JPS6229977A - ヒト・膵臓エラスタ−ゼ−２ｂ - Google Patents
ヒト・膵臓エラスタ−ゼ−２ｂInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒト・膵臓エラスターゼ−ＩＩＢ、それをコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡ、そ力２で形質転換
せしめた宿主および該宿主を用いるヒト・膵臓エラスタ
ーゼの製造法に関する。 エラスターゼは、セリン・プロテアーセの１種であシ、
繊維状の不浴殴蛋白質であるエラスチンを加水分解する
酵素である。エラスチンは、硬蛋白質の１種で、高等動
物の結合組織、ル１、大動脈外皮、頚索を構成しておシ
、ペプシン、トリプシンによシわずかに分解される。 Ｂａ１．ａ’ らは、動脈硬化症の研究途上で、血管
壁のエラスチン繊維の分解を認め、１９４９年、その分
解酵素の存在を推定した［： Ｂａ１Ｏ’ 、 Ｊ、ａ
ｎｄＢａｎｇａ、 １．： Ｓｃｈｗｅｉｚ Ｚ、Ｐａ
ｔｈｏｌ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １２ 。 ３５０ （１９４９） ］。つづいて、Ｂａｎｇａｆｌ
、１９５２年、エラスチンを特異的に分解する酵素を、
膵臓のなかに発見し、結晶状に取り出し、エラスターゼ
と命名しｆｔｌ ［Ｂａｎｇａ、 １． ： Ａｃｔａ
Ｐｈｙｓｊｏコ、 Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、 Ｈｕｎｇ、、 ３ 、３１７ （１９５２）
］。 エラスターゼ（′：ｉ、ヒ］・、・猿、）［ｎ、兎等は
とんどの動物の膵臓に存在することが確言忍されて寂り
、その含量はヒトか３．１ ｍ９ ／肝臓Ｊ、牛が２２
ｍ９／ ＆ 、 ラットが１０２渭９／、９程度であ
る。ヒトのエラスターゼ活性と、年令との関係が認めら
れて嘔シ、男４０オ以−１−１女６０才以上では膵臓お
よび血漿中のエラスターゼ活性が著しく低下していたＣ
Ｌｏｅｖｅｎ、 ｗ、Ａ、、 ａｎｄ Ｍａｕ、ｒｅ
ｅｎ Ｍ、 Ｂａ、］、ｄｗｊ−ｎ： Ｏｅｒｏｎｔｏ
ｌｏｇｉａ、 １７ 、１７０ （１９７１） ］。 動脈硬化症の患者の場合、膵、１藏のエラスターゼの活
性は、健常人のそれより著しく低下しているか、または
、消失していた［Ｂａ１ｏ’ 、 Ｊ、、 ａ、ｎｃｌ
Ｂａｎｇａ、 Ｔ、 ： Ｎａｔｕｒｅ、 １７８ 、
３１０ （１９５６） ］。なお、エラスターゼはエラ
スチンを酵素的に分解するだけでなく、その生合成をも
促進することが、その後の研究で明らかとなってきた。 ラット、兎などを用いて、エラスターゼの薬理作用が研
究されて２す、以下のような効果が明らかとなった。 １）動脈壁への脂質およびカルシウムの沈着抑制作用 ２）動脈壁のコレステロールおよびカルシウムの除去作
用 ３）変性エラスチンに対する選択的分解作用４）動脈壁
弾力繊維の新生促進作用 ５）血清脂質低下作用 ６）リポ蛋白代謝改善作用 以上の研究をもとに行った臨床研究に２いて、エラスタ
ーゼを経口投与した結果、以下のような効果が明らかと
なった。 １）動脈壁の弾力性・伸展性の回復作用２）血清脂質異
常の改善作用 ３）リポ蛋白代謝の改善作用 上記の研究には、ブタの膵臓より抽出Ｍ製したエラスタ
ーゼが用いられた。しかし、ブタエラスターゼをヒトに
投与した場合、それはヒトにとって異種タンパク質であ
るから、抗体産生が生じ、患者への再度の投与はアナフ
ィラキシ−をおこす危険性かある（特開昭５９−１１１
８０ ）。 従ってヒトに投与する場合は、ヒトエラスターゼを用い
るのが好捷しい。しかし、ヒトエラスターゼを十分量入
手することは極めて困難であった。そこで、本発明者ら
は組換えＤＮＡ技術を用いて、ヒトの膵臓のエラスター
ゼ遺伝子をクローニングし、得られた組換えＤＮＡ分子
を宿主に移入して、ヒト・膵臓エラスターゼ遺伝子を発
現せしめ、目的とするエラスターゼを得ることのできる
技術の開発研究を行った結果、本発明を完成するにいた
った。 現在、２種のヒト・膵臓エラスターゼの存在は、すでに
、知ら力、ているが、その特ト付けは、いまだ十分には
おこなわれておらず、そのうちの１種、膵臓エラスター
ゼ−■のアミノ酸配列は、Ｎ末端から１６１固が明らか
にされている［Ｌａｒｇｍａｎ、 Ｃ，ｅｔ ａｌＩＢ
］ｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ６２３
。 ２０８（＋９８０ ） ］のみで、その構造は、現在１
で１つたく不明であった。ところが、本発明者により、
そのアミノ酸配列のすべておよびそのＤＮＡ配列のすべ
てが明らか（τされるに至った。 本発明により明らかとなったアミノ酸配列は、上述の如
く、わずかに明らかにされたアミノ酸配列とは異なり、
本発明がまったくの新規物質Ｃ（係るものであることが
明らかである。 すなわち、本発明はヒト・膵臓エラスターゼ−ＩＩＢを
コードする塩基配列を含有ＤＮＡ、該ＤＮＡを用いて形
質転換せしめた宿主、および該ＤＮＡで形質転換せしめ
た宿主を培養することによるヒト・膵臓エラスターゼ−
ＩＩＢの製造法を提供するものである。 本発明は一般式 ％式％ で表されるアミノ酸配列で示さるヒト・膵臓エラスター
ゼ−ＩＩＢそ、および（■）で表れるとヒト・膵臓エラ
スターゼ−ＩＩＢそ、をコードＤＮＡに関する。そして
式中、０４）−末端にげ水素原子、１ｖｌｅｔ、または ＭｅｔＩ］、ｅＡｒｇＴｈｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕ、５ｅ
ｒＴｈｒＬｅｕＶａｌ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒを有していてもよい。 特に、一般式 ％式％（） （式中、ＸはＴＡＡ 、 ＴＧＡまたはＴＡＧを示す。 ）で表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基配列を
含有するＤＮＡに関する。 上記ＤＮＡ、 （ｆｆ）は、その５′末端にＡＴＧ 、
または（５’） − 【アミノ酸配列があります】を有
していてもよい。 ｎ１＊Ａ（ＩＩ）の５′禾端にＡＴ（）全有するときに
は、ポリペプチド（Ｉ）に加えて、（■）の（川−末端
にＭｅｔを有するポリペプチドをコードする。 ＤＮＡ （Ｔ）の５′末端に （５’） − 【アミノ酸配列があります】 −（３’） を有するときには、ポリペプチド（Ｉ）に加えて（ｒ）
の（Ｎ）−末端に 【アミノ酸配列があります】 を有するポリペプチドをコードする。 式（ＩＩ）で表わさ１．る塩基配列またはそわ、と同効
の塩基配列を含有する本発明のＤＮＡは、たとえば以下
に示す（イ）〜に）のステップにより製造することがで
きる。 （イ） ヒトの膵臓より、ｍＲＮＡを分離する。 （ロ） このｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用いてｃＤＮ
Ａバンクを作製する。 （ハ） 作製したＣＤＮＡバンクから、たとえば、ラッ
トエラスターゼＩｔ ｃ Ｄ Ｎ Ａをプローブに用
い、目的とするヒトエラスターゼをコードするｃ Ｄ
Ｉｉ Ａを含有するプラスミドを単離する。 に） このプラスミドから目的とするクローン化ＤＩ−
Ｉ Ａを切り出す。 膵臓のＲＮＡ抽出に８たっては、グアニジン・チオシア
ネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシア
ネート・塩化セシウム法なども採用しうるかグアニジン
・チオシアネート−グアニジン・塩酸法が以下の点で、
上述２法より優れている。（１）操作が簡単である。（
２）抽出・回収率が高い。（３）比較的大量の臓器から
の抽出が可能である。（４） ＤＩ＝ｌＡが混入してこ
ない。（５）ＲＮＡの分解が少ない。 真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３
′末端にポリＡ配列をもつことが知られているので、こ
の特徴を利用して、オリゴ（ｄＴ）セルロースのカラム
にｍＲＮＡを吸着せしめて、つぎに、これを溶出して精
製する。 得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて相
補的二Ｍ鎖ＤＮＡを合成するが、その方法としてはＳ１
ヌクレアーゼ法［Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ、 Ａ。 ｅｔ ａｌ、 ： Ｃｅ１ｌ、 ７ 、２７９ （１９
７６） ］、Ｌａ、ｎｄ法［Ｌａｎｄ。 Ｈ，ｅｔ ａｌ、 ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、、 ９ 、２２５１ （１９８１） ］、Ｏｋ
ａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法［：Ｏｋａｙａｍａ、 Ｈ，ａ
ｎｄ Ｐ、 Ｂｅｒｇ： ′＃Ａｏ］、。 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、、 ２ 、１６１ （１９８２
） ）、Ｏ，Ｊｏｏｎ Ｙｏｏ法［０，Ｊｏｏｎ Ｙｏ
ｏ、 ｅｔ ａｌ、 ： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＋Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｊ、。 ＵＳＡ 、胆、 １０４９ （１９８２） ］など採用
しうるが、本発明の目的には、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒ
ｇ法が好適であった。 つぎに、得られた紐換えプラスミドを大腸菌、たとえば
ＲＲ１株に導入して形質転換させる。テトラサイクリン
耐けあるいはアンピシリン耐性を、指標として、組換え
体を選択することができる。 得られた組換え体のなかから、エラスターゼをコードす
るＤＮＡを含有するクローンを選択するためには、３２
Ｐでラベルしたラットエラスター セ２１ ｃＤＮＡ
をプローブに用いるコロニーハイブリダイゼーンヨン法
を用いた。 選択されたクローンに含有される塩基配列の決定は、フ
ァージＩＪ１３を用いたジテオキシヌクレオチド合成鎖
停止の方法［Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、ら：Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ９ 、３０９ （１９８
１） ］ およびＭａｘａｍ−Ｇｌｂｅｒｔ法［Ｍａ
ｘａｍ、 Ａ、 Ｍ、 ａｎｄ Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｗ
、 ：Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ］、、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ｔＪｓＡ、 ７４ 、５６０ （１９７７） ］で実
施しうるが、本発明ではジテオキシヌクレオチド合成鎖
停止の方法を採用し、ヒト・膵臓のエラスターゼを完全
にコードするＤＮＡを有するクローンを決定した。 つぎに、得られたクローンからエラスターゼ遺伝子をき
シ出し、これを適当な発現ベクターにつないで、適当な
宿主に導入して発現せしめることができる。 プロモーターとしては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロ
モーター、ラクトース（１ａ）プロモーター、トリプト
ファン・ラクトース（１ａｃ）プロモーター、外膜主要
蛋白（ｌｐｐ ）プロモーター、バクテリオファージ由
来のラムダ（λ）Ｐｌ、プロモーター、蛋白質釦揮長因
子Ｔｕ（ｔ＋ｒｒＢ）プロモーターなどを使用しつる。 宿主として汀、大腸菌、枯草菌なとの細謂、酵１ユなど
の微生物のほか、動物細胞を採用しうる。本発明におい
ては、大腸＠ （ＬＥ３９２ 、ＹＡ ２１など）が宿
主どしては好適である。 本発明のＤｓＡｔ宿主に、形質転換・導入する方法とし
ては、Ｈａｎａｈａｎの方法［Ｈａｎａ、ｈａｎ、 Ｄ
、 ： Ｊ 。 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、、 １６６ 、５５７（１９８
３） ’３、塩化カルシウム法ＣＤａｇａｒｔ、 ＩＶ
イ、 ａｎｄ Ｓ、Ｄ、Ｅｈｒｌｉｃｈ ： Ｇｅｎｅ
、 ６ 、２３（１９７９） ］、低ｐＨ法〔高木座敷
編著：遺伝子操作マニュアル、 ｐ、 ４９ 、講談社
すイエンテイフイク（１９８２） ］等を採用しつる。 本発明においてば、Ｈａ ｎａ、ｈａ ｎ の方法が好
適であった。 このＪ：うにして得た宿主（組換え体）を、公知の培地
で培養し、培養物の中に、（■）で表わさｎるポリペプ
チド（その（＋４）−末端にＭｅｔまたはＭｅｔ Ｉ
］、ｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ＬｅｕＶａｌ Ａｌａ
Ｇ］、ｙ Ａ］、ａ Ｌｅｕ ５ｅｒを有していてもよ
い。）またはその同効物を生成蓄積せしめ、これを採取
することによ和本発明の目的を達することができる。 培地としては、グルコース、カザミノ酸などからなる培
地、例えは、Ｍ９培地［Ｍｉ１］−ｅｒ、 ＬＩＴ、
：Ｅｘｐｅｒｊ、ｍｅｎｔｓ ｉｎ １．Ａｏｌｅｃｕ
ｌａｒ （）ｅｎｅｔｉｃｓ、 ４３１〜４３３（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉ（ａｒｂｏｒ Ｌａｂ、、 Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７２） ） ］が挙げられる。 組換え体の培養は、通常、１５〜４３°Ｃで、３〜２４
時間行い、必要に応じて、通気や攪拌を加えることがで
きる。なお、動物細胞を宿主とする場合には、３〜１０
日間の培養を必要とする。 培養後は、組換え体細胞を、公知の方法、例えば遠心分
離等で集める。宿主として、枯草菌、酵母、動物細胞な
どを用いる場合、ベクターの選択によっては、生産さ几
たエラスターゼは細胞外に出て、上澄液に含まれる。 一方、大腸菌を宿主とした場合、生産されたエラスター
ゼは、不溶性の蛋白として、その細砲門のｌｎｃ］ｕｓ
１０ｎ ｂＯｄｙに含まれる場合が多い。 この場合は、菌体を破壊して遠心分離することにより、
生産されたエラスターゼは沈澱物として得られ、る。 菌体の破壊の方法としては、超音波処理、リゾチーム処
理、凍結融解処理等を採用することかできる。該上澄液
または沈澱物からのエラスターゼの単離は、通盾知られ
ている蛋白質の精製方法により実施しうる。 本発明によシ製造されるエラスターゼは、ヒト膵液より
抽出精製したエラスターゼと同等の生物学的活性を示し
、これと同様の目的に、同は１２番目と１３番目のＡｒ
ｇ−Ｍｅｔ結合が切れて１釜目のＣｙｓが分子内のＣｙ
ｓとジスルフィド結合によってつながったｔｗｏ−ｃｈ
ａｉｎｓ型のエラスターゼとしても存在しつる。従って
本発明はこのようなｔｗｏ−ｃｈａｉｓ 型のエラス
ターゼをも包含するものである。 以下に実施例を挙げて本発明によシ具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を制限するものではない。 実施例 （１） ヒト膵臓よシのｍ ＲＮ Ａの分離５、５
Ｎのヒト膵臓（−ｆ！Ｉ検試料）をグアニジンチオシア
ネート溶液（４Ｍのグアニジンチオシアネート、１％の
サルコシル、２０ｒｎＭのエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０
）、１００ｍＭの２−メルカプトエタノール、０１係の
アンチフオームＡ）中でポリトロンによって破壊、変性
した後、遠心して上澄を得た。これに００２５倍量のｌ
）Ａ酢酸および０７５倍量のエタノールを加え、−２
０℃で数時間冷却した後、遠心処理によって沈澱を得た
。次にこの沈澱をグアニジンノ・イドロクロライド溶液
（７，５ｉａのグアニジンノーイドロクロライド、２５
ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、５ ｍＭの
ジチオスレイトール（ＤＴＴ） ）に懸濁し、００２５
倍量の１Ｍ酢酸および０５倍量のエタノールを加え、−
２０℃で数時間冷却した後、遠心処理を行った。ここで
得られた沈澱をグアニジンハイドロクロライド溶液に再
懸濁し、酢酸、エタノールを加え、−２０°Ｃに冷却し
た後、遠心処理で沈澱を集めた。次に、この沈澱をエタ
ノールで数回洗い、混在しているグアニジンハイドロク
ロライドを除き、蒸留水に浴かした後にエタノールでＲ
ＮＡを沈澱させた。遠心分離にょ９沈澱を集め、５３．
９７１９のＲＮＡを得た。 こうして得たＲＮＡｆ高塩浴液塩浴液、５ ＋ｔの’ｔ
Ｊａｃｔ 。 ２０ ｍＭのＴｒｉｓ−Ｉ（ｃｚ （ｐＨ７，５）、ｉ
ｍＭのＥＤＴＡ、０．１係のドテシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ） ）中でオリゴ（ａＴ）セルロースカラムに
吸治させた後、ポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡを溶出溶液（
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ，／：（ｐＨ７，５） 、
１ ｍＭのＥＤＴＡ 、０．０５％のＳＤＳ ）で溶
出させ、２５５μｇのｎｎＲＮＡを得た。 （２） ＣＤＮＡ、バンクの作製 ｃＤＮＡバンクの作製は、Ｏｌｃａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
法に従って行った。すなわち、５μｙのｍＲＮＡ及び２
４ユニツトの逆転写酵素を２０μｔの反応液〔５０ｍＭ
のＴｒｉｓ−Ｈｃｚ（ｐＨ８，３）、８ｍＭのｉｖｆｇ
ｃｔ２．３０ ｍ１ｖｌのＫＣｔ、 ０．３ ｍＭのＤ
’ｒＴ 、 ２ ｍＭのｄ、ＡＴＰ 、 ２ ｍｌ、４
のｄＯＴＰ 、 ２ｍＭのｄＣＴＰ、２ｍ＋、４のｄ’
ｌ’ＴＰ 、 １０１ｔＣ１のα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ
、 １゜４μｙのベクター・ブライマーＤＩＪＡ（Ｐ
Ｌ−Ｐｈａｒｍａｃｉａより購入）〕中で、４２℃、６
０分反応させた。 ２μｌの０．２５ Ｍ Ｅｌ）Ｔ八と１μｌの１０％Ｓ
Ｄ ＦＥを力口えて反応を止めた後、２０μｌのフェ
ノール・クロロフォルムで除蛋白を行った。遠心した後
、水層をとり、２０μｌの４Ｍ酢＆アンモニウムと８０
μｔのエタノールを加え、−７０°Ｃ１１５分間冷却し
た。次いで、遠心して沈澱を集め７５係エタノールで沈
澱を洗った後、減圧乾燥した。 沈澱を１５μｌのターミナルトランスフエラーセ反応液
（１４０ｍＭＯカコジル酸カリウム、３０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣべｐ［（６，ａ）、ｉ ｍＭの塩化コバルト、
０．５ ｍＭのＤＴＴ 、 ０．２１１ＥＩのｐｏｌｙ
Ａ 、 １００ ｍ１ｖｌのｄＣＴＰ）に溶かした。 ３７°Ｃで３分間反応液をあたためた後、１８ユニツト
のターミナルテオキンヌクレオチジルトランスフェラー
ゼを加え、５分間反応させた。 次に、１μｌの０．２５ Ｍ ＥＤＴＡ及び０５μｌの
１０％ＳＤＳを加え反応をとめた後、フェノール・クロ
ロフォルムで除蛋白を行つ７ｔ、反応液を遠心後、水層
をとり、１５μｔの４Ｍ酢酸アンモニウム、６０μｔの
エタノールを加えよく混合した。−７０°Ｃに１５分間
おいた後、遠心して沈澱を集めた。 沈澱を１０μｔの制限酵累用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣ
１，１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｚ（ｐＨ７，５）、１０
ｍＭのＭｇＣｌ２、ｉ ｍＭのＤＴＴ ）に浴かし、２
５ユニツトの制限酵Ｅｌｆ、 Ｈｉｎｄ ３を加え、３
７’Ｃで約１時間消化した。 つキニ、フェノール・クロロフォルムで除蛋白後、エタ
ノール沈澱を行った。−７０℃で１５分間冷却した後、
遠心によって沈澱を集め、１０μｔのＴε（１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）、ｉ ｍＭのＥＤＴＡ
）に溶かした。 次に、上記試料の１μｔをオリゴｄＧ付きリンカ−（Ｐ
Ｌ−Ｐｈａｒｍａｃ ｉａより購入） １０ ｎ、９を
加えた反応液（ｉｏｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，
５）、ｉ ｍＭのＥＤＴＡ 。 １００ｍＭのＮａｃｔ ）に加え、６５℃で５分間加熱
し、次いで４２℃で３０分間保温した。 水中で反応液を冷却した後、１０μｔの１０培リガーゼ
緩衝液（１０ｍＭのＡＴＰ、 ６６０ ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｆ（ｐ［（７，５）、 ６６ ｍＭのＭｇＣｌ２
，１００ｍＭのＤＴＴ ）、７８μｌの蒸留水、８ユニ
ツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１２°Ｃで一晩保温
した。 次Ｋ、１０μｔ （７） １ ’；６ｃｔ、１ユニツト
のりボヌクレアーゼＨ１３３ユニットのＤＩ−Ｊ Ａポ
リメラーゼ■、４ユニツトのＴ ４ ＤＮＡリガーゼ、
０５μｌのヌクレオチド溶液（２０ｍＭのｄＡＴＰ、
２０１１１Ｍのｄ（）ＴＰ 。 ’ｌｏ ｍＭのｄＣＴＰ、 ２０ ｍＭのｄＴＴＰ）、
０１μｔの５０μｇ／μを牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を加え、１２°Ｃで１時間、ついで２５℃で１時間保温
した。 この反応液を、５倍に希釈した後、ただちに［（ａｎａ
、１ｉａｎの方法［Ｈａｎａｈａｎ 、 Ｄ、 ： Ｊ
、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。 １６６ 、５５７ （１９８３） 〕によって、大腸菌
ＲＲＩ株を形質転換し、ヒト膵臓ｃＤＮＡノくンクを作
製しする組換え菌の分離 上述のヒト膵臓ｃ Ｄ Ｎ 、Ａバンクのうち４７００
株の組換え菌のＤＮＡを、”ｒ ｕ、ｎ ｓｊ ｅ １
ｎ ＋ Ｍ 、ａ ｎ ｄ ＨＯｇｎ ｅ ｓＳ ｒ
Ｉ）、Ｓ、の方法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｔ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ 、 ７２ 。 ３９６１ （１９７５） ］ ＦＣよってニトロセルロ
ースフィルター上に固着した。 めに、ラット・膵臓エラスターゼｌ ｃＤＮＡ断片を
プローブとして用いた。ラット・膵臓エラスターゼＩＩ
ＣＤＮＡは、以下の方法で分離した。まず、ラット
膵１撒から抽出したｍＲＮ Ａを用いてｃＤＮＡバンク
を作製した。一方、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、 Ｒ。 Ｊ、ら［：Ｂｊ、ｏｃｌｌｅｍ、、 ２１ 、１４５３
（１９８２） 〕 により明らかにされたラット・膵
１懺エラスターセＴｌ ｍＲＮＡの塩基配列の一部（
１５１〜１５６ｉ￥目のアミノ酸配列（／こ灼応する）
にイｌ補的な、１７ｍａｒからなるオリゴチオキシヌク
レオチド５’ ｄ （ＧＧＣＡＴＡＧＴＣＣＡ ＣＡ
Ａ ＣＣＡ、） ３’を合成した。このオリゴチオキシ
ヌクレオチドの５′末端をＭａｘａｍ、 Ａ、Ｍ、 ａ
ｎｄ Ｇ１１ｂｅｒｔ。 Ｗ、の方法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、、 ＵＳＡ 、１４ 、５６０（１９７７）］に
よって Ｐで標識したものをプローブに用いて、上２の
ラット膵臓ｃＤＮＡバンクよす同エラスターゼｌ ｃ
ＤＮＡ クローンを選択した。 次に、得られ、たラット・膵１尿エラスターゼ■ｃ Ｄ
Ｎ Ａから制限酵累Ａａｔ ２とＨｉｎｄ ３で２０
０ 塩基長の断片を切り出し、ニックトランスレーショ
ン法［Ｒｉｇｂｙ、 Ｐ、Ｗ、 ｅｔ ａム： Ｊ、
ＭｏムＢｉｏ、／：、、 １１３ 。 ２３７ （＋９７７）］によって３２Ｐで標識した。こ
のＤｉ払断片をプローブにして、Ａｌｗｉｎｅ、 Ｊ、
Ｃ，らの方法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｔ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ、 ７４ 、５３５０ （＋９７７
）］によって上配のニトロセルロースフィルター上に固
着したＤＮＡ、に会合させ、オートラジオグラフィーに
よってプローブと反応するクローンを８株得た。これら
の菌株のうちの１株の含有するプラスミドをｐＨ２Ｅ８
と命名した。 ｐＨ２Ｆｌｌ に挿入され、ているＤＮＡの制限酵累
地図を第１図に示す。丑だその全塩基配列とそれがコー
トするアミノ酸配列を第１表に示す。 箋ｌ袈 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 ｐＨ２Ｅ８ｆｄ、１６１固のアミノ酸からなるシグナル
ペプチドをコートする領域と２５３個のアミノ酸からな
る成熟エラスターセ蛋日質をコードする領域の全てを持
っていることがわかる。甘だ、ｐＨ２Ｅ８は、５′及び
３′非翻訳領域も含んでいる。 ｐ）（２Ｅ ８のコートするアミノ酸配列と、ＭａｃＤ
ｏｎａｌｄ、 Ｒ，Ｊ、ら［Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ２１
、１４５３ （１９８２） ］の報告しているラット・
膵臓エラスターゼ■のそをコードするｃ Ｄ Ｎ Ａで
ある。ヒト・膵臓エラスターゼ■については、Ｌａｒｇ
ｍａ、ｎ、 Ｃ，ら（：Ｂｉｏｃｈｊ、ｍ。 Ｂｊ、ｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ６２３ 、２０８
（１９８０）］が（Ｎ）−末端の１６個のアミノ酸配列
を報告しているが、ｐＨ２Ｅ８のそれとは明らかに異な
っている。従って１）８２Ｅ８は新規のエラスターゼを
コードするものである。 Ｔ）８２Ｆ ８はヒトエラスターゼｍ ＲＮ Ａから逆
転写酵素によって合成された完全長のｃＤＮＡであるの
で、とのｃＤＮＡｉ適当な発現ベクターに移すことで、
大腸菌、酵母、動物細胞などを宿主として、ヒト・膵臓
エラスターゼ−ｎＢｋ大量生産できる。 （４） 動物細胞を用いたヒト・膵臓エラスターゼ−
■Ｂの生産 動物細胞を宿主にしてヒトエラスターゼ−１１Ｂを生産
させるため、第２図に示す手順によってそのｃＤＮＡと
発現用ベクターと全連結した。発現用ベクターとしてＳ
Ｖ４０のプロモーター、エンハンサ−、ポリＡシグナル
、ｓｍａｌｌ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子の介在配列（
イントロン）を含むｐｓＶ２シラスミＰを使用した。 ベクターとｃ ＤＮＡが転写方向に関して順の向きに連
結されている発現プラスミｌ’ （ｐＳＶ２−Ｅ２Ｂ）
を制限酵素切断・ぐターン全解析することにより、遣損
した。 構築した発現シラスミドｐｓＶ２− Ｅ２Ｂ Ｇ工、動
物細胞（Ｃ０８Ｉ細胞）へリン酸カルシウム法によす導
入（トランスフェクション）シタ。リン酸カルシウム法
によるｌ・ランスフエクションは、Ｇｒ ａｈａｍとｖ
ａｎ ｄｅｒ Ｅｂの方法に従つｆｃ （Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ。 ５２．４５６（１９７３）］。 トランスフェクションに使用するＣ０８Ｉ細胞は、直径
１０ｃｍのシャーレに１×１０ 細胞全まき、１０チの
牛胎児血清を含むダルベツコ変法イーグル培地で一晩培
養した。次に、３００μ７のｐＳＶ２− Ｅ２Ｂ ’プ
ラスミドに１２．５５ｍ１の滅菌蒸留水に懸濁し、０．
７５ ｍｅの２．５ Ｍ ＣａＣＡ２２加えてよく混合
した後に、ビベソトヲ用いて溶成中に７′Ｆｌ金りてな
がら、１．、５ ｍｌの１０ ｘ ＨｅＢ５ ｍＷ （
２１０ｍＭのＨＥＰＥＳ 、 １．３７ ＭのＮａＣ７
、４，７ｍＭのＫＣＡ 。 １０、６ ｍＭ （Ｄ Ｎａ２ＨＰＯ４、５５，５ｍＭ
のブドウ糖、Ｐ１４７．（１５）全滴下してＤｌｉＡと
リン酸カルシウムの沈殿全形成させた。３０分間室温で
放置して沈殿全熟成させた後、シャーレ１枚あたり１ｍ
１ｆ、予め１０係の牛脂児血清全含む新鮮な培地に置換
したＣ０８Ｉ細胞へ加えた。これを３７℃、５％の００
２存在下で１２時間培養した後、培養液ケ捨て、牛胎児
血清ヲ含まない新しいダルベツコ変法イーグル培地に置
換し、さらに３７°Ｃ１５多のｃｏ２存狂下（ｌこて４
８時間培養した。なお、ここで得られたトランスフェク
ションしたＣ０８Ｉ細胞を工、ヒトエラスターゼ−ｕＢ
ｍＲＮ−Ａの確認に用い、捷だ培養上清（エラスターゼ
活性の測定に供された。 トランスフェクションし７ｉ（ＣＯ８Ｉ細胞生細胞中現
プラスミドから転写されたヒトエラスターゼ−ｎＢ ｍ
ＲＮＡが存在していることを確認するために、以下のよ
うにＣ０８Ｉ細胞からｍＲＮＡ ｆ抽出してノーザン・
プロット・バイブリクイ−ｔ’ −ジョンを行なった。 ４８時間培養後のＣ０８Ｉ細胞に、シャーレ１枚あたり
、１ ｍｅのグアニノンチオシア不−ト浴ｉ（４Ｍのグ
アニノンチオンアネ−１−、１係のすｆｉｖコ’／ル、
２［１ｍＭのＥＤＴＡ、 ２５ｍＭのクエン酸ナトリウ
ム（ｐｔ（７，＋１ ）、１． ｆｌ （ｌ ｍＭの２
−メルカプトエタノール、０１− ％のアンチフオーム
Ａ）を加え、細胞全融解した。次に、この溶液全２１ゲ
ーソの注射針に数回通して高分子ＤｌｉＡ’ｉ低分子化
した後、５．７ Ｍの塩化セシウムと０． Ｉ ＭのＥ
ＤＴＡを含む溶液の上に重層し、日立ＲＰＳ ４０スウ
イングローターを用いて、３０，０００ ｒｐｍ、２０
℃、１７時間遠心した。ことで得られたＲＩｉＡ沈殿ケ
少量のエタノールで洗い、３００μｔの蒸留水に溶解し
た。 抽出した全ＲＮＡ ′ｊｆ：ＡｖｉｖどＬｅｄｅｒの方
法（Ｐ丁ＯＣ。 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ６９．１
４０８（１９７２））に従ってオリが（ｄＴ）セルロー
スカラムにかけ、数μグのｍＲＮＡを精製した。精製し
たｍ’ＲＮＡの半量ケ使用してＴｈｏｍａｓの方法（Ｐ
丁ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。 ＵＳＡ ７７．５２０１１１９８０））に従って、ノー
ザン・プロット・ハイブリダイゼーションを行なった。 プローブに（工、二ツクトランスレーション法［Ｒｉｇ
ｂｙ、 Ｐ、Ｗ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｍｏ１． Ｂ
ｉｏｌ、 １１３ 、２３７（１９７７））によって３
２ｐ標識したヒトエラスターゼ−ＩＢ ｃＤＮＡ ｆ用
いた。その結果、ｐｓＶ２−Ｅ２Ｂ全導入したＣ０３Ｉ
細胞のｍＦｔＮＡのみにプローブとハイブリダイズする
大きさ約１．８ ｋｂの強いバンドと、大きさ約１．Ｏ
ｋｂの弱いパン１：′が検出された。ｐｓＶ２− Ｅ２
Ｂが転写された場合、ベクターに含まれるポＩＪ Ａシ
グナルで転写が終結すると１．８ｋｂの大きさのｍＲＮ
Ａが生じ、ｃ ＤＮＡに含寸れるｙＷ ＩＪ Ａシグナ
ルで転写が終結すると１．Ｏｋｂのｍ ＲＮ Ａが生じ
ると推定される。ノーザン・プロット・ハイブリダイゼ
ーションによって得うれた結果は、それらの推定値と一
致した。したカッチ、ｐｓＶ２− Ｅ２Ｂ ＆Ｘ Ｃ０
３Ｉ細胞中で５Ｖ４ｏの７’ ｏ モーターＩＴ’ｌＪ
用して、ヒトエラスターゼ−ＩＩＢ ｍＲＮＡ ｋ多量
に合成していることが示された。 Ｔ）ＳＶ２に組み込んだヒトエラスターゼ−ｒ［ＢｃＤ
ＮＡはシグナルペプチド領域を保持しているので、発現
されるエラスターゼは培地中ヘプロエラスターゼとして
分泌されることが期待される。そこで４８時間培養後の
培養゛敵中のエラスターゼ活性全測定した。１ ｍｌの
培養上清にＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，０）を最
終濃度０２Ｍになるように加えたのち、１０■／ｍｌの
トリプシン全５０μを加え、２５℃で１５分間保温する
ことによりプロエラスターゼの活性化処理？行なった。 次に５０μｔの大豆トリプシン・インヒビター浴液（ｌ
Ｏｍｇ７ｍ１３ ）および合成基質であるＧｌｏ、ｔ
ａｒｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ −ｎ
１ｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ ｆ加え、２５℃で保温するこ
とにより酵素反応を行なった。反応後、遊離しｙｔ ｐ
−ｎ１ｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ ｆ ４１０ ｎｍでの
吸光度を測定することにエリ定量した。 その結果、ｐｓＶ２− Ｅ２Ｂでトランスフェクション
したＣＯ３１細胞の培養液ケ用いて測定した場合、明ら
かなエラスターゼ活性が検出され、ＣＯ８１細胞におけ
る活性ヒトエラスターゼ−ＩＢの生産が示された。なお
、この際トリプシンによるプロエラスターゼの活性化処
理は必須であった。 ｐｓＶ２− Ｅ２ＢをＣＯ３］細胞に導入した本実施例
においては、ヒトエラスターゼ−ＩＩＢの生産は短期的
（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ）であ
るが、ｐＳＶ２−Ｅ２Ｂシラスミドに適当な選択マーカ
ー（例えば、ｎｅｏ遺伝子、ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔ
ｅ ｒｅｄｕｃｔ、ａｓｅ遺伝子など）全連結してＣＨ
Ｏ細胞などに導入すれば、長期間にわたりヒトエラスタ
ーゼ−１１Ｂｉ生産可能な細胞株全造成することができ
る。 （５） 枯草菌＊用いたヒト・膵臓エラスターゼ−ｎ
Ｂの生産 発現ベクターの構築 発現ベクターの構築法は、第３図に示した。 １ず、ヒトエラスターゼ−ＩＢ ｃＤＮＡ ｋ含有する
プラスミドｐＨ２Ｅ８ｉ制限酵累Ｈｉｎｄ３で切断して
直鎖状にした後、制限酵素Ｐｖｕ ２で部分切断し、エ
ラスターゼ−ＤＢ ｃＤＮＡ ｋ含む約１．．３ｋｂの
ＤＮＡ断片を分離した。これを制限酵素Ｈｈａ ］で部
分切断することにより、エラスターゼ−ＩＢのアクチベ
ーションベプチドのト］末端側から８番目のアミノ酸エ
リ下流荀コードするｃＤＮＡ ’ｊ（含む断片を得た。 このＤＮＡ断片に、枯草菌α−アミラーゼのシグナルペ
プチドの一部ならびにエラスターゼ−ＩＢのアクチベー
ションペプチドの１ｑ末端側の７個のアミノ酸をコード
する合成オリゴヌクレオチド（第４図）をＴ４Ｄ１ｉＡ
りが−ゼにで結合させた。 一方、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子がクローニングさ
れているプラスミドｐＴＵＢ ２２８（Ｏｈｍｕｒａ、
Ｋ、 ｅｔａｌ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ９５
．８７（１９８４）：］全制限酵素Ｈｉｎｄ ３で切断
して、α−アミラーゼのプロモーターおよびシグナルペ
プチドの一部全含む４２８塩基対のＤＮＡ断片、および
複製開始点を含む５，１００塩基対のＤＮＡ断片を、そ
ね、それ単離した。４２８塩基対のＤｌｉＡ断片はさら
に制限酵素Ｈｐａ ２にて、まｆｃ５，１００塩基対の
ＤＮＡ断片Ｇ工制限酵素Ｓｍａ ］にて切断した後、そ
れぞれより３８５塩基対、４５６６塩基対のＤｌｉＡ断
片金１牝た。上記；３種のＤＩｉＡ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにて結合させた後、常法にエリ枯草菌２０７−２
５株（ｍ’ｉ ６３ ｈｓｒＭ ｒｅｃＥ４ ａ、ｍｙ
ＥＯ７ａｒｏ ｌ９０６１ｅｕＡ８１ｙｓ２１ ： Ｍ
ａｒｂｕｒｇ株由来）のプロトプラスト中に取り込寸せ
、再生させに後、１０μ？／ｍｌ！のカナマイノンを含
む培地で培養（−１本培地上にて生育可能な形質転換株
を得た。いくつかの形質転換株から目的のプラスミド全
選択するために、第４図に示した合成オリゴヌクレオチ
ドをプローブに用いて、コロニーノ〜イブリダイゼーシ
ョンを行なった。得られた陽１牛のクローンよりプラス
ミドを分離し、その塩基配列全決定することにより目的
のものであること全確認した。このようにして得られた
発現プラスミド全ｐＢｓＥＸ −Ｅ２Ｂと命名した。 培地上清中のエラスターゼ活性 前述のヒトエラスターゼ−ＩＢ発現プラスミドｐＢｓＥ
Ｘ−Ｅ２Ｂ全導入した枯草菌２０７−２５株を、５０μ
ｑ／ｍｌ！のカナマイシンを含むＬＧ培地１７！４］％
のバクトドリプトン（Ｄｉｆｃｏ ）、０５チのイース
トエキストラクト（Ｄｉｒｃｏ ）、０５％のＮａＣＬ
、 ２２μのブドウ糖、ｐＨ７，０）にて３５℃、４８
時間往復振盪培養した。培養終了後、培養液（工４℃に
冷却し、３，０００ｘｇ、５分間の遠心分離にて菌体全
除去した後、上清液に硫酸アンモニウム全５５係飽和に
なるように加え、４℃で１２時間攪拌した。本操作によ
って生成した不溶物音８．０００Ｘｇ、２０分間の遠心
分離により沈殿させ、上清液を除いた後、沈殿物音２０
ｍ１の０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ緩衝Ｕ （ｐ）（８，
ｏ ）に溶解した。主溶液ケ、１〃の０．２ Ｍ Ｔｒ
１ｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８，０）に対して１６時間
透析し、不溶性物質−４８，０００Ｘｇ、２０分間の遠
心分離にて除去した。この透析内ｇゲ粗エラスターゼー
ＪＩＢ試料液として以下の検定に用いた。 試料液のエラスターゼ活性は、下記の方法で測定した。 捷ず、試料液を＋−リプシンで処理することにより、プ
ロエラスターゼ全活性化し、次に合成基質Ｇｌｕｔａｒ
ｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ−ｎｉｔｒ
ｏ−ａｎｉｌｉｄｅと反応させ、遊離し７ｔｐ−ｎｉ廿
ｏａｎｊ、１ｉｄｅ ｆ４１、 Ｏｎｍの吸光度−ｔ
ｉ＋＋定することにより定量した。 反応温度は２５℃で行々つた。その結果、ｐＢｓＥＸ−
Ｅ２Ｂｉ導入した２０７−２５株の試料液において明ら
かな活性が検出され、枯草菌における活性ヒトエラスタ
ーゼ−ＩＢの生産が示された。 （６）大腸菌に用いたヒト・膵臓エラスターゼ−［Ｂの
生産 ヒトエラスターゼ−ＦＩＢ ｃＤＮＡ ｆ含有するプラ
スミドｐＨ２Ｅ ８を制限酵素Ｈｉｎｄ ３で切断して
直釦状にした後、制限酵素Ｐｖひ２で部分切断し、エラ
スターゼ−ＩＩＢ ｃＤＮＡ ｋ含む約１．３ｋｂのＤ
Ｉ−コＡ断片全分離した。これを制限酵素Ｄｄ、ｅ １
で部分切断することにエリ、エラスターゼ−ＩＢのアク
チペーション被プチドより下流をコードするｃＤＮＡＤ
ＮＡ断片ケ得た。次に、ＤＮＡポリメラーゼＫ］、ｅｎ
ｏｗフラグメントと４種のデオキシリボヌクレオシド５
′−三リン酸（ｄ、Ａ、ＴＰ 、 ｄ、ｃＴＰ 、 ｄ
ＯＴＰ 。 ｄＴＴＰ ） ｉ用いてこのＤＮＡ断片を処理すること
により、両末端を平滑末端にした。得られたＤＮＡ断片
全プラスミドｐＵＣ８のＳｍａ ］切断部位に、Ｔ４Ｄ
ＮＡ ＩＪガーゼケ用いて組み込んだ。 このようにして構築したプラスミド″ヲ用いて、大腸菌
ＪＭ １０３株全形質転換した。いくつかの形質転換株
からグラスミ１″ケ抽出し、ｃＤＮＡの転写の方向がラ
クトースオペロンのプロモーターの向きと一致している
ものを制限酵素マツピングＶＣ，，ｌ：り選択した。こ
のエラスターゼ−ＩＩＢ発現プラスミドｗ ｐＨ２ＥＸ
−８と命名した（第５図）。 ｐＨ２ＥＸ−８中のエラスターゼｃＤＮＡの５′床端付
近の塩基配列とアミノ酸配列は、次のようになる。 （−β−ガラクトシグーゼ→１←エラスターゼ＝Ｔｈｒ
Ｍｅｔ工１ｅＴｌ〕ｌ’ＡＳＩ〕５ｅｒＬｅｕＳｅｒＣ
ｙｓＧ１ｙＶａ、１”’ＡＴ’Ｇ ＡＣＣＡＴＧ
ＡＴＴ ＡＣＧ ＡＡＴ ＴＣＣＣＴＣＡＧ〒 Ｔ
ＧＴ ＧＧＧ ＧＴＣ・・・したがって、Ｉ）Ｈ２Ｅ
χ−８により発現されるヒトエラスターゼ−［Ｂは、そ
のアクチベーションペゾチドのト１末端側（Ｃシグナル
ペプチド由来の２個のアミノ酸（Ｌｅｕ 、 Ｓｅｒ
）とβ−がラクトシダーゼ由来の６個のアミノ酸が結合
した融合蛋白になる。 次に、ｐＨ２ＥＸ −８で大腸菌のいくつかの株？形質
転ｆｉし、ヒトエラスターゼ−■Ｂ金生産しつる菌株を
得た。得ら才した発現プラスミドを含む菌株全、２×Ｔ
Ｙ−アンピシリン培地（１６係のバクトドリプトン、１
％のイーストエキストラク）、０．５％のＬ］ａＣ１、
５０１１り／ｆｎｌ ノア ７ビシリン）に接種し、３
７℃、１５時間培養した。培養後、培養液を遠心して菌
体全集め、２．４ Ｘ １−０８細胞相当景の菌体を１
５μｔのＳＤＳ溶液（２％のＳＤＳ 。 ５％の２−メルカプトエタノール、１０％のグリセリフ
、６０ｍＭのＴｒｉｓ −ＨＣｌ （ｐＨ６８） ）に
懸濁し、１００℃、３分間加熱した後、Ｌａｅｍｍｌｉ
らの方法（Ｎａｔｑｒｅ、 ２２７．６８０（１９７０
））に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電、気泳
動し、生産されている蛋白全解析した。 その結果、ＹＡ２１株において多量々エラスターゼの生
産が認められた。エラスターゼ融合蛋白の生産高Ｑ工Ｙ
Ａ２１株が生産している全蛋白の２０係に相当していた
。Ｘ９８４株においても、比較的多量のエラスターゼ融
合蛋白が生産されていたが、生産高はＹＡ２１株の半分
以下であった。その他２株の大腸菌（）ＩＢ １０１株
およびＭＣ４１００株）におけるエラスターゼ融合蛋白
の生産量は、著しく低かった。 エラスターゼ融合蛋白は菌体内で１ｎｃｌｕｓｉｏｎｂ
ｏｄｙ ｆ形成しているので比較的容易に精製すること
ができた。す彦わち、ｐＨ２Ｅχ−８で形質転換し；ｉ
ＹＡ、 ２１株の培養液１！より、１ｎｃ１．ｕｓｉ
ｏｎ ｂｏｄｙ全形成している菌体が６．５Ｌｉ得られ
た。得られた菌体５．５ｆｉリゾチ一ム０２■／ｍｌお
よびデオキシコール６１ ｍｇ／ｍｅ ｆ含む５０ ｍ
Ｍ （７） ＴＴｉｓ−ＨＣＡ緩衝液（ｐＨ８，０）中
で処理して溶菌させた。未破壊の菌体ケ、低速遠ノし・
分離（１，５００Ｘｇ、１０分間）にて除去した後、高
速遠心分離（１１，０００Ｘｇ、２０分間）にて１ｎｃ
ｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｆ沈殿として回収した。この
１ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ Ｋはまだ菌体断片が多
量に含まれているので、トライトンＸ−１００ｆ ５
ｍｙ／ｍ／、ｆ含む５０ ｍＭのＴｒ ｉｓ −ＨＣＬ
緩衝液に懸ｌ蜀した後、高速遠心分離（１１，０００Ｘ
ｇ 。 ２０分間）にて洗浄した。洗浄した１ｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂｏｄｙｌ！、少量のＴｒｉｓ−ＨＣＡ緩衝液に懸濁し
て４℃で保存した。 このようにして精製することにより３００■のｉｎｃ］
、ｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙが得られ、これには約５０％の
エラスターゼ＝■Ｂ融合蛋白が含有されていた。 １ｋ、ｐＨ２ＥＸ−８で形質転換したＹＡ２１株により
生産されｉ １ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙがエラスタ
ーゼ融合蛋白であることは、ｉｍｍｕｎｏ−ｂ］、ｏｔ
ｔｉｎｇ法にて確認した。 上述のように、大腸菌にて生産されたエラスターゼの大
部分は、１ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙと々り菌体の不
溶性画分に存在しているが、一部は可溶性であり酵素活
性をも保存した状態で存在している。そこで、本酵素活
註の検出シエ以下のようにして行々つた。 ｐＨ２ＥＸ−８で形質転換したて９８４株ケ２ＸＴＹ−
アンピシリン培地１にで３７℃、１５時間振盪培養した
。培養終了後、腸体−ｉ３，０００Ｘｇ、５分間の遠心
分離にて集め、２０ｍ１：の緩衝液ＡＣ３０ｍＭのＴｒ
ｉｓ −ＨＣｔ（ｐ）！８．０ ）、］ ｍＭのＥＤＴ
Ａ 、 ５０ ｍＭのＮａＣｔ）に懸濁し、リゾチーム
’ｉ １０ Ｔｎ７加えたのち５℃で２０分間保温した
。次にデオキシコール酸を最終濃度１ｍ９７ｍ１となる
ように加え、２０℃に加温し、さらにデオキシリボヌク
レアーゼを最終濃度０．１ ｍｙ／ｍｅとなるように加
えたのちポリトロン破砕機で菌体を破砕した。得られた
溶菌数ケ８０，０００Ｘｇ、４０分間遠心分離し、菌体
断片を除いたのち、セファデックスＧ−７５カラムシロ
マドグラフイーにかけた。エラスターゼ活性画分は、さ
らに抗体アフィニティークロマトグラフィーにて精製し
、これをエラスターゼ−ＨＢ試利液として以下の検定に
用いた。 試料のエラスターゼ活ｉ生に、下記の方法で測定した。 まず、試料１ｋｌ−ＩＪプンンで処理することにより、
プロエラスターゼを活性化し友。 次に、合成基質Ｇ１１１ｊａｒｙ１−Ａｌａ−Ａ、１ａ
−ＰｒＯ−Ｌｅｕ−ｐ −ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ
と反応させ、遊離したｐ−ｎ１ｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ全
４１０ｎｍの吸光度全測定することにより定量した。反
応は、合成基質金倉む０．２ ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＡ緩
衝液（ｐＨ８，０）中で２５°に保温することにより行
なわれた。その結果、ｐＩ−１２ＥＸ−８で形質転換し
たす９８４株の試料液において、明らかな活性が検出さ
ｉｔ、大腸菌における活性ヒトエラスターゼ−■Ｂの生
産が示された。 （７）酵母を用いたヒト・膵臓エラスターゼ−［Ｂの生
産 酵母全宿主とする場合も、大腸菌、枯草菌および動物細
胞の場合と同様に、ヒト・膵臓エラスターゼ−［Ｂ ｃ
ＤＮＡ ｆ、常法にて適当なる発現ベクターに連結して
、宿主細胞に移入し、それ全発現させることができ、そ
の培養物中にエラスターゼ活性の存在全確認することが
でき之。 「組換えＤＮＡ実験指針」に記載されているＳ。 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｆ宿主とすることができるが、
具体的には同５２８８ｃ株などが好適であった。一方、
ベクターとしては、ＹＥｐ １３などが好適であった。 また、プロモーターとしては、アルコール脱水素酵素遺
伝子全コードするＡＤＨ１遺伝子などが
ードする塩基配列を含有するＤＮＡ、そ力２で形質転換
せしめた宿主および該宿主を用いるヒト・膵臓エラスタ
ーゼの製造法に関する。 エラスターゼは、セリン・プロテアーセの１種であシ、
繊維状の不浴殴蛋白質であるエラスチンを加水分解する
酵素である。エラスチンは、硬蛋白質の１種で、高等動
物の結合組織、ル１、大動脈外皮、頚索を構成しておシ
、ペプシン、トリプシンによシわずかに分解される。 Ｂａ１．ａ’ らは、動脈硬化症の研究途上で、血管
壁のエラスチン繊維の分解を認め、１９４９年、その分
解酵素の存在を推定した［： Ｂａ１Ｏ’ 、 Ｊ、ａ
ｎｄＢａｎｇａ、 １．： Ｓｃｈｗｅｉｚ Ｚ、Ｐａ
ｔｈｏｌ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １２ 。 ３５０ （１９４９） ］。つづいて、Ｂａｎｇａｆｌ
、１９５２年、エラスチンを特異的に分解する酵素を、
膵臓のなかに発見し、結晶状に取り出し、エラスターゼ
と命名しｆｔｌ ［Ｂａｎｇａ、 １． ： Ａｃｔａ
Ｐｈｙｓｊｏコ、 Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、 Ｈｕｎｇ、、 ３ 、３１７ （１９５２）
］。 エラスターゼ（′：ｉ、ヒ］・、・猿、）［ｎ、兎等は
とんどの動物の膵臓に存在することが確言忍されて寂り
、その含量はヒトか３．１ ｍ９ ／肝臓Ｊ、牛が２２
ｍ９／ ＆ 、 ラットが１０２渭９／、９程度であ
る。ヒトのエラスターゼ活性と、年令との関係が認めら
れて嘔シ、男４０オ以−１−１女６０才以上では膵臓お
よび血漿中のエラスターゼ活性が著しく低下していたＣ
Ｌｏｅｖｅｎ、 ｗ、Ａ、、 ａｎｄ Ｍａｕ、ｒｅ
ｅｎ Ｍ、 Ｂａ、］、ｄｗｊ−ｎ： Ｏｅｒｏｎｔｏ
ｌｏｇｉａ、 １７ 、１７０ （１９７１） ］。 動脈硬化症の患者の場合、膵、１藏のエラスターゼの活
性は、健常人のそれより著しく低下しているか、または
、消失していた［Ｂａ１ｏ’ 、 Ｊ、、 ａ、ｎｃｌ
Ｂａｎｇａ、 Ｔ、 ： Ｎａｔｕｒｅ、 １７８ 、
３１０ （１９５６） ］。なお、エラスターゼはエラ
スチンを酵素的に分解するだけでなく、その生合成をも
促進することが、その後の研究で明らかとなってきた。 ラット、兎などを用いて、エラスターゼの薬理作用が研
究されて２す、以下のような効果が明らかとなった。 １）動脈壁への脂質およびカルシウムの沈着抑制作用 ２）動脈壁のコレステロールおよびカルシウムの除去作
用 ３）変性エラスチンに対する選択的分解作用４）動脈壁
弾力繊維の新生促進作用 ５）血清脂質低下作用 ６）リポ蛋白代謝改善作用 以上の研究をもとに行った臨床研究に２いて、エラスタ
ーゼを経口投与した結果、以下のような効果が明らかと
なった。 １）動脈壁の弾力性・伸展性の回復作用２）血清脂質異
常の改善作用 ３）リポ蛋白代謝の改善作用 上記の研究には、ブタの膵臓より抽出Ｍ製したエラスタ
ーゼが用いられた。しかし、ブタエラスターゼをヒトに
投与した場合、それはヒトにとって異種タンパク質であ
るから、抗体産生が生じ、患者への再度の投与はアナフ
ィラキシ−をおこす危険性かある（特開昭５９−１１１
８０ ）。 従ってヒトに投与する場合は、ヒトエラスターゼを用い
るのが好捷しい。しかし、ヒトエラスターゼを十分量入
手することは極めて困難であった。そこで、本発明者ら
は組換えＤＮＡ技術を用いて、ヒトの膵臓のエラスター
ゼ遺伝子をクローニングし、得られた組換えＤＮＡ分子
を宿主に移入して、ヒト・膵臓エラスターゼ遺伝子を発
現せしめ、目的とするエラスターゼを得ることのできる
技術の開発研究を行った結果、本発明を完成するにいた
った。 現在、２種のヒト・膵臓エラスターゼの存在は、すでに
、知ら力、ているが、その特ト付けは、いまだ十分には
おこなわれておらず、そのうちの１種、膵臓エラスター
ゼ−■のアミノ酸配列は、Ｎ末端から１６１固が明らか
にされている［Ｌａｒｇｍａｎ、 Ｃ，ｅｔ ａｌＩＢ
］ｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ６２３
。 ２０８（＋９８０ ） ］のみで、その構造は、現在１
で１つたく不明であった。ところが、本発明者により、
そのアミノ酸配列のすべておよびそのＤＮＡ配列のすべ
てが明らか（τされるに至った。 本発明により明らかとなったアミノ酸配列は、上述の如
く、わずかに明らかにされたアミノ酸配列とは異なり、
本発明がまったくの新規物質Ｃ（係るものであることが
明らかである。 すなわち、本発明はヒト・膵臓エラスターゼ−ＩＩＢを
コードする塩基配列を含有ＤＮＡ、該ＤＮＡを用いて形
質転換せしめた宿主、および該ＤＮＡで形質転換せしめ
た宿主を培養することによるヒト・膵臓エラスターゼ−
ＩＩＢの製造法を提供するものである。 本発明は一般式 ％式％ で表されるアミノ酸配列で示さるヒト・膵臓エラスター
ゼ−ＩＩＢそ、および（■）で表れるとヒト・膵臓エラ
スターゼ−ＩＩＢそ、をコードＤＮＡに関する。そして
式中、０４）−末端にげ水素原子、１ｖｌｅｔ、または ＭｅｔＩ］、ｅＡｒｇＴｈｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕ、５ｅ
ｒＴｈｒＬｅｕＶａｌ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒを有していてもよい。 特に、一般式 ％式％（） （式中、ＸはＴＡＡ 、 ＴＧＡまたはＴＡＧを示す。 ）で表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基配列を
含有するＤＮＡに関する。 上記ＤＮＡ、 （ｆｆ）は、その５′末端にＡＴＧ 、
または（５’） − 【アミノ酸配列があります】を有
していてもよい。 ｎ１＊Ａ（ＩＩ）の５′禾端にＡＴ（）全有するときに
は、ポリペプチド（Ｉ）に加えて、（■）の（川−末端
にＭｅｔを有するポリペプチドをコードする。 ＤＮＡ （Ｔ）の５′末端に （５’） − 【アミノ酸配列があります】 −（３’） を有するときには、ポリペプチド（Ｉ）に加えて（ｒ）
の（Ｎ）−末端に 【アミノ酸配列があります】 を有するポリペプチドをコードする。 式（ＩＩ）で表わさ１．る塩基配列またはそわ、と同効
の塩基配列を含有する本発明のＤＮＡは、たとえば以下
に示す（イ）〜に）のステップにより製造することがで
きる。 （イ） ヒトの膵臓より、ｍＲＮＡを分離する。 （ロ） このｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用いてｃＤＮ
Ａバンクを作製する。 （ハ） 作製したＣＤＮＡバンクから、たとえば、ラッ
トエラスターゼＩｔ ｃ Ｄ Ｎ Ａをプローブに用
い、目的とするヒトエラスターゼをコードするｃ Ｄ
Ｉｉ Ａを含有するプラスミドを単離する。 に） このプラスミドから目的とするクローン化ＤＩ−
Ｉ Ａを切り出す。 膵臓のＲＮＡ抽出に８たっては、グアニジン・チオシア
ネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシア
ネート・塩化セシウム法なども採用しうるかグアニジン
・チオシアネート−グアニジン・塩酸法が以下の点で、
上述２法より優れている。（１）操作が簡単である。（
２）抽出・回収率が高い。（３）比較的大量の臓器から
の抽出が可能である。（４） ＤＩ＝ｌＡが混入してこ
ない。（５）ＲＮＡの分解が少ない。 真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３
′末端にポリＡ配列をもつことが知られているので、こ
の特徴を利用して、オリゴ（ｄＴ）セルロースのカラム
にｍＲＮＡを吸着せしめて、つぎに、これを溶出して精
製する。 得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて相
補的二Ｍ鎖ＤＮＡを合成するが、その方法としてはＳ１
ヌクレアーゼ法［Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ、 Ａ。 ｅｔ ａｌ、 ： Ｃｅ１ｌ、 ７ 、２７９ （１９
７６） ］、Ｌａ、ｎｄ法［Ｌａｎｄ。 Ｈ，ｅｔ ａｌ、 ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、、 ９ 、２２５１ （１９８１） ］、Ｏｋ
ａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法［：Ｏｋａｙａｍａ、 Ｈ，ａ
ｎｄ Ｐ、 Ｂｅｒｇ： ′＃Ａｏ］、。 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、、 ２ 、１６１ （１９８２
） ）、Ｏ，Ｊｏｏｎ Ｙｏｏ法［０，Ｊｏｏｎ Ｙｏ
ｏ、 ｅｔ ａｌ、 ： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＋Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｊ、。 ＵＳＡ 、胆、 １０４９ （１９８２） ］など採用
しうるが、本発明の目的には、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒ
ｇ法が好適であった。 つぎに、得られた紐換えプラスミドを大腸菌、たとえば
ＲＲ１株に導入して形質転換させる。テトラサイクリン
耐けあるいはアンピシリン耐性を、指標として、組換え
体を選択することができる。 得られた組換え体のなかから、エラスターゼをコードす
るＤＮＡを含有するクローンを選択するためには、３２
Ｐでラベルしたラットエラスター セ２１ ｃＤＮＡ
をプローブに用いるコロニーハイブリダイゼーンヨン法
を用いた。 選択されたクローンに含有される塩基配列の決定は、フ
ァージＩＪ１３を用いたジテオキシヌクレオチド合成鎖
停止の方法［Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、ら：Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ９ 、３０９ （１９８
１） ］ およびＭａｘａｍ−Ｇｌｂｅｒｔ法［Ｍａ
ｘａｍ、 Ａ、 Ｍ、 ａｎｄ Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｗ
、 ：Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ］、、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ｔＪｓＡ、 ７４ 、５６０ （１９７７） ］で実
施しうるが、本発明ではジテオキシヌクレオチド合成鎖
停止の方法を採用し、ヒト・膵臓のエラスターゼを完全
にコードするＤＮＡを有するクローンを決定した。 つぎに、得られたクローンからエラスターゼ遺伝子をき
シ出し、これを適当な発現ベクターにつないで、適当な
宿主に導入して発現せしめることができる。 プロモーターとしては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロ
モーター、ラクトース（１ａ）プロモーター、トリプト
ファン・ラクトース（１ａｃ）プロモーター、外膜主要
蛋白（ｌｐｐ ）プロモーター、バクテリオファージ由
来のラムダ（λ）Ｐｌ、プロモーター、蛋白質釦揮長因
子Ｔｕ（ｔ＋ｒｒＢ）プロモーターなどを使用しつる。 宿主として汀、大腸菌、枯草菌なとの細謂、酵１ユなど
の微生物のほか、動物細胞を採用しうる。本発明におい
ては、大腸＠ （ＬＥ３９２ 、ＹＡ ２１など）が宿
主どしては好適である。 本発明のＤｓＡｔ宿主に、形質転換・導入する方法とし
ては、Ｈａｎａｈａｎの方法［Ｈａｎａ、ｈａｎ、 Ｄ
、 ： Ｊ 。 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、、 １６６ 、５５７（１９８
３） ’３、塩化カルシウム法ＣＤａｇａｒｔ、 ＩＶ
イ、 ａｎｄ Ｓ、Ｄ、Ｅｈｒｌｉｃｈ ： Ｇｅｎｅ
、 ６ 、２３（１９７９） ］、低ｐＨ法〔高木座敷
編著：遺伝子操作マニュアル、 ｐ、 ４９ 、講談社
すイエンテイフイク（１９８２） ］等を採用しつる。 本発明においてば、Ｈａ ｎａ、ｈａ ｎ の方法が好
適であった。 このＪ：うにして得た宿主（組換え体）を、公知の培地
で培養し、培養物の中に、（■）で表わさｎるポリペプ
チド（その（＋４）−末端にＭｅｔまたはＭｅｔ Ｉ
］、ｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ＬｅｕＶａｌ Ａｌａ
Ｇ］、ｙ Ａ］、ａ Ｌｅｕ ５ｅｒを有していてもよ
い。）またはその同効物を生成蓄積せしめ、これを採取
することによ和本発明の目的を達することができる。 培地としては、グルコース、カザミノ酸などからなる培
地、例えは、Ｍ９培地［Ｍｉ１］−ｅｒ、 ＬＩＴ、
：Ｅｘｐｅｒｊ、ｍｅｎｔｓ ｉｎ １．Ａｏｌｅｃｕ
ｌａｒ （）ｅｎｅｔｉｃｓ、 ４３１〜４３３（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉ（ａｒｂｏｒ Ｌａｂ、、 Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７２） ） ］が挙げられる。 組換え体の培養は、通常、１５〜４３°Ｃで、３〜２４
時間行い、必要に応じて、通気や攪拌を加えることがで
きる。なお、動物細胞を宿主とする場合には、３〜１０
日間の培養を必要とする。 培養後は、組換え体細胞を、公知の方法、例えば遠心分
離等で集める。宿主として、枯草菌、酵母、動物細胞な
どを用いる場合、ベクターの選択によっては、生産さ几
たエラスターゼは細胞外に出て、上澄液に含まれる。 一方、大腸菌を宿主とした場合、生産されたエラスター
ゼは、不溶性の蛋白として、その細砲門のｌｎｃ］ｕｓ
１０ｎ ｂＯｄｙに含まれる場合が多い。 この場合は、菌体を破壊して遠心分離することにより、
生産されたエラスターゼは沈澱物として得られ、る。 菌体の破壊の方法としては、超音波処理、リゾチーム処
理、凍結融解処理等を採用することかできる。該上澄液
または沈澱物からのエラスターゼの単離は、通盾知られ
ている蛋白質の精製方法により実施しうる。 本発明によシ製造されるエラスターゼは、ヒト膵液より
抽出精製したエラスターゼと同等の生物学的活性を示し
、これと同様の目的に、同は１２番目と１３番目のＡｒ
ｇ−Ｍｅｔ結合が切れて１釜目のＣｙｓが分子内のＣｙ
ｓとジスルフィド結合によってつながったｔｗｏ−ｃｈ
ａｉｎｓ型のエラスターゼとしても存在しつる。従って
本発明はこのようなｔｗｏ−ｃｈａｉｓ 型のエラス
ターゼをも包含するものである。 以下に実施例を挙げて本発明によシ具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を制限するものではない。 実施例 （１） ヒト膵臓よシのｍ ＲＮ Ａの分離５、５
Ｎのヒト膵臓（−ｆ！Ｉ検試料）をグアニジンチオシア
ネート溶液（４Ｍのグアニジンチオシアネート、１％の
サルコシル、２０ｒｎＭのエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０
）、１００ｍＭの２−メルカプトエタノール、０１係の
アンチフオームＡ）中でポリトロンによって破壊、変性
した後、遠心して上澄を得た。これに００２５倍量のｌ
）Ａ酢酸および０７５倍量のエタノールを加え、−２
０℃で数時間冷却した後、遠心処理によって沈澱を得た
。次にこの沈澱をグアニジンノ・イドロクロライド溶液
（７，５ｉａのグアニジンノーイドロクロライド、２５
ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、５ ｍＭの
ジチオスレイトール（ＤＴＴ） ）に懸濁し、００２５
倍量の１Ｍ酢酸および０５倍量のエタノールを加え、−
２０℃で数時間冷却した後、遠心処理を行った。ここで
得られた沈澱をグアニジンハイドロクロライド溶液に再
懸濁し、酢酸、エタノールを加え、−２０°Ｃに冷却し
た後、遠心処理で沈澱を集めた。次に、この沈澱をエタ
ノールで数回洗い、混在しているグアニジンハイドロク
ロライドを除き、蒸留水に浴かした後にエタノールでＲ
ＮＡを沈澱させた。遠心分離にょ９沈澱を集め、５３．
９７１９のＲＮＡを得た。 こうして得たＲＮＡｆ高塩浴液塩浴液、５ ＋ｔの’ｔ
Ｊａｃｔ 。 ２０ ｍＭのＴｒｉｓ−Ｉ（ｃｚ （ｐＨ７，５）、ｉ
ｍＭのＥＤＴＡ、０．１係のドテシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ） ）中でオリゴ（ａＴ）セルロースカラムに
吸治させた後、ポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡを溶出溶液（
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ，／：（ｐＨ７，５） 、
１ ｍＭのＥＤＴＡ 、０．０５％のＳＤＳ ）で溶
出させ、２５５μｇのｎｎＲＮＡを得た。 （２） ＣＤＮＡ、バンクの作製 ｃＤＮＡバンクの作製は、Ｏｌｃａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
法に従って行った。すなわち、５μｙのｍＲＮＡ及び２
４ユニツトの逆転写酵素を２０μｔの反応液〔５０ｍＭ
のＴｒｉｓ−Ｈｃｚ（ｐＨ８，３）、８ｍＭのｉｖｆｇ
ｃｔ２．３０ ｍ１ｖｌのＫＣｔ、 ０．３ ｍＭのＤ
’ｒＴ 、 ２ ｍＭのｄ、ＡＴＰ 、 ２ ｍｌ、４
のｄＯＴＰ 、 ２ｍＭのｄＣＴＰ、２ｍ＋、４のｄ’
ｌ’ＴＰ 、 １０１ｔＣ１のα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ
、 １゜４μｙのベクター・ブライマーＤＩＪＡ（Ｐ
Ｌ−Ｐｈａｒｍａｃｉａより購入）〕中で、４２℃、６
０分反応させた。 ２μｌの０．２５ Ｍ Ｅｌ）Ｔ八と１μｌの１０％Ｓ
Ｄ ＦＥを力口えて反応を止めた後、２０μｌのフェ
ノール・クロロフォルムで除蛋白を行った。遠心した後
、水層をとり、２０μｌの４Ｍ酢＆アンモニウムと８０
μｔのエタノールを加え、−７０°Ｃ１１５分間冷却し
た。次いで、遠心して沈澱を集め７５係エタノールで沈
澱を洗った後、減圧乾燥した。 沈澱を１５μｌのターミナルトランスフエラーセ反応液
（１４０ｍＭＯカコジル酸カリウム、３０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣべｐ［（６，ａ）、ｉ ｍＭの塩化コバルト、
０．５ ｍＭのＤＴＴ 、 ０．２１１ＥＩのｐｏｌｙ
Ａ 、 １００ ｍ１ｖｌのｄＣＴＰ）に溶かした。 ３７°Ｃで３分間反応液をあたためた後、１８ユニツト
のターミナルテオキンヌクレオチジルトランスフェラー
ゼを加え、５分間反応させた。 次に、１μｌの０．２５ Ｍ ＥＤＴＡ及び０５μｌの
１０％ＳＤＳを加え反応をとめた後、フェノール・クロ
ロフォルムで除蛋白を行つ７ｔ、反応液を遠心後、水層
をとり、１５μｔの４Ｍ酢酸アンモニウム、６０μｔの
エタノールを加えよく混合した。−７０°Ｃに１５分間
おいた後、遠心して沈澱を集めた。 沈澱を１０μｔの制限酵累用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣ
１，１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｚ（ｐＨ７，５）、１０
ｍＭのＭｇＣｌ２、ｉ ｍＭのＤＴＴ ）に浴かし、２
５ユニツトの制限酵Ｅｌｆ、 Ｈｉｎｄ ３を加え、３
７’Ｃで約１時間消化した。 つキニ、フェノール・クロロフォルムで除蛋白後、エタ
ノール沈澱を行った。−７０℃で１５分間冷却した後、
遠心によって沈澱を集め、１０μｔのＴε（１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）、ｉ ｍＭのＥＤＴＡ
）に溶かした。 次に、上記試料の１μｔをオリゴｄＧ付きリンカ−（Ｐ
Ｌ−Ｐｈａｒｍａｃ ｉａより購入） １０ ｎ、９を
加えた反応液（ｉｏｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，
５）、ｉ ｍＭのＥＤＴＡ 。 １００ｍＭのＮａｃｔ ）に加え、６５℃で５分間加熱
し、次いで４２℃で３０分間保温した。 水中で反応液を冷却した後、１０μｔの１０培リガーゼ
緩衝液（１０ｍＭのＡＴＰ、 ６６０ ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｆ（ｐ［（７，５）、 ６６ ｍＭのＭｇＣｌ２
，１００ｍＭのＤＴＴ ）、７８μｌの蒸留水、８ユニ
ツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１２°Ｃで一晩保温
した。 次Ｋ、１０μｔ （７） １ ’；６ｃｔ、１ユニツト
のりボヌクレアーゼＨ１３３ユニットのＤＩ−Ｊ Ａポ
リメラーゼ■、４ユニツトのＴ ４ ＤＮＡリガーゼ、
０５μｌのヌクレオチド溶液（２０ｍＭのｄＡＴＰ、
２０１１１Ｍのｄ（）ＴＰ 。 ’ｌｏ ｍＭのｄＣＴＰ、 ２０ ｍＭのｄＴＴＰ）、
０１μｔの５０μｇ／μを牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を加え、１２°Ｃで１時間、ついで２５℃で１時間保温
した。 この反応液を、５倍に希釈した後、ただちに［（ａｎａ
、１ｉａｎの方法［Ｈａｎａｈａｎ 、 Ｄ、 ： Ｊ
、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。 １６６ 、５５７ （１９８３） 〕によって、大腸菌
ＲＲＩ株を形質転換し、ヒト膵臓ｃＤＮＡノくンクを作
製しする組換え菌の分離 上述のヒト膵臓ｃ Ｄ Ｎ 、Ａバンクのうち４７００
株の組換え菌のＤＮＡを、”ｒ ｕ、ｎ ｓｊ ｅ １
ｎ ＋ Ｍ 、ａ ｎ ｄ ＨＯｇｎ ｅ ｓＳ ｒ
Ｉ）、Ｓ、の方法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｔ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ 、 ７２ 。 ３９６１ （１９７５） ］ ＦＣよってニトロセルロ
ースフィルター上に固着した。 めに、ラット・膵臓エラスターゼｌ ｃＤＮＡ断片を
プローブとして用いた。ラット・膵臓エラスターゼＩＩ
ＣＤＮＡは、以下の方法で分離した。まず、ラット
膵１撒から抽出したｍＲＮ Ａを用いてｃＤＮＡバンク
を作製した。一方、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、 Ｒ。 Ｊ、ら［：Ｂｊ、ｏｃｌｌｅｍ、、 ２１ 、１４５３
（１９８２） 〕 により明らかにされたラット・膵
１懺エラスターセＴｌ ｍＲＮＡの塩基配列の一部（
１５１〜１５６ｉ￥目のアミノ酸配列（／こ灼応する）
にイｌ補的な、１７ｍａｒからなるオリゴチオキシヌク
レオチド５’ ｄ （ＧＧＣＡＴＡＧＴＣＣＡ ＣＡ
Ａ ＣＣＡ、） ３’を合成した。このオリゴチオキシ
ヌクレオチドの５′末端をＭａｘａｍ、 Ａ、Ｍ、 ａ
ｎｄ Ｇ１１ｂｅｒｔ。 Ｗ、の方法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、、 ＵＳＡ 、１４ 、５６０（１９７７）］に
よって Ｐで標識したものをプローブに用いて、上２の
ラット膵臓ｃＤＮＡバンクよす同エラスターゼｌ ｃ
ＤＮＡ クローンを選択した。 次に、得られ、たラット・膵１尿エラスターゼ■ｃ Ｄ
Ｎ Ａから制限酵累Ａａｔ ２とＨｉｎｄ ３で２０
０ 塩基長の断片を切り出し、ニックトランスレーショ
ン法［Ｒｉｇｂｙ、 Ｐ、Ｗ、 ｅｔ ａム： Ｊ、
ＭｏムＢｉｏ、／：、、 １１３ 。 ２３７ （＋９７７）］によって３２Ｐで標識した。こ
のＤｉ払断片をプローブにして、Ａｌｗｉｎｅ、 Ｊ、
Ｃ，らの方法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｔ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ、 ７４ 、５３５０ （＋９７７
）］によって上配のニトロセルロースフィルター上に固
着したＤＮＡ、に会合させ、オートラジオグラフィーに
よってプローブと反応するクローンを８株得た。これら
の菌株のうちの１株の含有するプラスミドをｐＨ２Ｅ８
と命名した。 ｐＨ２Ｆｌｌ に挿入され、ているＤＮＡの制限酵累
地図を第１図に示す。丑だその全塩基配列とそれがコー
トするアミノ酸配列を第１表に示す。 箋ｌ袈 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 ｐＨ２Ｅ８ｆｄ、１６１固のアミノ酸からなるシグナル
ペプチドをコートする領域と２５３個のアミノ酸からな
る成熟エラスターセ蛋日質をコードする領域の全てを持
っていることがわかる。甘だ、ｐＨ２Ｅ８は、５′及び
３′非翻訳領域も含んでいる。 ｐ）（２Ｅ ８のコートするアミノ酸配列と、ＭａｃＤ
ｏｎａｌｄ、 Ｒ，Ｊ、ら［Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ２１
、１４５３ （１９８２） ］の報告しているラット・
膵臓エラスターゼ■のそをコードするｃ Ｄ Ｎ Ａで
ある。ヒト・膵臓エラスターゼ■については、Ｌａｒｇ
ｍａ、ｎ、 Ｃ，ら（：Ｂｉｏｃｈｊ、ｍ。 Ｂｊ、ｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ６２３ 、２０８
（１９８０）］が（Ｎ）−末端の１６個のアミノ酸配列
を報告しているが、ｐＨ２Ｅ８のそれとは明らかに異な
っている。従って１）８２Ｅ８は新規のエラスターゼを
コードするものである。 Ｔ）８２Ｆ ８はヒトエラスターゼｍ ＲＮ Ａから逆
転写酵素によって合成された完全長のｃＤＮＡであるの
で、とのｃＤＮＡｉ適当な発現ベクターに移すことで、
大腸菌、酵母、動物細胞などを宿主として、ヒト・膵臓
エラスターゼ−ｎＢｋ大量生産できる。 （４） 動物細胞を用いたヒト・膵臓エラスターゼ−
■Ｂの生産 動物細胞を宿主にしてヒトエラスターゼ−１１Ｂを生産
させるため、第２図に示す手順によってそのｃＤＮＡと
発現用ベクターと全連結した。発現用ベクターとしてＳ
Ｖ４０のプロモーター、エンハンサ−、ポリＡシグナル
、ｓｍａｌｌ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子の介在配列（
イントロン）を含むｐｓＶ２シラスミＰを使用した。 ベクターとｃ ＤＮＡが転写方向に関して順の向きに連
結されている発現プラスミｌ’ （ｐＳＶ２−Ｅ２Ｂ）
を制限酵素切断・ぐターン全解析することにより、遣損
した。 構築した発現シラスミドｐｓＶ２− Ｅ２Ｂ Ｇ工、動
物細胞（Ｃ０８Ｉ細胞）へリン酸カルシウム法によす導
入（トランスフェクション）シタ。リン酸カルシウム法
によるｌ・ランスフエクションは、Ｇｒ ａｈａｍとｖ
ａｎ ｄｅｒ Ｅｂの方法に従つｆｃ （Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ。 ５２．４５６（１９７３）］。 トランスフェクションに使用するＣ０８Ｉ細胞は、直径
１０ｃｍのシャーレに１×１０ 細胞全まき、１０チの
牛胎児血清を含むダルベツコ変法イーグル培地で一晩培
養した。次に、３００μ７のｐＳＶ２− Ｅ２Ｂ ’プ
ラスミドに１２．５５ｍ１の滅菌蒸留水に懸濁し、０．
７５ ｍｅの２．５ Ｍ ＣａＣＡ２２加えてよく混合
した後に、ビベソトヲ用いて溶成中に７′Ｆｌ金りてな
がら、１．、５ ｍｌの１０ ｘ ＨｅＢ５ ｍＷ （
２１０ｍＭのＨＥＰＥＳ 、 １．３７ ＭのＮａＣ７
、４，７ｍＭのＫＣＡ 。 １０、６ ｍＭ （Ｄ Ｎａ２ＨＰＯ４、５５，５ｍＭ
のブドウ糖、Ｐ１４７．（１５）全滴下してＤｌｉＡと
リン酸カルシウムの沈殿全形成させた。３０分間室温で
放置して沈殿全熟成させた後、シャーレ１枚あたり１ｍ
１ｆ、予め１０係の牛脂児血清全含む新鮮な培地に置換
したＣ０８Ｉ細胞へ加えた。これを３７℃、５％の００
２存在下で１２時間培養した後、培養液ケ捨て、牛胎児
血清ヲ含まない新しいダルベツコ変法イーグル培地に置
換し、さらに３７°Ｃ１５多のｃｏ２存狂下（ｌこて４
８時間培養した。なお、ここで得られたトランスフェク
ションしたＣ０８Ｉ細胞を工、ヒトエラスターゼ−ｕＢ
ｍＲＮ−Ａの確認に用い、捷だ培養上清（エラスターゼ
活性の測定に供された。 トランスフェクションし７ｉ（ＣＯ８Ｉ細胞生細胞中現
プラスミドから転写されたヒトエラスターゼ−ｎＢ ｍ
ＲＮＡが存在していることを確認するために、以下のよ
うにＣ０８Ｉ細胞からｍＲＮＡ ｆ抽出してノーザン・
プロット・バイブリクイ−ｔ’ −ジョンを行なった。 ４８時間培養後のＣ０８Ｉ細胞に、シャーレ１枚あたり
、１ ｍｅのグアニノンチオシア不−ト浴ｉ（４Ｍのグ
アニノンチオンアネ−１−、１係のすｆｉｖコ’／ル、
２［１ｍＭのＥＤＴＡ、 ２５ｍＭのクエン酸ナトリウ
ム（ｐｔ（７，＋１ ）、１． ｆｌ （ｌ ｍＭの２
−メルカプトエタノール、０１− ％のアンチフオーム
Ａ）を加え、細胞全融解した。次に、この溶液全２１ゲ
ーソの注射針に数回通して高分子ＤｌｉＡ’ｉ低分子化
した後、５．７ Ｍの塩化セシウムと０． Ｉ ＭのＥ
ＤＴＡを含む溶液の上に重層し、日立ＲＰＳ ４０スウ
イングローターを用いて、３０，０００ ｒｐｍ、２０
℃、１７時間遠心した。ことで得られたＲＩｉＡ沈殿ケ
少量のエタノールで洗い、３００μｔの蒸留水に溶解し
た。 抽出した全ＲＮＡ ′ｊｆ：ＡｖｉｖどＬｅｄｅｒの方
法（Ｐ丁ＯＣ。 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ６９．１
４０８（１９７２））に従ってオリが（ｄＴ）セルロー
スカラムにかけ、数μグのｍＲＮＡを精製した。精製し
たｍ’ＲＮＡの半量ケ使用してＴｈｏｍａｓの方法（Ｐ
丁ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。 ＵＳＡ ７７．５２０１１１９８０））に従って、ノー
ザン・プロット・ハイブリダイゼーションを行なった。 プローブに（工、二ツクトランスレーション法［Ｒｉｇ
ｂｙ、 Ｐ、Ｗ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｍｏ１． Ｂ
ｉｏｌ、 １１３ 、２３７（１９７７））によって３
２ｐ標識したヒトエラスターゼ−ＩＢ ｃＤＮＡ ｆ用
いた。その結果、ｐｓＶ２−Ｅ２Ｂ全導入したＣ０３Ｉ
細胞のｍＦｔＮＡのみにプローブとハイブリダイズする
大きさ約１．８ ｋｂの強いバンドと、大きさ約１．Ｏ
ｋｂの弱いパン１：′が検出された。ｐｓＶ２− Ｅ２
Ｂが転写された場合、ベクターに含まれるポＩＪ Ａシ
グナルで転写が終結すると１．８ｋｂの大きさのｍＲＮ
Ａが生じ、ｃ ＤＮＡに含寸れるｙＷ ＩＪ Ａシグナ
ルで転写が終結すると１．Ｏｋｂのｍ ＲＮ Ａが生じ
ると推定される。ノーザン・プロット・ハイブリダイゼ
ーションによって得うれた結果は、それらの推定値と一
致した。したカッチ、ｐｓＶ２− Ｅ２Ｂ ＆Ｘ Ｃ０
３Ｉ細胞中で５Ｖ４ｏの７’ ｏ モーターＩＴ’ｌＪ
用して、ヒトエラスターゼ−ＩＩＢ ｍＲＮＡ ｋ多量
に合成していることが示された。 Ｔ）ＳＶ２に組み込んだヒトエラスターゼ−ｒ［ＢｃＤ
ＮＡはシグナルペプチド領域を保持しているので、発現
されるエラスターゼは培地中ヘプロエラスターゼとして
分泌されることが期待される。そこで４８時間培養後の
培養゛敵中のエラスターゼ活性全測定した。１ ｍｌの
培養上清にＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，０）を最
終濃度０２Ｍになるように加えたのち、１０■／ｍｌの
トリプシン全５０μを加え、２５℃で１５分間保温する
ことによりプロエラスターゼの活性化処理？行なった。 次に５０μｔの大豆トリプシン・インヒビター浴液（ｌ
Ｏｍｇ７ｍ１３ ）および合成基質であるＧｌｏ、ｔ
ａｒｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ −ｎ
１ｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ ｆ加え、２５℃で保温するこ
とにより酵素反応を行なった。反応後、遊離しｙｔ ｐ
−ｎ１ｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ ｆ ４１０ ｎｍでの
吸光度を測定することにエリ定量した。 その結果、ｐｓＶ２− Ｅ２Ｂでトランスフェクション
したＣＯ３１細胞の培養液ケ用いて測定した場合、明ら
かなエラスターゼ活性が検出され、ＣＯ８１細胞におけ
る活性ヒトエラスターゼ−ＩＢの生産が示された。なお
、この際トリプシンによるプロエラスターゼの活性化処
理は必須であった。 ｐｓＶ２− Ｅ２ＢをＣＯ３］細胞に導入した本実施例
においては、ヒトエラスターゼ−ＩＩＢの生産は短期的
（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ）であ
るが、ｐＳＶ２−Ｅ２Ｂシラスミドに適当な選択マーカ
ー（例えば、ｎｅｏ遺伝子、ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔ
ｅ ｒｅｄｕｃｔ、ａｓｅ遺伝子など）全連結してＣＨ
Ｏ細胞などに導入すれば、長期間にわたりヒトエラスタ
ーゼ−１１Ｂｉ生産可能な細胞株全造成することができ
る。 （５） 枯草菌＊用いたヒト・膵臓エラスターゼ−ｎ
Ｂの生産 発現ベクターの構築 発現ベクターの構築法は、第３図に示した。 １ず、ヒトエラスターゼ−ＩＢ ｃＤＮＡ ｋ含有する
プラスミドｐＨ２Ｅ８ｉ制限酵累Ｈｉｎｄ３で切断して
直鎖状にした後、制限酵素Ｐｖｕ ２で部分切断し、エ
ラスターゼ−ＤＢ ｃＤＮＡ ｋ含む約１．．３ｋｂの
ＤＮＡ断片を分離した。これを制限酵素Ｈｈａ ］で部
分切断することにより、エラスターゼ−ＩＢのアクチベ
ーションベプチドのト］末端側から８番目のアミノ酸エ
リ下流荀コードするｃＤＮＡ ’ｊ（含む断片を得た。 このＤＮＡ断片に、枯草菌α−アミラーゼのシグナルペ
プチドの一部ならびにエラスターゼ−ＩＢのアクチベー
ションペプチドの１ｑ末端側の７個のアミノ酸をコード
する合成オリゴヌクレオチド（第４図）をＴ４Ｄ１ｉＡ
りが−ゼにで結合させた。 一方、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子がクローニングさ
れているプラスミドｐＴＵＢ ２２８（Ｏｈｍｕｒａ、
Ｋ、 ｅｔａｌ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ９５
．８７（１９８４）：］全制限酵素Ｈｉｎｄ ３で切断
して、α−アミラーゼのプロモーターおよびシグナルペ
プチドの一部全含む４２８塩基対のＤＮＡ断片、および
複製開始点を含む５，１００塩基対のＤＮＡ断片を、そ
ね、それ単離した。４２８塩基対のＤｌｉＡ断片はさら
に制限酵素Ｈｐａ ２にて、まｆｃ５，１００塩基対の
ＤＮＡ断片Ｇ工制限酵素Ｓｍａ ］にて切断した後、そ
れぞれより３８５塩基対、４５６６塩基対のＤｌｉＡ断
片金１牝た。上記；３種のＤＩｉＡ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにて結合させた後、常法にエリ枯草菌２０７−２
５株（ｍ’ｉ ６３ ｈｓｒＭ ｒｅｃＥ４ ａ、ｍｙ
ＥＯ７ａｒｏ ｌ９０６１ｅｕＡ８１ｙｓ２１ ： Ｍ
ａｒｂｕｒｇ株由来）のプロトプラスト中に取り込寸せ
、再生させに後、１０μ？／ｍｌ！のカナマイノンを含
む培地で培養（−１本培地上にて生育可能な形質転換株
を得た。いくつかの形質転換株から目的のプラスミド全
選択するために、第４図に示した合成オリゴヌクレオチ
ドをプローブに用いて、コロニーノ〜イブリダイゼーシ
ョンを行なった。得られた陽１牛のクローンよりプラス
ミドを分離し、その塩基配列全決定することにより目的
のものであること全確認した。このようにして得られた
発現プラスミド全ｐＢｓＥＸ −Ｅ２Ｂと命名した。 培地上清中のエラスターゼ活性 前述のヒトエラスターゼ−ＩＢ発現プラスミドｐＢｓＥ
Ｘ−Ｅ２Ｂ全導入した枯草菌２０７−２５株を、５０μ
ｑ／ｍｌ！のカナマイシンを含むＬＧ培地１７！４］％
のバクトドリプトン（Ｄｉｆｃｏ ）、０５チのイース
トエキストラクト（Ｄｉｒｃｏ ）、０５％のＮａＣＬ
、 ２２μのブドウ糖、ｐＨ７，０）にて３５℃、４８
時間往復振盪培養した。培養終了後、培養液（工４℃に
冷却し、３，０００ｘｇ、５分間の遠心分離にて菌体全
除去した後、上清液に硫酸アンモニウム全５５係飽和に
なるように加え、４℃で１２時間攪拌した。本操作によ
って生成した不溶物音８．０００Ｘｇ、２０分間の遠心
分離により沈殿させ、上清液を除いた後、沈殿物音２０
ｍ１の０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ緩衝Ｕ （ｐ）（８，
ｏ ）に溶解した。主溶液ケ、１〃の０．２ Ｍ Ｔｒ
１ｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８，０）に対して１６時間
透析し、不溶性物質−４８，０００Ｘｇ、２０分間の遠
心分離にて除去した。この透析内ｇゲ粗エラスターゼー
ＪＩＢ試料液として以下の検定に用いた。 試料液のエラスターゼ活性は、下記の方法で測定した。 捷ず、試料液を＋−リプシンで処理することにより、プ
ロエラスターゼ全活性化し、次に合成基質Ｇｌｕｔａｒ
ｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ−ｎｉｔｒ
ｏ−ａｎｉｌｉｄｅと反応させ、遊離し７ｔｐ−ｎｉ廿
ｏａｎｊ、１ｉｄｅ ｆ４１、 Ｏｎｍの吸光度−ｔ
ｉ＋＋定することにより定量した。 反応温度は２５℃で行々つた。その結果、ｐＢｓＥＸ−
Ｅ２Ｂｉ導入した２０７−２５株の試料液において明ら
かな活性が検出され、枯草菌における活性ヒトエラスタ
ーゼ−ＩＢの生産が示された。 （６）大腸菌に用いたヒト・膵臓エラスターゼ−［Ｂの
生産 ヒトエラスターゼ−ＦＩＢ ｃＤＮＡ ｆ含有するプラ
スミドｐＨ２Ｅ ８を制限酵素Ｈｉｎｄ ３で切断して
直釦状にした後、制限酵素Ｐｖひ２で部分切断し、エラ
スターゼ−ＩＩＢ ｃＤＮＡ ｋ含む約１．３ｋｂのＤ
Ｉ−コＡ断片全分離した。これを制限酵素Ｄｄ、ｅ １
で部分切断することにエリ、エラスターゼ−ＩＢのアク
チペーション被プチドより下流をコードするｃＤＮＡＤ
ＮＡ断片ケ得た。次に、ＤＮＡポリメラーゼＫ］、ｅｎ
ｏｗフラグメントと４種のデオキシリボヌクレオシド５
′−三リン酸（ｄ、Ａ、ＴＰ 、 ｄ、ｃＴＰ 、 ｄ
ＯＴＰ 。 ｄＴＴＰ ） ｉ用いてこのＤＮＡ断片を処理すること
により、両末端を平滑末端にした。得られたＤＮＡ断片
全プラスミドｐＵＣ８のＳｍａ ］切断部位に、Ｔ４Ｄ
ＮＡ ＩＪガーゼケ用いて組み込んだ。 このようにして構築したプラスミド″ヲ用いて、大腸菌
ＪＭ １０３株全形質転換した。いくつかの形質転換株
からグラスミ１″ケ抽出し、ｃＤＮＡの転写の方向がラ
クトースオペロンのプロモーターの向きと一致している
ものを制限酵素マツピングＶＣ，，ｌ：り選択した。こ
のエラスターゼ−ＩＩＢ発現プラスミドｗ ｐＨ２ＥＸ
−８と命名した（第５図）。 ｐＨ２ＥＸ−８中のエラスターゼｃＤＮＡの５′床端付
近の塩基配列とアミノ酸配列は、次のようになる。 （−β−ガラクトシグーゼ→１←エラスターゼ＝Ｔｈｒ
Ｍｅｔ工１ｅＴｌ〕ｌ’ＡＳＩ〕５ｅｒＬｅｕＳｅｒＣ
ｙｓＧ１ｙＶａ、１”’ＡＴ’Ｇ ＡＣＣＡＴＧ
ＡＴＴ ＡＣＧ ＡＡＴ ＴＣＣＣＴＣＡＧ〒 Ｔ
ＧＴ ＧＧＧ ＧＴＣ・・・したがって、Ｉ）Ｈ２Ｅ
χ−８により発現されるヒトエラスターゼ−［Ｂは、そ
のアクチベーションペゾチドのト１末端側（Ｃシグナル
ペプチド由来の２個のアミノ酸（Ｌｅｕ 、 Ｓｅｒ
）とβ−がラクトシダーゼ由来の６個のアミノ酸が結合
した融合蛋白になる。 次に、ｐＨ２ＥＸ −８で大腸菌のいくつかの株？形質
転ｆｉし、ヒトエラスターゼ−■Ｂ金生産しつる菌株を
得た。得ら才した発現プラスミドを含む菌株全、２×Ｔ
Ｙ−アンピシリン培地（１６係のバクトドリプトン、１
％のイーストエキストラク）、０．５％のＬ］ａＣ１、
５０１１り／ｆｎｌ ノア ７ビシリン）に接種し、３
７℃、１５時間培養した。培養後、培養液を遠心して菌
体全集め、２．４ Ｘ １−０８細胞相当景の菌体を１
５μｔのＳＤＳ溶液（２％のＳＤＳ 。 ５％の２−メルカプトエタノール、１０％のグリセリフ
、６０ｍＭのＴｒｉｓ −ＨＣｌ （ｐＨ６８） ）に
懸濁し、１００℃、３分間加熱した後、Ｌａｅｍｍｌｉ
らの方法（Ｎａｔｑｒｅ、 ２２７．６８０（１９７０
））に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電、気泳
動し、生産されている蛋白全解析した。 その結果、ＹＡ２１株において多量々エラスターゼの生
産が認められた。エラスターゼ融合蛋白の生産高Ｑ工Ｙ
Ａ２１株が生産している全蛋白の２０係に相当していた
。Ｘ９８４株においても、比較的多量のエラスターゼ融
合蛋白が生産されていたが、生産高はＹＡ２１株の半分
以下であった。その他２株の大腸菌（）ＩＢ １０１株
およびＭＣ４１００株）におけるエラスターゼ融合蛋白
の生産量は、著しく低かった。 エラスターゼ融合蛋白は菌体内で１ｎｃｌｕｓｉｏｎｂ
ｏｄｙ ｆ形成しているので比較的容易に精製すること
ができた。す彦わち、ｐＨ２Ｅχ−８で形質転換し；ｉ
ＹＡ、 ２１株の培養液１！より、１ｎｃ１．ｕｓｉ
ｏｎ ｂｏｄｙ全形成している菌体が６．５Ｌｉ得られ
た。得られた菌体５．５ｆｉリゾチ一ム０２■／ｍｌお
よびデオキシコール６１ ｍｇ／ｍｅ ｆ含む５０ ｍ
Ｍ （７） ＴＴｉｓ−ＨＣＡ緩衝液（ｐＨ８，０）中
で処理して溶菌させた。未破壊の菌体ケ、低速遠ノし・
分離（１，５００Ｘｇ、１０分間）にて除去した後、高
速遠心分離（１１，０００Ｘｇ、２０分間）にて１ｎｃ
ｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｆ沈殿として回収した。この
１ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ Ｋはまだ菌体断片が多
量に含まれているので、トライトンＸ−１００ｆ ５
ｍｙ／ｍ／、ｆ含む５０ ｍＭのＴｒ ｉｓ −ＨＣＬ
緩衝液に懸ｌ蜀した後、高速遠心分離（１１，０００Ｘ
ｇ 。 ２０分間）にて洗浄した。洗浄した１ｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂｏｄｙｌ！、少量のＴｒｉｓ−ＨＣＡ緩衝液に懸濁し
て４℃で保存した。 このようにして精製することにより３００■のｉｎｃ］
、ｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙが得られ、これには約５０％の
エラスターゼ＝■Ｂ融合蛋白が含有されていた。 １ｋ、ｐＨ２ＥＸ−８で形質転換したＹＡ２１株により
生産されｉ １ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙがエラスタ
ーゼ融合蛋白であることは、ｉｍｍｕｎｏ−ｂ］、ｏｔ
ｔｉｎｇ法にて確認した。 上述のように、大腸菌にて生産されたエラスターゼの大
部分は、１ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙと々り菌体の不
溶性画分に存在しているが、一部は可溶性であり酵素活
性をも保存した状態で存在している。そこで、本酵素活
註の検出シエ以下のようにして行々つた。 ｐＨ２ＥＸ−８で形質転換したて９８４株ケ２ＸＴＹ−
アンピシリン培地１にで３７℃、１５時間振盪培養した
。培養終了後、腸体−ｉ３，０００Ｘｇ、５分間の遠心
分離にて集め、２０ｍ１：の緩衝液ＡＣ３０ｍＭのＴｒ
ｉｓ −ＨＣｔ（ｐ）！８．０ ）、］ ｍＭのＥＤＴ
Ａ 、 ５０ ｍＭのＮａＣｔ）に懸濁し、リゾチーム
’ｉ １０ Ｔｎ７加えたのち５℃で２０分間保温した
。次にデオキシコール酸を最終濃度１ｍ９７ｍ１となる
ように加え、２０℃に加温し、さらにデオキシリボヌク
レアーゼを最終濃度０．１ ｍｙ／ｍｅとなるように加
えたのちポリトロン破砕機で菌体を破砕した。得られた
溶菌数ケ８０，０００Ｘｇ、４０分間遠心分離し、菌体
断片を除いたのち、セファデックスＧ−７５カラムシロ
マドグラフイーにかけた。エラスターゼ活性画分は、さ
らに抗体アフィニティークロマトグラフィーにて精製し
、これをエラスターゼ−ＨＢ試利液として以下の検定に
用いた。 試料のエラスターゼ活ｉ生に、下記の方法で測定した。 まず、試料１ｋｌ−ＩＪプンンで処理することにより、
プロエラスターゼを活性化し友。 次に、合成基質Ｇ１１１ｊａｒｙ１−Ａｌａ−Ａ、１ａ
−ＰｒＯ−Ｌｅｕ−ｐ −ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ
と反応させ、遊離したｐ−ｎ１ｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ全
４１０ｎｍの吸光度全測定することにより定量した。反
応は、合成基質金倉む０．２ ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＡ緩
衝液（ｐＨ８，０）中で２５°に保温することにより行
なわれた。その結果、ｐＩ−１２ＥＸ−８で形質転換し
たす９８４株の試料液において、明らかな活性が検出さ
ｉｔ、大腸菌における活性ヒトエラスターゼ−■Ｂの生
産が示された。 （７）酵母を用いたヒト・膵臓エラスターゼ−［Ｂの生
産 酵母全宿主とする場合も、大腸菌、枯草菌および動物細
胞の場合と同様に、ヒト・膵臓エラスターゼ−［Ｂ ｃ
ＤＮＡ ｆ、常法にて適当なる発現ベクターに連結して
、宿主細胞に移入し、それ全発現させることができ、そ
の培養物中にエラスターゼ活性の存在全確認することが
でき之。 「組換えＤＮＡ実験指針」に記載されているＳ。 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｆ宿主とすることができるが、
具体的には同５２８８ｃ株などが好適であった。一方、
ベクターとしては、ＹＥｐ １３などが好適であった。 また、プロモーターとしては、アルコール脱水素酵素遺
伝子全コードするＡＤＨ１遺伝子などが
第１図は、実施例で得られたプラスミドｐＨ２Ｅ８の制
限酵素地図を表わし、部分は、シグナルペプチ１と考え
られるペプチドをコードする部分全示す。部分は、成熟
エラスターゼ蛋白質全コードする部分を示す。 第２図は、ｐｓＶ２−Ｅ２ＢプラスミＰ構築の手順金示
す。ｐｓＶ２−β−グロビンを工、ｐＳＶ２ベクターに
β−グロビンのｃＤＮＡが挿入されているプラスミドで
ある。一方、ｐＨ２Ｅ８ ＆Ｘ Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅ
ｒｇベクターにヒトエラスターゼ−ＩＴＢ ｃＤＮＡが
挿入されているプラスミドである。ｓ１ヌクレアーゼ等
の反応は、″モレキュラー・クローニング” （Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、 Ｔ。 ｅｔ ａｌ、 （ｅｄ、） ” Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂ、 （１，９８０） 〕に記載の方法に従った
。 太矢印＋Ｘ ＳＶ ４０由来のプロモーター全示し、細
矢印は転写の方向ケ示す。図中、Ｂ、Ｈ，Ｓ、ｖ ＋・
工それぞれ制限酵素Ｂｇ１２、Ｈｉｎｄ ３、Ｐｓｔ
Ｉ、Ｐｖｕ ２全表わす。 第３図は、ｐＢｓＥＸ−Ｅ２Ｂプラスミド構築の手順を
示す。ｐＴＵＢ ２２８は、枯草菌の複製開始点を持っ
たベクターに、枯草菌のα−アミラーセ遺伝子がクロー
ン化されているプラスミドゝである。 太矢印はα−アミラーゼのプロモーターを示し、細矢印
は転写の方向を示す。図中、Ａ、Ｈ，Ｐ、Ｓ、■（工そ
れぞれ制限酵素Ｔ−１ｈａ １ 、Ｈｉｎｄ ３、Ｈｐ
ａ ２、Ｓｍａｌ、Ｐｖｕ２ｉ表わす。 第４図は、枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のシグナルペプ
チド領域の一部およびエラスターゼ−■Ｂ ｃＤＮＡの
アクチペーションペプチトゝＤＮ末端１１１１１ ｋ含
む合成り＋ｑＡ！Ｊンカーを示す。 第５図に、ｐＨ２Ｅχ−８プラスミド構築の手順？示ス
。斜線の領域（′！、、β−ガラクトシダーセ゛遺伝子
ケ示す。太矢印はラクトース・プロモーター・オペレー
ターケ示し、細矢印に転写の方向を示す。図中、Ｄ、）
］、Ｓ、 Ｖｌ工それぞれ制限酵素ＩＭｅ １ 、 Ｂ
ｉｎｄ ３、Ｓｍａ １、ＰＶＩＪ、 ２ ｋ表わす。
限酵素地図を表わし、部分は、シグナルペプチ１と考え
られるペプチドをコードする部分全示す。部分は、成熟
エラスターゼ蛋白質全コードする部分を示す。 第２図は、ｐｓＶ２−Ｅ２ＢプラスミＰ構築の手順金示
す。ｐｓＶ２−β−グロビンを工、ｐＳＶ２ベクターに
β−グロビンのｃＤＮＡが挿入されているプラスミドで
ある。一方、ｐＨ２Ｅ８ ＆Ｘ Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅ
ｒｇベクターにヒトエラスターゼ−ＩＴＢ ｃＤＮＡが
挿入されているプラスミドである。ｓ１ヌクレアーゼ等
の反応は、″モレキュラー・クローニング” （Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、 Ｔ。 ｅｔ ａｌ、 （ｅｄ、） ” Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂ、 （１，９８０） 〕に記載の方法に従った
。 太矢印＋Ｘ ＳＶ ４０由来のプロモーター全示し、細
矢印は転写の方向ケ示す。図中、Ｂ、Ｈ，Ｓ、ｖ ＋・
工それぞれ制限酵素Ｂｇ１２、Ｈｉｎｄ ３、Ｐｓｔ
Ｉ、Ｐｖｕ ２全表わす。 第３図は、ｐＢｓＥＸ−Ｅ２Ｂプラスミド構築の手順を
示す。ｐＴＵＢ ２２８は、枯草菌の複製開始点を持っ
たベクターに、枯草菌のα−アミラーセ遺伝子がクロー
ン化されているプラスミドゝである。 太矢印はα−アミラーゼのプロモーターを示し、細矢印
は転写の方向を示す。図中、Ａ、Ｈ，Ｐ、Ｓ、■（工そ
れぞれ制限酵素Ｔ−１ｈａ １ 、Ｈｉｎｄ ３、Ｈｐ
ａ ２、Ｓｍａｌ、Ｐｖｕ２ｉ表わす。 第４図は、枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のシグナルペプ
チド領域の一部およびエラスターゼ−■Ｂ ｃＤＮＡの
アクチペーションペプチトゝＤＮ末端１１１１１ ｋ含
む合成り＋ｑＡ！Ｊンカーを示す。 第５図に、ｐＨ２Ｅχ−８プラスミド構築の手順？示ス
。斜線の領域（′！、、β−ガラクトシダーセ゛遺伝子
ケ示す。太矢印はラクトース・プロモーター・オペレー
ターケ示し、細矢印に転写の方向を示す。図中、Ｄ、）
］、Ｓ、 Ｖｌ工それぞれ制限酵素ＩＭｅ １ 、 Ｂ
ｉｎｄ ３、Ｓｍａ １、ＰＶＩＪ、 ２ ｋ表わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、一般式 【アミノ酸配列があります】 で表わされるアミノ酸配列で示されるヒト・膵臓エラス
ターゼ−IIＢまたはその同効物。 ２、（Ｎ）−末端が水素原子、Ｍｅｔ、または【アミノ
酸配列があります】 を有する特許請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列で示
されるヒト・膵臓エラスターゼ−IIＢまたはその同効物
。 ３、一般式 【アミノ酸配列があります】 で表わされるヒト・膵臓エラスターゼ−IIＢをコードす
るＤＮＡ。 ４、（Ｎ）−末端が水素原子、Ｍｅｔ、または【アミノ
酸配列があります】 を有するヒト・膵臓エラスターゼ−IIＢをコードする特
許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ。 ５、一般式 【塩基配列があります】 （式中、ＸはＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを示す。）で
表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基配列を含有
することを特徴とする特許請求の範囲第３項または第４
項記載のＤＮＡ。 ６、５′末端にＡＴＧ、または 【塩基配列があります】を有す ることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡ
。 ７、以下に記述した（イ）〜（ニ）を含むことを特徴と
する一般式 【塩基配列があります】 （式中、ＸはＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを示す。）で
表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基配列を含有
するＤＮＡの製造法。 （イ）ヒトの膵臓より、ｍＲＮＡを分離する。 （ロ）このｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用いてｃＤＮＡ
バンクを作製する。 （ハ）作製したｃＤＮＡバンクからプローブを用いてヒ
トエラスターゼをコードするｃＤＮＡを含有するプラス
ミドを単離する。 （ニ）このプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ
を切り出す。 ８、５′末端にＡＴＧまたは 【塩基配列があります】を有す ることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ
の製造法。 ９、一般式 【塩基配列があります】 （式中、ＸはＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを示す。）で
表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基配列を含有
するＤＮＡで形質転換せしめた宿主。 １０、５′末端にＡＴＧまたは 【塩基配列があります】を有す ることを特徴とする特許請求の範囲第９項記載のＤＮＡ
で形質転換せしめた宿主。 １１、大腸菌、枯草菌、酵母または動物細胞であること
を特徴とする特許請求の範囲第９項または第１０項記載
の宿主。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9198685 | 1985-04-27 | ||
| JP60-91986 | 1985-04-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6229977A true JPS6229977A (ja) | 1987-02-07 |
Family
ID=14041793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61021662A Pending JPS6229977A (ja) | 1985-04-27 | 1986-02-03 | ヒト・膵臓エラスタ−ゼ−２ｂ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6229977A (ja) |
-
1986
- 1986-02-03 JP JP61021662A patent/JPS6229977A/ja active Pending
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