んでなる
親和試薬を用いても除去されず、ゲル口過法を用いても
、＋’ＰＡの樹脂に対ずろ反応性が樹脂の分離能力に影
響を及ぼし、完全に分離できない。
つ物質はもちろん固定化抗ヒ）ｔＰＡ抗体を含んでなる
親和試薬を用いても除去されず、ゲル口過法を用いても
、＋’ＰＡの樹脂に対ずろ反応性が樹脂の分離能力に影
響を及ぼし、完全に分離できない。
宿主細胞由来＋ＰＡは分子量がヒ）ｔＰＡと同じである
ので、これを分離、除去するには本発明法以外には、こ
れを識別するモノクローナル抗体を含んでなる親和試薬
を用いるしかないと思われる。
ので、これを分離、除去するには本発明法以外には、こ
れを識別するモノクローナル抗体を含んでなる親和試薬
を用いるしかないと思われる。
このモノクローナル抗体を作製するには時間と手間がか
かり実用性に乏しい。
かり実用性に乏しい。
本発明は ｔＰＡが実用化される際に生じろ。
これら難解な問題を容易な方法で一挙に解決できた点で
意義は大きい。
意義は大きい。
本発明で用いられたｔ’ＰＡ精製の為の親和試薬は、そ
の特異性の面でｔＰＡ のみならずトリプシン、プラス
ミンと反応しこれらを阻害する。このことはｔＰＡ生産
細胞培養培地がトリプシ７．プラスミンで汚染されてい
る場合、ｔＰＡ精製の障害になる。しかしながら、予め
トリプシン、プラスミンは阻害するがｔＰＡは阻害しな
い型の阻害剤１例えば大豆から誘導されたトリプノン阻
害剤。
の特異性の面でｔＰＡ のみならずトリプシン、プラス
ミンと反応しこれらを阻害する。このことはｔＰＡ生産
細胞培養培地がトリプシ７．プラスミンで汚染されてい
る場合、ｔＰＡ精製の障害になる。しかしながら、予め
トリプシン、プラスミンは阻害するがｔＰＡは阻害しな
い型の阻害剤１例えば大豆から誘導されたトリプノン阻
害剤。
α−２−プラスミンインヒビタ−又はアプロチニンを培
養培地中に添加するとトリプシン及びプラスミンがこれ
ら阻害剤と複合体を形成し１本発明使用の親和試薬と反
応しなくなり、容易に除去される。
養培地中に添加するとトリプシン及びプラスミンがこれ
ら阻害剤と複合体を形成し１本発明使用の親和試薬と反
応しなくなり、容易に除去される。
以上記述した通り１本発明のエリスリナラティツマ及び
他のエリスリナ種の種子に生成し、かつトリプゾノ、プ
ラスミン及びｔＰＡの阻害剤であるがウロキナーゼに作
用しない型の固定化クニノツ型阻害剤を含んでなる親和
試薬は、抗ヒトｔＰＡモノクローナル抗体を使用したｔ
ＰＡ精製法と比較してその使用法を改良することにより
１反応の特毀性、ｔＰＡ に対する吸着能力、使用時の
安定性及び実用性の面で優れていることが確認された。
他のエリスリナ種の種子に生成し、かつトリプゾノ、プ
ラスミン及びｔＰＡの阻害剤であるがウロキナーゼに作
用しない型の固定化クニノツ型阻害剤を含んでなる親和
試薬は、抗ヒトｔＰＡモノクローナル抗体を使用したｔ
ＰＡ精製法と比較してその使用法を改良することにより
１反応の特毀性、ｔＰＡ に対する吸着能力、使用時の
安定性及び実用性の面で優れていることが確認された。
実施例１
親和試薬の調製：
本発明で阻害剤として用いた親和試薬は以下のようにし
て調製した： エリスリナラティツマ種子をＪｏｕｂｅｒｔらの方法に
従って採集し、加工した。種子をすりつぶし。
て調製した： エリスリナラティツマ種子をＪｏｕｂｅｒｔらの方法に
従って採集し、加工した。種子をすりつぶし。
脱脂し、０．５モル／１ＮａＣ１水溶液により１０℃で
一夜抽出した。抽出物を遠心分離し、目的物を硫酸アン
モニウム沈殿により上澄みから回収し。
一夜抽出した。抽出物を遠心分離し、目的物を硫酸アン
モニウム沈殿により上澄みから回収し。
続いてセファテックスＧ５０．ＤＥＡ−セルロースおよ
びＤＥＡ−セファローズのクロマトグラフィーにかけた
。最終精製物は、０．１φドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）含有１５係ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に
付した場合、みかけ分子量２２ 、０００ドルトンの単
一バンドとして移動した。
びＤＥＡ−セファローズのクロマトグラフィーにかけた
。最終精製物は、０．１φドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）含有１５係ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に
付した場合、みかけ分子量２２ 、０００ドルトンの単
一バンドとして移動した。
精製物（２６ｍ９）を市販臭化シアン活性化アガロース
５ ｍｌに通常方法で結合させた（調製物の使用方法も
教示するＰｈａｒｍａｃｉａにより市販されているセフ
ァローズ４ ）。Ｒ相試［ハ、 ＮａＣｌ００４ モ＃
／ ｌ 、 ０，１ ％ Ｔｒ ｉ ｔｏｎＸ−１０
０（当該技術において普通使用される市販界面活性剤）
および０．０２％ナトリウムアジド安定剤を含むｐＩ−
１７，４のリン酸緩衝液に対して平衡化させた。この親
和試薬を使い捨てプラスチックシリンジの円筒から造ら
れた５ｍｌのカラムに充填した。
５ ｍｌに通常方法で結合させた（調製物の使用方法も
教示するＰｈａｒｍａｃｉａにより市販されているセフ
ァローズ４ ）。Ｒ相試［ハ、 ＮａＣｌ００４ モ＃
／ ｌ 、 ０，１ ％ Ｔｒ ｉ ｔｏｎＸ−１０
０（当該技術において普通使用される市販界面活性剤）
および０．０２％ナトリウムアジド安定剤を含むｐＩ−
１７，４のリン酸緩衝液に対して平衡化させた。この親
和試薬を使い捨てプラスチックシリンジの円筒から造ら
れた５ｍｌのカラムに充填した。
実施例２
ボウズ（Ｂｏｗｅ ｓ ）メラノーマ細胞培養液〔１０
チ熱不活性（５６℃、３０分間）胎児牛血清及び２０
ＫＴＵ／ｌのアプロチニンを含む〕２１をＴｗｅ ｅｎ
ｓ ｏ （０，０２％）で安定化後、親和カラムに適用
した。
チ熱不活性（５６℃、３０分間）胎児牛血清及び２０
ＫＴＵ／ｌのアプロチニンを含む〕２１をＴｗｅ ｅｎ
ｓ ｏ （０，０２％）で安定化後、親和カラムに適用
した。
流出液を集め、プラスミノーゲソ依存フィブリン溶解活
性を測定した。
性を測定した。
カラムに適用された活性の約１０係が確認された。
この画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後の
ザイモグラフィーで調べると、プラスミノ一ゲンアクチ
ベーターとして１１万士働万ダルトン及び７万ダルトン
の二種類が確認された。
ザイモグラフィーで調べると、プラスミノ一ゲンアクチ
ベーターとして１１万士働万ダルトン及び７万ダルトン
の二種類が確認された。
全培養液をカラムに通温させた後、 ｌ 、ＯＭＮａ
ＣＩ及び０．２係Ｔｗｅｅｎ ８０を含む２０倍カラ
ム容量＋７） ０．Ｉ ＭＮＴ−１４１（ＣＯ３ｐＨ７
，５緩衝液でカラムを洗った。この方法により、カラム
に適用された活性の約３係が検出され、ザイモグラフ上
で１１万±を万及び７万ダルトンのバンドがプラスミノ
ーゲンアクチベーターとして確認された。
ＣＩ及び０．２係Ｔｗｅｅｎ ８０を含む２０倍カラ
ム容量＋７） ０．Ｉ ＭＮＴ−１４１（ＣＯ３ｐＨ７
，５緩衝液でカラムを洗った。この方法により、カラム
に適用された活性の約３係が検出され、ザイモグラフ上
で１１万±を万及び７万ダルトンのバンドがプラスミノ
ーゲンアクチベーターとして確認された。
吸着した蛋白質は、 ０．１ ＭＮａＣＩを含む０．１
グリ７ン塩酸ｐＴＩ ３．５緩衝液を用いて溶出された
。
グリ７ン塩酸ｐＴＩ ３．５緩衝液を用いて溶出された
。
この方法により残りのプラスミノーゲン依存フィブリン
溶解活性剤は溶出し、鋭いピークとして見られ、このピ
ークは蛋白質のピークに一致する。
溶解活性剤は溶出し、鋭いピークとして見られ、このピ
ークは蛋白質のピークに一致する。
この分画はカラムに適用された活性の８０−８５係を示
し、分子量７万ダルトノの蛋白質の単一バンドである。
し、分子量７万ダルトノの蛋白質の単一バンドである。
実施例３
人胎児包皮細胞培養液〔１０チ熱不活性（５６℃、３０
分間）胎児牛血清及び２０ ＫＴＵ／ｌ ７ フロチニ
ンを角む〕２１をＴｗｅｅｎ ８０ （０，（’１２％
）で安定化後、親和カラムに適用した。
分間）胎児牛血清及び２０ ＫＴＵ／ｌ ７ フロチニ
ンを角む〕２１をＴｗｅｅｎ ８０ （０，（’１２％
）で安定化後、親和カラムに適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに適用された活性の約４５係が確
認された。
性を測定した。カラムに適用された活性の約４５係が確
認された。
この両分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後の
ザイモグラフィーで調べると、プラスミノーゲンアクチ
ベータ−として１０万ダルトン付近に２−３本、５〜７
万ダルトン付近に２−３本。
ザイモグラフィーで調べると、プラスミノーゲンアクチ
ベータ−として１０万ダルトン付近に２−３本、５〜７
万ダルトン付近に２−３本。
３万５千ダルトン付近に１本バンドが確認された。
全培養液をカラムに通過させた後、 １ 、ＯＭ Ｎ
ａＣｌ及び３．２％ Ｔｗｅｅ口８０口金０２０倍カラ
ム容量の０、Ｉ Ｍ ＮＨ４Ｉ−ＩＣＯ３，ｐＨ７，５
緩衝液でカラムを洗った。
ａＣｌ及び３．２％ Ｔｗｅｅ口８０口金０２０倍カラ
ム容量の０、Ｉ Ｍ ＮＨ４Ｉ−ＩＣＯ３，ｐＨ７，５
緩衝液でカラムを洗った。
この方法によりカラムに適用された活性の約５係が検出
され、ザイモグラフ上で上記と同じバンドが確認された
。
され、ザイモグラフ上で上記と同じバンドが確認された
。
吸着した蛋白質は、 ０．１． ＭＮａＣｌを含む０．
１Ｍグリシン塩酸ｐＨ３，５緩衝液を用いて溶出された
。
１Ｍグリシン塩酸ｐＨ３，５緩衝液を用いて溶出された
。
この方法により、残りのプラスミノーゲン依存フィブリ
ン溶解活性剤は溶出し、鋭いピークとして見られ、この
ピークは蛋白質のピークに一致す、る。この分画はカラ
ムに適用された活性の４０−５０係を示し１分子量７万
ダルトンの単一なバンドである。
ン溶解活性剤は溶出し、鋭いピークとして見られ、この
ピークは蛋白質のピークに一致す、る。この分画はカラ
ムに適用された活性の４０−５０係を示し１分子量７万
ダルトンの単一なバンドである。
実施例４
マウス線維芽細胞（Ｃ１２７細胞）は遺伝子組換え技法
を用いたｔＰＡの生産を行なう際の宿主細胞として使用
が可能である。この野生株の培養液〔２％熱不活性（５
６℃、３０分間）胎児牛血清を含む〕３１をＴｗｅｅｎ
８０（０，０２％ ）で安定化後、親和カラムに適用し
た。
を用いたｔＰＡの生産を行なう際の宿主細胞として使用
が可能である。この野生株の培養液〔２％熱不活性（５
６℃、３０分間）胎児牛血清を含む〕３１をＴｗｅｅｎ
８０（０，０２％ ）で安定化後、親和カラムに適用し
た。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。ｔＰＡは検出されなかった。
性を測定した。ｔＰＡは検出されなかった。
全培養液をカラムに通過させた後、 １．５ Ｍ Ｎａ
Ｃｌ及び０．２％Ｔｗｅｅｎ８Ｑを含む２０倍カラム容
量の０．１ ＭＮＨ４ＨＣＯ３ｐＨ７，５緩衝液でカラ
ムを洗った。この方法によりカラムに適用された活性の
ほぼ１００チが検出され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動後のザイモグラフイーにおいて分子量７万ダ
ルトンのｔＰＡが検出された。
Ｃｌ及び０．２％Ｔｗｅｅｎ８Ｑを含む２０倍カラム容
量の０．１ ＭＮＨ４ＨＣＯ３ｐＨ７，５緩衝液でカラ
ムを洗った。この方法によりカラムに適用された活性の
ほぼ１００チが検出され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動後のザイモグラフイーにおいて分子量７万ダ
ルトンのｔＰＡが検出された。
この後、通常使用されるヒト由来ｔＰＡの溶出条件でｔ
ＰＡは検出されず、又０．２％Ｔｗｅｅｎ８Ｑを含む１
０倍カラム容量の４ Ｍ ＮＨ４ＳＣＮ溶液でカラムを
洗浄したがこの方法によりｔＰＡは溶出しなかった。こ
の点によりＣ１２７由来ｔＰＡの親和試薬への結合強度
がヒ）ｔＰＡ と異なることが確認された。
ＰＡは検出されず、又０．２％Ｔｗｅｅｎ８Ｑを含む１
０倍カラム容量の４ Ｍ ＮＨ４ＳＣＮ溶液でカラムを
洗浄したがこの方法によりｔＰＡは溶出しなかった。こ
の点によりＣ１２７由来ｔＰＡの親和試薬への結合強度
がヒ）ｔＰＡ と異なることが確認された。
特許出願人 三井東圧化学株式会社
手 続 補 正 書
昭和６０年８月１２１Ｅ
Claims (1)
- 抗ヒトｔＰＡ抗体と反応し、かつ１１万±２万ダルトン
の分子量をもつ蛋白を不純物として含む粗ｔＰＡを、エ
リスリナラティシマ及び他のエリスリナ種の種子中に生
成し、かつトリプシン、プラスミン及びｔＰＡの阻害剤
であるが、ウロキナーゼには作用しない型の固定化クニ
ッツ型阻害剤を含んで成る親和試薬と密接に接触させ、
これにより選択的にｔＰＡを取得することを特徴とする
粗ｔＰＡの精製法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60168601A JPS6229975A (ja) | 1985-08-01 | 1985-08-01 | 粗ｔＰＡの精製法 |
| ZA865536A ZA865536B (en) | 1985-08-01 | 1986-07-24 | Purification procedure of tpa from crude preparations |
| CA000514780A CA1314833C (en) | 1985-08-01 | 1986-07-28 | Purification procedure of tpa from crude preparations |
| FI863111A FI87793C (fi) | 1985-08-01 | 1986-07-30 | Foerfarande foer rengoering av oren tpa |
| NO863095A NO172396C (no) | 1985-08-01 | 1986-07-31 | Fremgangsmaate for rensing av tpa fra urene preparater |
| DE8686305919T DE3681528D1 (de) | 1985-08-01 | 1986-08-01 | Verfahren zur reinigung eines rohen gewebeplasminogenaktivators. |
| EP86305919A EP0210870B1 (en) | 1985-08-01 | 1986-08-01 | Method of purifying crude tissue plasminogen activator |
| DK369686A DK369686A (da) | 1985-08-01 | 1986-08-01 | Fremgangsmaade til oprensning af vaevsplasminogenaktivator |
| US07/602,387 US5110736A (en) | 1985-08-01 | 1990-10-24 | Purificaiton procedure of tpa from crude preparations |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60168601A JPS6229975A (ja) | 1985-08-01 | 1985-08-01 | 粗ｔＰＡの精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6229975A true JPS6229975A (ja) | 1987-02-07 |
Family
ID=15871078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60168601A Pending JPS6229975A (ja) | 1985-08-01 | 1985-08-01 | 粗ｔＰＡの精製法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5110736A (ja) |
| EP (1) | EP0210870B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6229975A (ja) |
| CA (1) | CA1314833C (ja) |
| DE (1) | DE3681528D1 (ja) |
| DK (1) | DK369686A (ja) |
| FI (1) | FI87793C (ja) |
| NO (1) | NO172396C (ja) |
| ZA (1) | ZA865536B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62116600A (ja) * | 1985-10-04 | 1987-05-28 | サウスアフリカン・インヴエンシヨンズ・デイヴエロツプメント・コ−ポレ−シヨン | 試薬および方法 |
| WO1988001294A1 (fr) * | 1986-08-11 | 1988-02-25 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | PROCEDE POUR SEPARER L'UN DE L'AUTRE UN tPA MONO-BRIN ET UN tPA DOUBLE-BRIN |
| JP2008534373A (ja) * | 2005-03-31 | 2008-08-28 | キャタピラー インコーポレイテッド | 電気液圧操舵制御システム |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR960015610B1 (ko) * | 1987-06-22 | 1996-11-18 | 제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드 | 신규의 혈전붕괴 단백질의 제조방법 |
| US5411864A (en) * | 1987-11-05 | 1995-05-02 | Genentech, Inc. | Method of purifying recombinant proteins from corresponding host cell proteins |
| DE3832898A1 (de) * | 1988-09-28 | 1990-04-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator |
| AU1801101A (en) * | 1999-11-22 | 2001-06-04 | American Red Cross | Novel detection method for a functionally active form of an enzyme in biologicalsamples and a kit |
| CN114426962B (zh) * | 2021-12-21 | 2024-06-18 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | t-PA纯化方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0112122B1 (en) * | 1982-12-14 | 1991-08-28 | South African Inventions Development Corporation | Plasminogen activator |
| PH22337A (en) * | 1983-11-21 | 1988-08-12 | Ciba Geigy Ag | Synthesis of fibrinolytic agents by yeast |
-
1985
- 1985-08-01 JP JP60168601A patent/JPS6229975A/ja active Pending
-
1986
- 1986-07-24 ZA ZA865536A patent/ZA865536B/xx unknown
- 1986-07-28 CA CA000514780A patent/CA1314833C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-07-30 FI FI863111A patent/FI87793C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-07-31 NO NO863095A patent/NO172396C/no unknown
- 1986-08-01 DK DK369686A patent/DK369686A/da unknown
- 1986-08-01 DE DE8686305919T patent/DE3681528D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-01 EP EP86305919A patent/EP0210870B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-10-24 US US07/602,387 patent/US5110736A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62116600A (ja) * | 1985-10-04 | 1987-05-28 | サウスアフリカン・インヴエンシヨンズ・デイヴエロツプメント・コ−ポレ−シヨン | 試薬および方法 |
| WO1988001294A1 (fr) * | 1986-08-11 | 1988-02-25 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | PROCEDE POUR SEPARER L'UN DE L'AUTRE UN tPA MONO-BRIN ET UN tPA DOUBLE-BRIN |
| JP2008534373A (ja) * | 2005-03-31 | 2008-08-28 | キャタピラー インコーポレイテッド | 電気液圧操舵制御システム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0210870B1 (en) | 1991-09-18 |
| ZA865536B (en) | 1987-03-25 |
| FI87793C (fi) | 1993-02-25 |
| EP0210870A2 (en) | 1987-02-04 |
| NO863095L (no) | 1987-02-02 |
| DK369686A (da) | 1987-02-02 |
| FI863111A0 (fi) | 1986-07-30 |
| FI87793B (fi) | 1992-11-13 |
| NO863095D0 (no) | 1986-07-31 |
| DE3681528D1 (de) | 1991-10-24 |
| US5110736A (en) | 1992-05-05 |
| CA1314833C (en) | 1993-03-23 |
| NO172396C (no) | 1993-07-14 |
| FI863111L (fi) | 1987-02-02 |
| NO172396B (no) | 1993-04-05 |
| EP0210870A3 (en) | 1988-01-07 |
| DK369686D0 (da) | 1986-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0378375B2 (ja) | ||
| US4902623A (en) | Plasminogen activator | |
| EP0256836B1 (en) | Purification procedure of tpa from crude preparations | |
| EP0245100B1 (en) | Purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator | |
| JPS6229975A (ja) | 粗ｔＰＡの精製法 | |
| AU606582B2 (en) | Methods for the recovery of tissue plasminogen activator | |
| DE3486023T2 (de) | Verfahren zur herstellung von urokinase zymogen. | |
| EP0276328B1 (en) | Process for separating single-strand human tpa and double-strand human tpa from each other | |
| JPH0223158B2 (ja) | ||
| Tamura et al. | Purification of human plasma kallikrein and urokinase by affinity chromatography | |
| US5139939A (en) | Process for the production of human tissue plasminogen activator and cell strain useful therefor | |
| Fischer et al. | Purification of recombinant human coagulation factors II and IX and protein S expressed in recombinant Vaccinia virus-infected Vero cells | |
| US5158882A (en) | Method for purifying a crude tissue plasminogen activator preparation | |
| JPH0813271B2 (ja) | 線溶活性蛋白質およびその製造法 | |
| CA1275062A (en) | Plasminogen activator kym | |
| CA1333163C (en) | Methods for the recovery of tissue plasminogen activator | |
| IE903230A1 (en) | A process for the purification of plasminogen activator inhibitor 2 (PAI) 2 | |
| JPH07100032B2 (ja) | 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法 | |
| JPS62259585A (ja) | 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法 | |
| JPS6379593A (ja) | ｔＰＡを精製する方法 | |
| JPH01304881A (ja) | ウロキナーゼ前駆体の製造方法 | |
| JPS6357531A (ja) | インタ−フエロン組成物 |